Kolorektal Kanserle İlişkili miR-192-5p'nin Klinik Önemi, İmmün İnfiltrasyon Manzarası ve Fonksiyonel Ağ Analizi

Özet

Bu çalışma, kolorektal kanserde miR-192-5p'yi değerlendirmek için halka açık veri setlerini, eşleştirilmiş doku doğrulamasını, hücre göçü deneylerini, hedef ağ tahminini ve immün imza analizini entegre etmektedir. Bulgular, TCGA/GDC ekspresyon verileri ile yerel qRT-PCR sonuçları arasındaki uyumsuzluğu vurgulamakta ve miR-192-5p'nin tanısal, prognostik, fonksiyonel ve immünlikle ilgili öneminin aşırı yorumlanmaması gerektiği konusunda uyarıda bulunmaktadır.

Özet

Kolorektal kanser (KRK), mikroRNA'ların tümör progresyonuna ve biyobelirteç keşfine katkıda bulunabildiği heterojen bir malignitedir. Bu çalışma; TCGA/GDC ve GEO biyoinformatik analizleri, eşleşmiş doku qRT-PCR doğrulaması, hedef tahmini, immün imza analizi ve HT29 yara iyileşmesi deneylerini entegre ederek miR-192-5p'nin KRK'deki klinik önemini, immün ilişkilerini ve fonksiyonel ağını değerlendirmiştir. TCGA/GDC miRNA-seq verilerinin yeniden analizi 616 tümör ve 11 normal COADREAD örneğini kapsamış ve tümör örneklerinde veritabanı düzeyinde hsa-mir-192 sinyalinin normal örneklere göre daha yüksek olduğunu göstermiştir (Mann-Whitney p = 9.96 x 10^-8). Benzer eğilim 11 eşleşmiş TCGA vakasında da gözlemlenmişken (medyan tümör-normal farkı = 3.13 log2[RPM + 1], Wilcoxon p = 0.0029), eşleşmiş klinik dokularda yapılan yerel qRT-PCR, KRK dokularında olgun miR-192-5p ekspresyonunun daha düşük olduğunu desteklemiştir. TCGA tabanlı ROC analizi güçlü bir tümör-normal ayrımı göstermiş, ancak dengeli yeniden örnekleme ve bir-normali-dışarıda-bırakma analizleri, normal örnek sayısının sınırlı olması nedeniyle bu sonucun dikkatli yorumlanması gerektiğini doğrulamıştır. Klinikopatolojik analiz, TCGA kohortunda N evresi ve yaş ile ilişkiler olduğunu öne sürmüş; ancak özet tabloda T evresi ve M evresi anlamlı bulunmamış ve genel sağkalım analizi anlamlı bir prognostik ilişki göstermemiştir. TCGA RNA-seq kullanılarak yapılan aday hub-gen analizleri keşifsel ekspresyon, korelasyon ve sağkalım kanıtları sağlamış ancak doğrudan miR-192-5p hedeflemesini ortaya koymamıştır. İmmün imza analizi heterojen ve çoğunlukla zayıf korelasyonlar göstermiştir. Fonksiyonel olarak, miR-192-5p mimik transfeksiyona HT29 yara kapanması azalmıştır. Bu bulgular, miR-192-5p'nin KRK ile biyolojik olarak ilişkili olduğunu, ancak ekspresyon yönünün ve klinik yorumunun platforma bağlı olduğunu ve daha fazla deneysel doğrulama gerektirdiğini göstermektedir.

Giriş

Kolorektal kanser (KRK), dünya genelinde en yaygın malignitelerden biridir ve kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenleri arasında yer almaya devam etmektedir^1,2. Kolonoskopi, dışkıda immünokimyasal testler, SEPT9 metilasyon testi, dolaşan tümör belirteçleri ve moleküler profilleme, KRK tespitini ve klinik yönetimi iyileştirmiş olsa da^3,4, tümör biyolojisinde, tedavi yanıtında ve hasta sonuçlarında önemli bir heterojenlik sürmektedir^5,6,7. Bu nedenle, KRK biyolojisinin karakterize edilmesine yardımcı olan biyobelirteçler, risk stratifikasyonuna ve daha bireyselleştirilmiş terapötik stratejilerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir⁸.

MikroRNA'lar (miRNA'lar), yaklaşık 19–24 nükleotit uzunluğunda olan ve gen ekspresyonunu temel olarak post-transkripsiyonel mekanizmalar aracılığıyla düzenleyen küçük kodlama yapmayan RNA'lardır⁹. miRNA ekspresyonundaki düzensizlikler; kanser hücresi proliferasyonunu, migrasyonunu, invazyonunu, apoptozunu, immün etkileşimleri ve tedavi yanıtını etkileyebilir¹⁰. miR-192-5p'nin farklı hastalıklar ve kanserlerde, doku tipine, moleküler arka plana ve deneysel sisteme bağlı olarak onkogenik veya tümör baskılayıcı ilişkilerle, bağlama bağımlı bir şekilde hareket ettiği bildirilmiştir^{11,12,13,14,15,16}. CRC'de önceki çalışmalar, klinik örneklerde değişmiş miRNA profilleri ve kolon kanseri hücrelerinde malign fenotiplerin fonksiyonel düzenlemesini bildirmiştir^12,14,15. Ancak, genel veri tabanı analizleri her zaman aynı ekspresyon yönünü göstermeyebilir; miR-192-5p'nin CRC'deki klinik önemi, hedef ağı ve immün ilişkileri dikkatli bir değerlendirme gerektirmektedir.

Bu çalışma, TCGA/GDC ve GEO biyoinformatik analizleri, eşleşmiş klinik dokularda qRT-PCR doğrulaması, in vitro migrasyon deneyleri, aday hedef gen öngörüsü, yol zenginleştirme ve immün imza korelasyon analizlerini entegre ederek CRC'de miR-192-5p'yi değerlendirmiştir. Çalışma, olgun miR-192-5p'nin CRC dokularında düşük eksprese edilebileceği ve tümör baskılayıcı bir etki gösterebileceği hipotezine dayanmaktadır. Yeniden analiz edilen TCGA/GDC miRNA-seq sinyali karşıt bir ekspresyon yönü gösterdiğinden, sonuçlar tek bir kesin ekspresyon paterninden ziyade keşifsel ve platforma bağımlı olarak yorumlanmıştır.

Protokol

Bu çalışma, Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak yürütülmüştür. Onay, 21 Ekim 2021 tarihinde İç Moğolistan Tıp Üniversitesi Etik Kurulu tarafından verilmiştir. Çalışmaya dahil edilen tüm katılımcılardan yazılı bilgilendirilmiş onam alınmıştır.

