İnsan göbek damarı endotel hücrelerini kullanan mikrotaşıyıcı boncuk tabanlı üç boyutlu anjiyogenez modeli

Özet

Bu protokol, insan göbek damarı endotel hücreleri kullanılarak mikrotaşıyıcı boncuk tabanlı üç boyutlu anjiyogenez modelini tanımlar. Bu test, endotel filizlenmesinin ve lümen benzeri yapı oluşumunun doğrudan görselleştirilmesine olanak tanır ve anjiojenik mekanizmalar ile terapötik müdahalelerin çalışmalarına uygulanabilir.

Özet

Anjiyogenez, endotel hücre aktivasyonu, göç, uzama, lümen oluşumu, dallanma ve anastomozu içeren çok aşamalı biyolojik bir süreçtir. Geleneksel iki boyutlu kültür sistemleri, ilaçların, genlerin veya kültür koşullarının ön değerlendirmesinde faydalıdır, ancak üç boyutlu ekstrasellüler bir matriks içinde endotel morfogenezinin mekansal organizasyonunu yeterince özetleyemezler. Mevcut protokol, insan göbek ven endotel hücreleri (HUVEC) kullanılarak mikrotaşıyıcı boncuk tabanlı üç boyutlu anjiyojenez testini tanımlar. HUVEC'ler önce kimyasal olarak bağlanmış asit-denatüre domuz tip I kolajen içeren mikrotaşıyıcı boncuklara tohumlanır ve ardından bazaz zar matrisine gömülür. Daha sonra jelin üzerine oral mukozal fibroblastlar ekilir; böylece endotel filizlenmesi ve damar benzeri yapı oluşumu için parakrin destek sağlanır. Kültür ortamı her 2 günde bir değiştirilir ve filizlenme davranışı ile anjiojenik fenotipler ters mikroskopi ile izlenir. Uygun kültür koşullarında, endotel filizleri birkaç gün içinde ortaya çıkar, ardından lümen benzeri yapılar ve filizler arası bağlantılar oluşur. Bu yöntem, endotel morfogenezinin in vitro çalışmaları için pratik ve tekrarlanabilir bir platform sağlar ve gen manipülasyonu, farmakolojik müdahale ve hastalık modellemesi araştırmalarında da uygulanabilir.

Giriş

Endotel filizlenmesi, anjiyogenezde önemli bir olaydır ve mevcut damar yapılarından endotel hücrelerinin ortaya çıkışı, göçü, çoğalması ve hizalanmasını içerir; ardından lümen oluşumu ve birbirine bağlı damarvari ağların^{kurulmasını içerir 1,2}. Geleneksel iki boyutlu kültür sistemleri ve jel bazlı tüp oluşum testleri teknik olarak basit olsa da, endotel hücrelerinin mekânsal yeniden yapılanmasını üç boyutlu bir mikro ortamda yeniden şekillendirme kapasitesi^{sınırlıdır 3,4}. Klasik mikrotaşıyıcı boncuk tabanlı üç boyutlu filizlenme testi, endotel filizlenmesi, uzama, lümen oluşumu ve ağ montajı dahil olmak üzere anjiyogenezin in vitro birkaç aşamasını yeniden üretir ve bu nedenle anjiyogenez araştırmalarında yaygın olarak kullanılan bir yöntem haline gelmiştir.

