Fareşik Bileşiklerin Fare Yaşlanma Modellerinde Mitokondriyal Morfolojiye Etkilerinin Ölçülmesi

Özet

Bu protokol, implante edilebilir osmotik minipumplerle uygulanan ilaçların yaşlanan fare modellerinde mitokondriyal morfoloji üzerindeki etkilerini ölçme yöntemlerini tanımlar. Fare karaciğerlerinin üç boyutlu (3D) süper çözünürlüklü konfokal görüntülemesi yapılır ve mitokondriyal yapıların tarafsız segmentasyonu, sınıflandırması ve nicel analizi için bir pipeline geliştirilir.

Özet

Yaşlanmaya bağlı moleküler hasar birikimi, özellikle yüksek enerji harcaması olan dokularda mitokondriyal morfoloji ve metabolik işlevsizlik değişikliklerine katkıda bulunabilir. Metabolik işlev bozukluğunu iyileştiren ve sağlıklı, 'genç' mitokondriyal morfolojileri geri kazandıran farmakolojik bileşikler, memelilerde sağlık süresini (yani yaşlanmaya bağlı kronik hastalıkların yükünden arınmış yaşam süresi) uzatmak için etkili yöntemler olabilir. Burada, hidrofobik farmakolojik bileşiklerin stabil ilımı için yaşlı farelerde deri altı osmotik pompa implantasyonlarının yapılması yöntemleri tanımlanmıştır. Daha sonra dokular sabitlenir, kriyoseksiyon yapılır, boyanır ve süper çözünürlüklü konfokal ışık mikroskopisiyle görüntülenir. Son olarak, mitokondriyal yapıların üç boyutlu segmentasyonu, sınıflandırılması ve nicel ölçümü için otomatik bir pipeline sunulur. Bu nedenle, bu yöntemler fare ömrü boyunca farklı dokularda mitokondriyal üç boyutlu yapıdaki değişiklikleri nicel olarak değerlendirmek için faydalı olabilir. Ayrıca, bu teknikler yaşlanmaya bağlı metabolik işlev bozukluğunu hafifletmeye yardımcı olan küçük moleküllü ilaçların tekrarlanabilir tanımlanmasına yardımcı olabilir.

Giriş

Mitokondriler, ev sahibi hücre ve dokunun mevcut metabolik taleplerine uyacak şekilde uzaylı-zamansal olarak organize edilmiş çift zarla bağlı^{organellerdir 1}. İç zardaki invaginasyonlar, cristae olarak adlandırılır, kardiolipin ve fosfatidiletanamin gibi iki katmanlı olmayan iç membran fosfolipidleri, krista uçlarındaki ATP sentaz dimerleri sıraları, kristaların tepesindeki dinamin benzeri GTPaz Optik Atrofi 1'in kardiolipin bağlayan oligomerleri ve krista birleşimlerindeki Mitokondriyal Temas Alanı ve Krista Düzenleyici Sistemi (MICOS) kompleksleri arasında dinamik bir koordinasyon yoluyla oluşur^{ve organize edilir 1}. Bu iç zar yapıları, mitokondrileri bireysel fonksiyonel birimlere alt^{bölmelere ayırır ve} mitokondriyal transmembran potansiyel üreten solunum komplekslerinin toplanabileceği artan yüzey alanı^{sağlar 1}. Apoptotik sinyal³, Ca²⁺ ve reaktif oksijen türleri^{homeostaz 3} ile lipid^{biyosentez 4} ile ilgili ikincil hücresel işlevlere sahip dinamik organeller olarak, mitokondriyal morfolojik yapılar, oksijen^{erişiminin azalması 5} ve endoplazmik^{retikulum 6,7'den} artan Ca²⁺ salınımı gibi çevresel değişikliklere karşı oldukça hassastır.

Moleküler hasar birikimi, yaşlanma sırasında mitokondriyal yapı ve fonksiyon değişikliklerine^{katkıda bulunur 8}. Kühlbrandt grubu tarafından çeşitli model organizmalar üzerinde yapılan öncü kriyo-elektron tomografi (kriyo-ET) çalışmaları, krista yoğunluğu ile solunum kapasitesi arasında açık bir korelasyonun yanı sıra yaşa bağlı bir krista yoğunluğu ve buna bağlı ATP sentaz dimer ^9,10 kaybı göstermiştir. Ayrıca, mitokondriyal hacmdeki değişiklikler, mitokondriyal fisyon ve füzyon dinamiklerinin^{bozulmasından kaynaklanabilir; 11}, artan lipid birikimi¹² ve şişlik^{artmıştır 13}. İskelet kasında, yaşam^{beklentisini güçlü bir şekilde öngören VO 2 max,} intermiyofibriler mitokondriyal parçalanma derecesi ve krista^{yoğunluğu 16} temelinde doğru tahmin edilebilir.

Beklenmedik şekilde, mitokondrilerde yaşlanmanın ilişkili yapısal ve fonksiyonel değişiklikleri, birçok kronik hastalığın patogenezine^{katkıda bulunabilir} 17,18,19,20. Artan mitokondriyal parçalanma ve mitokondriyal biyogenezde ve morfolojide değişiklikler hem Alzheimer hem de Parkinson hastalığı^{ile ilişkilidir 20}. Bu değişiklikler, oksidatif fosforilasyon komplekslerinde bozulmalara yol açar, proton hareket kuvvetinin oluşumunu engeller ve aşırı reaktif oksijen^{türlerinin üretimine yol açar} 20,21,22. Yaşlanmaya bağlı kalp disfonksiyonu ve kalp yetmezliğinde, artan mitokondriyal parçalanma, şişlik, vakuolizasyon ve kriste yoğunluğunun kaybı ATP üretiminin azalmasına katkıda^{bulunur 23,24}. Bu yapısal değişiklikler, mitokondriyal Ca²⁺ yönetiminin değişmesi ve mitokondriyal geçirgenlik geçiş^gözenek 6,7,13,25'in artan aktivitesiyle kısmen ilgili olabilir. Mitofajinin varsayılan bir düzenleyicisi olarak, yaşlanma sırasında geçirgenlik geçiş gözeneğinin aşırı açılması yıkıcı olabilir ve kontrolsüz hücre ölümüne^{yol açabilir 13}. Son olarak, mitokondriyal lipid metabolizması ve mitofajide yaşlanmaya bağlı eksikliklerin de alkol dışı yağlı karaciğer hastalığının gelişimine katkıda bulunabileceği^{bilinmektedir 26}. Özellikle, karaciğer steatozunun artan oksidatif stres ve donut benzeri mitokondriyal yapıların oluşumunun arttığı^{gösterilmiştir 3,27}.

Sonuç olarak, belirli kronik hastalıklardan muzdarip bireylerin yaşam kalitesini artırmak için mitokondriyal fonksiyonun yaşlanmaya bağlı azalmalarını hedefleyen tedavilerin geliştirilmesine büyük ilgi vardır. Forzinity (elamipretide), iç zar yüzey^{potansiyelini 28} azaltan ve mitokondriyal ATP^{üretimini 29,30} artıran lipid-interaktif bir peptiddir ve Barth sendromunun tedavisinde FDA tarafından onaylanan ilk mitokondri hedefli ilaç olmuştur. Barth sendromu, kardiolipin yeniden şekillendirme kusurlarının kardiyomiyopati, iskelet kas zayıflığı ve erken ölüme katkıda bulunduğu X-bağlantılı bir^{bozukluktur 31}. Kısa süreli tedavi, yaşlı^{farelerde kas} biyolojik yaşında tespit edilebilir değişiklikler üretemese de, elamipretid tedavisi kalp ejeksiyon fraksiyonu ve küresel uzunlamasına strain ^32,33, kas yorgunluğu ve kuvvet^{üretimi 33,34,35} ve kırılganlık³² gibi yaşlanmanın fonksiyonel parametrelerinde tekrarlayan iyileşmeler göstermiştir. Bağırsaktan türetilen ellagitannin olan ve^{mitofageyi indükleyen Urolithin A}, aerobik kas dayanıklılığı ve gücünde^{klinik iyileşmeler göstermiştir (37,38}), ayrıca yaşlı farelerde ve indüklenmiş kalp yetmezliği fare modellerinde kalp disfonksiyonu üzerinde olumlu etkiler^{göstermiştir 39}. Metformin, Kompleks I⁴⁰ ile etkileşime girdiği kanıtlanmış bir anti-diyabet ilacının da kalori^{kısıtlaması} 41,42'nin kısmi bir taklitiği olarak görülmesi önerilmiştir. Ancak, metformin tedavisi önceki epidemiyolojik verilerde kanser riskini azaltmış ve bilişsel düşüşü geciktirmiş olsa^{da 43,44}, diyabetik olmayan hastalarda sağlık süresi ve yaşam süresi üzerindeki etkileri hâlâ açık bir^{sorudur 45}. Son olarak, NAD+ öncüsü olan nikotinamid ribozid ile tedavi, mitokondriyal biyogenezi ve mitokondriyal açılmış protein yanıtını yukarı düzenleyerek enerji üretimini^{iyileştirebilir} 46,47,48,49, ancak UM-HET3 farelerindeki uzun vadeli tedavisi fare medyanı veya yüzde 90'lık yaşam süresi üzerinde anlamlı bir etkisi ^{olmamıştır 50}.

