CD90 Tabanlı Flüoresans-Aktiflenmiş Hücre Ayırma Kullanılarak Hipotiroid Farelerden Fare Hipofiz Tirotroplarının Zenginleştirilmesi

Özet

Bu protokol, hipotiroid, yetişkin fare hipofiz bezlerinden tirotropların zenginleştirilmesini enzimatik dissosiyasyon ve CD90 tabanlı floresans-aktifete hücre ayırtması ile tanımlar; böylece tirotropla zenginleştirilmiş bir hücre popülasyonunun aşağı akım moleküler analizleri ve kısa vadeli birincil kültürü mümkün olur.

Özet

Tirotroplar, ön hipofiz bezinde bulunan ve tiroid uyarıcı hormon (TSH) salgılayan ve tiroid aktivitesini düzenleyen uzmanlaşmış endokrin hücrelerdir. TSH salgısı, hipotalamik tirotropin salgılayan hormon tarafından pozitif şekilde düzenlenir ve dolaşımdaki tiroid hormonları tarafından negatif şekilde düzenlenir. Tirotroplar, hipofiz hücrelerinin yalnızca küçük bir kısmını (~%5) oluşturur ve fizyolojilerini izole etme ve inceleme çabalarını zorlaştırır. Burada, hipotiroidli yetişkin farelerden tirotropların izole edilmesi için geliştirilmiş bir yaklaşımı tanımlıyoruz. Hipotiroidizm, ön hipofiz bezinin enzimatik ayrışmasından ve CD90.2 yüzey antijeni kullanılarak floresansla aktive hücre ayırmasından önce tiroropep popülasyonunu genişletmek için indüklendi. On iki farenin ön hipofiz bezlerinin işlenmesi, Tshb haberci RNA ekspresyonu için zenginleştirilmiş yaklaşık 1,5 ×⁶ CD90.2-pozitif hücre elde etti. CD90.2-pozitif hücreler, ön hipofiz hücrelerinin yaklaşık %25'ini temsil ediyor ve CD90.2-negatif hücrelere kıyasla yaklaşık beş kat daha yüksek Tshb ekspresyonu sergiliyor; bu da önemli tirotrop zenginleşmesini gösteriyor. İzole hücreler kısa süreli kültürde canlı kalmış ve triiodotironin tedavisine yanıt vermeyi korudu. Bu protokol, fare tirotroplarının moleküler, transkriptomik, epigenom ve fizyolojik analizler için zenginleştirilmesini ve kültürlenmesini sağlar.

Giriş

Hipofiz bezi, beynin tabanında yer alan ve hormonal homeostaz üzerinde hiyerarşik kontrol sağlayan bir endokrin organdır. Aktivitesi, hipofiz hormonlarının üretimini uyaran veya engelleyen hipotalamik sinyallerle düzenlenir; bu sinyaller periferik endokrin organların işlevini yönetir. Bez, kök/progenitor hücreler ve farklılaşmış hormon üreten hücreler dahil olmak üzere heterojen ve dinamik bir hücre^{popülasyonu içerir 1}. Fizyolojik stres veya hasara yanıt olarak, hipofiz kök/progenitor hücreleri aktive olabilir, kendini yenileyebilir ve birden fazla hormon salgılayan hatlara^{ayrılabilir 2,3}. Yapısal olarak, hipofiz iki ana loba ayrılmıştır: oksitosin ve vazopressin salgılayan hipositler ve nörosekretor terminallerden oluşan arka lob (PL) ve büyüme hormonu, prolaktin, tiroid uyarıcı hormon (TSH), adrenokortikotropik hormon ve gonadotropin follikül uyarıcı hormon (FSH) ile luteinizan hormon (LH) salgılayan özel endokrin hücre tiplerini içeren ön lob (AL). Ön hipofiz ayrıca endokrin ^fonksiyon 4,5,6'yı destekleyen S100B-pozitif folikülotellat hücreler, endotel hücreleri ve perisitler gibi hormonal olmayan hücre tiplerini barındırır. Kemirgenler ayrıca hipofiz bezinin ara lobunda melanotroflar^{içerir 7,8}.

Hipofiz fonksiyonu, farklılaşma ve gelişime olan ilgi, kemirgen modellerinde yetişkin hipofiz kök ve progenitör hücrelerini izole etmeye yönelik birden fazla protokolün geliştirilmesini sağlamıştır. Fareler, daha büyük hipofiz bezlerinin daha fazla hücre sayısı sağlaması ve doku işleme sırasında iyileşmeyi hızlandırması nedeniyle hipofiz fizyolojisi araştırmalarında sıkça kullanılır ^4,9. Buna karşılık, farelerden hipofiz hücrelerini izole etmek teknik olarak zordur ve standart protokoller sınırlıdır. Yetişkin hipofiz kök/progenitor hücre agregalarını kullanan son protokoller, hipofiz gelişimi ve fonksiyonunu modellemek için faydalı araçlar^{sağlar 10}; ancak bu sistemler henüz belirli endokrin hücre popülasyonlarının doğrudan izolasyonuna izin vermez. Ön hipofizin hormon üreten hücre tipleri arasında, tirotroplar hipotalamus-hipofiz–tiroid (HPT) ekseninin başlıca düzenleyicileridir ve memelilerde tiroid hormonu (TH) sentezini ve salgılanmasını kontrol ederler. Tirotroplar tarafından üretilen TSH, ortak bir α-subbirimden (Cga ile kodlanan, FSH ve LH ile paylaşılan) ve bir β-alt birimden (Tshb ile kodlanan) oluşan heterodimerik bir glikoproteindir ve bu birim reseptör özgüllüğü sağlar. Bu hücreler, dolaşımdaki triiodotironin (T3) ve tiroksin (T4) seviyelerine karşı son derece hassastır. Tirotip popülasyonu, hipotiroidizm sırasında T3 ve T4 seviyeleri düşük olduğunda genişler ve hipertiroidizm sırasında klasik negatif geri besleme^mekanizması 11,12,13 ile küçülür.

Temel fizyolojik rollerine rağmen, tirotroplar sadece ön hipofiz hücrelerinin küçük bir kısmını (yaklaşık %5) oluşturdukları ve diğer endokrin popülasyonlarla fenotipik özellikleri paylaştıkları için incelenmesi zordur. Bu kıtlık ve sağlam in vitro modellerin olmaması, tirotipt regülasyonu ve HPT ekseni kontrolünün mekanik araştırmalarını sınırlamıştır. TαT1 tümör hücre hattı, yaygın olarak kullanılan tirotip-benzeri model^14'ü temsil eder, ancak fizyolojik yanıtları tam olarak yansıtmaz; özellikle, Tshb'nin T3 bağımlı baskılanması, bazal transkripsiyon^{seviyesi 15'in} çok düşük olması nedeniyle genellikle zor değerlendirilir. Sonuç olarak, birçok çalışma, HEK293, COS, CV1, GH3 veya JEG3 gibi tirotrop dışı hücre hatlarının farklı Tshb ^{yapılarını ifade etmesine dayanmıştır 15}. Ancak bunlar, endogen transkripsiyonel mekanizmalar yerine plazmid omurgaları tarafından yönlendirilen etkiler dahil olmak üzere fizyolojik olmayan düzenleyici artefaktlar getirebilen heterolog sistemlerdir.

