Burada, beyin kafatası boşluğundan çıkarıldığında genellikle kaybolan epifiz bezini koruyan bir diseksiyon protokolü sunuyoruz. Bu protokol; immünohistokimya, in situ hibridizasyon ve uzamsal transkriptomik dahil olmak üzere sonraki uygulamalar için embriyonik ve erken postnatal fare beyni preparasyonlarında epifiz bezinin korunmasını sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Perinatal Fare Beyni Preparasyonlarında Pineal Bezinin Korunması
Bu makalede
Özet
Özet
Melatonin salgılayan nöroendokrin bir yapı olan pineal bez, embriyonik ön beyindeki dorsal orta hatta bulunan bir anlage'den oluşur. Farede embriyonik gün (E) 14,5'te, çift telensefalik veziküller arasında, diensefalonun tavanından dışarı doğru çıkan bir pineal divertikül görülür. Bu divertikül; üzerindeki kıkırdak, meningeal ve vasküler doku ile yakın temas halindedir. Geç embriyonik veya erken postnatal evrelerde beyni çıkarmak için kraniyal kavis açıldığında, bu yapı kolayca kaybolur. Önemli nöroendokrin rolüne rağmen, pineal bezin erken gelişimi ve bu süreci düzenleyen sinyal mekanizmaları, kısmen fare beyninin embriyonik gelişimi sırasında bu yapının sağlam korunmasının zorluğu nedeniyle hala yetersiz anlaşılmaktadır.
Bu makale, embriyonik evrelerden postnatal (P) 7. güne kadar beyin izolasyonu sırasında, pineal bezin yapısal bütünlüğünü ve diensefalon tavanına olan bağlantısını koruyan yenilikçi bir diseksiyon prosedürünü sunmaktadır. Prosedür, E18.5 fare beyni kullanılarak gösterilmiştir ve bu nedenle in situ hibridizasyon, immünohistokimya ve mekansal transkriptomik dahil olmak üzere doku mimarisinin korunmasını gerektiren sonraki uygulamalar için uygundur. Protokol, gelişmekte olan pineal bezin izole edilmesi için de kullanılabilir; böylece küçük boyutu nedeniyle normalde zorlayıcı olan, transkriptomik ve proteomik analizlerde pineal beze özgü temsilin artırılması sağlanır.
Giriş
Epifiz bezi, omurgalı beyninin dorsal orta hattında yer alan küçük bir nöroendokrin yapı olup, melatonin hormonunun ritmik salınımı aracılığıyla sirkadiyen fizyolojinin düzenlenmesinde merkezi bir rol oynar1,2. Memeli embriyogenezi sırasında epifiz bezi, gelişmekte olan ön beynin dorsal orta hattından köken alır. Farelerde epifiz gelişimi, dorsal diensefalik nöroepitelyumun özelleşmiş bir bölgesinin epifiz anlage/epifiz resessini oluşturmasıyla başlar; bu yapı daha sonra embriyonik gün (E) 14,5'te dışa doğru büyüyerek epifiz divertikülünü oluşturur3,4,5. Bu divertikül, diensefalonun tavanına yapışıktır ve çift telensefalik veziküller arasında görülür. Gelişim ilerledikçe, bu divertikül beynin dorsal orta hattındaki üst yapılarla, özellikle de ön beynin dorsal yüzeyi boyunca uzanan venöz kanallar olan superior sagittal sinüs (SSS) ve transvers sinüs (TS) ile yakın ilişki kurar6. Gelişmekte olan epifiz bezi, SSS ve TS'nin kesişim noktasının hemen altında yer alır ve dorsal diensefalona olan hassas bağlantısı, beyni kafa kemerinden çıkarmak için üzerindeki vasküler-meningeal yapıların kaldırıldığı sırada özellikle savunmasızdır7. Bu durum, kafa kemeri beyin çıkarma işlemi için açıldığında epifiz bezinin kopma ihtimali nedeniyle, bezin hasara karşı özellikle hassas olmasına yol açar. Sonuç olarak, epifiz bezi rutin diseksiyonlar sırasında sıklıkla kaybedilir; bu da sağlam preparasyonlarda bezin yapısının ve moleküler kompozisyonunun analiz edilmesini kısıtlar.
Burada, pineal bezin ve diensefalon tavanına olan bağlantısının korunduğu fare beyni diseksiyonu için adım adım bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, E16.5'ten erken postnatal aşamalara (P7) kadar olan embriyonik evrelere uygulanabilir ve in situ hibridizasyon, immünohistokimya ve mekansal transkriptomik kullanılarak yapılan pineal bez gelişim çalışmaları için uygundur. Alt uygulamaların bir göstergesi olarak, pineal bezde zenginleşen marker CRX için in situ hibridizasyon ve immünohistokimya sunulmuştur.