Klinik numune toplama

Aralık 2017 ve Şubat 2020 tarihleri arasında radikal rezeksiyon uygulanan 45 hastadan eşleştirilmiş CRC ve komşu kanserli olmayan dokular toplandı. Hastaların hiçbiri preoperatif radyoterapi veya kemoterapi almadı ve diğer maligniteleri olan hastalar çalışma dışı bırakıldı. Komşu kanserli olmayan dokular, tümör sınırından en az 5 cm uzaklıktan toplandı. Örnekler, cerrahi olarak çıkarıldıktan hemen sonra donduruldu ve RNA ekstraksiyonuna kadar sıvı azot içerisinde saklandı. Kohort, 27 erkek ve 18 kadın hastayı içermekteydi; 13 hasta 60 yaşın altında, 32 hasta ise 60 yaş ve üzerindeydi. Klinikopatolojik değişkenler arasında tümör çapı, TNM evresi, diferansiyasyon, vasküler tümör trombusu, lenf nodu metastazı ve preoperatif CEA seviyesi yer aldı.

Kamuya açık veri toplama ve ön işleme

TCGA-COAD ve TCGA-READ için açık erişimli miRNA-seq, RNA-seq ve klinik veriler Genomic Data Commons portalından elde edilmiştir. Primer tümörler ve normal solid doku örnekleri, GDC örnek tipine göre belirlenmiştir. Metastatik ve tekrarlayan tümör örnekleri, tümör-normal diferansiyel ekspresyon analizinden hariç tutulmuştur. TCGA miRNA-seq dosyaları için bu analizde tespit edilen veri tabanı düzeyi girdi hsa-mir-192 olmuştur; ekspresyon değerleri, RPM'nin milyon başına eşleşmiş miRNA okumalarını belirttiği log2(RPM + 1) şeklinde analiz edilmiştir. Eşleşmiş örneklerin mevcut olduğu durumlarda hem eşleşmemiş hem de eşleşmiş tümör-normal analizleri gerçekleştirilmiştir. Aday hedef gen taraması için GSE89076 ve GSE156355 GEO veri setleri kullanılmıştır. GEO'dan elde edilen diferansiyel eksprese genler, düzeltilmiş p < 0,05 ve mutlak log2 kat değişimi ≥ 2 kriterleri kullanılarak taranmıştır. Veri seti isimleri, makale boyunca tutarlılık açısından kontrol edilmiştir.

Tanısal, klinikopatolojik ve sağkalım analizleri

TCGA-COAD, TCGA-READ ve birleştirilmiş COADREAD kohortunda keşifsel tümör-normal ayrımını değerlendirmek için Alıcı İşletim Karakteristiği (ROC) analizi kullanılmıştır. Normal örnek sayısı az olduğu için, 5.000 iterasyonlu dengeli tümör-normal yeniden örnekleme ve bir-normal-örnek-çıkarma analizi dahil olmak üzere ek duyarlılık analizleri gerçekleştirilmiştir. Klinikopatolojik ilişki analizleri için, primer tümör örnekleri medyan TCGA miR-192 ekspresyon seviyesine göre yüksek ve düşük ekspresyon gruplarına ayrılmıştır. Örneklem büyüklüğünün izin verdiği durumlarda analizler, birleştirilmiş COADREAD kohortu için ve COAD ile READ için ayrı ayrı tekrarlanmıştır. Genel sağkalım, log-rank testi ve tek değişkenli Cox regresyonu ile birlikte Kaplan-Meier analizi kullanılarak değerlendirilmiştir. Prognostik sonuçların abartılmasını önlemek için tanısal, klinikopatolojik ve sağkalım analizleri ayrı ayrı raporlanmıştır.

Aday hedef-gen ve merkez-gen (hub-gene) analizleri

Aday hedef genler, miRWalk tahmini ile GSE89076 ve GSE156355'ten elde edilen diferansiyel olarak ifade edilen genlerin entegre edilmesiyle belirlenmiştir. Bu üç kaynak arasındaki örtüşme, sonraki keşifsel analizler için saklanmıştır. STRING kullanılarak bir protein-protein etkileşim ağı oluşturulmuş ve Cytoscape tabanlı cytoHubba ve MCODE analizleri kullanılarak düğüm derecesi ve modül bağlantısına göre hub genler seçilmiştir. Elde edilen hub genler (KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1, CDK1, PLP1, NRXN1, GRIK3 ve KIF5C), TCGA RNA-seq verileri kullanılarak daha detaylı değerlendirilmiştir. Tümör-normal ekspresyon farkları, TCGA miR-192 ekspresyonu ile Spearman korelasyonları ve genel sağkalım ilişkileri, ek keşifsel analizler olarak özetlenmiştir. Bu genler yalnızca aday hedefler olarak değerlendirilmiştir; biyoinformatik verilerden herhangi bir doğrudan bağlanma, kurtarma etkisi veya alt protein düzeyinde regülasyon çıkarımı yapılmamıştır.

GO ve KEGG zenginleştirme analizi

Aday gen seti ve anlamlı ağ modülleri için Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Gen ve Genom Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizleri gerçekleştirilmiştir. GO terimleri; biyolojik süreç, hücresel bileşen ve moleküler fonksiyon kategorileri altında gruplandırılmıştır. p < 0.05 olan zenginleştirme sonuçları istatistiksel olarak dikkate değer kabul edilmiş ve deneysel olarak doğrulanmış mekanizmalardan ziyade hipotez üretici yolak sinyalleri olarak yorumlanmıştır.

RNA ekstraksiyonu ve qRT-PCR analizi

Toplam RNA, üreticinin protokolüne uygun olarak TRIzol reaktifi kullanılarak 45 çift CRC ve komşuluktaki kanserli olmayan doku örneğinden ekstrakte edildi. RNA saflığı ve konsantrasyonu spektrofotometrik olarak değerlendirildi ve A₂₆₀/A₂₈₀ değerleri 1.8 ile 2.1 arasında olan örnekler ters transkripsiyon için kullanıldı. qRT-PCR, TransGen Biotech marka bir miRNA ters transkripsiyon sistemi ve SYBR Green tabanlı miRNA qPCR reaktifleri kullanılarak gerçekleştirildi. Ters transkripsiyon ve qPCR amplifikasyonu, reaktif üreticisinin talimatlarına göre yapıldı. Her bir qRT-PCR reaksiyonu teknik olarak üçte bir oranında (triplikle) çalıştırıldı. RNU6B internal referans olarak kullanıldı. miR-192-5p primerleri 5'-GGGGCTGACCTATGAATTGA-3' (ileri) ve 5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3' (geri) şeklindeydi. RNU6B primerleri 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' (ileri) ve 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3' (geri) şeklindeydi. qPCR platformu desteklediğinde, amplifikasyon spesifikliğini değerlendirmek için erime eğrisi (melt-curve) analizi kullanıldı. Göreceli ekspresyon, 2^-ΔΔCt yöntemi kullanılarak hesaplandı. Eşleşmiş tümör ve komşu doku sonuçları, eşleşmiş klinik ölçümler olarak analiz edildi.