Burada, yetişkin fare hipofiz bezinden tirotropların izole edilmesi için adım adım bir protokol sunuyoruz; bu protokol, daha önce^{sıçanlarda 9} uygulanmış bir yöntemden uyarlanmış ve fare hipofizinin daha küçük boyutu ve daha düşük tirotipp içeriği için optimize edilmiştir. Tshb eksprese eden hücrelerin verimini artırmak ve güvenilir bir sonraki analiz sağlamak için birkaç önemli değişiklik yapıldı. Protokol, tirotroplarla zenginleştirilmiş yüzey belirteci olan yüzey antijeni CD90'ın ekspresyonunu kullanır. CD90 (aynı zamanda THY1 olarak da bilinir), integrin β2 ligandı (ITGB2) ile heterotipik etkileşimler yoluyla juksaile sinyalini aracılık eden glikosilfosfatidilinositol ile bağlı membran^proteini 16,17'dir. CD90 genellikle bağışıklık ve sinir hücresi popülasyonlarıyla ilişkilendirilse de, önceki transkriptomik çalışmalar tirotroplarda Thy1 zenginleşmesini tespit etmiştir. THY1'e bağlı temas sinyalizasyonu, hematopoietik hücreler, T hücreleri, fibroblastlar, endotel hücreleri ve nöronlar dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde görülür; burada yapışma, göç, apoptoz, tümör baskılanması ve^fibrozis 18,19,20 şeklinde düzenlemeleri sağlar.

Önemli olarak, fare ön hipofizinin tek hücreli transkriptomik profillemesi, Thy1'i ^{tirotroplar 5'te} en yüksek şekilde ifade edilen yapışma ilişkili genlerden biri olarak tanımlamış ve THY1'in tirotroplarla zenginleşmiş bir yüzey belirtemesi olduğunu göstermiştir. Ayrıca, halka açık fare hipofiz tek hücreli ribonüklein asit (RNA) dizileme veri setleri, Thy1/CD90 ekspresyonunun^{tirotroplar 22,23} açısından zenginleştirildiğini göstermektedir. Ancak, ekspresyonu tamamen bu soy ile sınırlı değildir; PIT1-hattı hücrelerinin alt kümelerinde, somatotroplar ve laktotroplar dahil olmak üzere, ayrıca progenitor benzeri popülasyonlarda tespit edilebilir bir ekspresyon vardır. Tek hücreli transkriptomik çalışmalar, PIT1 hattı hipofiz hücreleri arasında önemli transkripsiyonel örtüşmeleri göstermiştir; bunlar arasında somatotroplar, laktotroplar ve tirotroplar üretebilen ortak bir PIT1 öncül popülasyonu^{tespit edilmiştir 24}. Benzer şekilde, Thy1/CD90 yalnızca tirotrop popülasyonunu tanımlamaz, ancak fare tirotroplarını zenginleştirmek için kullanılabilir. Bu bulgular üzerine inşa edilerek, izolasyon stratejimizde THY1 hedefli antikorların kullanımı, hipotiroidizm kaynaklı genişleme sonrası tirotropların zenginleştirilmesi için etkili bir yöntem sunar ve T3'e hormonal yanıtların değerlendirilmesi dahil fonksiyonel çalışmalar yapılmasını mümkün kılar.

Protokol, vahşi tip C57BL/6 farelerine düşük iyotlu diyet vererek ve içme suyunda methimazol (MMI) ve potasyum perklorat (_{KClO 4}) ile tiroid fonksiyonunu inhibe etmesiyle^{başlar 25}. Bu tedavi, bir hafta içinde önemli hipotiroidizmi indükler ve ön hipofizde Tshb ifade eden tirotropların popülasyonunu genişletir. Hipotiroid koşullarda TSH üreten hücreler, hiperplazi, hipertrofi, bol vakuolasyonlu sitoplazma, belirgin sitoplazmik süreçler ve büyümüş lizozomlar gibi önemli fizyolojik ve morfolojik adaptasyonlar geçirir; bu, TH geri beslemesinin yokluğuna uyum^{sağlamayı yansıtır} 26,27,28. Bu nedenle, hipotiroidizmin indüksiyonu, tirotip popülasyonunu genişletmek için bir strateji olarak kullanılabilir.

Hipotiroidizm indüksiyonunun ardından, fareler izofluran ile anestezi edilir ve doku ayrışması sırasında hücre canlılığını maksimize etmek için Ca²⁺/^{Mg 2+} serbest tuzlu su çözeltisi ile kardiyak perfüzyona maruz bırakılır. Hasattan sonra, ön hipofiz bezi nazik enzimatik sindirime uğrar ve tek hücreli süspansiyon oluşturulur ve bu süspansiyon fikoeritrin-siyanin 7-konjuge anti-CD90.2 antikoruyla inkubasyon edilir ve floresansla aktive hücre ayırma (FACS) ile tirotropları zenginleştirir. Etiketlenmiş hücreler daha sonra kısa süreli kültür için büyüme ortamına veya RNA ekstraksiyonu için TRIzol'e toplanır. Zenginleştirme stratejisini doğrulamak için, Tshb haberci RNA ekspresyonu, sıralanmış popülasyonlarda ölçüldü ve CD90-pozitif hücrelerde yüksek zenginleştirilmiş olduğu bulundu. Bu yöntem, gen ifade profilleme, transkriptomik ve epigenomik analizler, yüksek verimli testler ve birincil hücre kültürü gibi farelerde geniş bir sonraki uygulama yelpazesini destekler ve tirotrop fonksiyonu ile HPT ekseninin düzenlenmesinin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların incelenmesi için değerli bir platform sağlar.

Protokol

Bu protokol, en az 1 haftalık hipotiroidi indüksiyonu sonrası yetişkin farelerden alınan yeni disseksiye edilmiş hipofiz bezlerinin AL'den tirotropların izole edilmesini açıklar. Tüm hayvan prosedürleri, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kurumsal ve Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Teksas Üniversitesi Tıp Şubesi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi, tüm hayvan prosedürlerini onayladı.

Deneyler sırasında erkek ve dişi fareler bir arada toplandı çünkü tirop veriminde cinsiyete bağlı farklar veya sonraki analizlerde fark gözlemlenmedi. Her deney başına yaklaşık 12 fare kullanıldı, ancak 20 hayvana kadar büyük kohortlar tüm reaktif hacimlerinin orantılı ölçeklendirilmesiyle işlenebilir.

Başarılı izolasyon, hızlı ve tutarlı perfüzyone, minimum diseksiyon süresine, PL'nin tamamen çıkarılmasına ve birincil hücrelerin yüksek yoğunluklu kaplamasına bağlıdır. Ötenazi, perfüzyon, hipofiz diseksiyon ve enzimatik sindirimin başlatılması arasında önerilen maksimum işlem süresi 6 saat idi. Hücreler, 0,7^{cm 2} kuyuyuk başına 2,0–2,5 × 10⁵ hücre yoğunluğunda (8 kuyruklu bir cam odası kaydırağının bir kuyuğunun yüzey alanı) kaplandı. Kısa süreli tirotrop kültürünü desteklemek için minimum %95 canlılık gerekiyordu.