Burada, mitokondriyal morfolojinin süper çözünürlüklü konfokal görüntülemesi için farmakolojik bileşiklerle işlenmiş yaşlı farelerden dokuların hazırlanması yöntemleri tanımlanmaktadır. Farelerde sürekli ilaç teslimatı için osmotik minipompaların başarılı bir şekilde yerleştirildiği gösterilir ve karaciğerler, tedavinin dış zar yapısına etkileri açısından analiz edilir. Son olarak, mitokondriyal hacm, yüzey alanı ve sferikliğin tarafsız, tekrarlanabilir nicel ölçümü ile mitokondrilerin farklı yapılara sınıflandırılması için bir analiz hattı sunulmaktadır. Bu nedenle, bu yöntemler hem memelilerin yaşam süresi boyunca mitokondriyal morfolojideki değişiklikleri incelemek hem de metabolik sağlıktaki yaşlanmaya bağlı düşüşleri hafifletmeye yardımcı olabilecek farmakolojik bileşikleri belirlemek için geçerlidir.

Protokol

Araştırma hayvanlarıyla ilgili tüm prosedürler, laboratuvar hayvanlarının kullanımına ilişkin kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi ve Brigham and Women's Hospital ile Harvard Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri tarafından Protokol no. 2016N000368 kapsamında onaylandı. Bu protokolü diğer ülkelerde uygulamak isteyen araştırmacılar, geçerli hayvan refahı düzenlemelerine uyumu sağlamak için yerel kurumsal ve düzenleyici kurumlarına danışmalıdır.

1. Deri altı osmotik pompa implantasyonu

NOT: Hayvan ameliyatları yalnızca deneyimli, eğitimli personel tarafından yapılmalı ve hayvan stresi ve/veya acısını en aza indirmek için büyük özen gösterilmelidir. Araştırma hayvanlarıyla ilgili prosedürleri yalnızca onaylı hayvan protokollerinde tam olarak tanımlandığı şekilde gerçekleştirin. Hayvan kullanımıyla ilgili tüm araştırmalar, 3R'lere – Yenileme, Azaltma ve Geliştirme – sıkı sıkıya bağlı olmalıdır. Bu protokol, küçük cerrahi bir işlem olarak sınıflandırılan deri altı osmotik pompa implantasyonunu detaylandırır. İntraperitoneal osmotik pompa implantasyonları da yapılabilir, ancak bu daha karmaşık bir işlemdir ve büyük cerrahi işlem olarak sınıflandırılır. Bu nedenle, intraperitoneal implantasyonu destekleyecek güçlü bilimsel gerekçeler olmadıkça, deri altı prosedürünün yapılması önerilir.

1. Osmotik pompaların doldurulması
   NOT: İlaç çözeltilerinin hazırlanması ve osmotik pompaların doldurulması, steril bir yöntemle bir biyogüvenlik dolabında yapılmalıdır. Pompa modelleri, istenen rezervuar hacmi ve tedavi süresine göre seçilmelidir. Bu çalışma için model 2004 kullanıldı (~200 μL rezervuar hacmi, 4 hafta boyunca tedavi teslimatı).
   1. İlaç çözeltisini, osmotik pompalarla uyumlu bir çözücüde hazırlayın. Bakınız https://alzet.com/formulating-the-solution/. Hedeflenen günlük dozu elde etmek için gereken ilaç konsantrasyonunu belirlemek için sipariş edilen osmotik pompaların partisinde listelenen akış hızını (μL/s) kullanın.
      NOT: %50 v/v DMSO ve %50 v/v PEG₃₀₀ çözeltisi, hidrofobik bileşikleri kararlı bir şekilde çözer ve osmotik pompalarla uyumludur. Tüm bileşikler ve çözücüler mümkün olduğunda farmastik kalitede olmalıdır.
   2. İlaç çözeltiyi filtre ile 0.22 μm şırınga filtresinden geçirin ve oda sıcaklığında kalın.
   3. Bir akış moderatörünü bir pompaya yerleştirin ve mikrofuge tüpüne sığana kadar aşağı itin. Akış moderatörünü tamamen aşağı basmayın.
   4. Boş bir mikrofuge tüpünde analitik bir denge kalın, ardından osmotik pompanın ağırlığını kaydedin.
   5. Dolum borusunu 1 mL'lik bir şırıngaya takın ve pompanın rezervuar hacminin en az 1,5 katı çekin. Hava kabarcıklarını pistonu aşağı çekerek, şırıngayı sallayarak ve dolum tüpünün üstünde sıvı oluşana kadar yukarı iterek çıkarın.
   6. Pompayı dik tutarken akış moderatörünü çıkarın.
   7. Pompanın üstündeki açıklıktan doldurma borusunu sokun, daha fazla ilerleyemeyene kadar.
   8. Pompayı dik tutarken pistonu yavaşça aşağı itin. Çözelti çıkışta ortaya çıkana kadar doldurmaya devam edin. Sonra dolgu tüpünü çıkarın ve fazla çözeltiyi hassas bir iş mendiliyle silin.
   9. Akış moderatörünü kapağı pompanın üst kısmıyla hizalanana kadar takın.
   10. Doldurulmuş pompayı tekrar bir mikrofuge tüpüne koyun ve tartın. Çözeltinin ağırlığını belirleyin ve dolgu hacminin rezervuar hacminin en az %90'ı olduğunu doğrulayın (miligram ≈ mikrolitre cinsinden hacim farkı).
   11. 15 mL'lik konik bir tüpü 5 mL steril 1× fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) ile doldurun ve önceden doldurulmuş pompayı ekleyin. Parafin filmi ile mühürleyin ve pompa(lar)ı 37 °C'de kuluçka için, osmotik pompa modelinin gerektirdiği sürede astarlayın. 2004 modeli için bu 40 saattir.
2. Meloksikamın hazırlanması
   NOT: Bu, steril teknikle bir biyogüvenlik kabinde yapılmalıdır. Meloksikam, steroid olmayan bir anti-enflamatuar ilaç (NSAID) olup, kontrollü bir madde değildir ancak edinilmesi için kontrollü madde lisansı gerekebilir.
   1. 27 G'lik bir iğne ve 3 mL Luer-lok şırıngası kullanarak, 5 mg/mL meloksikam stokunu steril PBS ile 5 mL'lik steril cam şişede 1 mg/mL'ye seyreltin. Hazırlık gününü hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın.
3. Ameliyat bölgesi hazırlığı
   NOT: Biyogüvenlik kabine içinde osmotik pompa implantasyonu yapılması zorunlu değildir ve cerrahi işlemler sırasında sterilliği korumak mümkün değildir. Ancak, ameliyat bölgesi yine de sıkı temizlik standartlarına ve aseptik uygulamaya uymalıdır. Ameliyat alanı temiz, dağınıklıktan arınmış ve az yaya trafiği yaşamalıdır. İdeal olarak, hem bir hazırlık alanı (yani tıraş ve ovma için) hem de bir ameliyat alanı (yani pompa implantasyonu için) bulunur.
   1. Ameliyat alanını %70 etanol ile tamamen dezenfekte edin ve kağıt havlularla kurutulun.
   2. Cam boncuk sterilizatorunu açın ve 250 °C'ye ayarlayın. 15–30 dakika ısınmasına izin verin.
   3. Buharlaştırıcıyı açın ve ısıtma pedini %65'e ayarlayın. Hayvan vücut ağırlığını ayarlayın ve izofluran oranını %3,2'ye ayarlayın.