Hücre kültürü ve transfeksiyon

İnsan CRC hücre hattı HT29, yazarların laboratuvar hücre stokundan temin edilmiş olup kimliği doğrulanmış ve mikoplazma kontaminasyonu içermediği onaylanmıştır. HT29 hücreleri, %10 fetal bovine serum, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile takviye edilmiş McCoy's 5A ortamında, 37 ^oC sıcaklıkta ve %5 CO₂ atmosferinde kültüre edilmiştir. Hücreler yaklaşık %80 konfluense ulaştıklarında pasajlanmıştır. miR-192-5p mimikleri ve negatif kontrol oligonükleotid con238, Sangon Biotech'ten (Şanghay, Çin) satın alınmış ve geçici transfeksiyon için kullanılmıştır. HT29 hücreleri 6 kuyucuklu plakalara ekilmiş ve hücre yoğunluğu yaklaşık %20–30'a ulaştığında, 50 nM final oligonükleotid konsantrasyonu ve reaktif üreticisinin talimatlarına göre uygulanan lipid tabanlı bir transfeksiyon protokolü kullanılarak transfekte edilmiştir. Tam reaktif-oligonükleotid oranı ve reaktif miktarı, yazarların laboratuvar kayıtlarında kullanılan üretici tarafından önerilen protokol takip edilerek belirlenmiştir. Hücreler, standart kültür koşulları altında transfeksiyon kompleksleri ile inkübe edilmiş ve transfeksiyon sonrası görüntüleme ile yara iyileşme analizleri deneysel takvime uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Mevcut çalışmaya yalnızca HT29 hücre verileri dahil edilmiştir.

Yara iyileşme deneyi

Transfekte edilmiş HT29 hücreleri 6 kuyucuklu plaklara ekilmiş ve konfluent bir monolayer oluşana kadar kültüre edilmişlerdir. Steril bir 200 µL pipet ucu kullanılarak doğrusal bir çizik oluşturulmuş ve ayrılan hücreler PBS ile yıkanarak uzaklaştırılmıştır. Migrasyon değerlendirmesi sırasında proliferasyonla ilişkili etkileri azaltmak için besiyeri, serumsuz besiyeri ile değiştirilmiştir. Yara görüntüleri 0 sa, 24 sa ve 48 sa zaman noktalarında yakalanmıştır. Yara iyileşmesi analizi, üç bağımsız biyolojik replikatta gerçekleştirilmiş ve her grup ile zaman noktası için birden fazla mikroskobik alan ölçülmüştür. Yara genişliği, görüntü analiz yazılımı kullanılarak mikroskopi görüntülerinden nicelleştirilmiştir; orijinal ölçümler için kullanılan kesin yazılım sürümü kaynak kayıtlarda mevcut değildir. Yara iyileşme hızı, [(0 sa'daki yara genişliği - belirtilen zaman noktasındaki yara genişliği) / 0 sa'daki yara genişliği] x 100% şeklinde hesaplanmıştır. Mevcut taslak veriler ayrı bir proliferasyon kontrol deneyi içermediğinden, yara iyileşmesi sonuçları migrasyonla ilişkili olarak yorumlanmış ancak proliferasyon etkileri tamamen dışlanmamıştır.

İmmün imza korelasyon analizi

TCGA miR-192 ekspresyonu ile immün ilişkili imzalar arasındaki ilişki, primer tümör RNA-seq verileri kullanılarak yeniden değerlendirilmiştir. İmza-skor korelasyon analizine, eşleşmiş miRNA ve RNA-seq verilerine sahip toplam 425 tümör örneği dahil edilmiştir. Yanlış keşif oranı (FDR) düzeltmesi sonrası miR-192 ekspresyonunun; Tfh hücreleri (rho = -0.205, FDR = 0.00049), aktive dendritik hücreler (rho = -0.186, FDR = 0.00098), Treg hücreleri (rho = -0.185, FDR = 0.00098), plazmasitoid dendritik hücreler (rho = -0.169, FDR = 0.0027) ve makrofajlar (rho = -0.149, FDR = 0.0092) dahil olmak üzere birkaç immün imza ile istatistiksel olarak anlamlı ancak zayıf negatif korelasyonlar gösterdiği görülmüştür. Pozitif korelasyonlar temel olarak eozinofil (rho = 0.139, FDR = 0.0155) ve Th17 hücresi imzaları (rho = 0.121, FDR = 0.0296) için gözlemlenmiştir. Bu bulgular, tek tip bir pozitif immün infiltrasyon paterninden ziyade, heterojen ve genellikle zayıf immün ilişkiler olduğunu göstermektedir.

İstatistiksel analiz

İstatistiksel analizler GraphPad Prism 9.0, SPSS 25.0 ve R yazılımı 3.6.3 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sürekli değişkenler, uygun olduğu şekilde ortalama ± standart sapma veya medyan ile çeyrekler arası aralık olarak özetlenmiştir. Tümör ve komşu doku örnekleri eşleştirildiğinde, eşleştirilmiş doku karşılaştırmaları eşleştirilmiş testler kullanılarak analiz edilmiştir. Normallik varsayımları karşılanmadığında nonparametrik testler kullanılmıştır. Keşifsel diyagnostik ayrım için ROC eğrileri, dengeli yeniden örnekleme ve leave-one-normal-out analizi kullanılmıştır; kategorik klinikopatolojik ilişkiler için Ki-kare testleri; sağkalım analizleri için log-rank ve Cox modelleri; immün ve hub-gen analizleri için ise Spearman korelasyonu kullanılmıştır. İki yönlü p < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiş olup, immün imza korelasyonları için yanlış keşif oranı düzeltmesi bildirilmiştir.