Tek hücreli süspansiyon üretimi için kullanılan tüm reaktifler steril koşullarda hazırlanmıştır. Çalışma yüzeyleri %70 etanol ile sterilize edildi, diseksiyon aletleri kullanımdan önce otoklavlandı ve tüm hücre kültürü hazırlık adımları aseptik teknikle bir biyogüvenlik kabinde gerçekleştirildi. Bu protokol 12 hayvan için standartlaştırılmıştı. Farklı sayıda fare kullanıldığında tüm reaktif hacimlerini orantılı olarak ölçeklendirin. Tüm reaktifler, tüketim malzemeleri ve ekipmanlar için Malzeme Tablosu'na bakınız.

Hipotiroidi indüksiyonunda, fareler 20°C–24°C ve %40–60 göreli nemde, 12 saat ışık/12 saat karanlık döngü ve yiyecek ile suya imkansız erişim ile belirli patojensiz koşullar altında barındırıldı. Hayvanlar, standart yatak ve çevresel zenginleştirme (yuva malzemesi ve barınak) içeren bireysel havalandırmalı kafeslerde (kafeste üç fareye kadar) grup halinde barındırıldı. Başarılı hipotiroidi indüksiyonu, hepatik iodotironin deiyodinaz (Dio1) ekspresyonunun ölçülmesiyle doğrulandı. Dio1 haberci RNA (mRNA) ekspresyonunda ötiroid kontrol farelerine göre en az %50 azalması, başarılı hipotiroidizm indüksiyonunun göstergesi olarak kabul edildi.

1. C57BL/6 farelerde hipotiroidizm indüksiyonu

NOT: Bu prosedürü 7–10 gün boyunca uygulayın; bu işlem in vivo olarak iyot eksikliği içeren bir diyet ve tiroid fonksiyonunun kimyasal inhibisyonu yoluyla hipotiroidi indüke etmek. Deneysel tasarım için Şekil 1A'ya ve hipotiroidi indüksiyonunun doğrulanması için Şekil 1B'ye bakınız.

Şekil 1. C57BL/6 farelerde hipotiroidi indüksiyonu. (A) Yetişkin C57BL/6 farelerinde hipotiroidi indüklemek için kullanılan deneysel iş akışının şematik temsili. Fareler, içme suyunda %0,05 metimazol (MMI) ve %0,1 potasyum perklorat (KClO₄) ile birlikte 7 gün boyunca iyot eksikliği içeren diyetle birlikte ön hipofiz izolasyonu aldılar. (B) Eutiroid ve hipotiroid farelerde hepatik Dio1 haberci ribonüklein asit (mRNA) ekspresyonunun ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) analizi. Referans gen olarak siklofilin A (CyA) kullanıldı. Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulur (n = 6 grup başında). İstatistiksel anlamlılık Öğrencinin t-testi kullanılarak belirlendi. **P < 0.001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

1. MMI/KClO₄ içme suyu hazırlayın
   1. 1 g MMI ve 2 g KClO₄'u 2 L filtrelenmiş suda çözün.
   2. Çözeltiyi oda sıcaklığında (20°C–25°C) 1 saat karıştırın ve tam çözünmesine kadar kullanın.
      DIKKAT: MMI ve KClO₄ tehlikeli kimyasallardır. Hazırlık ve kullanım sırasında eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruyucu takın.
      NOT: MMI iyod örgütlenmesini engellerken, KClO₄ sodyum–iyodid simporteri²⁵ aracılığıyla iyod alımını engeller. Doğru dozu korumak ve yatak, yiyecek kalıntıları ve mikrob büyümesinden kaynaklanan kontaminasyonu en aza indirmek için içme çözümünü her 2 günde bir değiştirin. Hemen kullanılmazsa, çözeltiyi sıkı kapalı ve ışığa dayanıklı bir kapta 4°C'de 14 güne kadar sakla.
2. Hipotiroidizmi indük etmek
   1. 8 haftalık erkek veya dişi C57BL/6 farelerini iyotsuz konut koşullarında kafeste üç hayvana kadar gruplar halinde evlendirin.
      NOT: Belirli patojensiz koşullarda, 20°C–24°C ve %40–60 göreli nemde, 12 saat ışık/12 saat karanlık döngü ve yiyecek ile suya imkansız erişim ile ev fareleri. Hayvanları, standart yatak ve çevresel zenginleştirme içeren bireysel havalandırmalı kafeslerde beslendirin; yuva malzemesi ve barınak dahil. Tedaviye başlamadan önce hayvanları 3 gün boyunca alıştırın. Ev erkek ve dişi fareler ayrı ayrı olur. Burada anlatılan deneyler için, ötiroid grubu ayrı kafeslerde bulunan altı erkek ve altı dişiden oluşuyordu; hipotiroid grubu ise ayrı kafeslerde bulunan altı erkek ve altı dişiden oluşuyordu. Hücre hazırlığı sırasında aynı tedavi grubundaki erkek ve dişi farelerden AL'leri topladı çünkü tirotip veriminde veya sonraki analizlerde cinsiyete bağlı farklar gözlemlenmedi.
   2. Fareleri 7–10 gün boyunca iyod eksikliği içeren bir diyetle besleyin.
      NOT: İyot eksikliği diyeti ve MMI/KClO₄ tedavisini aynı anda başlatın.
   3. Tedavi süresi boyunca %0,05 MMI ve %0,1 KClO₄ içeren içme suyu ima edin.
      NOT: Tedaviyi ötenazi süresince sürdürün. Hipotiroidi indüksiyonu boyunca vücut ağırlığını, gıda alımını, su alımını ve klinik belirtileri günlük olarak takip edin. Başarılı hipotiroidizm indüksiyonu genellikle vücut kilosunun azalması ve daha düşük aktivite veya donuk tüy gibi klinik belirtilerle ilişkilidir; eutiroid kontrollerine göre bu durum daha da azalır. Yedi günlük ve on günlük indüksiyon dönemleri, tiroripte zenginleştirme verimliliğinde benzer bir verimlilik sağlar.

2. Kardiyak perfüzyon ve AL diseksiyon

NOT: Bu prosedürü her fare başına yaklaşık 15 dakika içinde uygulayın; böylece hipofiz izolasyonu sırasında doku canlılığını en üst düzeye çıkarabilir ve hücre bütünlüğünü korur.