   4. Isıtma pedinin yüzeyine sıcaklık problarından birini bantlayın. Isıtma pedini 35–37 °C'ye kadar ısıtın.
   5. Buharlaştırıcı şırıngayı çıkarın. Yeşil sekmeyi tamamen içine itin ve bir şişe izoflurana takarak pistonu geri çekerek isofluranla doldurun.
   6. Şırıngayı buharlaştırıcıya tekrar takın ve şırıngayı astarlayın.
   7. İyileşme için temiz bir hayvan kafesinin altına ikinci bir ısıtma pedi yerleştirin. Kafesi ısıtıcı pedin yarısı kapalı, yarı kapalı olarak yerleştirin.
4. Pompa implantasyonu
   NOT: Tüm cerrahi aletler önceden temizlenmeli ve otoklav edilmelidir. Hayvanlar arasında cerrahi aletlerin sterilizasyonu için cam boncuk sterilizatörü kullanılabilir. Bu sadece 5 hayvana kadar partiler için kullanılabilir. Sterilizasyon parametrelerinin sağlandığını doğrulamak için otoklav gösterge şeridi eklediğinizden emin olun. Uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) için temiz bir laboratuvar önlüğü, cerrahi maske, steril cerrahi eldiven ve saç örtüsü bulunur. Ameliyat yapılan hayvanlar diğer hayvanların görüş alanında olmamalıdır.
   1. Faresi kuyruğunun tabanından tutup anestezi odasına yerleştirin. Tüpleri açın ve odaya izofluran akışını (%3,2) açın. Isıtıcı pedin üzerine iki steril örtü örtü yerleştirin.
   2. Fareşin yan dönmesini bekle ve solunumunu takip et. Solunum yavaşlayıp gevşediğinde, izofluran akışını odaya durdurun. Tüpleri odaya takın ve kullanılacak burun konisinden boruları açın. Burun konusuna izofluran (%2) akışını başlatın.
   3. Fareyi odadan çıkarın ve burnunu ısıtıcı pedin burun konisine sokun. Her iki göze de oftalmik merhem ekin.
   4. Faresi bir tartıda tartın ve sonra burun konusuna geri dönün. Uygulanacak 1 mg/mL meloksikam hacmini belirleyin. 5 mg/kg doz için, fare kilosunu gram cinsinden 5 ile çarparak meloksikamın mikrolitresini elde edin.
   5. 1 mg/mL meloksikam şişeyinin kapağına %70 etanol sprey sprey ve hassas bir iş mendiliyle kurutulun. Sonra, 0.3 mL insülin şırıngası kullanarak doğru meloksikam hacmini çekin. Şırıngadaki tüm hava kabarcıklarını çıkarın.
   6. Fareyi bir elinizle kaşkın/tutun, başınızı aşağıya doğru eğik. İğneyi, karın alt sağ kvadrantına 30°–45° açı ile eğim yukarı bakacak şekilde yerleştirin. İğnenin doğru yerleştirildiğini doğrulamak için aspirasyon yapın.
   7. Aspirat gözlemlenmezse, pistonu yumuşak basın ve meloksiki intraperitonel enjekte edilsin.
   8. Fareyi burun konisine ve ısıtma pedine geri götürün. İmplantasyon bölgesinin çevresindeki bölgenin (orta ve üst sırt) %150'sini cerrahi makas makinesiyle tamamen tıraş edin. İş bittikten sonra hayvanın tüylerini nazikçe süpür/fırçalayın ve ilk örtü örtüsünü atın.
      NOT: Aseptik cerrahi yapmak için temiz tıraş gereklidir. En azından, herhangi bir kesi tamamen hayvan tüylerinden arınmış olmalıdır.
   9. Fareyi başı cerraha bakacak şekilde konumlandırın. Pamuk uçlu aplikatörler kullanılarak povidon-iyot ve %70 etanol ile dönüşümlü bir ovuruş yapın; toplamda 3 uygulama. Planlanan kesinin ortasından başladığınızdan emin olun ve pamuk uçlu aplikatörlerle dışarıya doğru spiral yapın.
   10. Hayvanı steril fenestrasyonlu cerrahi perdelerle örtün ve cerrahi eldivenleri takmak için uygun aseptik tekniği kullanın.
   11. Herhangi bir kesi yapmadan önce, pedal reflekslerini dikkatlice kontrol ettiğinizden emin olun, her iki ayağınızı doku forsepsiyle sıkıca sıkıştırın. Birden fazla basmadan sonra hareket yok. Bu, cerrahi bir anestezi düzlemini doğrular.
   12. Orta skapulyar deriyi doku pençesiyle çadırla kapatın ve küçük İris cerrahi makasla omurgaya dik olarak 1 cm kesi yapın. Düz bir kesim yapmak için, Iris cerrahi makası ile fareye 90° açı ile kesin.
   13. Kesi içinde küçük hemostatik pensler kullanarak deri altı dokuyu yaymak ve pompa için bir cep oluşturmak için kullanın. Pompa cebinin hayvanın önünden uzakta olduğundan ve hayvanın bir yanına hafifçe yerleştirildiğinden emin olun. Kesinin her tarafındaki deriyi gevşetmek için hemostatik forseps kullanın.
   14. Kesiyi doku forsepsiyle açın ve hemostatik forseps kullanarak pompayı takın. Pompayı akış moderatörünü önce takarak takın.
       DIKKAT: Pompa, kesiden yeterince uzak olacak şekilde yerleştirilmelidir, yani kesiyi çevreleyen deri gergin olmasın. Doğru konumlandırılmazsa, bu yara açılmasına yol açabilir. Pompa hayvanın iyileşmesi sırasında pozisyon değiştirebilir.
   15. Doku forsepsiyle cildi nazikçe çadırla kapatın ve kesiyin her iki tarafını birbirine eşit şekilde çekin. Kesinin bir ucundan başlayarak, klips aplizeriyle tüm kesi boyunca 7 mm sarılmış klipsler yerleştirin (2–4 klips gerekebilir).
   16. Kesideki boşluklar için başka bir yara klipsiyle doldurulamayacak kadar küçükse, steril aplikatör ile az miktarda doku yapıştırıcısı uygulayın. Doku forsepsiyle sıkıştırın.
   17. Yaranın kapalı olduğundan emin olmak için kesik etrafındaki deriyi nazikçe çekip gerin. Sonra, burun konisine giden izofluran akışını kapatın ve ilgili tüpleri kesin. Fareleri ısıtma pedindeki kurtarma kafesine yerleştirin.
   18. Fareyi tamamen izleyin, ta ki uyanana ve hareket edene kadar. Hayvanları sıkça herhangi bir sıkıntı veya ağrı belirtisi için izleyin ve iyileşene kadar diğer farelerden izole edin.
   19. 24 saat sonra, intraperitoneal enjeksiyonla 5 mg/kg meloksikam tekrar uygulanır. (İsteğe bağlı) Hayvanların iyileşmesine yardımcı olmak için Elektro-Jel takviyeleri verin ve/veya mamayı kafesin zeminine koyun.
   20. 10–14 gün sonra, hayvanları tekrar izofluran ile anestezi edin, oftalmik merhem sürün ve klips çıkarıcı ile klipsleri çıkarın.
       NOT: Yara klipslerinin üzerinde tekrar çıkmasını önlemek için klipslerin bu zamana kadar çıkarılması gerekir. Ayrıca, tüm osmotik pompaların belirli bir süre süresi vardır. Pompaları ya dışarı çıkardığınızdan veya hayvanların yaşam sürelerinin sonuna kadar ötenazi yaptığınızdan emin olun. Daha uzun tedavi süreleri için, aynı hayvana arka arkaya birden fazla pompa implantasyonu yapılabilir.