Sonuçlar

Kamu veri setlerinde ve eşleştirilmiş klinik dokularda ekspresyon analizi

miR-192'nin ekspresyon paterni, GDC kaynaklı TCGA-COAD ve TCGA-READ miRNA-seq verileri kullanılarak yeniden değerlendirilmiştir (Şekil 1). Bu dosyalarda, veri tabanı düzeyindeki giriş doğrudan olgun hsa-miR-192-5p türü yerine hsa-mir-192 olarak tanımlanmıştır; bu nedenle, bu genel veri tabanı sonucu bir TCGA miR-192 sinyali olarak yorumlanmıştır. Birleştirilmiş COADREAD kohortunda, 616 primer tümör ve 11 solid doku normal örneği analiz edilmiştir. Tümör örnekleri, normal örneklerden daha yüksek miR-192 ekspresyonu göstermiştir (medyan 16.05'e karşı 13.46 log2[RPM + 1], Mann-Whitney p = 9.96 x 10^-8). Aynı yüksek tümör yönelimi, tek başına COAD'da (455 tümör ve 8 normal örnek, p = 9.89 x 10^-8) ve tek başına READ'da (161 tümör ve 3 normal örnek, p = 1.94 x 10^-5) gözlemlenmiştir. Eşleştirilmiş TCGA analizi de 11 eşleşmiş vakada daha yüksek tümör ekspresyonu göstermiştir (medyan tümör-normal farkı = 3.13 log2[RPM + 1], Wilcoxon p = 0.0029). Bu sonuçlar, CRC dokularında azalmış olgun miR-192-5p ekspresyonunu destekleyen yerel eşleştirilmiş qRT-PCR sonucuyla uyumsuz kalmaya devam etmiştir (Şekil 2).

Tanısal performans ve klinikopatolojik ilişkiler

TCGA tabanlı ROC analizi, yukarıda açıklanan tümör ve normal örnekler arasındaki ayrım tanımı kullanılarak tekrarlanmıştır (Şekil 3). AUC değeri birleşik COADREAD kohortu için 0,968, yalnızca COAD için 0,947 ve yalnızca READ için 0,994 olarak bulunmuştur. Ek dengeli yeniden örnekleme sonucunda medyan AUC değerleri COADREAD için 0,983, COAD için 0,984 ve READ için 1,000 olarak elde edilmiştir; ancak 95% güven aralıkları COADREAD (0,868–1,000) ve COAD (0,781–1,000) için geniş çıkmış ve READ grubu yalnızca üç normal örnek içermiştir. Biri-dışarıda-bırakılarak yapılan normal analiz, ROC tahmininin küçük normal gruba karşı duyarlı olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, ROC sonucu klinik bir diyagnostik biyobelirteç için yeterli kanıt olarak değil, yalnızca tümör-normal ayrımının keşifsel bir kanıtı olarak tutulmuştur. Medyan TCGA miR-192 ekspresyonuna dayalı klinikopatolojik ilişki analizi, N evresi (p = 0,019) ve yaş (p = 0,004) ile anlamlı ilişkiler gösterirken, T evresi (p = 0,110) ve M evresi (p = 0,932) anlamlı bulunmamıştır (Tablo 1).

Sağkalım analizi

Genel sağkalım analizi, CRC'de TCGA miR-192 ekspresyonu için anlamlı bir prognostik ilişkiyi desteklememiştir (Şekil 3). Birleştirilmiş COADREAD kohortunda, medyan kesimli Kaplan-Meier karşılaştırması anlamlı bulunmamış (log-rank p = 0.857) ve tek değişkenli Cox regresyonu da anlamlı bir ilişki göstermemiştir (log2 ekspresyon birimi başına HR = 0.934, p = 0.374). Aynı sonuç COAD (log-rank p = 0.889; Cox p = 0.493) ve READ (log-rank p = 0.807; Cox p = 0.716) için de gözlemlenmiştir. Bu nedenle veriler, CRC'de miR-192 için güçlü bir prognostik biyobelirteç iddiasını desteklememektedir.

Aday hedef genler ve fonksiyonel zenginleştirme

Aday hedef gen analizi, miRWalk öngörüleri ile GSE89076 ve GSE156355 GEO veri setlerinden elde edilen farklı eksprese edilen genlerin entegre edilmesiyle gerçekleştirilmiştir. Bu tarama, sonraki ağ ve zenginleştirme analizleri için 93 aday gen belirlemiştir (Şekil 4). Protein etkileşim analizi sonucunda KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1, CDK1, PLP1, NRXN1, GRIK3 ve KIF5C keşifçi hub genler olarak seçilmiştir (Şekil 5). TCGA RNA-seq duyarlılık analizi, KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1 ve CDK1'in tümör dokusunda normal dokuya göre daha yüksek, PLP1, NRXN1, GRIK3 ve KIF5C'nin ise tümör dokusunda daha düşük olduğunu göstermiştir. TCGA miR-192 ekspresyonu ile yapılan korelasyon analizi karmaşık sonuçlar vermiştir: CDCA5, CCNB1 ve CDK1 pozitif korelasyonlar gösterirken; PLP1, NRXN1 ve KIF5C negatif korelasyonlar göstermiştir. Zenginleştirme analizi; sitokrom P450 ile ilaç metabolizması, sitokrom P450 ile ksenobiyotiklerin metabolizması, retinol metabolizması, glutamaterjik sinapsla ilişkili terimler ve presinaptik organizasyon ile ilgili temsili terimleri öne çıkarmıştır (Şekil 6). Bu bulgular, hub gen ağının biyolojik ilgisini desteklemektedir ancak doğrudan miR-192-5p hedeflemesini kanıtlamamaktadır.

Hücre göçü deneyi

miR-192 artışının fonksiyonel etkilerini değerlendirmek için HT29 hücreleri miR-192 mimikleri ile transfekte edildi. Floresan mikroskopisi, miR-192-5p mimik ve negatif kontrol transfeksiyon gruplarında transfeksiyonun başarılı olduğunu doğruladı (Şekil 7). Yara iyileşmesi deneyinde, miR-192 transfekte edilmiş HT29 hücrelerinin göç hızı, hem 24 h hem de 48 h sürelerinde transfekte edilmemiş HT29 hücrelerinden ve negatif kontrol transfekte edilmiş hücrelerden daha düşükle çıktı (Şekil 8). 24 h'de göç hızı, transfekte edilmemiş grupta %15,69 +/- 3,47 ve negatif kontrol grubunda %15,45 +/- 3,92 iken, miR-192 transfekte edilmiş grupta %9,75 +/- 2,43 idi (P = 0,010). 48 h'de göç hızı, miR-192 transfekte edilmiş grupta %20,04 +/- 2,54 iken, iki kontrol grubunda sırasıyla %26,84 +/- 7,65 ve %27,98 +/- 6,78 idi (P = 0,021). Bu sonuçlar, miR-192 artışının HT29 hücresi göçünü in vitro ortamda baskıladığını göstermektedir.