Mevcut protokolde, normal insan göbek ven endotel hücreleri kullanılarak üç boyutlu mikrotaşıyıcı boncuk tabanlı filizlenme modeli oluşturulmuştur. Daha önce bildirilen endotel mikrotaşıyıcı boncuk filizlenme^testleri 5,6,7'ye dayanarak, bu yöntem endotel hücre kaplamasının temel çerçevesini mikrotaşıyıcı boncuklara yerleştirerek, üç boyutlu bir matrise gömülmesini ve fibroblast örtü kültürünü korurken, prosedürü basitleştirmek ve rutin görüntülemeyi kolaylaştırmak için geleneksel fibrin jelinin yerine bazal membran matrisi koymaktadır. Bu değiştirilmiş protokolde bazal zar matrisi, birkaç pratik ve biyolojik nedenle seçilmiştir. Deneysel olarak, fibrin jeli hazırlamak için gereken ek polimerizasyon adımları olmadan hızlı jel oluşumu, basit boncuk gömümü ve pratik rutin mikroskobik gözlem sağlayan kullanıma hazır üç boyutlu bir matriks sağlar. Biyolojik olarak, bazal zar matris, endotel hücre yapışmasını, göçü, filiz uzanmasını ve lümen benzeri yapı oluşumunu destekleyen ekstrahücre matris bileşenleri içerir. Bu nedenle, bu modifikasyon, endotel filizlenme davranışının doğrudan görselleştirilmesi, anjiyojenik fenotiplerin karşılaştırılması ve üç boyutlu kültür ortamında farmakolojik veya genetik müdahalelerin değerlendirilmesi gerektiren çalışmalar için uygundur. Ancak, bazal membran matrisi matris bileşimi, mekanik özellikleri, bozunabilirliği ve biyoaktif ipuçları açısından fibrin jelinden farklı olduğundan, mevcut test, klasik fibrin tabanlı testin doğrudan yerine modifiye edilmiş bir mikrotaşıyıcı boncuk tabanlı filizlenme modeli olarak yorumlanmalıdır. Bu matrisle ilgili farklılıklar, filizlenme kinetiklerini, lümen kararlılığını ve ağ morfolojisini etkileyebilir ve farklı üç boyutlu anjiyogenez sistemleri arasındaki sonuçları karşılaştırırken dikkate alınmalıdır. Bu model, endotel filizlenme davranışını üç boyutlu gözlemlemek için uygundur ve farmakolojik müdahale, gen manipülasyonu ve anjiojenik mekanizmalar çalışmalarına da uygulanabilir.

Protokol

Bu protokolte kullanılan insan göbek damarı endotel hücreleri, Yunnan Eyaleti İlk Halk Hastanesi Doğum Bölümü'nden toplanan insan göbek kordonu dokularından izole edilip kültürlenmiştir. Örnek toplamadan önce tüm bağışçılardan yazılı bilgilendirilmiş onay alındı. İnsan kaynaklı materyallerle ilgili tüm prosedürler, Yunnan Eyaleti İlk Halk Hastanesi'nin Tıbbi Etik Komitesi tarafından onaylandı (onay no. KHLL2023-KY198). İnsan ağız mukozal fibroblastları (HOMF'ler), Kunming Tıp Üniversitesi Bağlı Stomatoloji Hastanesi'nde Dr. Jiemei Zhai'nin araştırma grubu tarafından nazikçe sağlanmıştır. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Hücre hazırlığı

1. İnsan göbek damarı endotel hücrelerinin (HUVEC) kültürü, ek fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilip, %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir kuluçka içinde, 37 °C'de %10 nihai konsantrasyona ulaşın. Test için kullanılan hücreler kontaminasyondan arınmış, stabil büyüme göstermeli ve logaritmik büyüme aşamasında olmalıdır. 4–6. pasajlarda hücreler kullanılır.
2. İnsan ağız mukoza fibroblastları (HOMF) yüksek glikozlu bazal ortamda, %10 fetal sığır serumu (FBS) ile 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka içinde, %5 CO₂ ile kültürlenmelidir. 4–6. pasajlarda hücreler kullanılır.
3. Mikrotaşıyıcı boncuk kaplamasından önce, her iki hücre tipinin uygun birleşimde olduğunu doğrulayın. Aşırı birleşen kültürlerden veya aşırı enzimatik sindirimden kaçının, çünkü bunlar sonraki filizlenmeyi olumsuz etkileyebilir.

2. Mikrotaşıyıcı boncukların hazırlanması

1. 0,5 g kuru mikrotaşıyıcı boncukları 50 mL PBS ile en az 3 saat hidretleyin. Yıkamadan sonra, boncukları 50 mL PBS ile yeniden askıya alın ve yaklaşık 3 × 10⁴ boncuk/mL olarak 10 mg/mL mikrotaşıyıcı boncuk süspansiyonu elde edilir.
2. Süspansiyonu silikonlu cam şişeye aktarın, 115 °C'de 15 dakika otoklavla sterilize edin ve 4 °C'de kullanana kadar saklayın.
3. Endotel hücre kaplamasından önce, depolama çözümünü çıkarın ve boncukları steril PBS ile yıkayın. Boncukları endotel hücresi büyüme ortamında 37 °C'de en az 30 dakika dengelendirin.
4. Dengelenmiş boncukları hemen kullanmadan önce nazikçe tekrar askıya alın, böylece tortul oluşması ve boncuk birikmesini önleyin.
5. Hücre kaplamasından önce, boncuk süspansiyonunun küçük bir aliquotunu ters mikroskop altında inceleyin. Boncuklar tamamen nemlenmiş, eşit şekilde asılı ve görünür agregalar veya parçalanmış parçacıklardan arınmış olduğunda devam edin.