2. Dokuların fiksasyonu, gömülmesi ve kesitlenmesi

1. Dokuların fiksasyonu
   NOT: Tüm hayvan prosedürleri deneyimli personel tarafından yapılmalı, hayvan stresi ve acısını en aza indirmek için. Ötenazi odası temizlenmeli ve kalan karbondioksit giderilmesi için her hayvanın arasına fiziksel olarak boşaltılmalıdır. Stresi en aza indirmek için, hayvanlar mümkün olduğunda evlerinde ötenazi yapılmalıdır. Son olarak, hayvanlar diğer farelere mekânsal yakınlıkta veya onların görüş önünde ötenazi yapılmamalıdır. Hayatta kalmayan işlemler için temiz cerrahi aletler gereklidir, ancak steril (yani otoklavlı) olmaları gerekmez.
   1. Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve akış ölçer hedeflenen akış hızına (~%40–%70 dakikada odalık hacmin %40–%70) ulaşana kadar regülatörü açın.
   2. İşlem boyunca fareyi gözlemleyin, atlama gibi bir sıkıntı belirtisi olmadığından emin olun. Solunum aktivitesinin durmasını izleyin ve solunum aktivitesi durduktan sonra en az 2 dakika boyunca_CO2 akışını sürdürün. CO2'ye maruz kalma süresinin en az 5 dakika olduğundan emin olun.
   3. Faresi alıp servikal dislokasyon gibi ikincil bir ötenazi yöntemi uygulayın.
   4. Hayvanın uzuvlarını 23-G iğnelerle alüminyum folyo ile kaplanmış polistiren köpüğüne sabitleyin. Kürkü %70 etanol ile ıslatın.
   5. Karın tabanına yakın küçük bir kesi yapın ve deriyi boyuna kadar kesin. Aynı kesiyi takip ederek vücut boşluğunu açın ve dikkatlice kaburga kafesini kesin.
   6. Karın tabanından başlayarak U şeklinde kesiler yapın ve 23-G iğnelerle cildi iğneleyin.
   7. İlgili organ(lar) disseksiye edilip, 5 mL %4 paraformaldehit (PFA) ile önceden doldurulmuş 15 mL konik bir tüpe yerleştirin. Bir rotisserie ile 4 °C'de 24 saat bekle.
      DIKKAT: PFA çözümü tehlikelidir. Deriyle temas etmekten kaçının. Uygun PPE için laboratuvar önlüğü, nitril eldivenler ve koruyucu gözlükler bulunur.
      NOT: Dokulardan kan perfüzyonu gerekiyorsa ve/veya perfüzyon fiksasyonu isteniyorsa, daha önce tarif edildiği gibi kardiyak perfüzyon^uygulanır. Burada yapılan daldırma fiksasyonunda, özellikle daha büyük doku parçalarında fiksasyonun dokuya yayılması zaman alabilir. Bu, mitokondriyal morfolojiyi değiştirebilir; Ayrıca, PFA ile fiksasyon dokuların⁵² küçülmesine de neden olabilir.
   8. 24 saat sonra paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve dokuları 10 mL 1× PBS ile durulayın. Oda sıcaklığında bir rotisserie üzerinde toplam 3 kez 10 dakika boyunca uygulayın.
   9. PBS'yi çıkarın ve dokuları 10 mL %30 sukroza batırın, 48 saat boyunca 4 °C'de bir rotisserie üzerinde kullanın. Sakarozun sızması, doku(lar) battığında tamamlanır.
      NOT: Çözücünün hayvana teslim edildiğini doğrulamak için, pompada kalan miktarı ölçün.
2. Dokuların gömülmesi
   NOT: Kalıplardaki doku konumunu ve yönünü takip ettiğinizden emin olun.
   1. Polistiren köpük kabı kuru buzla doldurun ve üzerine düz bir metal levha yerleştirin.
   2. Kalıpları metal levhanın üzerine yerleştirin ve 2/3–3/4 kısmını optimal kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği (doku göme ortamı) ile doldurun. Hava kabarcıklarını yüzeye veya köşelere ince forseps ile getirin. Donma hızını artırmak için, kalıpların üzerine doğrudan kuru buz pelletleri yerleştirin.
   3. Bir tartı botuna doku göme ortamı yerleştirin ve dokuları karıştırın. Herhangi bir sukroz çözeltisi taşımamaya çalışın.
   4. Doku göme ortamı kalıpın altına tamamen donduktan sonra (tamamen opak olmalı), dokuyu kalıbın içine öyle batırın ki kalıpın hiçbir tarafına veya yüzeyine değmeyin. İstediğiniz konuma ve yönelime yerleştirin.
   5. Kalıpları -80 °C dondurucuya aktarmadan önce doku gömülü ortamın tamamen donmasını bekleyin.
      NOT: (Duraklama noktası) Gömülü dokular en az 3 ay depolanabilir.
3. Dokuların kesitlenmesi
   NOT: Partiden partiye kalınlıktaki değişkenliği azaltmak için, analiz edilecek tüm dokular tek bir seansta kesitlendirilmelidir.
   1. -80 °C dondurucudan gömülü mendilleri alın ve kuru buzla dolu polistiren köpük kabına yerleştirin.
   2. Kriostat odasının sıcaklığını ve numune tutucusunu sırasıyla -24 °C ve -25 °C'ye kadar önceden soğutun.
   3. Bıçak tutucusuna yeni bir mikrotom bıçağı yerleştirin ve anti-roll plakasını yerleştirin. Daha kolay temizlik için kriyosta odasını kağıt havlularla kaplayın.
   4. Numune çubuğunu kriyostat odasından çıkarıp oda sıcaklığına ısıtın.
   5. Doku kalıpının her köşesini dikkatlice kesmek için jiletle kullanın. Dokunun gömülü orta blokunu çıkarmak için nazikçe ayırın.
   6. Doku bloğunu örnek çukuruna sıkıca bastırarak ileri geri döndürün. Tam olarak yapıştıktan sonra, numune kakasını birkaç dakika boyunca kriyostat odasına dondurulması için koyun.
      NOT: Doku bloğunu, dokunun istenen yönde kesitlenmesi için doğru yönde yerleştirildiğinden emin olun.
   7. Doku bloğu numune çubuğuna tamamen donduktan sonra, chuck tutucuya yerleştirin ve yerine sıkıştırın. Kriyostat bıçağını, dokunmadan doku bloğunun hemen önünde olacak şekilde hareket ettirin.
   8. Kesim ayarını 50 μm olarak ayarlayın ve dokunun tam kesiti açığa çıkana kadar bloğu kesmeye başlayın.
   9. Trim ayarını kaldırın ve kesit kalınlığını 20 μm olarak ayarlayın. Anti-roll plakasını indirmeden önce bu kalınlıkta birkaç dilim kesin. Kesitin %80–%90'ını yavaşça ve pürüzsüzce kesip geçin, sonra durdu.
   10. Anti-roll plakasını kaldırın. Yüklü bir cam sürgü alın ve yüklü tarafı istenen konumda doku bölümüne bastırın.
       NOT: Anti-roll plakasını kaldırdıktan sonra doku bölümü yukarı kıvrılıyorsa, ince fırçalarla açabilirsiniz.
   11. Çakmayı çakan tutucudan çıkarın. Chuck'u kriostattan çıkarıp oda sıcaklığına getirin. Doku bloğunu chuck'tan çekip tekrar kalıbın içine yerleştirin.
   12. Doku bloğunun kalıptan düşmesini önlemek için alozya sarın ve -80 °C dondurucuya geri getirin.
   13. Monte edilen doku kesitlerini -20 °C'ye yerleştirin.
       NOT: (Duraklama noktası) Doku kesitleri -20 °C'de süresiz olarak güvenli bir şekilde saklanabilir.

3. İmmünofluoresans boyama

1. Kriyoseksiyonları alın ve 37 °C'de bir kuluçka makinesinde 10 dakika kurumasına izin verin.
2. Fazla doku gömülü ortamı çıkarmak için slaytları yıkayın.
   1. %0,1 v/v Triton X-100 (PBS-T) içeren 1 L 1× PBS hazırlayın
   2. 3 boyama kavanozunu PBS-T ile doldurun.
   3. Slaytları sürgü rafına yerleştirin. Leke kavanozunda 10 dakika boyunca slaytlar suya batırın. Toplamda 3 kez tekrarlayın.
3. Lekelenme için dokuyu engelle.
   1. Her slaytı nazik bir iş mendilinde hafifçe dokunarak kuruyun. Kaydırmaları bir sürgü kutusunda askıda bırakın, mendil yukarıya bakacak.
   2. 1× PBS, %0,3 v/v Triton X-100 ve %5 w/v sığır serum albümini (BSA) içeren 20 mL blok çözeltisi hazırlayın.
   3. Her slayta 1 mL bloklayıcı çözelti pipetleyin, dokuların tamamen kaplı olduğundan emin olun.
   4. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın.
4. Dokuları birincil antikorla kuluçka edin.
   1. Her slaytı nazik bir iş mendilinde hafifçe dokunarak kuruyun. Başka bir hassas silme ile doku bölümleri arasındaki kalan sıvıyı nazikçe emerin.
   2. Tom20 tavşan α-fare antikorunu bloklayıcı çözelti içinde 1:200 derece seyreltme hazırla (slayt başına 200 μl)
   3. Slayt kutusunun dibine kağıt havluları yerleştirin ve tamamen suyla nemlendirin.
   4. Kaydırmaları sürgü kutusunda asılı şekilde yatırın, mendil yukarıya bakıyor. Her slayta 200 μL seyreltilmiş birincil antikor pipet uygulayarak dokuların tamamen kaplı olduğundan emin olun.
   5. Kullanılacak kapak kapaklarının büyüklüğünde parafin filmi parçaları kesil. Her slayt için 1 parça parafin film kesin.
   6. Her parça parafin filmini her slayta yerleştirerek antikor seyreltmesini doku bölümlerine yayın. Kaydırma kutusunu kapatın ve gece boyunca 4 °C'de kuluçka yapın.
5. Slaytları primer antikorla kuluçkadan sonra yıkayın.
   1. 3 boyama kavanozunu PBS-T ile doldurun. Slaytları alın ve parafin film parçalarını çıkarın.
   2. Slaytları sürgü rafına yerleştirin. Leke kavanozunda 10 dakika boyunca slaytlar suya batırın. Toplamda 3 kez tekrarlayın.
6. Slaytları ikincil antikorda inkubasyon edin.
   NOT: Mitokondrilerin özel etiketlenmesini doğrulamak için, her gruptan en az bir slayt hazırlayın ve sadece ikincil antikorla boyansın.
   1. Her slaytı nazik bir iş mendilinde hafifçe dokunarak kuruyun. Başka bir hassas silme ile doku bölümleri arasındaki kalan sıvıyı nazikçe emerin.
   2. Keçi α-tavşan Alexa Fluor 568 antikoru ve 5 μg/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren bloklayıcı çözelti (slayt başına 200 μL) 1:200 seyreltme hazırlayın.
   3. Kaydırmaları sürgü kutusunda asılı şekilde yatırın, mendil yukarıya bakıyor. Her slayta 200 μL seyreltilmiş ikincil antikor pipet uygulayarak dokuların tamamen kaplı olduğundan emin olun.
   4. Kullanılacak kapak kapaklarının büyüklüğünde parafin filmi parçaları kesil. Her slayt için 1 parça parafin film kesin.
   5. Her slayta bir parça parafilm yerleştirerek antikor seyreltmesini doku kesitlerine yayın. Kaydırma kutusunu kapatın ve oda sıcaklığında 4 saat veya gece boyunca 4 °C'de kuluçka yapın.
7. Kapakları yıka.
   NOT: Kaplama kaymalarını almak ve tutmak için plastik forseps kullanın
   1. Kapakları tek teker sıcak musluk suyu ve Contrad 70 gibi cam eşyaları için deterjan içeren bir kaba yerleştirin. Üzerine parafin filmi parçası ile örtün.
   2. Banyo sonikatorunda 30 dakika sonikasyon yapın.
   3. Sıcak musluk suyunda birkaç kez durulayın. Sonra çift damıtılmış suda birkaç kez daha durulayın. Son çift damıtılmış su durulamasında 15 dakika sonikasyon yapın.
   4. Kapakları %70 etanol içinde koyun ve depolayın. Kaplama kaplamalarını monte etmeye hazır olunca, %70 etanolden çıkarın ve bir duman başlığında hava kurumasına izin verin.
8. Slaytları ikincil antikorla kuluçkadan sonra yıkayın.
   1. 3 boyama kavanozunu PBS-T ile doldurun. Slaytları alın ve parafin film parçalarını çıkarın.
   2. Slaytları sürgü rafına yerleştirin. Leke kavanozunda 10 dakika boyunca slaytlar suya batırın. Toplamda 3 kez tekrarlayın.
   3. Her slaytı nazik bir iş mendilinde hafifçe dokunarak kuruyun. Başka bir hassas silme ile doku bölümleri arasındaki kalan sıvıyı nazikçe emerin.
9. Kapak kapaklarını takın.
   1. Bir slayta 2–3 eşit dağılmış antifade montaj damlası ekleyin.
   2. Hava kabarcıklarını önlemek için, temizlenmiş bir #1.5 kapak kaydırması alın ve uzun eksen boyunca sürgüye 45° açı ile tutun. Örtü kaydırağının üzerine nazikçe ve yavaşça eğin. Tüm slaytlar için tekrar.
   3. Kaydırakların ışıktan korunarak oda sıcaklığında 18–60 saat boyunca kürlenmesine izin verin.
   4. Slaytları ışıktan korunan 4 °C'de sakla.
      NOT: (Duraklama noktası) Slaytlar, kürleme döneminden hemen sonra veya 4 °C'de saklandığında 1 aya kadar görüntülenebilir. Kenarları kapatmaya gerek yok. #1.5 veya #1.5H kaplama kalınlıklarını kullandığınızdan emin olun, çünkü diğer kalınlıklar küresel aberrasyon yaratabilir ve görüntü kalitesini düşürebilir. DAPI ile montaj ortamı kullanmayın, çünkü DAPI geniş uyarılma ve emisyon spektrumlarına sahiptir. Kürlenme süresi örnek kalınlığına bağlıdır; Burada, 48 saat.