Bu yöntemdeki temel yenilik, beyin kafatası boşluğundan çıkarıldığında epifiz bezinin kopmasına neden olacak fiziksel bağlantıların dikkatle uzaklaştırılmasıyla, orta hat yapıları üzerindeki stresin minimize edilmesidir. Bu, standart prosedüre göre bir iyileştirmedir.
Bu diseksiyon yöntemi P7 evresine kadar olan aşamalarla sınırlıdır; çünkü erken postnatal gelişim sırasında kafa kubbesinin ilerleyici kemikleşmesi, kafatasının sertliğini artırır ve meningeal ve vasküler yapılarla olan bağını güçlendirir. Yetişkin kemirgenlerde epifiz bezi diseksiyon prosedürlerini tanımlayan birçok çalışma olsa da8, bezin özellikle kırılgan olduğu ve beyin izolasyonu sırasında hasara karşı hassas olduğu embriyonik ve erken postnatal evrelerde epifiz bezinin korunmasına odaklanan çok az çalışma bulunmaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm prosedürler, Tata Temel Araştırmalar Enstitüsü'nün Kurumsal Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylanmış ve bu kurulun kurallarına uygun olarak yürütülmüştür.
1. Malzeme hazırlığı
- Prosedürden önce mikrodissection için gerekli tüm aletlerin (Materyal Tablosuna bakınız) hazırlandığından emin olun. Tüm aletleri %70 etanol kullanarak sterilize edin. Uzamsal transkriptomik/in situ hibridizasyon gibi alt uygulamalar için preparat toplarken, aletleri RNase dekontaminasyon solüsyonu ile silin.
- Dissection mikroskobu tablasını RNase dekontaminasyon solüsyonu ile temizleyin ve dissection tezgahının yanına bir şişe buz gibi soğuk 1× PBS bulundurun.
- Bu prosedürden önce aşağıdaki aletleri ve plastik malzemeleri hazır tutun:
- Hayvan preparasyonu için şunları hazır tutun: 2 çift küt uçlu pens, 1 çift cerrahi makas, 2 petri kabı (10 cm), ihtiyaca göre birkaç petri kabı (6 cm; her bir baş için bir tane).
- Beyni izole etmek için şunları hazır tutun: 1 çift #5 pens, 1 çift #55 pens, 1 çift mikrodissection makası ve alt uygulamaya uygun toplama tüpleri/kapları.
- NOT: Eğer alt uygulama in situ hibridizasyon veya uzamsal transkriptomik içeriyorsa, dissection aletlerini kullanmadan önce RNase dekontaminasyon solüsyonu ile temizleyin.
2. Hayvan hazırlığı
- E14.5–P0 arası hayvanlar için (2.1.1– 2.1.6) adımları izleyin
- Gebe anneyi Kurumsal Hayvan Etik Kurulu kılavuzlarına uygun olarak ötanize edin. Gösterilen örnekte, anne servikal dislokasyon yoluyla ötanize edilmiştir.
- Uterusu açığa çıkarmak için gebe annenin abdominal boşluğuna orta hat üzerinden bir insizyon yapın. Künt forseps kullanarak uterin hornları nazikçe dışarı çıkarın ve buz gibi 1× PBS içeren steril bir 10 cm'lik kaba yerleştirin.
- Bireysel fetusleri, çevreleyen amniyotik keseden ve plasentadan ayırarak dikkatlice izole edin.
- Fetusleri, buz gibi 1× PBS içeren taze bir 10 cm'lik petri kabına aktarın ve her biri beyin izolasyonu için alınana kadar buz üzerinde tutun. Tek bir fetusu buz gibi PBS içeren 6 cm'lik bir petri kabına aktarın.
- P7'ye kadar olan postnatal aşamalar için, yavruyu Kurumsal Hayvan Etik Kurulu kılavuzlarına uygun olarak ötanize edin. Ardından 2.1.6 adımından itibaren devam edin.
- Bir cerrahi makas kullanarak, ön beyni istenmeyen hasarlardan korumak amacıyla arka beyni de kapsayacak şekilde başı gövdeden ayırın.
- Kanı temizlemek için başı soğuk PBS ile yıkayın. Buz gibi 1× PBS içeren taze bir 6 cm'lik petri kabına aktarın. Sonraki diseksiyon adımları sırasında kanın ve kalıntıların yıkanıp gitmesini sağlamak için başı PBS içinde batmış halde tutun.