3. Endotel hücrelerini mikrotaşıyıcı boncuklara kaplamak

1. HUVEC'leri tripsin kullanarak ayırın ve hücreleri endotel hücre büyüme ortamına yeniden süsküyer.
2. Mikrotaşıyıcı boncukları her boncuk başına 1.500 hücre yoğunluğuyla kaplayın. 3 ×^{10 6} HUVEC, 2.000 mikrotaşıyıcı boncukla 1,5 mL endotel hücresi büyüme ortamında karıştırın.
3. Hücre-boncuk karışımını mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hücre kültüründe 12 saat kuluçka yapın. Tam 12 saatlik kuluçka dönemi boyunca, hücreler ile boncuklar arasında yeterli temas sağlamak ve endotelyal hücrelerin tekiz tutunmasını sağlamak için tüpü her 20 dakikada bir nazikçe ters çevirin.
4. 12 saat sonra, kaplı boncukları 4 mL endotel hücre büyüme ortamı içeren 25^{cm 2} hücre kültür şişesine aktarın ve endotel hücrelerinin mikrotaşıyıcı boncuk yüzeyine sıkı tutunmasını sağlamak için gece boyunca kuluçkaya devam eder.
5. Gömülmeden önce, temsil eden kaplamalı boncukları ters bir mikroskop altında inceleyin. Yalnızca incelenen boncukların %80'inden fazlası boncuk yüzeyinde sürekli ve nispeten düzgün endotel hücre tabakası gösterdiğinde, minimum serbest yüzen hücreler, belirgin hücre kümeleri yok ve ciddi boncuk toplanması olmadığında matris gömülmesine devam edin. Gömülme için düzensiz kaplamalı, büyük hücre kümeleri veya geniş toplanmış boncuklar kullanılmamalıdır.
6. Eğer boncuklar şişenin dibine yapışırsa, şişeyi hafifçe sallayarak serbest bırakın. Güçlü pipetlemeden kaçının; bu boncuk toplanması veya hücre ayrılmasına neden olabilir.

4. Kaplamalı boncukların üç boyutlu bir matrise gömülmesi

1. Endotel hücresi kaplı mikrotaşıyıcı boncukları 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve boncukların yerçekimiyle yerleşmesine izin verin. Fazla ortamı çıkarın ve uygun miktarda taze medium ekleyin.
2. Mikrotaşıyıcı boncuk süspansiyonu, önceden soğutulan bazaz membran matrisi ile 1:1 (v/v) oranında karıştırarak nihai boncuk konsantrasyonu 500 boncuk/mL elde edilir.
3. 24 kuyuluğa sahip bir plakanın her kuyusunun ortasına 100 μL matris boncuk süspansiyonu eklenerek karışımın kuyu duvarına temas etmeden tek bir kubbe şeklinde jel damlası oluşturmasını sağlar. Süspansiyonu dağıtmadan hemen önce nazikçe karıştırın ve hava kabarcıkları oluşmamasını önleyin.
4. 24 kuyruklu plakayı oda sıcaklığında 5 dakika bekleyin ki jelleşme ve jel damlasının stabilizasyonu sağlansın. Daha sonra plakayı 37 °C'de %5 CO₂ içinde dik pozisyonda 15 dakika kuluçka altına alın, ardından tam jelleşme ve doğru jel oluşumunu sağlamak için ters pozisyonda ek 15 dakika kuluçka yapın.
5. Jel tamamen katılaştıktan sonra hemen fibroblast örtü kültürüne geçin.

5. Fibroblast örtü kültürü

1. 3 × 10⁴ insan ağız mukozal fibroblastını (HOMF) 1 mL endotel hücre büyüme ortamına askıya alın ve hücre süspansiyonunu her kuyunun duvarı boyunca nazikçe ekleyin; böylece hücreler jel yüzeyine doğrudan zarar vermeden dağılmasına olanak tanır.
2. %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37 °C sıcaklıkta endotel hücre büyüme ortamında kuluçkaya devam edin. İnsan ağız mukozal fibroblastları, endotel filizinin uzanması, stabilizasyonu ve üç boyutlu kültür sisteminde damar benzeri yeniden yapılanmanı destekleyen stromal türevli parakrin sinyaller sağladıkları için destek hücreleri olarak kullanılır.