4. Süper çözünürlüklü görüntüleme

NOT: Bu protokol, bir ZEISS Axio Observer Z1 etrafında inşa edilmiş ve iki çok alkali fotoçoğaltıcı tüp (PMT) ile GaASP 32 kanal spektral dedektörü, çevresel bir örtü ve Plan Apo 63×/1.4 yağ diferansiyel girişim kontrastı (DIC) III objektif ile donatılmış ZEISS Airyscan2 nokta tarama LSM 980 konfokal kullanır.

1. Satın alma sürecini kur.
   1. Tek bir Airyscan SR hattı ekleyin ve uygun floroforu seçin.
   2. 10" plakayı ve uygun emisyon bant geçiş filtrelerini seçin.
      NOT: 10" plaka bu mikroskopa özgüdür çünkü kızılötesi (IR) dedektörlerle donatılmıştır.
   3. Uygun lazer(ler)i seçin. Nyquist örnekleme kriterini SR'ye tıklayarak 2'ye ayarlayın (piksel boyutu 0.05 μm'ye ayarlanmalıdır).
   4. Canlı tuşuna tıklayın ve Airyscan dedektörü hizalayın (canlı hizalama özelliğini seçin). Yoğunluk dedektör simgesinin ortasında ve dedektör yeşil olduğunda dur düğmesine tıklayın.
      NOT: Her şey doğru ayarlanmışsa, yazılımın sol tarafında "Airyscan ayarları başarıyla optimize edildi" mesajı görünmelidir.
   5. Tekrar canlı yayına geçin ve lazer yoğunluğunu ayarlayın ki iyi bir sinyal olsun ama doygun pikseller olmasın (menzil göstergesine tıklayın). Optimize edildikten sonra dur tuşuna tıklayın.
      1. (İsteğe bağlı) Lazer gücünü ayarlamadan sinyali artırmak için kazancı artırın.
2. Veri toplama işlemi gerçekleştirin.
   1. z-stack'e tıklayın ve adım boyutunun 0.1 μm olarak ayarlandığını doğrulayın (ayarlanmadıysa ayarlayın).
   2. Canlı tuşuna tıklayın ve z-stack'in alt ve üst sınırlarını ayarlayın.
   3. Deneyi başlat düğmesine tıklayın.
   4. Z-yığını toplandıktan sonra, görselin altındaki Airyscan sekmesine gidin ve 3D sürecine tıklayın. Burada kullanılan ses yalıtımı Weiner filtre parametrelerini farklı replikalar ve tedavi grupları arasında tutarlı tutun.
   5. İşlenen Airyscan z-stack'ını kaydet.
      NOT: İki Airyscan SR hattı kullanılıyorsa, mikroskobun her kare boyunca izleri değiştirdiğinden emin olun.

5. Mitokondriyal morfolojinin nicelendirilmesi için otomatik bir boru hattının oluşturulması

NOT: Bu protokol, ZEISS arivis Pro Software 4.1.2 kullanılarak mitokondriyal morfolojinin 3B nicelenmesi için otomatik bir görüntü analiz boru hattı geliştirilmesini tanımlar.

1. Airyscan ile işlenen .czi dosyalarını arivis dönüştürme aracı kullanarak .sis formatına dönüştürün.
   NOT: Eğer tam görüntü büyükse ve parametre optimizasyonu sırasında işlem süresi çok uzunsa, görüntülerin küçük, temsilci bir alt bölgesini kırparak ayarları optimize etmek için çalışma referansı olarak kullanın. Bu kırpılmış görüntü, hem iyi izole mitokondrileri hem de daha yüksek yoğunluklu bölgeleri içermelidir, böylece tüm görüntü alanını doğru şekilde temsil eder. Kırpılan görüntüde tatmin edici segmentasyon sağlandığında, optimize edilmiş pipeline tüm görüntü setine uygulanabilir. Bu yaklaşım, zaman kazandıracak ve boru hattı kalitesinden ödün vermeden tüm parametreleri ayarlamayı kolaylaştıracaktır.
2. Boru hattını kurup optimize edin.
   1. Yazılımda temsil bir görüntü (örneğin, kontrol grubundan) açın.
   2. Analiz için giriş olarak Tom20 immünoflüoresans kanalını seçin.
   3. Segmentasyondan önce denoizasyon adımı uygulayın. Burada, çapı 5.42 ve 0.5 şiddeti olan parçacık geliştirme algoritması kullanıldı.
      NOT: Parçacık güçlendirme filtresi, kompakt, kabaca küresel veya uzun nesneleri güçlendirirken arka plan gürültüsünü bastırmak için tasarlanmış yapıyı koruyan bir gürültü giderme algoritmasıdır. Belirli bir mekansal ölçekte (çap) yerel yoğunluğu artırarak çalışır; bu da özellikle koyu bir zeminde parlak, izole parçacıklar veya tübüler olarak görünen mitokondriler için uygundur. Eğer çapın parametre değeri çok küçük ayarlanırsa, gürültü artırılırken, çok büyük bir değer bitişik nesneleri birbirine bulanıklaştırır. Güç parametresi, yüksek değerlerin sinyal yükseltmesini artırdığı ancak çok yüksek ayarlandığında artefaktlar getirebileceği geliştirme derecesini kontrol eder. Varsayılan değerlerle başlayın ve ilgi alanındaki temsil edici bir bölgede çıktıyı görsel olarak inceleyerek ayarlama yapın. Arivis Pro'da çeşitli denoizasyon yöntemleri mevcuttur. Gauss yumuşatma, yüksek frekanslı gürültüyü eşit şekilde azaltan ancak ince yapısal detayları bulanıklaştırabilen basit ve hızlı bir seçenektir. Orta filtreleme, keskin kenarları korumada ve tuz-karabiber gürültüsünü gidermede daha iyidir. Parçacık geliştirme (burada kullanılan) ayrık floresan nesneleri tespit etmek amaç olduğunda tercih edilir; çünkü belirlenen boyut aralığına uygun yapılardan gelen sinyali seçici olarak güçlendirir. Düşük sinyal-gürültü oranına veya önemli arka plan heterojenliğine sahip görüntüler için, daha güçlü bir ses yalıtımı geçişi gerekebilir. Aynı temsil görüntüde iki veya üç yöntemin test edilmesi ve aşağı akış segmentasyon kalitesinin karşılaştırılması önerilir.
   4. 3D uzaydaki nesneleri tespit eden Blob Finder algoritması kullanarak mitokondrileri bireysel segmentlere ayırın.
   5. Nesne boyutu ve hassasiyet eşiği dahil olmak üzere segmentasyon parametrelerini ayarlayın ve tespit edilen nesnelerle denoizlenmiş görüntü arasındaki örtüşmeyi görsel olarak inceleyerek doğru segmentasyonu sağlayın. Burada aşağıdaki parametreler kullanıldı: 0,244 μm çap, %25 olasılık eşiği ve %22,22 bölünme hassasiyeti, normalleştirme ilk başlangıç noktasına ayarlanmış.
      NOT: Segmentasyon parametreleri görüntü çözünürlüğü ve voxel boyutuna bağlıdır. Bu çalışmada, görüntü boyutları 1354 piksel × 1354 piksel olup, XY piksel boyutu 0,049 μm ve voxel boyutu 0,049 × 0,049 × 0,100^{μm 3} idi.
3. Özellik çıkarma ve kalite kontrolü gerçekleştirin.
   1. Tespit edilen her nesne için hacim (^{μm 3}), yüzey alanı (^{μm 2}) ve mitokondri ile aynı hacm/yüzey alanına sahip kürenin yüzey alanı (kürenin yüzey alanı) dahil olmak üzere morfolojik parametreler çıkarın.
   2. Görsel doğrulama için segmentlenmiş nesneleri TIFF dosyaları olarak dışa aktarın.
   3. FIJI veya arivis'te dışa aktarılan dosyaları açın ve segmentasyon doğruluğunu görsel olarak incelemek için orijinal görüntüyle üzerine bindirin.
   4. Her örnek için nicel ölçümleri ayrı tablo dosyaları olarak dışa aktarın.
4. Boru hattını uygula.
   1. Optimize edilmiş pipeline'ı kaydet. Bir örnek boru hattı Ek Dosya 1'de bulunabilir.
   2. Pipeline'ı, çalışmadaki tüm deneysel gruplardan ek görüntülere uygulayın.
   3. Tüm deneysel gruplarda tutarlı performans sağlamak için gerekirse segmentasyon parametrelerini yinelemeli olarak iyileştirin.
   4. Tamamlandıktan sonra, çalışma akışındaki tüm görsellere toplu modda pipeline uygulayın.
5. Veri analizi yapın
   1. İhtaktarılan verileri istatistiksel analiz için RStudio'ya (sürüm 4.3.2) aktarın.
   2. Yüklenmediyse, şu paketleri kurun: readxl, dplyr, tidyr, purrr, ggplot2, ggpubr, patchwork, scales, randomForest, caret, umap, factoextra, RColorBrewer, mclust, outliers ve tidyverse.
   3. Tüm veri setlerini birleştirmek, verileri filtrelemek (aşağıya bakınız), hacim, yüzey alanı ve sferiklik değerlerini çizmek ve segmentli mitokondrileri örnek alt tipi oranları için analiz etmek için script (Ek Dosya 2) yükleyin.
   4. (İsteğe bağlı) Mitokondrileri hacme göre filtreleyerek segmentasyon artefaktları ve gürültü dışlanır.
      1. Uygun filtreleri belirlemek için hacim dağılımlarını görsel olarak inceleyin.
         NOT: Tüm örneklerde çok küçük hacimlerde (0.0003^{μm 3'ün} altında) belirgin bir artış görüldü; bu, gerçek mitokondri yerine segmentasyon gürültüsüyle tutarlıdır.
      2. Alt sınırı belirlemek için, aday eşikler (0.0009, 0.003, 0.005, 0.007 ve 0.01^{μm 3}) üzerinden parçacık tutulmasını değerlendirin. Partikül sayısındaki en keskin düşüş 0.003^{μm 3'ün} altında gerçekleşti; bu da çoğu gürültü parçacığının bu aralıkta olduğunu gösteriyor. Görsel inceleme, 0.003^{μm 3'ün} gürültü zirvesinin sağ kenarına karşılık geldiğini doğruladı.
      3. Üst sınır için, dağılımlar doğal olarak 10^{μm 3'ün} çok altında daraldı; Bu sınırı, aşırı segmentli mitokondriyal ağlar gibi büyük yapay nesneleri hariç tutacak şekilde ayarlayın. Son filtreleme, 0.003 ile 10^{μm 3} arasında hacimli parçacıkları tuttu.
         NOT: Bu betik, tespit edilen tüm mitokondrilerde örnek başına ortalama değerleri hesaplar ve bunları analiz birimi olarak kullanır. Bu yaklaşım, aynı biyolojik örnek içindeki bireysel mitokondrilerin bağımsız olmamasını açıklar.