İmmün imza korelasyon analizi

TCGA miR-192 ekspresyonu ile bağışıklıkla ilişkili imzalar arasındaki ilişki, primer tümör RNA-seq verileri kullanılarak yeniden değerlendirildi (Şekil 9). Eşleşmiş miRNA ve RNA-seq verilerine sahip toplam 425 tümör örneği imza-skor korelasyon analizine dahil edildi. miR-192 ekspresyonu; Tfh hücreleri (rho = -0.205, p = 2.15e-05), aktive olmuş dendritik hücreler (rho = -0.186, p = 0.00011), Treg hücreleri (rho = -0.185, p = 0.00013), plazmasitoid dendritik hücreler (rho = -0.169, p = 0.00046), makrofajlar (rho = -0.149, p = 0.0020), Tcm hücreleri (rho = -0.136, p = 0.0050), NK CD56bright hücreleri (rho = -0.132, p = 0.0065) ve Tem hücreleri (rho = -0.129, p = 0.0078) dahil olmak üzere çok sayıda bağışıklık hücresi imzasıyla zayıf negatif korelasyonlar gösterdi. Eozinofil (rho = 0.139, p = 0.0040) ve Th17-hücresi (rho = 0.121, p = 0.0129) imzaları için zayıf pozitif korelasyonlar gözlendi. Bu nedenle, CRC'de miR-192'nin bağışıklıkla ilişkisi heterojen görünmektedir ve bağışıklık infiltratları genelinde tek biçimde pozitif olarak tanımlanmamalıdır.

Veri Kullanılabilirliği

Bu çalışmada analiz edilen genel veri setlerine GDC/TCGA portalından ve Gene Expression Omnibus (GEO) veritabanından GSE89076 ve GSE156355 erişim numaraları ile ulaşılabilir. Bu çalışma sırasında gerçekleştirilen kuru laboratuvar analizleri ve yeniden analizler Ek Tablo 1'de sunulmuştur. Ham qRT-PCR Ct değerleri, yara genişliği ölçümleri, orijinal mikroskopi görüntüleri ve ilgili deneysel veriler dahil olmak üzere qRT-PCR ve yara iyileşmesi analizlerini destekleyen temel deneysel veriler Ek Klasör 1'de sunulmuştur.

Şekil 1: TCGA'da miR-192'nin pan-kanser ekspresyon genel görünümü. x-ekseni tümör kısaltmalarını, y-ekseni ise göreceli miR-192 ekspresyonunu göstermektedir. Mavi normal dokuyu, kırmızı ise tümör dokusunu belirtmektedir. İstatistiksel anlamlılık şu şekilde gösterilmiştir: * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001; NS = anlamlı değil. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: CRC veri setlerinde ve eşleştirilmiş dokularda miR-192/miR-192-5p ekspresyonu. (A) CRC tümör örneklerinde normal örneklere göre daha yüksek veritabanı düzeyinde hsa-mir-192 sinyali gösteren TCGA/GDC miRNA-seq analizi. (B) Eşleştirilmiş lokal doku örneklerinin qRT-PCR analizi, CRC dokularında olgun miR-192-5p ekspresyonunun komşu kanserli olmayan dokulara göre daha düşük olduğunu göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: TCGA hsa-mir-192 ekspresyonuna dayalı keşifsel tanı ve sağkalım analizleri. (A–C) Kaplan-Meier sağkalım eğrileri. Sağkalım analizi, anlamlı bir prognostik ilişkiyi desteklememiştir. (D) TCGA kohortunda tümör-normal ayrımı için ROC eğrisi. Normal örnek sayısının azlığı nedeniyle AUC değeri dikkatle yorumlanmalıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Aday hedef gen taraması ve protein etkileşim analizi. (A) miRNA-hedef tahmini ile GSE89076 ve GSE156355'ten elde edilenle farklı olarak ifade edilen genler arasındaki örtüşmeyi gösteren Venn diyagramı. (B) 93 aday genin protein-protein etkileşim ağı. Düğümler genleri, kenarlar ise tahmin edilen veya küratörlüğünü yaptırılmış gen ilişkilerini temsil etmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Aday hedef ağından hub-gen taraması. (A,B) Modül taraması ile belirlenen ağ modülleri. (C) Ağ bağlantısına dayalı hub-gen sıralaması. (D) Modül ve derece tabanlı taramanın entegrasyonu sonrası elde edilen aday hub hedefler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Aday genler ve anlamlı ağ modülleri için seçilmiş GO ve KEGG zenginleştirme terimleri. Kabarcık grafiği, temsili zenginleştirilmiş biyolojik fonksiyonları ve yolakları özetlemektedir. Zenginleştirme sonuçları keşifseldir ve deneysel doğrulanma gerektirmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: HT29 hücre transfeksiyon görüntüleri. (A) Temsili HT29 hücreleri. (B) miR-192-5p mimik ile transfekte edilmiş HT29 hücrelerinin floresan görüntüsü. (C) Negatif kontrol con238 ile transfekte edilmiş HT29 hücrelerinin floresan görüntüsü. Ölçek çubuğu = 100 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: HT29 hücrelerde yara iyileşmesi deneyi. (A) Transfekte edilmemiş HT29 hücreler, miR-192-5p mimic transfekte edilmiş HT29 hücreler ve con238 transfekte edilmiş HT29 hücrelerde 0 h, 24 h ve 48 h sürelerindeki temsili çizik görüntüleri. (B) 24 h ve 48 h sürelerindeki yara iyileşme hızlarının yüzdelerle gösterilen nicelendirmesi. Ölçek çubuğu = 100 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: CRC tümör örneklerinde TCGA miR-192 ekspresyonu ile immün ilişkili imza skorları arasındaki korelasyon. Analiz; birkaç zayıf negatif korelasyon ve esas olarak eozinofil ve Th17 hücresi imzaları için pozitif korelasyonlar içeren heterojen immün ilişkiler göstermiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Özellikler	TCGA miR-192'nin düşük ekspresyonu	TCGA miR-192'nin yüksek ekspresyonu	p değeri	Yöntem
n	308	308
T evresi, n (%)			0.11	Ki-kare testi
T1	9 (1.5%)	11 (1.8%)
T2	44 (7.2%)	59 (9.6%)
T3	209 (34.1%)	211 (34.4%)
T4	43 (7%)	27 (4.4%)
N evresi, n (%)			0.019	Ki-kare testi
N0	156 (25.5%)	190 (31%)
N1	88 (14.4%)	63 (10.3%)
N2	61 (10%)	54 (8.8%)
M evresi, n (%)			0.932	Kikare testi
M0	214 (39.9%)	234 (43.7%)
M1	41 (7.6%)	47 (8.8%)
Yaş, medyan (IQR)	66 (56, 75)	69 (60, 77)	0.004	Wilcoxon