1. Perfüzyon ve toplama çözeltileri hazırlayın
   1. Ca²⁺ ve Mg²⁺ olmadan HEPES tamponlu tuzlu çözelti (HBSS) hazırlayın
      1. 667 mL %0,9 NaCl, 20 mL 1 M HEPES ve 313 mL çift damıtılmış su (ddH₂O) birleştirerek 1 L özel hazırlanmış HBSS Ca²⁺ ve^{Mg 2+} olmadan hazırlanır.
      2. Çözeltiyi otoklavla geçirin ve 4°C'de kullanana kadar saklayın.
   2. Ca²⁺ ve Mg²⁺ olmadan hepparinli HBSS hazırlayın
      1. 27 μL enoksaparin sodyum (100 mg/mL stok çözeltisi) 50 mL özel hazırlanmış HBSS'ye Ca²⁺ ve^{Mg 2+} olmadan ekleyin.
   3. Toplama ortamı (CM) hazırla
      1. 440 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamını, 50 mL ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumunu (FBS), 4 mM L-glutamin ve 10 mL 1 M HEPES'i birleştirerek nihai hacmi 500 mL elde edin.
      2. Çözeltiyi 0.22 μm filtre ile filtre sterilize edin ve 4°C'de 1 aya kadar saklayın.
         NOT: Saklamadan önce biyogüvenlik dolabının altında 50 mL aliquot hazırlayarak kontaminasyonu en aza indirin.
      3. Kullanımdan önce CM'yi 20°C–25°C'ye ısıtın.
   4. Disseksiyon aletlerini sterilize et
      1. Kullanmadan önce makas, penset, cımbız, iğne tutucuları, iris pensleri, cerrahi kaşıklar ve küt probları %75 etanol ile sterilize edin.
         NOT: Etanol sterilizasyonundan sonra doku temasından önce aletlerin tamamen hava kurumasına izin verin.
2. Kardiyak perfüzyon yapın
   1. Fareyi %100 oksijenle verilen izofluran ile derinlemesine anestezi yapın. Anesteziyi %5 izofluran içeren bir odada indük edin ve anestezi %3 isofluranlı burun konisi üzerinden sürekli izleme ve atık gaz temizleyerek sürdürün.
      DIKKAT: Kurumsal güvenlik yönergelerine uygun olarak izofloran anestezi prosedürleri uygulayın ve solunum maruziyetini en aza indirmek için uygun temizlik sistemleri kullanın.
   2. Pedal çekilme refleksinin yokluğunu parmak sıkıştırarak tam anestezi doğrulayın.
   3. Hayvana %75 etanol püskürtüp toplama tavasındaki perfüzyon aşamasına yerleştirin.
   4. Uzuvları sabitleyerek peritoneal bölgeyi açığa çıkarın.
   5. Torakal boşluğu dikkatlice açın ve büyük organlara ve kan damarlarına zarar vermeyin.
   6. Kaburgaları keserek göğüs kapağı oluşturun, kapağı başın üzerine katlayın ve hemostatla sabitleyin.
   7. Kalbi bir kelepçe ile stabilize edin ve sol ventrikülün zirvesine 23 kalibre bir iğne yerleştirin.
   8. İğneyi silikon boru kullanarak peristaltik pompaya bağlayın.
   9. Perfüzyona Ca²⁺ ve Mg²⁺ olmadan hepparinli HBSS ile başlayın, oda sıcaklığında tutulur.
   10. Perfüzyon başladıktan hemen sonra sağ atriumu keserek drenaj yapılmasına izin verin.
   11. Hayvanı 5 dakika boyunca 3 mL/dakika akış hızında perfüze edin.
       NOT: Karaciğerde görünür solgunluk gözlemleyerek başarılı perfüzyonu doğrulayın.
3. AL'yi izole et
   1. Perfüzyondan hemen sonra farenin kafasını kesin.
   2. Saç derisi ve kafatasısı kemiklerini, ince diseksiya makası ve forseps kullanarak beyni açığa çıkararak çıkarın.
   3. Beyin ile kafatası arasına cerrahi bir kaşığı yerleştirin.
   4. Beyni nazikçe kaldırın ve optik kiazmayı kesin.
   5. Hipofiz bezini kaplayan ince meningeal zarı (dura mater) ince cımbız kullanılarak stereomikroskop altında alın.
   6. PL'yi Şekil 2A'da gösterildiği gibi dikkatlice parçalayıp at.
      NOT: AL'yi rostral olarak konumlanan daha büyük pembe doku olarak tanımlayın. PL'yi, dorsal olarak konumlanan daha küçük beyaz-saydam doku olarak tanımlayın.
   7. AL'ye erişimi artırmak için çevre bağ dokusu ve kalıntı meningeal zarları kör bir probla kesin.
   8. AL'yi küt cımbızla tutun ve 1,8 mL CM içeren 15 mL polipropilen tüpe aktarın.
      NOT: 12 hayvandan AL'leri aynı toplama tüpüne biriktirin.
   9. Tüm diseksiyonlar tamamlanana kadar örneği oda sıcaklığında tutun.
      NOT: Hücre canlılığının kaybını en aza indirmek için doku toplama ile enzimatik sindirimin başlatılması arasında 3 saati geçmeyin.
4. Hipotiroidizm indüksiyonunu onaylayın
   1. Her fareden yaklaşık 50 mg küçük bir karaciğer örneği alın.
   2. Gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonuyla hepatik Dio1 mRNA ekspresyonunu nicelikle ölçün ve tedavi edilmemiş ötiroid kontrollerle karşılaştırın (Şekil 1B).
      NOT: Başarılı hipotiroidizm indüksiyonunu, hepatik Dio1 ekspresyonunda ötiroid kontrollerine göre en az %50 azalma olarak tanımlayın. Dio1 ekspresyonu, dolaşımdaki TH^{seviyeleri 29} ile pozitif korelasyonludur; bu nedenle, azaltılmış Dio1 ekspresyonu, başarılı hipotiroidi indüksiyonunu doğrular.
5. Tekrar doku toplama
   1. 2.2–2.4 adımlarını tekrarlayın. 12 fareden AL toplanana kadar.
   2. Hemen 3. Adıma geçin.

Şekil 2. Fare ön hipofizinden tek hücreli bir süspansiyon hazırlanması. (A) Ön lob (AL) diseksiyonu, enzimatik ayrıştırmayı ve floresansla aktive hücre ayırması (FACS) için tek hücreli süspansiyon hazırlanmasını gösteren iş akışı. İş akışı, arka lob çıkarılması, kollajenaz sindirimi, tripsin–etilendiamintetraasetik asit (EDTA) sindirimi ve FACS analizinden önce filtrasyonu içerir. (B) Ötiroid ve hipotiroid farelerden dissosiyasyon yapmış ön hipofiz hücrelerinin canlılık boyası boyama ve otomatik hücre sayımı ile ilgili temsil eden görüntüler. Toplam hücre verimi ve canlı hücre konsantrasyonu belirtilmiştir. Ölçek çubuğu = 200 μm. (C) Doku ayrışması ve aşağı akış FACS analizine hazırlık sonrası ön hipofiz hücre çaplarının dağılımı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. 

3. Fare AL'den tek hücreli bir süspansiyon hazırlanması

NOT: Bu işlemi yaklaşık 60 dakika içinde uygulayarak ön hipofiz dokusundan tek hücreli bir süspansiyon oluşturulur.