Sonuçlar

Yukarıda tanımlanan protokol (Şekil 1) 20 aylık erkek UM-HET3 farelerinde gerçekleştirilmiştir. Farelere ya araç (Kontrol) ya da kimyasal yeniden programlama kokteyli (Tedavi edilmiş) model 2004 osmotik^{minipumpler 53} kullanılarak uygulandı. Karaciğerler daha sonra Airyscan2 konfokal mikroskobunda bölümlere ayrıldı ve analiz boru hattı kullanılarak z-yığınlarını işlendi.

3D floresan görüntüleri ZEISS arivis Pro Software 4.1.2 kullanılarak işlendi ve analiz edildi. Mitokondri segmentasyonundan önce, parçacık geliştirme algoritması görüntüleri gürültüden arındırmak ve özgün olmayan bağlanmadan kaynaklanan arka plan, odak dışı ışık, otofloresan ve/veya floresansı kaldırmak için uygulanmıştır. Parçacık geliştirme, belirli bir çaptan sinyali seçici olarak güçlendirir. Gürültü giderildikten sonra, bireysel mitokondriler Blob Finder algoritması kullanılarak 3D olarak segmentlere ayrıldı; bu algoritma, belirli bir boyut aralığında yerel yoğunluk maksimumlarına göre nesneleri tespit eder. Son olarak, nesne segmentasyonu her 2D dilimi ikili bir görüntüye indirge.

Segmentasyon iş akışını göstermek için, Şekil 2 , İşlem boru hattının her aşamasında Kontrol ve İşlenmiş örnekler için temsili optik dilimler sunmaktadır. Ham floresans görüntüsü, belirli mitokondriyal floresans ve istenmeyen arka plan, odak dışı ışık ve otofloresans karışımını içeren işlenmemiş Tom20 sinyalini gösterir. Parçacık güçlendirme denoizasyonu uygulandıktan sonra, arka plan sinyali önemli ölçüde azaltılmış ve kalan floresans ayrık, iyi tanımlanmış yapılarla sınırlandırılmıştır (Şekil 2). Bu, mitokondriyal sınırların daha temiz bir temsilini sağlar ve doğru segmentasyonu kolaylaştırır.

Blob Finder segmentasyonunun çıktısı yeşil renkte gösterilmiştir. Z-yığınlarının doğru şekilde segmentlendiğini doğrulamak için, sessiz 2B dilimler ve ilgili segmentli ikili görüntüler üst üste bindirildi (Şekil 2). Segmentasyon süreci yeterince optimize edilmişse, mitokondriyal floresansın ikili nesnelerle güçlü ve tutarlı ortak lokalizasyonu gözlemlenmelidir. Segmentasyon süreci aşırı segmentleme (yani bireysel mitokondrileri birden fazla nesneye bölmek) veya az segmentleme (yani birden fazla mitokondriyi tek bir cisimde birleştirmek) ise, segmentasyon parametrelerini ayarlayın. Girişlerin görsel incelenmesi yüksek kaliteli segmentasyonu doğrular: tespit edilen nesneler tam olarak seslendirilmiş Tom20 floresans sinyali ile birlikte lokalize olur; aşırı segmentasyon, nesne aşırı boyutlanma, mekansal olarak bitişik mitokondrilerin tek nesnelere uygunsuz birleşmesi veya Tom20 sinyali olmayan bölgelerde sahte nesneler oluşturma kanıtı yoktur. Bu segmentasyon doğruluğu seviyesi hem Kontrol hem de İşlenmiş örneklerde tutarlı şekilde sağlandı ve ZEISS arivis yazılımında optimize edilmiş boru hattı parametrelerinin deneysel gruplar arasında sağlam ve genelleştirilebilir olduğunu gösterdi. Bu sonuçlar birlikte, segmentasyon yaklaşımını doğrular ve ondan elde edilen morfolojik ölçümlerin güvenilirliğini destekler.

Segmentli nesneler, hacm, sferiklik ve yüzey alanı gibi mitokondriyal parametreler için ölçülebilir (Şekil 3). Biyolojik örnek başına tespit edilen çok sayıda mitokondri ve hücre içindeki bireysel organellerin bağımsız olmamasını hesaba katmak için, örnek başına medyan değerler hesaplanmış ve istatistiksel karşılaştırma birimi olarak kullanılmıştır. Grup farklılıkları Wilcoxon testi kullanılarak değerlendirildi. İşlenmiş örnekler, kontrol modellerine kıyasla anlamlı derecede daha yüksek mitokondriyal hacmi ve yüzey alanı sergilemiştir; bu da kimyasal yeniden programlamanın mitokondriyal morfolojide önemli ölçüde yeniden şekillendirilmesine yol açtığını göstermektedir.

Son olarak, segmentli mitokondriler farklı alt^{tiplere (54,55}) ayrılabilir (Şekil 4). Dirsek^{yöntemi 56}, k-ortalama kümelenmesi için optimal küme^{sayısını belirlemek amacıyla kullanılmıştır (}Şekil 4A). Daha sonra, k = 4 küme kullanılarak, kontrol ve tedavi edilen gruplar için mitokondrilerin rastgele alt örnekleri, hem mitokondriyal alt tip (sol) hem de tedavi grubu (sağda) ile renklendirilen uniform manifold yaklaşımı ve projeksiyon (UMAP) boyut azaltma (Şekil 4B) ile çizildi. Son olarak, kontrol ve tedavi edilen gruplar için her mitokondriyal alt tipin oranları (Şekil 4C) çizildi. Tedavi grubunda daha az parçalanmış mitokondri vardı ancak ağ veya uzamış mitokondrilerin oranında anlamlı bir değişiklik olmadı.