6. Kültür bakımı ve mikroskobik gözlem

1. Kültür ortamını her 2 günde bir değiştirin. Ara madde değişimleri sırasında, kullanılmış ortamı yavaşça aspire edin ve jelin bozulmaması için kuyunun duvarına taze kültür ortamı ekleyin.
2. Kültürleri her gün veya iki günde bir parlak alan veya faz kontrastı modunda ters mikroskop altında gözlemleyin. Boylamasına nicel analiz için, 7. günde her kuyunun birden fazla görüş alanı seçin ve aynı önceden tanımlanmış alanları 9. ve 11. günlerde fotoğraflayın.
3. Optimal kültür koşullarında, belirgin endotel filizlenme genellikle 4–6. günlerde gözlemlenir, lümen benzeri yapılar 5–7. günlerde ortaya çıkar ve 7. günden sonra birbirine bağlı mikrovasküler benzeri ağlar yavaş yavaş oluşur.
4. Başarılı filizlenmeyi, boncuk yüzeyinden çevresindeki üç boyutlu matrise radyal olarak büyüyen çoklu endotel uzantılarının varlığı olarak tanımlayın. Bir filiz, yalnızca boncuk yüzeyinin dışına net bir şekilde uzandığında ve boncukla ilişkili endotel hücre tabakasına bağlı kaldığında sayılmalıdır.
5. Lumen benzeri yapı oluşumunu, görünür merkezi bir boşluk veya tüp benzeri morfolojiye sahip uzun endotel yapılarının ortaya çıkışı olarak tanımlayın. Filizler arası bağlantılar, bitişik filizler arasında oluşan doğrudan temaslar veya sürekli yapılar olarak tanımlanır.
6. Yoğun hücre ölümü, şiddetli boncuk toplanması (boncuk) birikmesi, jel yapısı bozulmuş, bol kabarcıklar, matriks çöküşü veya sadece kısa, düzensiz hücre çıkıntıları olan kültürler optimal olmayan olarak değerlendirilmeli ve nicel analizden dışlanmalıdır.

7. Görüntü edinimi ve nicel analiz

1. 7. günde her kuyunun birden fazla görüş alanını seçin ve 9. ve 11. günlerde aynı önceden tanımlanmış alanlardan görüntüler alın. Görüntüler, her zaman aynı büyütme, pozlama ayarları ve görüntüleme koşullarıyla toplanmalıdır.
2. Mikrotaşıyıcı boncuk başına filizlenme sayısını ve vaskülerleşmiş alanı nicelikle ölçün.
   1. Vaskülerize alan ölçümü için açık kaynak görüntü analiz yazılımı kullanın. Alınan görüntüyü açın ve damarlanmış ilgi bölgesinin (ROI) sınırını poligon veya serbest el seçim aracıyla manuel olarak belirleyin. Seçilen yatırım getirisini ROI yöneticisine ekleyin.
   2. Görselleştirme için, önerilen yatırım getirisini göstermek için ilgi alanına bağlı bir görselleştirme eklentisi kullanın. Ölçüm ayarlarında alan ölçümü etkinleştirin ve damarlanmış alanı elde etmek için seçilen yatırım getirisi ölçün. Tüm görsellere aynı analiz ayarlarını uygulayın.
   3. Anjiojenik hız analizi için, 7. günün vaskülerleşmiş alanını temel olarak kullanın ve 9. ve 11. günlerdeki vaskülerize alandaki göreli değişimi hesaplayın.
3. Üç gözlemci tarafından bağımsız olarak bireysel filizlenme sayısını sayın ve analiz için ortalama değeri kullanın.

Sonuçlar

Üç boyutlu HUVEC modelinde anjiyogenez

Başarılı kültürlerde, endotel hücreleri mikrotaşıyıcı boncukların yüzeyinde eşit şekilde dağılımlıdır ve belirgin bir boncuk toplanması gözlemlenmez. Dinamik gözlem, 7, 9 ve 11. günlerde ilerleyici endotel filizlenmesi ve mikrovasküler benzer ağ oluşumunu gösterdi (Şekil 1A). Nicel analiz, bu modeldeki ilerleyici anjiojenik yanıtı daha da doğruladı. 7. gün temel alındığında, anjiojenik oran 7. günde %0 olarak belirlenmiş ve %66,94, 9. gün %18,49 ± 11. gün %169,51 ± %100,83'e ulaşmıştır; bu da kültür sırasında damarlanmış alanın kademeli genişlemesini gösterir (Şekil 1B). Temsil parlak alan görüntülemesi, endotel filizlerinin 7 gün kültür sonrası boncuk yüzeyinden çevredeki üç boyutlu matrise radyal olarak çıktığını göstermiştir (Şekil 1C). Ayrıca, konfokal mikroskopi, üç boyutlu kültür sisteminin brüt morfolojisi ve mekansal organizasyonuna genel bir bakış sundu (Şekil 1D). Mikrotaşıyıcı boncuk başına ortalama filizlenme sayısı, üç gözlemcinin bağımsız sayımlarına göre 31,3 filiz/boncuktu. Bu bulgular, modelin endotel filizlenmesi, uzayış, lümen benzeri morfolojisi ve vasküler benzeri yeniden şekillendirmeyi üç boyutlu bir ortamda desteklediğini göstermektedir.