1. Enzimatik sindirim çözeltileri hazırlayın
   1. %2 kollagenaz çözeltisi hazırlayın
      1. Clostridium histolyticum'dan (>125 kollagenaz sindirim birimi/mg solid) 100 mg kollajenazı 4.9 mL ddH₂O içinde çöz.
      2. 100 μL 1 M HEPES ekleyerek 5 mL nihai hacmi elde edilir.
      3. Çözeltiyi 0.22 μm filtre ile sterilize edin.
      4. Çözeltiyi 200 μL hacimlere ayırın ve −30°C'de 2 aya kadar depolayın.
         NOT: Tekrarlayan donma–erime döngülerinden kaçının. Eritilmiş kollagenaz aliquotlarını tekrar kullanmayın.
   2. %0,25 tripsin–etilenediamintetraasetik asit (EDTA) hazırlayın
      1. 1 mL %0,5 tripsin–EDTA ile 1 mL HBSS ile Ca²⁺ ve Mg²⁺ olmadan karıştırın.
      2. Çözeltiyi 4°C'de kullanana kadar sakla.
         NOT: Hazırlık gününde seyreltilmiş tripsin–EDTA çözeltisi kullanın. Sulandırılmış tripsin–EDTA'yı saklamayın veya tekrar kullanmayın.
2. Kollajenaz sindirimi yapın
   1. Toplanan AL dokularına 200 μL %2 kollagenaz çözeltisi ekleyin.
   2. Dokuyu düşük tutma uçlarıyla takılmış bir P1000 mikropipetle pipetleyerek nazikçe karıştırın.
   3. Süspansiyonu 37°C su banyosunda 15 dakika kuluçka yapın.
      NOT: Tüp kapağını kuluçka sırasında kapalı tutun, böylece kontaminasyonu en aza indirin.
   4. İnkubasyon sırasında tüpü her 5 dakikada bir nazikçe vurun.
3. Deoksiribonükleaz I (DNaz I) sindirimi gerçekleştirin
   1. Süspansiyona doğrudan 5 μL DNaz I (1 U/μL) ekleyin, üstnatantı çıkarmadan.
   2. Çözeltiyi karıştırmak için tüpü 10 kez hafifçe vurun.
   3. Süspansiyonu 37°C'de 5 dakika kuluçka edin.
4. Dokuyu pellet
   1. Süspansiyonu oda sıcaklığında 100 × g boyunca 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
   2. Süpernatantı dikkatlice 1 mL pipet kullanarak çıkarın.
      NOT: Hücre kaybını en aza indirmek için süpernatant çıkarımı sırasında pelletin üzerinde yaklaşık 50 μL kalıntı sıvı bırakın.
5. Tripsin sindirimi yapın
   1. Pellete 2 mL %0,25 tripsin–EDTA ekleyin.
   2. Süspansiyonu 37°C'de 10–15 dakika boyunca kuluçka edin, görünür sağlam doku parçaları kalmayınca.
      NOT: Aşırı doku sindirimini önlemek ve hücre canlılığını azaltmak için 15 dakikayı geçmeyin.
6. Enzimatik sindirimi durdurun ve dokunun ayrıştırılması
   1. Tripsisasyonu durdurmak için 2 mL CM ekleyin.
   2. Süspansiyonu 1 mL'ye ayarlanmış mikropipet ile 10–20 kez nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin; görünür doku parçaları kalmayınca.
      NOT: Mekanik dissosiyasyon sırasında düşük tutma pipet uçları kullanın. Kabul edilebilir tek hücreli süspansiyon, ağırlıklı olarak tek hücreler içeren, minimal görünür agregalar veya kalıntılar (≤Trypan Blue hariç tutulmasıyla mikroskobik incelemede %%5–%10 kümeler) içeren uniform, düşük viskoziteli bir süspansiyondur.
7. Tek hücreli süspansiyonu topla
   1. Süspansiyonu oda sıcaklığında 100 × g boyunca 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
   2. Süpernatantı dikkatlice çıkarın.
   3. Hemen 4. Adıma geçin.
      NOT: Tek hücreli süspansiyon hazırladıktan sonra 15 dakika içinde boyamaya başlayın ve mümkün olduğunda hücre ayırtmasını 1 saat içinde tamamlayın. Bu aralıkta hücreleri buz üzerinde tutarak canlılık kaybını en aza indirin.

4. Floresansla aktive hücre sıralaması için boyama

NOT: Bu işlemi yaklaşık 60 dakika içinde gerçekleştirerek CD90-pozitif hücrelerin FACS için dissosiyasyon yapmış ön hipofiz hücrelerini boyandırın.

1. Hücre askısını hazırlayın
   1. Hücre pelletine %2 FBS ve %0,09 sodyum azid içeren fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS, 1×) 350 μL boyama tamponu ekleyin.
   2. Pelleti hafifçe yukarı ve aşağı pipetle, düşük tutma uçlarıyla donatılmış bir P1000 mikropipeti kullanarak nazikçe yeniden askıya alın ve böylece tek hücreli süspansiyon elde edin.
   3. Süspansiyonu 1.5 mL düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
2. Hücre konsantrasyonu ve yaşamlılığı belirleyin
   1. Hücre sayımı için askıdan 5 μL aliquot alın.
   2. Aliquot'u 5 μL canlılık boyası ile karıştırın.
   3. Karışımdan 10 μL otomatik hücre sayacına yükleyin.
      NOT: Hücre canlılığı %≥85 olduğunda ve minimum kalıntı ile hücre agregaları gözlemlendiğinde FACS'ye geçin.
   4. Toplam hücre konsantrasyonunun yaklaşık 1 × 10 7 hücre/mL ve hipotiroid örnekleri için 2 ×^{10 7} hücre/mL olduğunu doğrulayın (Şekil 2B). Dissosiyasyon sonrası hücre boyutu dağılımı Şekil 2C'de gösterilmiştir.
3. Tazminat kontrollerini hazırla
   1. Hücre süspansiyonundan 50 μL 300 μL boyama tamponuna aktarın.
   2. Süspansiyon, ayrı 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde üç 100 μL aliquot'a bölünür.
   3. Aşağıdaki kontrolleri hazırlayın: (i) lekesiz kontrol, (ii) sadece propidium iyodid (PI) kontrol ve (iii) fikoeritrin-siyanin 7 (PE-Cy7) CD90.2 ile ilgili kontrol.
4. Hücreleri boyamak
   1. 300 μL hücre süspansiyonuna 3 μL PE-Cy7 ile konjuge edilmiş anti-CD90.2 antikor ekleyin.
      NOT: Antikor konsantrasyonu önceki titrasyon deneyleriyle belirlendi. Son olarak 1:100 seyreltme, pozitif ve negatif popülasyonlar arasında optimal ayrım sağlarken arka plan boyamalarını en aza indirdi.
   2. CD90.2 kompensasyon kontrolüne 1 μL antikor ekleyerek 1:100 nihai seyreltme elde edilir.
   3. Tüm örnekleri karanlıkta buzun üzerinde 30 dakika kuluçka edin.
      NOT: Inkubasyon sırasında her 10 dakikada bir örnekleri nazikçe karıştırarak homojen boyama sağlanır.
5. Lekeli hücreleri yıkayın
   1. Her tüpe 1 mL soğuk boyama tamponu ekleyin.
   2. Örnekleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 210 × g santrifüjlendirin.
      NOT: Eğer mümkünse, hücre pelletinin yavaşlama sırasında bozulmasını en aza indirmek için santrifüj frenini devre dışı bırakın.
   3. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın.
6. Lekeli hücreleri yeniden süsle
   1. Ana hücre süspansiyonunu 300 μL boyama tamponunda yeniden askıya alın.
      NOT: Sıralamadan hemen önce PI'yi 1 μg/mL nihai konsantrasyona ekleyin.
   2. Her bir kompensasyon kontrolünü 100 μL boyama tamponunda yeniden askıya alın.
7. Hücre süspansiyonunu filtreleyin
   1. Hücre süspansiyonu, 35 μm hücre süzgeciyle donatılmış bir akış sitometri borusundan hemen önce filtreleyin.
8. Floresansla aktive hücre sıralamasına geçin
   1. Hemen 5. Adıma geçin ve lekelenmiş hücreleri floresansla aktive edilen hücre ayırıcı ile ayırın.