Şekil 1: Protokolün genel özeti. Fareler, altı deri osmotik minipump implantasyonu kullanılarak 6 haftaya kadar ilaç veya araç ile tedavi edilir (1). Tedaviden sonra fare dokuları sabitlenir, sukrozla infiltrasyon edilir, OCT Bileşimine gömülür ve kriyo-bölüm yapılır (2). Daha sonra doku kesitleri Tom20'ye karşı antikorlarla ve Alexa Fluor 568 ile etiketlenmiş ikincil antikorlarla boyanır (3). Süper çözünürlüklü z-yığınları, Airyscan2 nokta taramalı konfokal mikroskopta toplanır (4) ve denoizasyonlu işlenmiş z-yığınları mitokondriyal morfolojiyi niceltmek için arivis'te segmentlere ayrılır (5). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Mitokondriyal segmentasyon ve morfoloji analizi için otomatik boru hattı.
Kontrol (üst paneller) ve Aranmış (alt paneller) örneklerinden temsil eden tek optik dilimler. Tom20 immünoflüoresans sinyali gri renkte gösterilmiştir (sol). Gürültü giderilmesinden sonra aynı görüntü gri ile gösterilir, ardından tespit edilen mitokondriyal nesneleri yeşil renkte vurgulayan segmentasyon çıktısı gelir. Birleştirilen görüntü, ses yalıtımı olan sinyal ile segmentli nesneler arasındaki örtüşmeyi gösterir. Girişler, belirtilen bölgelerin daha yüksek büyütme görünümlerini gösterir; bu da ses gidermesinin etkilerini ve segmentasyonun doğruluğunu gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kontrol ve Tedavi Edilen gruplarda mitokondriyal morfoloji. Kutu grafikleri, örnek başına ortalama değerlerin medyan ± çeyreklerarası aralığını gösterir (n = 10 her grup için). Her nokta, o örnek içinde tespit edilen tüm mitokondriler arasında medyan olarak özetlenmiş bir biyolojik örneği temsil eder. Hacm ve yüzey alanı log₁₀ ölçekinde gösterilir. Gruplar Wilcoxon sıralama toplamı testleriyle karşılaştırıldı. Anlamlılık seviyeleri: ns p ≥ 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Mitokondriyal alt tiplerin denetimsiz morfometrik sınıflandırması. (A) Küme içindeki toplam karelerin toplamını (WSS) küme sayısının (k) fonksiyonu olarak gösteren Elbow grafiki, 10.000 mitokondri rastgele bir alt örneklemde hesaplanır. k = 4 noktası, aşağı akış analizi için optimal küme sayısı olarak seçildi. (B) (Sol) Mitokondriyal morfometrik özelliklerin UMAP boyut küçültmesi (n = 20.000 rastgele örneklenmiş mitokondri), atanan alt tipe göre renklendirilmiştir. Morfolojik olarak dört farklı alt tip tanımlanmıştır: parçalanmış (küçük, yüksek sferiklik), uzun (uzun, düşük sferiklik), ağlı (büyük, düzensiz) ve orta. (Sağ) UMAP projeksiyonu, deneysel grup (Kontrol vs. Tedavi Edilmiş) tarafından renklendirilmiştir ve her grubun morfolojik uzay boyunca dağılımını gösterir. (C) Her deneysel gruptaki her mitokondriyal alt tipin örnek başına oranları. Her veri noktası bir biyolojik örneği temsil eder (grup başına n = 10). Kutu grafikler, bıyıklar arasında çeyrek aralığı ve medyanı gösterir; bıyıklar ise çeyreklerarası aralığın 1,5 katına kadar uzanır. Alt tip oranları Wilcoxon sıra-toplamı testi kullanılarak gruplar arasında karşılaştırıldı ve p-değerleri Benjamini-Hochberg yöntemiyle çoklu karşılaştırmalar için düzeltildi. ns p ≥ 0.05, ****p < 0.0001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Örnek arivis pipeline. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Mitokondriyal morfoloji ve alt tip popülasyonlarının nicelendirilmesi için R yazısı.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokolü başarıyla uygulamak için en kritik iki adım, (i) osmotik pompa implantasyonu sırasında kesinin kapatılması ve (ii) doğru segmentasyondur. İlki için, pompanın yapılabileceği kadar büyük ama pompanın hayvanın yanından kayabileceği kadar büyük olmayan deri altı cep oluşturmaya özel özen gösterin. Kesi kapandığında, pompa çevredeki cilde herhangi bir gerginlik yaratmayacak kadar uzağa yerleştirilmelidir; bu da açılmaya yol açabilir. Hayvan iyileşmesine başlamadan önce kapalı kesiyi çevreleyen deriyi her yöne çekerek yaranın yeterince kapalı olduğundan emin olun. Yara klipleri avantajlıdır çünkü hızlı uygulanıp çıkarılabilirler. Ancak, kesilerin düzgün şekilde kapatılamamasından kaynaklanan herhangi bir sorun varsa, kesilmiş dikişler kullanılabilir. İkincisi için, doğru segmentasyon, yeterli görüntü benzerliği oluşana kadar sürekli olarak segmentasyon sonuçlarını ses kalitesi alınmış görüntülerle karşılaştırmanızı gerektirir. Kontrol ve Tedavi Edilen Hayvanlardan alınan Z-yığınları aynı toplama parametreleri kullanılarak ve tercihen aynı görüntüleme oturumu sırasında toplanmalıdır. Aynı şekilde, tüm işlem adımları tam olarak aynı parametrelerle tüm görüntülere uygulanmalıdır. Çap segmentasyon parametresi, tespit edilecek nesnelerin beklenen boyutunu tanımlar. İyi bir başlangıç noktası, birkaç elle incelenen nesneden tek bir optik dilim kullanılarak ölçülen ortalama mitokondriyal genişliktir. Olasılık eşiği, bir nesnenin kabul edilmesi için gereken minimum tespit güvenini kontrol eder. Daha düşük değerler hassasiyeti artırır ve daha fazla nesneyi algılar, ancak bu nesnelerin bazıları yanlış olabilir. Buna karşılık, daha yüksek değerler özgüllüğü artırır ancak daha düşük sinyali nesnelerin kaybolmasına neden olabilir. Önerilen başlangıç aralığı %25–%30 arasındadır. Son olarak, bölünmüş hassasiyet, agresif şekilde dokunan veya üst üste binen nesnelerin bireysel nesnelere nasıl ayrıldığını belirler. Düşük bölünme hassasiyeti, kümelenmiş mitokondrileri tek birleşmiş nesneler olarak bırakır. Öte yandan, yüksek bölünme hassasiyeti, uzun veya dallanmış mitokondrilerin parçalara aşırı bölünmesine yol açabilir. %15–%30 arasındaki değerler tipik mitokondriyal morfolojik çalışmalar için makuldür. Doğru segmentasyon hâlâ zorlayıcı olsa da, segmentasyon FIJI^60'taki Mitokondri^{Analizörü 59} kullanılarak gerçekleştirilebilir. Huygens Professional yazılımı ve özel bir Python betiği kullanılarak hem hücrelerde hem de dokularda mitokondriyal morfolojilerin nicelendirilmesi için yarı otomatik bir boru hattı da yakın zamanda^{tanımlanmıştır 61}.

Bir sınırlama, Airyscan2 konfokal mikroskobunun çözünürlük sınırıdır; XY'de ~150 nm, Z-düzleminde ~350 nm'dir. Bu, mitokondriyal kristaların yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini engeller; çünkü bireysel kristalar arasındaki mesafeler ~40–120^nm 62,63,64 olarak tespit edilmiştir. Buna karşılık, uyarılmış emisyon azalması (STED) yanal olarak ~20–50 nm çözünürlük sınırlarına ulaşabilir ve bireysel mitokondriyal^{kristaları net bir şekilde ayırt edebilir 62,63,64}. Son zamanlarda, hem canlı hem de sabit hücrelerde mitokondriyal iç zarın etkili boyama ve görüntülemesini sağlayan birkaç STED boyası^{geliştirilmiştir} 63,64,65. Krista morfolojilerinin analizinin mitokondriyal biyoenerjik sağlık¹⁰ hakkında içgörüler sağlayabileceği göz önüne alındığında, bu tür veriler bu nedenle istenmektedir. Ancak, mitokondriyal morfoloji, memeli dokuları ile hücre kültürü arasında (aşağıda derinlemesine tartışılmıştır) büyük farklılıklar gösterir ve şu anda STED görüntüleme ve krista yapılarının analizi için dokuların iç zarını boyamak için bir metodoloji yoktur.