Üç boyutlu HUVEC modelinde optimal olmayan sonuçlar

Başarısız veya optimal olmayan kültürlerde, hücre ölümü (Şekil 2A), mikrotaşıyıcı boncukların kopması (Şekil 2B), boncuk yüzeyinde anormal hücre toplanması (Şekil 2C), jel içinde yaygın kabarcık oluşumu (Şekil 2D), matriksin lokal çökmesi (Şekil 2E), aşırı yüksek boncuk yoğunluğu (Şekil 2F), mikrotaşıyıcı boncuklarda düzensiz hücre kaplaması (Şekil 2G), boncuk toplanması (Şekil 2H) ve ya belirgin filizlenme yok ya da sadece sınırlı filiz oluşumu (Şekil 2I,J). Bu anormallikler, modelin başarılı kurulmasının yetersiz hücre canlılığı, yetersiz hücre kaplaması, bazal membran matriksinin yanlış sıcaklık kontrolü, aşırı güçlü yeniden süspansiyon veya ortam değişimi sırasında jelin bozulması nedeniyle etkili olabileceğini göstermektedir.

Şekil 1: Üç boyutlu HUVEC modelinde anjiyogenez. (A) 7, 9 ve 11. günlerde üç boyutlu HUVEC modelinde anjiyogenezin dinamik değerlendirmesi. Görüntüler 20× büyütme ile alındı. Ölçeg çubuğu = 10 μm. (B) Anjiojenik hızın nicel analizi. Anjiojenik oran, 7, 9 ve 11. günlerde zamanla vaskülerleşmiş alanın göreli değişimi olarak tanımlandı ve 7. gün temel alındı. Hesaplandı: anjiojenik oran = [(gösterilen zaman noktasında vaskülerleşmiş alan − 7. gün damarlanmış alan) / 7. gün damarlanmış alan] × %100. Anjiojenik hız verileri, üç bağımsız deneyden ortalama SD ± olarak sunulmaktadır. (C) 7 gün kültür sonrası HUVEC'lerde endotel filizlenmesinin temsilci görüntüsü. Görüntü 20× büyütme ile alındı. Ölçeg çubuğu = 10 μm. (D) Üç boyutlu kültür sisteminin brüt morfolojisini gösteren konfokal genel görüntü. Görüntü 4× tarama ile alındı. Ölçek çubuğu = 500 μm. (E) HUVEC'lerde filizlenme sayısının nicel analizi. Filizlerin sayısı üç gözlemci tarafından bağımsız olarak sayıldı ve analiz için ortalama değer kullanıldı. Bu tanımlayıcı nicel analizler için istatistiksel karşılaştırma yapılmadı. Bu şekilde gösterilen endotel filizlenme yapıları, HUVEC kaplı mikrotaşıyıcı boncuklardan türetilmiştir; HOMF'ler üst örtü destek hücreleri olarak kullanıldı ve görüntülerde özel olarak etiketlenmedi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Üç boyutlu HUVEC modelinde optimal olmayan sonuçlar. (A) Hücre ölümü. Beyaz okla gösterildiği gibi, hücreler noktalı kalıntı olarak görünür ve mikrotaşıyıcı boncukluğun yüzeyi pürüzsüz hale gelir. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Mikrotaşıyıcı boncukluğun yırtılması, beyaz okla gösterildiği gibi. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C) Mikrotaşıyıcı boncuk yüzeyinde hücre toplanması. Beyaz okla gösterildiği gibi, hücreler boncuk gibi kümelenmiş bir görünüm sergiler. Ölçek çubuğu = 50 μm. (D) Beyaz okla belirtildiği gibi jel içinde geniş bir kabarcık oluşumu. Ölçek çubuğu = 100 μm. (E) Beyaz okla belirtildiği gibi matrisin yerel çöküşü. Ölçek çubuğu = 10 μm. (F) Aşırı yüksek mikrotaşıyıcı boncuk yoğunluğu. Ölçek çubuğu = 10 μm. (G) Mikrotaşıyıcı boncuk üzerinde düzensiz hücre kaplaması. Beyaz okun belirttiği gibi, boncuk yüzeyinin bir tarafı pürüzsüz kalır. Ölçek çubuğu = 50 μm. (H) Boncuk toplayıcısı. Ölçek çubuğu = 50 μm. (I,J) Belirgin filizlenme yok ya da sadece sınırlı filizlenme oluşumu var. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Deneysel iş akışının şematik illüstrasyonu. (A) Kimyasal olarak bağlanmış asit-denatüre domuz tip I kolajeni içeren HUVEC, HOMF ve mikrotaşıyıcı boncukların uygun koşullarda test kurulumundan önce hazırlanması. (B) HUVEC'lerin hazırlanmış mikrotaşıyıcı boncuklarla karıştırılması, böylece endotel hücresinin boncuk yüzeyine tutunmasını teşvik etmek. (C) Endotelyal hücrelerin uniform tutumunu teşvik etmek için her 20 dakikada bir 12 saat boyunca hafif inversiyonla boncuk kaplama kuluçkası. (D) Kaplamalı boncukların kültür şişesine aktarılması, böylece endotel hücrelerinin mikrotaşıyıcı boncuk yüzeyine sıkı tutunmasını sağlamak için daha fazla kuluçka yapılması. (E) HUVEC kaplı mikrotaşıyıcı boncukların bazal membran matriksine gömülmesi, ardından jelin üzerine HOMF'lerin ekilmesi ve endotel filizlenme ve damar benzeri yeniden yapılanma için stromal köklü parakrin desteği sağlanması. (F) 7, 9 ve 11. günlerde endotel filizlenme, lümen benzeri yapı oluşumu, filizler arası bağlantılar, filiz sayı ve damarlanmış alanın mikroskobik gözlemi ve nicel analizi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Mevcut protokol, mikrotaşıyıcı boncuklara dayalı modifiye edilmiş üç boyutlu endotel filizlenme modelini tanımlamaktadır. Şekil 3, deneysel iş akışının şematik bir genel bakışını sunar. Protokol, Nakatsu ve Hughes tarafından bildirilen klasik anjiyogenez testinden uyarlanmış ve mevcut çalışmanın ^8,9 hedeflerine uygun optimize edilmiştir. Klasik sistemde, endotel hücreleri kollajen kaplı mikrotaşıyıcı boncuklar üzerine kaplanır, üç boyutlu bir matrikse gömülür ve filizlenme, uzama, lümen oluşumu ve damar benzeri^{anastomozu desteklemek} için fibroblastlarla birlikte kültürlenir ^7,10. Mevcut protokolde, fibrin jeli yerine bazal membran matrisi kullanıldı ve destekleyici hücreler olarak insan ağız mukoza fibroblastları kullanıldı; böylece endotel anjiojenik davranışın in vitro gözlemi için uygun bir üç boyutlu kültür sistemi oluşturuldu. Temsilci görüntülerde gösterilen filizlenen yapılar, HUVEC kaplı mikrotaşıyıcı boncuklardan türetilirken, insan ağız mukoza fibroblastları üst üste destek hücreleri olarak tohumlanmıştır ve bu görüntülerde özel olarak etiketlenmemiştir.

Bu protokolün önemli bir özelliği, klasik fibrin jel sistemi yerine bazal membran matrisinin kullanılmasıdır. Deneysel olarak, bazal zar matrisi kullanıma hazır, hızlı sıcaklığa bağlı jelleşme geçirdiği ve ayrı fibrinojen, trombin veya aprotinin hazırlanmasına gerek kalmadan endotel hücresi kaplı mikrotaşıyıcı boncukların rahat gömülmesini sağladığı için test kurulumunu kolaylaştırır. Bu özellik, protokolü nispeten basit ve rutin mikroskobik gözlem için uygun kılar. Ancak bu değişiklik, testin biyolojik mikro ortamını da değiştirir. Fibrin jelinin aksine, bazal membran matrisi, bazal membranla ilişkili ekstrasellüler matriks bileşenleri ve endotel yapışması, göç, filiz uzanması, lümen benzeri morfolojisi ve ağ yeniden şekillendirilmesini etkileyebilecek biyoaktif ipuçları içerir. Ayrıca, matris sertliği, bozunabilirliği ve ligand bileşimindeki farklılıklar, filizlenme kinetiği ve ağ morfolojisini etkileyebilir. Bu nedenle, bu değiştirilmiş testle elde edilen sonuçlar, orijinal fibrin tabanlı testin doğrudan karşılığı olarak değil, bazaz membran matrisi tabanlı mikrotaşıyıcı boncuk filizlenme modelinin sonuçları olarak yorumlanmalıdır.