Tablo 1: CRC'de TCGA miR-192 ekspresyon grupları ile klinikopatolojik özellikler arasındaki ilişki. Yüksek ve düşük ekspresyon grupları, medyan TCGA miR-192 ekspresyon seviyesi ile tanımlanmıştır. Özet tabloda, N evresi ve yaş anlamlıyken, T evresi ve M evresi anlamlı bulunmamıştır.

Ek Tablo 1: Bu çalışma için oluşturulan kuru laboratuvar yeniden analiz sonuçları. Çalışma kitabı; TCGA/GDC ekspresyon karşılaştırmalarını, dengeli ROC sensitivite analizlerini, bir-normal-çıkarma (leave-one-normal-out) analizlerini, klinikopatolojik ilişki analizlerini, sağkalım analizlerini, hub-gen ekspresyon ve korelasyon özetlerini ve immün imza korelasyon sonuçlarını içermektedir.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Klasör 1: qRT-PCR, hücre transfeksiyonu ve yara iyileşmesi deneylerini destekleyen ham deneysel veriler. Bu dosyalar, makalede sunulan analizler için kullanılan orijinal qRT-PCR Ct değerlerini, akış sitometrisi/transfeksiyon verilerini, yara genişliği ölçümlerini ve temsili mikroskopi görüntülerini içermektedir.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışma; kamuya açık veri seti analizi, lokal doku doğrulaması, hedef ağ tahmini, immün imza analizi ve in vitro migrasyon deneylerini birleştirerek, CRC'de miR-192-5p'nin klinik ve biyolojik önemini değerlendirmiştir. Analizlerde doğrulanmış TCGA örnek tanımlamaları kullanılmış, mümkün olan yerlerde COAD ve READ ayrımı yapılmış, log2(RPM + 1) miRNA değerleri kullanılmış, eşleşmiş ve eşleşmemiş karşıştırmalar ayırt edilmiş, ROC sağlamlığı test edilmiş ve hub-gen RNA-seq duyarlılık analizleri eklenmiştir. Temel bulgu, kamuya açık TCGA/GDC miR-192 sinyali ile lokal mature miR-192-5p qRT-PCR sonucunun zıt ekspresyon yönlerine işaret etmesidir; bu durum, veri tabanı düzeyindeki öncül (precursor) anotasyonların mature miRNA ölçümlerinden ayırt edilmesi gerekliliğini vurgulamaktadır^9,11.

Bu uyumsuzluk yalnızca eşit olmayan örneklem boyutlarıyla açıklanmamalıdır. TCGA normal grubu küçüktü ancak eşleştirilmemiş, eşleştirilmiş, yalnızca COAD ve yalnızca READ analizlerinin tamamı TCGA/GDC'de aynı yüksek tümör yönelimini göstermiştir. Örnek kaynağındaki farklılıklar, sekanslama ile qRT-PCR platformları arasındaki farklar, veri tabanı düzeyindeki hsa-mir-192 anotasyonu ile olgun hsa-miR-192-5p ölçümü arasındaki farklar, RNA işleme, tümör saflığı, komşu doku tanımı ve popülasyon özellikleri gibi çeşitli faktörler buna katkıda bulunmuş olabilir. Biyobelirteç yorumlaması ve tümör heterojenliği ile ilgili benzer endişeler CRC çalışmalarında vurgulanmıştır^5,6,7,8. Bu nedenle bulgular, CRC'de miR-192-5p'nin tek bir evrensel ekspresyon yöneliminden ziyade, bağlama ve platforma bağlı bir yorumlamasını desteklemektedir.

Tanısal analiz de dikkatle yorumlanmalıdır. TCGA tabanlı ROC analizi yüksek bir AUC üretmiş olsa da, karşılaştırma, birleştirilmiş COADREAD kohortunda yalnızca 11 normal örnek bulunurken, normal örneklere kıyasla çok daha fazla tümör örneği içeriyordu. Dengeli yeniden örnekleme hâlâ yüksek medyan AUC değerleri göstermişti, ancak her bir dengeli karşılaştırma küçük normal grup tarafından kısıtlandığı için aralıklar genişti. Bu nedenle ROC sonucu, TCGA/GDC içindeki keşifsel tümör-normal ayrımını desteklemektedir ancak miR-192-5p'yi klinik bir tanısal biyobelirteç olarak belirlemek için yetersizdir. Bu yorum, keşifsel biyobelirteç sinyalleri ile klinik olarak doğrulanmış tanısal veya prognostik biyobelirteçler arasındaki genel ayrım ile uyumludur^4,8.

Sağkalım analizi, COADREAD, COAD veya READ vakalarında miR-192 ekspresyonu ile genel sağkalım arasında anlamlı bir ilişki göstermemiştir. Mevcut analizde, miR-192 seçili klinikopatolojik değişkenlerle ilişkili olabilir, ancak mevcut veriler güçlü bir prognostik biyobelirteç sonucunu desteklememektedir. Bu ayrım önemlidir çünkü prognostik biyobelirteçler, belirteç durumunun klinik olarak ilgili bağlamlar genelinde bağımsız ve tekrarlanabilir bir şekilde sonuçla ilişkili olduğuna dair kanıt gerektirir⁸.

In vitro yara iyileşmesi deneyi, miR-192 artışının HT29 hücre göçünü azaltabileceğine dair fonksiyonel kanıtlar sunmaktadır. Bu sonuç, CRC hücrelerindeki potansiyel tümör baskılayıcı işlevle ve lokal qRT-PCR yönüyle tutarlıdır. Önceki çalışmalar ayrıca, miR-192 ile ilişkili yollar da dahil olmak üzere miRNA'ların epitelial-mezenkimal geçişi, hücre kaderini ve göçle ilişkili fenotipleri düzenlemedeki rollerini desteklemiştir^15,16,17. Bununla birlikte, fonksiyonel veriler henüz eksiktir. Mekanistik bir tümör baskılayıcı modeli desteklemek için; en az bir ek CRC hücre hattında tekrarlanan transfeksiyonlar, yara iyileşmesi deneyleri için proliferasyon kontrolleri, Transwell göç/invazyon deneyleri, seçilen hedeflerin çift-lüsiferaz doğrulaması, hedef mRNA ve protein ölçümleri ile kurtarma deneylerini içeren ek ıslak laboratuvar doğrulamaları gerekecektir.