5. FACS kapı ve sıralama stratejisi

NOT: Bu işlemi yaklaşık 60 dakika içinde uygulayarak FACS ile canlı CD90.2-pozitif tirotropları izole et.

1. Hücre ayırıcısını yapılandırma
   1. Hücre ayırıcıya 100 μm bir nozul takın.
   2. Kılıf basıncını 20 psi'ye ayarlayın.
      NOT: Oda sıcaklığında tutulan steril PBS bazlı kılıf sıvısı kullanın.
2. Enstrüman kalite kontrolünü gerçekleştirin
   1. Numune toplamadan önce üreticinin talimatlarına göre enstrüman kalite kontrol prosedürlerini çalıştırın.
      NOT: Alternatif hücre ayırıcılarında üretici tarafından önerilen eşdeğer kalite kontrol iş akışları kullanılabilir.
   2. Düşüş gecikmesini ve akış stabilitesini kalibrasyon boncukları kullanarak doğrulayın.
3. Floresans telafisi yapın
   1. Tek renkli telafi kontrolleri edinin.
   2. Kapı kapatmadan ve ayırmadan önce floresan telafisi yapın.
      NOT: Tazminat hesaplama ile lekelenmemiş ve tek boyalı kontroller kullanın. Gerekirse sıralamadan önce tazminat matrislerini manuel olarak doğrulayın ve ayarlayın.
4. Kapı stratejisini tanımlayın
   1. Döküntüleri ileri saçılma ve yan saçılma parametreleri kullanılarak dışlayın (Şekil 3A,B).
   2. Kapı tek hücreleri, ileri saçma yüksekliği ile ileri saçılma alanı ve yan saçılma yüksekliği ile yan saçılma alanı ile karşılaştırın.
   3. Ölü hücreleri PI-negatif hücreleri kapatılarak dışlayın.
   4. Tirotip zenginleştirme için kapı CD90.2-pozitif hücreler.
      NOT: CD90.2-pozitif hücreleri, CD90 algılama kanalında 10^3'ten fazla floresan yoğunluğu gösteren olaylar olarak tanımlayın (Şekil 3C–F).
5. Toplama tüplerini hazırla
   1. Toplama tüplerini planlanan sonraki uygulamaya göre hazırlayın.
      NOT: Düşük tutma toplama tüplerini RNA izolasyonu için 1 mL QIAzol lizis reaktifi veya hücre kültürü uygulamaları için %10 kömürle soyulmuş fetal sığır serumu takviyesi Medium 199 ile önceden doldurun.
6. CD90.2-pozitif tirotropları sıralayın
   1. CD90.2-pozitif tek hücreleri toplama tüplerine ayırın.
   2. RNA analizi için hücreleri toplamak
      1. Hücreleri doğrudan 1 mL liz reaktifine toplayın.
      2. Hücreleri lizlemek için tüpleri 1 dakika girdabla tutun.
      3. Numuneleri hemen kuru buzda dondurun.
      4. Örnekleri −80°C'de saklayarak RNA çıkarımı yapılana kadar.
   3. Birincil kültür için hücreleri toplamak
      1. Hücreleri, %10 kömürle soyulmuş fetal sığır serumu ve %1 penisillin-streptomisin ile takviye edilmiş kültür ortamına toplayın.
      2. Hücreleri, en az 2 ×^{10 5} hücre/kuyu yoğunluğunda, nihai olarak 200 μL hacimde 8 delikli cam slaytlara tohumlayın.
      3. Hücreler, %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş kuluçka makinesinde 37°C'de 72 saate kadar kültürlenin.
         NOT: Kabul edilebilir kültür performansı, 24 saat içinde görünür hücre bağlanması, yaklaşık %60–%80 bağlanma etkinliği ve 72 saat sonra ≥%70–%80 canlılık ile gösterilir.
      4. Gerekirse kültür ortamına 100 nM T3 ekleyin.
         NOT: Hücre bağlanmasından sonra, genellikle kaplamadan 24 saat sonra T3 tedavisine başlayın ve 72 saat içinde numune toplanana kadar tedaviye devam edin. 40 mM NaOH'da T3 stok çözeltisi hazırlayın ve aynı nihai çözücü konsantrasyonunda araç ile işlenmiş kontroller ekleyin.
         NOT: Kömürle soyulmuş serum, TH eksik kültür ortamını korur ve deneysel olarak indüklenen T3'e bağımlı Tshb ekspresyonunun algısını iyileştirir.

Şekil 3. FACS kapı stratejisi ve tiroropep zenginleştirmesinin doğrulanması. (A,B) Canlı tek ön hipofiz hücrelerini izole etmek için kullanılan ardışık kapı taktikası. Kapılar arasında ileri saçılma alanı (FSC-A) ve yan saçılma alanı (SSC-A) kullanılarak döküntü dışlanması, ileri saçma yüksekliği (FSC-H) ile FSC-A ile yan saçılma yüksekliği (SSC-H) ile SSC-A arasındaki singlet ayrımcılığı ve propidium iyodid (PI)-pozitif ölü hücrelerin dışlanması yer alır. (C–F) Phycoerythrin-syanine 7 (PE-Cy7) ile konjuge edilmiş anti-CD90.2 antikoru kullanılarak CD90.2-pozitif ve CD90.2-negatif hücre popülasyonlarının tanımlanması ve zenginleştirilmesini gösteren temsilli FACS grafikleri. (G–I) Sıralanmış hücre popülasyonlarında tirotrop zenginleşmesinin ters transkripsiyon nicel polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) doğrulaması. Kısaltmalar: FSC-A, ileri saçma alanı; SSC-A, yan saçılma alanı; FSC-H, ileri saçma yüksekliği; SSC-H, yan saçılma yüksekliği; PI, propidium iyodid; PE-Cy7, fikoeritrin–siyanin 7; NT, tedavi edilmemiş. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

6. Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile CD90-pozitif ve CD90-negatif hücrelerde Tshb mRNA'nın gen ekspresyonu analizi

NOT: Bu işlemi yaklaşık 5 saat içinde yaparak sıralanmış hücre popülasyonlarında Tshb mRNA ifadesini nicelikle ölçebilirsiniz.