Bu modelin başarılı bir şekilde kurulması birkaç kritik adıma bağlıdır. Mikrotaşıyıcı boncuk yüzeyinde düz endotel hücresi kaplaması, filizlenmenin tutarlı başlatılması ve uzantılması için gereklidir. Yetersiz veya düzensiz kaplama, filizlenme sayısının azalmasına, yönünün zayıf büyümesine ve tekrarlanabilirliğin azalmasına yol açabilir. Stabil jel oluşumu, test performansının bir diğer önemli belirleyicisidir. Matris hazırlama ve gömme sırasında, yanlış sıcaklık kontrolü erken jelleşmeye, düzensiz boncuk dağılımına veya kabarcık oluşumuna yol açabilir ve bunların hepsi endotel filizlenmesini engelleyebilir. Ayrıca, filizlenme büyümesini ve stabilizasyonunu destekleyen sürekli parakrin sinyaller sağlamak için destekleyici fibroblastlar gereklidir. Bu nedenle, bu adımların dikkatli kontrolü, istikrarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için gereklidir.

Birkaç ölçüm test tutarlılığını artırabilir. Şekil 2'de gösterilen temsil altoptimal sonuçlar, pratik sorun giderme göstergeleri olarak kullanılabilir. Yaygın hücre ölümü, hücre ayrılması sırasında aşırı sindirim, uygunsuz geçiş sayısı veya gecikmeli ortam değişiminden kaynaklanabilir; Bu nedenle, sağlıklı logaritmik faz endotel hücreleri ve hafif enzimatik sindirim önerilir. Mikrotaşıyıcı boncukların yırtılması veya boncuk toplanması güçlü pipetleme, aşırı mekanik çalkalama veya yetersiz boncuk yeniden süspansiyonu nedeniyle olabilir ve boncuk hazırlama ve kaplama sırasında nazik karıştırma ve dikkatli kullanımla azaltılabilir. Entesel olmayan endotel hücre kaplaması veya boncuk yüzeyindeki büyük hücre kümeleri genellikle yetersiz karışımı, aşırı hücre yoğunluğunu veya kaplama döneminde yetersiz boncuk-hücre temasını gösterir; Bu durumda, hücre boncuk süspansiyonu düzenli aralıklarla nazikçe ters çevrilmeli ve gömülmeden önce incelenmelidir. Kabarcık oluşumu ve yerel matriks çöküşü genellikle matrisin yanlış işlenmesi, erken jelleşme veya ortam ekleme veya değiştirme sırasında jelin bozulmasıyla ilişkilidir; Matriksi kullanmadan önce buzda tutmak, dağıtma sırasında hava kabarcıklarını önlemek, tam jelleşmeye izin vermek ve kuyu duvarı boyunca yavaş yavaş ekleyerek bu sorunları azaltabilir. Belirgin filizlenme veya sadece sınırlı filizlenme gösteren kültürler, zayıf endotel hücre bağlanması, düşük hücre canlılığı, yetersiz fibroblast kaynaklı destek veya kararsız matriks oluşumunu gösterebilir ve nicel analizden dışlanmalıdır.

Geleneksel iki boyutlu tüp oluşum testleriyle karşılaştırıldığında, bu üç boyutlu mikrotaşıyıcı boncuk tabanlı model, endotel hücrelerinin ekstrasellüler matriks içindeki mekansal davranışını daha etkili şekilde tekrarlar ve endotel filizlenme, uzama, lümen benzeri yapı oluşumu ve ağ montajının görselleştirilmesini sağlar. Ayrıca, üç boyutlu kültür ortamı, in vivo besin ve sinyal dağılımına daha çok benzeyen^{koşullar sağlar 11,12}. Teknik olarak genellikle zorlayıcı ve maliyetli olan mikrofluidik damar çip sistemlerine kıyasla, bu yöntem nispeten basit, tekrarlanabilir ve maliyet etkilidir; bu da onu anjiyogenez rutin in vitro çalışmaları için oldukça uygundur.