Hub gen analizi, hipotez oluşturucu olarak değerlendirilmelidir. TCGA RNA-seq takviyeleri, seçilen hub genler için tümör-normal ekspresyon farklarının güçlü olduğunu göstermiş, ancak bu genlerin miR-192 ile korelasyonları karışık sonuçlar vermiştir. CDCA5, CCNB1 ve CDK1 dahil olmak üzere birçok hücre döngüsü geni, miR-192 ile negatif değil pozitif korelasyon göstermiştir; bu durum basit bir doğrudan miRNA-hedef baskılama modeliyle uyumlu değildir. Buna karşın PLP1, NRXN1 ve KIF5C negatif korelasyonlar sergilemiştir. Bu sonuçlar ağın biyolojik ilgisini desteklemektedir ancak lusiferaz, protein düzeyi ve kurtarma (rescue) doğrulamaları olmadan doğrudan hedeflemenin sonucuna varılamayacağını göstermektedir. Bu temkinli yorum, in silico hedef-ağ analizlerinin keşifsel doğasıyla tutarlıdır^10,11.

İmmün analiz, ihtiyatlı bir yorumlamayı daha da desteklemektedir. Tümör RNA-seq immün imza skorları, miR-192 ekspresyonunun birkaç immün imza ile negatif korelasyon gösterdiğini ve temel olarak eozinofil ve Th17 hücresi imzalarıyla pozitif korelasyon gösterdiğini ortaya koymuştur. Yanlış keşif oranı düzeltmesinden sonra bile korelasyonların çoğu zayıf çıkmıştır. İmmün imza yöntemleri, yolak veya hücre durumu zenginleşmesini bulk ekspresyon verilerinden çıkardığı için, bu bulgular keşifsel olarak değerlendirilmeli ve ortogonal immün profilleme yaklaşımları kullanılarak doğrulanmalıdır¹³.

Bu çalışmanın birkaç kısıtlılığı bulunmaktadır. Birincisi, yerel doğrulama kohortu nispeten küçüktü ve tek bir merkezden gelmekteydi. İkincisi, kamuya açık veri seti analizi ile yerel qRT-PCR doğrulaması farklı platformlar ve ölçüm düzeyleri kullanmıştır. Üçüncüsü, TCGA normal miRNA-seq örnekleri az sayıdaydı ve bu durum tanısal çıkarımı kısıtlamıştır. Dördüncüsü, hub-gen ve immün analizler hesaplamalı yöntemlerle yapılmıştır ve deneysel doğrulama gerektirmektedir. Beşincisi, mevcut fonksiyonel deneyler HT29 yara iyileşme verileriyle sınırlı kalmıştır. Bu kısıtlılıklar, çalışmanın miR-192-5p'nin CRC'de doğrulanmış bir tanısal, prognostik veya mekanistik biyobelirteç olduğuna dair kesin bir kanıt olarak değil, entegre bir keşifsel analiz olarak sunulmasını haklı çıkarmaktadır^6,8.