1. RNA çıkarımı için sıralanmış hücreleri topla
   1. CD90-pozitif ve CD90-negatif hücreleri (2,5 ×^10-5 hücre) 1,5 mL lizis reaktifi içeren ayrı 1,5 mL tüplere toplayın.
2. Hücreleri liz edin
   1. Örnekleri 1 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde girdabla hücreleri tamamen lizize edin ve örnekleri buz üzerine yerleştirin.
      NOT: Gerekirse RNA çıkarımından önce lizlenmiş örnekleri −80°C'de sakla.
3. Toplam RNA çıkar
   1. RNA çıkarma kitiyle birlikte verilen üretici talimatlarına göre toplam RNA çıkarın.
      NOT: Üreticinin talimatlarına uygun olarak, genomik deoksiribonukleik asit (DNA) çıkarılarak arıtma sırasında DNaz sindirimi yapılarak üreticinin talimatlarına uygun olarak DNaz sindirimi yapılarak elülasyondan önce kalıntı genomik deoksiribonukleik asit (DNA) alın.
   2. Spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu ölçün.
      NOT: Tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi için yaklaşık 1.8–2.1 A260/A280 oranına ve 1.8'den A260/A230 oranına sahip örnekler kullanın.
4. cDNA'yı sentezle
   1. Üreticinin talimatlarına göre 100 ng toplam RNA'dan cDNA'yı sentezleyin; birinci iplik cDNA sentez kitiyle birlikte sunulur.
      NOT: cDNA sentezi sırasında oligo(dT) primerleri kullanın.
   2. Şablon-astar karışımını Tablo 1'e göre hazırlayın.
   3. Reaktifleri nazikçe karıştırın ve tüpün dibindeki örneği toplamak için kısa bir süre santrifüj yapın.
   4. Şablon-astarlı karışımı 65°C'de 10 dakika boyunca denatüre edin.
   5. Numuneleri hemen buzda soğutun.
   6. Tablo 2'ye göre ters transkripsiyon reaksiyon karışımını hazırlayarak nihai hacmi 20 μL elde edin.
      NOT: Tablo 2'de listelenen reaktif hacimlerini toplam örnek sayısıyla çarparak ve pipetleme değişkenliğini hesaba katlamak için ek %10 fazla hacim ekleyerek ana karışım hazırlayın.
   7. Reaksiyonu girdap yapmadan nazikçe karıştırın ve kısa süreliğine santrifüj yapın.
   8. Reaksiyonu 50°C'de 60 dakika kuluçka yapın.
   9. Reaksiyonu 85°C'de 5 dakika boyunca inaktif hale getirin.
   10. Numuneleri buz üzerinde soğut.
   11. Doğrudan ters transkripsiyonlu niceliksel polimeraz zincir reaksiyonuna (RT-qPCR) geçin veya cDNA'yı −30°C'de depolayın.
       NOT: cDNA, nukleazsız koşullarda −30°C'de 6 aya kadar depolanabilir. Tekrarlayan donma–erime döngülerinden kaçının.
       NOT: Buharlaşmayı en aza indirmek için ısıtmalı kapaklı bir termosiklinde cDNA sentezi adımlarını gerçekleştirin.
5. RT-qPCR reaksiyon karışımını hazırlayın
   1. RT-qPCR reaksiyon karışımını Tablo 3'e göre hazırlayın.
6. RT-qPCR plakasını yükleyin
   1. 96 kuyruklu bir plakanın her kuyusuna 9 μL RT-qPCR reaksiyon karışımı ekleyin.
   2. 5 ng giriş toplam RNA'sından üretilen ters transkripsiyonlu ürüne karşılık gelen 1 μL cDNA şablonu ekleyin.
   3. Örnekleri nazikçe karıştırın ve kısa bir süre santrifüj yapın.
7. RT-qPCR gerçekleştir
   1. RT-qPCR'i, üreticinin SYBR Green master mix ile birlikte verilen talimatlarına göre gerçekleştirin.
      NOT: Başlangıçta 95°C denatürasyon adımını 2 dakika kullanın, ardından 5 saniye için 95°C ve 30 saniye için 60°C 40 döngü kullanın. Her uzatma adımının sonunda floresans edinin. Tek ürün amplifikasyonunu doğrulamak için 65°C'den 95°C'ye kadar 0,5°C aralıklarla erime eğrisi analizi yapın.
8. Tshb ifadesini normalleştirin
   1. Tshb ifadesini ΔCt yöntemiyle Cyclophilin A (CyA) ifadesine normalize edin.
      NOT: Deneysel gruplar arasında minimum CT varyasyonunu doğrulayarak analiz öncesi CyA stabilitesini doğrulayın.
9. Göreceli gen ifadesini hesaplayın
   1. CD90-pozitif hücrelerde CD90-negatif hücrelere göre göreceli Tshb ifadesini 2^−ΔΔCt yöntemiyle hesaplayın.
      NOT: Sekiz biyolojik örnek kullanılarak RT-qPCR analizi yapılacak ve her biri teknik tekrarlanmış reaksiyonlarda analiz edilmiştir (Şekil 3G–I).

Reaktif	Hacim	Nihai miktar/konsantrasyon
Toplam RNA	Değişken	100 ng
Anchored oligo(dT)18 primer (50 pmol/μL)	1 μL	2.5 μM
PCR dereceli su	Değişken	Toplam hacmi 13 μL olarak ayarlayın
Toplam	13 μL	—

Tablo 1: Tamamlayıcı dezoksiribonuklein asit sentezi için şablon–primer karışımı hazırlanması. Şablon-primer karışımını tamamlayıcı deoksiribonükleik asit (cDNA) sentezi için hazırlamak için kullanılan reaktifler, hacimler ve nihai miktarlar. Her reaksiyonda 100 ng toplam ribonüklein asit (RNA), sabitlenmiş oligo(dT)18 primer ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kalitesinde su içeren son hacmi 13 μL olarak ayarlanmıştır. Bildirilen 2,5 μM konsantrasyonu, ters transkripsiyon reaksiyonu bileşenlerinin eklenmesinden önce 13 μL şablon-primer karışımındaki primer konsantrasyonuna atıfta bulunur.

Reaktif	Hacim	Nihai miktar/konsantrasyon
Transkriptotör Ters Transkriptaz Reaksiyon Tamponu (5×)	4 μL	1×
Koruyucu RNaz İnhibitörü (40 U/μL)	0.5 μL	20 U
Deoksinükleotid karışımı (her biri 10 mM)	2 μL	Her biri 1 mM
Transkriptotör Ters Transkriptaz (20 U/μL)	0.5 μL	10 U
Şablon–astar karışımı (Tablo 1)	13 μL	—
Toplam	20 μL	—

Tablo 2: Tamamlayıcı deoksiribonuklein asit sentezi için ters transkripsiyon reaksiyonu karışımı. Birinci iplik tamamlayıcı deoksiribonükleik asit (cDNA) sentezi için kullanılan reaktifler, hacimler ve nihai konsantrasyonlar. Son reaksiyon hacmi 20 μL idi. Bildirilen deoksinükleotid trifosfat konsantrasyonları (her biri 1 mM), tam reaksiyon karışımındaki nihai konsantrasyonları ifade eder.