Bu protokolün önemli bir sınırlaması, klasik fibrin jel sisteminin yerine bazal zar matrisinin kullanılmasıdır. Bu nedenle, mevcut test, orijinal fibrin tabanlı yöntemin doğrudan bir kopyası değil, daha önce bildirilen endotel mikrotaşıyıcı boncuk filizlenme modelinin modifiye edilmiş bir versiyonu olarak değerlendirilmelidir. Farklı matrisler bileşim, mekanik özellikler ve bozulma davranışı açısından farklılık gösterdiğinden, filizlenme kinetiklerini, lümen stabilitesini ve damar ağı^{morfolojisini etkileyebilirler} 13,14,15. Bu nedenle, bu modelle elde edilen sonuçlarla geleneksel fibrin tabanlı sistemlerle elde edilenlerle karşılaştırıldığında dikkatli olmak gerekir.

Bu modelin, bazal endotel filizlenmesinin gözleminin ötesinde potansiyel uygulamaları vardır. Ayrıca farmakolojik müdahale çalışmaları, gen aşırı ekspresyonu veya knockdown deneyleri, sinyal yolu analizi ve hastalıkla ilişkili endotel^{fenotiplerinin incelenmesi için de uyarlanabilir 16,17}. Daha fazla optimizasyonla, bu üç boyutlu filizlenme testi, anjiyogenezi hedefleyen damar gelişim mekanizmaları ve terapötik stratejiler için güvenilir bir in vitro platform olarak hizmet edebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1.5 mL mikrosantrifüj tüpü	Beyotime	FTUB306	Berrak, nükleaz içermeyen
15 mL santrifüj tüpü	Haier	311005	Konik tabanlı, steril, torba paketli
24 kuyu hücre kültür plakası	Haier	612003	Düz tabanlı, doku kültürü için işlem görmüş, bireysel olarak sarılmış, yapışkan hücre kültürü için
Otomatik hücre sayım slaytı	Countstar	12-0005-50	Otomatik hücre sayacı için tek kullanımlık slayt, kutuda 50 slayt
CO2 hücre kültür inkübatörü	Thermo Fisher Scientific	3110	37 °C ve %5 CO2 ile hücre kültürü için kullanılır
Cytodex 3 mikro taşıyıcılar	Cytiva	17048503	Kuru toz; kollajen kaplı dekstran mikro taşıyıcı boncuk
Noktalı Çizgi eklentisi	Yok	Yok	Etkilenilmesi gereken bölge görselleştirme eklentisi, çevrelenmiş vaskülerize alanların görüntülenmesi için kullanılır
Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Kartal Ortamı (DMEM), yüksek glukoz	EvaCell (EVA Life Sciences)	E2102	DMEM temel (1×), 4.5 g/L D-glukoz, L-glutamin ve 110 mg/L sodyum pirüvat içerir, 500 mL
Endotelyal Hücre Ortamı (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Ek FBS ile takviye edilmiş endotel hücre kültürü ortamı, kullanımdan önce nihai konsantrasyon %10 olacak şekilde
Fetal boğa serumu (FBS)	Gibco	10099141C	Kalifiye, tek kullanımlık format, Avustralya menşeli, 500 mL
İnsan oral mukoza fibroblastları (HOMF)	Jiemei Zhai araştırma grubu, Kunming Tıp Üniversitesi Bağlı Diş Hekimliği Hastanesi	Yok	İnsan oral mukozadan izole edilmiş primer fibroblastlar; başka bir laboratuvar tarafından sağlanmıştır
İnsan göbek kordonu ven endotel hücreleri (HUVEC)	Kendi laboratuvarımız	Yok	İnsan göbek kordon damarlarından izole edilmiş primer endotel hücreler; katalog numarası yok
ImageJ yazılımı	Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH), ABD	Yok	Açık kaynak yazılım; sürüm 1.54p
Ters çevrilmiş mikroskop	Olympus, Japonya	Yok	Parlak alan, faz kontrastı ve floresan görüntüleme için
Lazer taramalı konfokal mikroskop	Nikon, Japonya	Yok	Konfokal görüntüleme için; model belirtilmemiş
Matrigel bazal membran matrisi	Corning	354262	Yüksek konsantrasyon (HC), fenol kırmızısız, LDEV içermeyen, 10 mL
Penisilin-Streptomisin (Pen-Strep)	Gibco	15140-122	Hücre kültürü için penisilin-streptomisin çözeltisi, 100×, 100 mL
Fosfat tamponlu salin (PBS)	LiJi Bio	AC08L011	1×, steril, 500 mL
T25 hücre kültürü şişesi	ABCBIO	ABC707008	T25, havalandırmalı kapak, doku kültürü için işlem görmüş, yapışkan hücre kültürü için
Tripsin-EDTA (%0.25)	Gibco	25200-056	%0.25 tripsin-EDTA çözeltisi, 100 mL