Sağlam dokuda mitokondriyal morfolojinin nicelendirilmesi, hücre kültür sistemlerine kıyasla benzersiz zorluklar sunar. Kültürlenmiş hücrelerde, mitokondriler genellikle sitoplazma boyunca iyi ayrılmış ağlar halinde dağılır ve hücreler arasında minimum örtüşme bulunur. Ancak doku kesitlerinde veya tüm montaj preparatlarında hücreler yoğun şekilde paketlenmiş ve sınırları iyi tanımlanmamıştır. Hücre düzeyinde analiz gerekiyorsa, plazma zarını hedefleyen ek bir floresan etiket veya hücre tipine özgü bir işaretleyici ile birlikte görüntü analizi hattında ilgili bir segmentasyon adımı eklenmelidir; böylece mitokondriyal morfolojinin nicelenmesinden önce bireysel hücre sınırları tanımlanır. İkinci önemli fark ise, kültürlenmiş hücrelerde mitokondrilerin genellikle görselleştirilmesi ve yorumlanması kolay olan sürekli ve birbirine bağlı retiküler ağlar oluşturmasıdır. Dokularda bu desen nadiren gözlemlenir. Örneğin, karaciğer kesitlerinden mitokondriler, tüm^{sitozol 66'yı} kaplayan nokta, çubuk ve demetler deseni gösterir. Ancak, kültürdeki hepatositler tübüler morfolojiler gösterir ve net ağ^{oluşumları vardır 66}. Benzer şekilde, kültürdeki düz dokudan gelen mitokondrilerle düz kas hücrelerinden gelen mitokondriler karşılaştırıldığında, morfolojilerinde ve ağ desenlerinde belirgin farklılıklar^{gözlemlenmektedir 67}. Üç boyutlu mimari, hücre tipine özgü mitokondriyal dağılımdaki farklılıklarla birleşince, bu dokulardaki mitokondrilerin uzun ağlar yerine ayrı, yoğun paketlenmiş nokta veya kısa parçalar olarak görünmesine neden olur. Bu nedenle, dokular ile hücre kültürü arasındaki morfolojik özellikler karşılaştırılırken verilerin dikkatli yorumlanması gerekmektedir; çünkü iki fark kısmen gerçek biyolojik varyasyondan ziyade görüntüleme bağlamına bağlanabilir.

Bu protokolün öne çıkan noktalarından biri, dokularda mitokondriyal yapıları ışık mikroskobu ile nicel olarak ölçülebilme yeteneğidir. Süper çözünürlüklü ışık mikroskopisi görüntülerinden mitokondriyal morfolojiyi nicelendirmek için başka yöntemler olsa da, bunların çoğu sadece kültürdeki hücreler için uygundur. Ayrıca, diğer analiz yöntemlerinin aksine, burada sunulan boru hattı tamamen otomatiktir, hem mitokondriyal boyutları hem de alt tür oranlarını nicelikten ölçer ve başarılı bir şekilde performans göstermek için çok az kodlama deneyimi gerektirir. Tarama/iletim elektron mikroskopisi (SEM/TEM) ve kriyo-ET, daha önce dokularda mitokondriyal yapıların 2D ve 3D olarak görüntülenmesi^{için kullanılmıştır} 10,68,69. Ancak, örnek fiksasyonu, susuz kalma ve gömülme sonrası doğal yapıların korunması konusunda^{endişeler vardır 70,71}. Ayrıca, FIJI^60'ta mitokondriyal parametrelerin manuel ölçümü, TEM^{görüntüleri 72} için tercih edilen analiz yöntemi olabilir; bu da önemli çalışma gerektirir ve örnek yanlılığına yol açabilir. Ancak TEM görüntülerinden mitokondriyal morfolojilerin otomatik nicelendirilmesi için derin öğrenme yöntemleri yakın zamanda^{tanımlanmıştır 73,74}. Sunulan yaklaşımın avantajlarından biri, analiz pipeline kurulduktan sonra, kullanıcı girdisi çok az veya hiç kullanılmadan görüntüleri toplu şekilde işleyebilmesidir. İkincisi için, yüksek basınçlı dondurma doku yapılarını neredeyse doğal koşullarda^{koruyabilir 75}. Ancak, kriyo-ET örnek dondurma, kesitleme, frezeleme, veri toplama ve veri işleme kapsamlı eğitim ve son derece gelişmiş ekipman gerektirir. Buna karşılık, süper çözünürlüklü konfokal mikroskopi nispeten daha erişilebilirdir ve başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için daha az eğitim ve kaynak gerektirir.

Yaşlı farelerde osmotik pompa implantasyonları, farklı farmakolojik bileşiklerin yaşlanmaya bağlı fizyolojik fonksiyon düşüşleri üzerindeki etkilerini değerlendirmek için güvenli bir şekilde gerçekleştirilebilir. Ayrıca, burada açıklanan yöntemler birçok farklı organa genellenebilir. Yaşlanmaya bağlı metabolik fonksiyondaki azalmaların hastalıklara katkıda bulunduğu ve yaşlanmanın yaygın özelliklerinden biri olan mitokondriyal işlevsizlikten kaynaklandığı iyi^{tanımlanmıştır 76}. Ayrıca, mitokondriyal yapıların mitokondriyal biyoenerjik kapasite ve metabolik durumu^{etkilediği anlaşılmaktadır 77,78}. Bu nedenle, fare yaşlanması sırasında mitokondriyal yapı üzerindeki etkileri açısından bileşiklerin niceliksel olarak değerlendirilmesi, burada açıklanan yöntemlerle insan sağlığını uzatabilecek tedavilerin belirlenmesine yardımcı olabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Airyscan2 point scanning confocal microscope	ZEISS	LSM 980 with Airyscan2	ZEISS point scanning LSM 980 confocal built around a ZEISS Axio Observer Z1 and equipped with two multi-alkali PMTs and a GaASP 32 channel spectral detector, an environmental enclosure, and a Plan Apo 63×/1.4 Oil DIC III objective. The microscope used in this study is also equipped with two external NIR detectors, as well as the following laser lines: 405, 458, 488, 514, 561, 594, 639, and 730 nm.
Alüminyum folyo	Essendant	BWK7112
Analiz dengesi	Mettler Toledo	MR204
Yatay kayışlı cam plaka	Gel Company	LGI70
Arivis Pro Yazılımı	ZEISS	Sürüm 4.1.2
Banyo sonikatörü	Branson Ultrasonics	71020-MT
Bovin serum albümini	Research Products International	A30075
Santrifüj tüpleri, 15 mL	CELLTREAT	229411
Yüklü mikroskopik slaytlar	Globe Scientific	1358W
Klips sökücü	Alzet	0009976
CO2	Airgas	CD 50
Contrad 70	Decon Labs	1003
Pamuk uçlu aplikatörler	Puritan Medical	25-8061WC
Kriyostata	Leica Biosystems	CM3050 S
Kriyosat bıçakları	Sakura Finetek USA Inc	4689
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	ddH2O'da 5 mg/mL'ye hazırlayın, çoğaltın ve ışıktan korunmuş şekilde -20 °C'de saklayın
Dimetil sülfoksit	Sigma-Aldrich	D2650
EasyDip slayt boyama sistemi	Electron Microscopy Services	71388-01
Electro-Gel	Bio-Serv	EGS-1
Gömü küpleri, 22 mm ´ 22 mm ´ 20 mm	Polysciences	18646A-1
Etanol, 200 proof	Decon Labs	V1001
Delikli steril örtü çarşafları	Dukal	20001
İnce forseps	Fine Science Tools	11445-12
Cam boncuk sterilizatörü	VWR	75999-324
Keçi anti-tavşan Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11036
Isıtma pedi	CVS	215313
Hemostatik forseps	World Precision Instruments	501705
İmmüsol 518 F daldırma yağı	ZEISS	433802-9010-000
İndüksiyon odası	World Precision Instruments	EZ178
İnsülin şırıngaları, 0.3 mL	BD	328431
İris cerrahi makasları	Sklar Surgical Instruments	47-1135
İzofluran	Patterson Veterinary	07-890-8115
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
Luer-Lok 1 mL şırıngalar	BD	309628
Luer-Lok 3 mL şırıngalar	BD	309657
Luer-Lok 50 mL şırıngalar	BD	309653
Meloxivet (meloksikam)	Patterson Veterinary	07-894-8524
Mikrosantrifüj tüpleri, 1.5 mL	CELLTREAT	229443
Mikroskop slayt kutusu	Heathrow Scientific	15994E
Mikroskop slayt kapak camı, #1.5, 22 mm ´ 50 mm	Electron Microscopy Services	72204-04
CO2 içermeyen inkübatör	Benchmark Scientific	H2200-H
Deliksiz steril örtü çarşafları	Dukal	20-002
OCT Bileşiği	Sakura Finetek USA Inc	4583
Oftalmik merhem	Patterson Veterinary	07-888-2572
Osmotik mini pompalar	Alzet	2004
Parafilm	Bemis	PM999
Paraformaldehit, %4 w/v	Santa-Cruz Biotechnology	sc-281692
PBS, 1´	Thermo Scientific	10010023
PEG300	Sigma-Aldrich	90878
PES şırınga filtreleri, 0.22 µm	CELLTREAT	229747
Povidon iyot 10% USP çubuklu çubuklar	Medline	MDS093901ZZ
ProLong Glass Antifade	Invitrogen	P36980
Tavşan anti-Tom20 antikoru	Novus Biologicals	NBP2-67501
Tıraş bıçakları, 0.22 mm	VWR	55411-050
Rotatör/rotiserie	Labnet	H5500
RStudio	The R Project for Statistical Computing	sürüm 4.3.2
Terazi	Fisher Scientific	S72422
SomnoSuite düşük akışlı anestezi sistemi	Kent Scientific	SS-01
Buhar sterilizasyonu gösterge şeritleri	Crosstex	SIS-250
Steril cam şişeler, 5 mL	Thermo Scientific	ST5
Steril iğneler, 0.5", 23 G	BD	305145
Steril iğneler, 0.5", 27 G	BD	305109