Reaktif	Hacim	Nihai miktar/konsantrasyon
PowerTrack SYBR Yeşil Ana Miks (2×)	5 μL	1×
Tshb ileri ve geri oligonukleotid primerler (bkz. Malzemeler Tablosu)	0.5 μL	400 nM
PCR dereceli su	3.5 μL	9 μL reaksiyon hacmine ayarlanır
Alt toplam reaksiyon hacmi	9 μL	—
cDNA şablonu	1 μL	5 ng
Son reaksiyon hacmi	10 μL	—

Tablo 3: Ters transkripsiyon niceliksel polimeraz zincir reaksiyon reaksiyonu karışımı hazırlanması. Tshb haberci ribonüklein asidin (mRNA) ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) amplifikasyonu için kullanılan reaktifler, hacimler ve nihai konsantrasyonlar. Şablon eklenmeden önceki reaksiyon karışımı hacmi 9 μL idi. Amplifikasyondan hemen önce 1 μL tamamlayıcı deoksiribonüklein asit (cDNA) şablonu ekleyerek nihai reaksiyon hacmi 10 μL elde edilir.

Sonuçlar

On iki 8 haftalık C57BL/6 faresi (6 erkek ve 6 dişi) hipotiroidizmi indüklemek için içme suyunda MMI ve KClO₄ ile birlikte iyot eksikliği içeren bir diyetle 1 hafta tedavi edildi (Şekil 1A). Hepatik tip 1 Dio1 mRNA ekspresyonu, başarılı hipotiroidi indüksiyonunu doğrulamak için ötiroid ve hipotiroid farelerde^{nicelendirilmiştir 29}. Hipotiroid fareler, ötiroid kontrollere kıyasla karaciğer Dio1 mRNA ekspresyonunda yakl...

Tartışma

Burada açıklanan CD90 tabanlı FACS protokolü, yetişkin fare hipofiz dokusundan primer tirotropları zenginleştirmek için hormonal yanıt vermeyi korurken tekrarlanabilir bir yöntem sunar. Bu yöntem, tirotipp biyolojisi ve HPT ekseni düzenlemesinin incelenmesinde uzun süredir devam eden teknik sınırlamayı ele almaktadır. Tarihsel olarak, tirotipt düzenlemesi üzerine yapılan araştırmalar büyük ölçüde TαT1 hücre hattına dayanmıştır; ancak TαT1 hücreleri çok düşük bazal Tshb ekspresyo...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.22 µm filtre	Corning	430769	Koleksiyon ortam sterilizasyonu için
0.22 µm şırınga filtresi	Pall Life Sciences	PN4602	Kollagenaz sterilizasyonu için
0.5% Tripsin–EDTA	Gibco	15400-054	Hücre disosiyasyonu için
1.5 mL düşük bağlanma mikrosantrifüj tüpleri	Invitrogen	AM12450	FACS boyama için
15 mL polipropilen tüpler	Falcon	352097	Anterior lob koleksiyonu ve hücre disosiyasyonu için
23 gauge iğne	BD Vacutainer Safety-Lok	367283	Kardiyak perfüzyon için
8 kuyu cam hazne slaytı	Millipore	PEZGS0816	Post-FACS kültürü için
Accudrop boncuklar	BD Biosciences	345249	FACS sırasında damla gecikme kalibrasyonu için
Anti-fare PE-Cy7 anti-CD90.2 antikoru	Invitrogen	25-0902-82	FACS boyama için
Otomatik hücre sayacı	DeNovix	s-10700	Hücre sayımı için
Karbonla arındırılmış fetal boğa serumu	Gibco	12676029	Post-FACS tirotrop kültürü için
Clostridium histolyticum'dan kollajenaz	Sigma-Aldrich	C9263	Hücre disosiyasyonu için
Koleksiyon pan	Standart laboratuvar diseksiyon tepsisi	N/A	Kardiyak perfüzyon için
Ca2+ ve Mg2+ içermeyen özel hazırlanmış HEPES tamponlu salin çözeltisi (HBSS)	N/A	N/A	Perfüzyon ve hücre disosiyasyonu için
Siklofilin A (CyA) oligonükleotid primeri ileriye	Integrated DNA Technologies	5′-GCC GAT GAC GAG CCC TTG-3′	RT-qPCR için
Siklofilin A (CyA) oligonükleotid primeri geri	Integrated DNA Technologies	5′-TGC CGC CAG TCG CAT TAT-3′	RT-qPCR için
DMEM, 1×	Gibco	11965-092	Koleksiyon ortamı için
DNase I çözeltisi	Promega	M6101	Hücre disosiyasyonu için
Enoksaparin sodyum enjeksiyonu	Sandoz	0781-3119-64	Perfüzyon için
Fetal boğa serumu (FBS)	Cytiva HyClone	SH30088.02HI	Koleksiyon ortamı için
Akış sitometri boyama tamponu	Invitrogen	00-4222-26	FACS boyama için
Hemostat	Fine Science Tools	13008-12	Torasik kavite stabilizasyonu için
HEPES, 1 M	Gibco	15630-080	Koleksiyon ortamı için
HEPES, 1 M	Teknova	H1035	HBSS hazırlanması için
İyot eksikliği diyeti	Envigo	TD.95007	In vivo hipotiroidizm indüksiyonu için
Iris forseps	Fine Science Tools	11065-07	Hipofiz diseksiyonu için
İzofluran	Piramal Critical Care	66794-017-25	Anestezi için
L-glutamin	Gibco	35050-061	Koleksiyon ortamı için
Ortam 199	Gibco	11150-059	Post-FACS kültürü için
Metimazöl (MMI)	Sigma-Aldrich	M8506-100G	In vivo hipotiroidizm indüksiyonu için
MicroAmp Hızlı 96 kuyu reaksiyon plakası	Applied Biosystems	4346907	RT-qPCR için
Penisilin–Streptomisin	Gibco	15140122	Post-FACS kültürü için
Peristaltik pompa	Fisher Scientific	GP1000	Kardiyak perfüzyon için
Potasyum perklorat (KClO4)	Sigma-Aldrich	241830-500G	In vivo hipotiroidizm indüksiyonu için
PowerTrack SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A46109	RT-qPCR için
Propidyum iyodür	eBioscience	00-6990-50	FACS sırasında canlılık boyama için
QIAzol lizis reaktifi	Qiagen	79306	RNA ekstraksiyonu için
Silikon tüp	Cole-Parmer	EW-96410-13	Kardiyak perfüzyon için
Stereomikroskop	Nikon	SMZ-745T	Anterior lob diseksiyonu için
StepOnePlus Gerçek Zamanlı PCR Sistemi	Applied Biosystems	4376600	RT-qPCR için
Cerrahi kaşık	Fine Science Tools	10090-13	Hipofiz maruziyeti sırasında beyin kaldırma için
Transcriptor İlk Strand cDNA Sentez Kiti	Roche	4379012001	CDNA hazırlığı için
Trypan Mavi	Thermo Fisher Scientific	T10282	Hücre sayımı için
Tshb oligonükleotid primeri ileriye	Integrated DNA Technologies	5′-TCT GTG CTG GGT ATT GTA TGA C-3′	RT-qPCR için
Tshb oligonükleotid primeri geri	Integrated DNA Technologies	5′-GCG GCT TGG TCG AGT AGT TG-3′	RT-qPCR için
Su banyosu	Fisher Scientific Isotemp Su Banyosu	15-462-5Q	Enzimatik sindirim için