Özetle, miR-192-5p'nin CRC ile biyolojik olarak ilgili olduğu görülmektedir, ancak ekspresyon paterni ve klinik yorumu karmaşıktır. TCGA/GDC analizi, CRC tümör örneklerinde daha yüksek miR-192 sinyali göstermişken, yerel bir eşleştirilmiş doku kohortunda yapılan qRT-PCR, daha düşük olgun miR-192-5p ekspresyonu göstermiştir. ROC analizi, araştırıcı bir tümör-normal ayrımıyla işaret etmiştir ancak küçük TCGA normal grubu nedeniyle sınırlı kalmıştır. Genel sağkalım ile anlamlı bir ilişki gözlemlenmemiştir. Hub-gen ve immün analizler hipotez üretici kanıtlar sağlamakta ve HT29 yara iyileşmesi verileri, miR-192-5p regülasyon artışının hücre migrasyonunu azaltabileceğini önermektedir. miR-192-5p'nin CRC'de valide edilmiş bir diyagnostik, prognostik veya mekanistik biyobelirteç olarak kabul edilebilmesi için daha fazla bağımsız kohort ve hedeflenmiş ıslak laboratuvar deneyleri gereklidir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.25%+2:60 trypsin-EDTA	Biological Industries	03-054-1	Hücre sindirimi/pasajlama
10% amonyum persülfat	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	A8090	SDS-PAGE reaktifi
10% sodyum dodesil sülfat	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	SIS1070	SDS-PAGE reaktifi
4x protein yükleme tamponu	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	P1016	Protein örnek hazırlama
-80 C ultra düşük sıcaklık dondurucusu	Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.	https://www.haiermedical.com/	Örnek saklama
Anti-Myc mikoplazma giderme reaktifi	Wuhan Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	P-CMR-001	Mikoplazma dekontaminasyonu
ARL2, BATF2, MEN1 ve beta-actin primer setleri	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	Özel sentezlenmiş	mRNA qPCR primerleri
Otomatik mikroplaka okuyucu	PerkinElmer, USA	VICTOR Nivo	Absorbans ölçümü
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225	Protein kantifikasyonu
Biyogüvenlik kabini / temiz bench	Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.	https://www.haiermedical.com/	Aseptik hücre kültürü
Hücre sayım odası / hemositometre	Shanghai Qiujing Biochemical Reagent Instrument Co., Ltd.	http://www.shqiujing.net/	Hücre sayımı
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	Biosharp	BS350B	Hücre proliferasyonu/sitotoksisite analizi
Hücre kültürü flaskları, kültür plakaları, santrifüj tüpleri ve pipet uçları	Corning	https://www.corning.com/in/en.html	Genel hücre kültürü sarf malzemeleri
Cell Cycle and Apoptosis Detection Kit	Meilun Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China	https://www.chemicalbook.com/ShowSupplierProductsList13366/0_EN.htm	Akış sitometrik hücre döngüsü/apoptoz analizi
CO2 hücre inkübatörü	Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.	https://www.haiermedical.com/	Hücre kültürü
con238 negatif kontrol oligonükleotid	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	Özel sentezlenmiş	Transfeksiyon kontrolü
Cytoscape yazılımı	Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/	Ağ modülü ve hub-gen görselleştirme
Dijital termostatik manyetik karıştırıcı	Changzhou Saipu Experimental Instrument Factory	https://czxtyq.en.alibaba.com/	Çözelti hazırlama
Elektrikli termostatik blast kurutma fırını	Nanjing Wohuan Technology Industry Co., Ltd.	https://www.wtsensor.com/about-wt/aboutwt/	Kurutma/sterilizasyon desteği
Elektroforez sistemi	Bio-Rad Laboratories	Mini-PROTEAN 3 Cell	Jel elektroforezi
Elektrotransfer sistemi	Hoefer	TE77XP	Protein transferi
Fetal sığır serumu	Biological Industries	04-001-1ACS	Hücre kültürü takviyesi
Akış sitometresi	ACEA Biosciences	NovoCyte	Akış sitometrisi
Floresan ters mikroskop	Ningbo Sunny Instruments Co., Ltd.	https://www.sunny-instrument.com/en	Hücre ve yara görüntüleme
GDC/TCGA portalı	National Cancer Institute	Açık erişim veri tabanı	Kamuya açık miRNA-seq, RNA-seq ve klinik veriler
GEO veri tabanı	National Center for Biotechnology Information	GSE89076 ve GSE156355	Kamuya açık gen ekspresyon veri setleri
GraphPad Prism	GraphPad Software	Versiyon 9	İstatistiksel analiz ve grafikleme
Yüksek hızlı soğutmalı santrifüj	Shanghai Huxiangyi Centrifuge Instrument Co., Ltd.	https://www.bioridgecentrifuge.com/	Örnek hazırlama
HT29 hücreleri	Yazarların laboratuvar hücre stoğu	Uygulanamaz	İnsan kolorektal kanser hücre hattı
Görüntü analiz yazılımı	ImageJ	Uygulanamaz	Yara genişliği kantifikasyonu
Görüntüleme sistemi	Tanon Science & Technology Co., Ltd.	Tanon-5200	Jel/blot görüntüleme
IncuCyte S3 dinamik hücre gözlem ve fonksiyonel analiz sistemi	Beijing Sensi Wantong Technology Co., Ltd.	IncuCyte S3	Canlı hücre görüntüleme/fonksiyon analizi
Akıllı termostatik su banyosu	Leica	HI1210	Sıcaklık kontrollü inkübasyon
Lentivirüs ve enfeksiyon reaktifi	Shanghai GeneChem Co., Ltd.	https://synapse.patsnap.com/organization/04ffbf33ff2a6311226a8fa05498cec4	Stabil hücre transduksiyonu
Manuel pipetler	Gilson	PIPETMAN P	Sıvı taşıma
McCoy's 5A bazal medyum	Wuhan Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	PM150710	HT29 hücre kültürü medyumu
Medikal santrifüj	Zhuhai üreticisi belirtilmemiş	3200	Örnek hazırlama
Medikal buzdolabı-dondurucu	Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.	https://www.haiermedical.com/	Reaktif/örnek saklama
Meilunbio Fixer Süper Hassas ECL Kemilüminesans Substratı	Meilun Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China	MA0186	İmmunoblot tespiti
Mini santrifüj	Beijing DLAB Scientific Co., Ltd.	https://www.dlabsci.com/	Örnek hazırlama
miR-192-5p ve U6 primer setleri	TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China	Özel sentezlenmiş	miRNA qPCR primerleri
miR-192-5p mimik	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	Özel sentezlenmiş	Geçici transfeksiyon oligonükleotid
miRcute Enhanced miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit	TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China	KR211	miRNA ters transkripsiyonu
miRcute Enhanced miRNA Fluorescence Quantitation Kit (SYBR Green FP)	TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China	FP411	miRNA qPCR
miRWalk	Kamu veri tabanı	Web veri tabanı	miRNA-hedef tahmin veri tabanı
Nitrokselüloz membran	Millipore	HATF00010	Protein transfer membranı
Yağsız kuru süt	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	D8340	İmmunoblot bloklama reaktifi
Eşleştirilmiş kolorektal kanser ve bitişik kanser dışı dokular	Yazarların kurumu	Uygulanamaz	Klinik örnekler
PCR tüpleri	Corning	PCR-02-C	PCR/qRT-PCR kurulumu
Penisilin-streptomisin çözeltisi	Biological Industries	03-031-1B	Hücre kültürü antibiyotiği
PerfectStart Uni RT&qPCR Kit	TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, China	AUQ-01	mRNA ters transkripsiyonu ve qPCR
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Biological Industries	02-023-1A	Hücre yıkama tamponu
Ön boyanmış protein markörü	Fermentas	26619	Protein moleküler ağırlık markörü
Saf su hazırlama sistemi	China Moer	Mevcut değil	Saf su hazırlama
Puromisin	Phygene	PH1143	Transdukt edilmiş hücrelerin seçimi
R yazılımı	R Foundation for Statistical Computing	Versiyon 3.6.3	İstatistiksel analiz ve biyoinformatik
Hızlı transfer tamponu	Crisbio	Uygulanamaz	Protein elektrotransferi
Gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR sistemi	Applied Biosystems (ABI), USA	Mevcut değil	qRT-PCR tespiti
RIPA lizis tamponu	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	R0020	Protein ekstraksiyonu
RNaz-free mikro santrifüj tüpleri	Corning	3208	RNA taşıma
Serumsuz hücre kriyoprezervasyon medyumu	New Cell & Molecular Biotech Co., Ltd.	C40100	Hücre kriyoprezervasyonu
SPSS Statistics	IBM	Versiyon 25	İstatistiksel analiz
Stabilize antikor dilüenti	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	Uygulanamaz	Primer/sekonder antikor dilüsyonu
Steril pipet uçları	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	TP-10-C	Yara iyileşme çizme aracı
STRING veri tabanı	STRING Consortium	Web veri tabanı	Protein etkileşim ağı analizi
TEMED	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T8090	SDS-PAGE reaktifi
TransZol Up	TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, China	ET111-01	RNA ekstraksiyonu
Tris-HCl tamponu, pH 6.8	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T1020	SDS-PAGE istifleme-jel tamponu
Tris-HCl tamponu, pH 8.8	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T1010	SDS-PAGE ayırıcı-jel tamponu
Tween-20	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T8220	İmmunoblot yıkama reaktifi
Dikey basınçlı buhar sterilizatörü	Shanghai Boxun Medical Biological Instrument Corp.	BXM-30R	Sterilizasyon