3. Pineal bezin sağlam kaldığı beyin izolasyonu için diseksiyon prosedürü
NOT: Aşağıdaki tüm adımlar bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Diseksiyon boyunca beyni ve çevre yapıları net bir şekilde görebilmek için büyütmeyi en az 2× (veya gerektiği kadar) seviyesine ayarlayın. RNA ve protein degradasyonunu minimize etmek için tüm diseksiyon işlemi buz soğukluğunda PBS içerisinde yürütülmelidir. 3.1–3.10 arasındaki adımlar için, adım 3.1'deki talimatlara uygun olarak, başı sıkıca tutmak ve prosedür boyunca sabitlemek için baskın olmayan elinizi kullanın. 3.2–3.9 arasındaki adımlar, baskın olmayan elin başı sabitlediği, baskın elin ise ince motor becerileri gerçekleştirdiği şekilde yürütülmelidir; buna başlangıçta #5 pensle, ardından her adım için belirtilen şekilde #55 pens veya mikrodiseksiyon makaslarına geçilerek başlanmalıdır.
- Baskın olmayan el ile #5 pens kullanın. İki ucu, kararlı bir aşağı yönlü hareketle göz çukurlarına yerleştirin. 3.9. adım tamamlanana kadar beyni petri kabının altına sabitlemek için aşağı yönlü basıncı sürdürün.
NOT: Beyin, göz çukurlarının üzerinde yer alır ve pensin göz çukurlarına yerleştirilmesinden etkilenmez. Sabit bir aşağı yönlü basınç uygulamak, diseksiyon boyunca beyni stabilize eder. - Baskın el ile, başı örten deriyi #5 pens kullanarak koparıp çıkarın.
NOT: Bu aşamada, beyni örten düzgün kondrokranyum görülür. - Kondrokranyumun orta beyin-arka beyin üzerine gelen kısmını şu şekilde çıkarın:
- #5 pens kullanarak, orta beynin telensefalon ile birleştiği noktada, orta beynin her iki yanındaki kondrokraniuma iki penetran insizyon yapın.
- #5 pensin bir ucunu, telensefalonu orta beyinden ayıran hayali teğetsel hat boyunca kondrokranyumun altına teğetsel olarak kaydırın. Sıkıca kavrayın ve kondrokranyumu yırtarak açın.
- Orta beyin ve arka beyin açığa çıkana kadar kondrokranyumu çıkarmaya devam edin.
- #55 pense geçiş yapın. Bir ucu, telensefalon üzerindeki kondrokranyumun kaudal kenarının hemen altına yerleştirin. Vasküler ve meningeal dokularla olan tüm bağlantıları ayırarak kondrokranyumu nazikçe separe edin.
- Bir mikrodiseksiyon makası kullanarak, dorsal telensefalik orta hat boyunca olfaktör bulba doğru kesin. Kapalı bir #55 pens kullanarak, kondrokranyumun beyne olan tüm bağlantılarını nazikçe temizleyin. Telensefalik hemisferleri örten kondrokranyumun iki yarısını #5 pens kullanarak ayırın.
NOT: Bu aşamada, SSS beynin içindeki kondrokranyumun üst kenarı boyunca koyu kırmızı bir ven olarak görülür ve TS, SSS'ye dik olarak görülür. - Pineal bez, SSS'nin hemen altındadır. Bir mikrodiseksiyon makası kullanarak SSS'nin rostral ucundan bir kesi yapın.
- Pineal bezi, SSS ve TS'yi daha iyi açığa çıkarmak için #55 pens kullanarak kondrokranyumun dorsal kısmını her iki taraftan tamamen çıkarın.
- Bir mikrodiseksiyon makası kullanarak, pineal bezin her iki yanındaki TS üzerine iki kesi yapın. #55 pens kullanarak TS'nin lateral bağlantılarını ayırın.
- Kapalı bir #5 pens kullanarak, beynin rostral kısmını ventral kranial kubbeden nazikçe yerinden oynatın. Kapalı pensi beynin ventral tarafının altına kaydırarak beyni tamamen yerinden çıkarın.
- Beyni, sonraki uygulamalar için uygun şekilde pineal bez bütün halde kalacak şekilde saklayın.
4. Protokoldeki kritik adımlar
NOT: Bu diseksiyon protokolünün başarısı, pineal bezi çevreleyen vasküler bağlantıların dikkatli bir şekilde yönetilmesine bağlıdır. Diseksiyon prosedürü boyunca pineal bezin bütünlüğünü korumak için aşağıdaki noktalar kritik öneme sahiptir:
- #5 penset uçlarını her iki göz çukuruna yerleştirerek başı sabitleyin ve 3.1–3.9 arasındaki adımlar boyunca sabit bir aşağı doğru baskı uygulayın. Bu işlem, beyne doğrudan baskı yapmaktan kaçınırken stabil bir destek sağlar.
- Kondrokraniumun çıkarılması sırasında (adım 3.3), pineal bezin dorsal diensefalondan ayrılmasına neden olabileceği için aşırı çekme veya soyma işlemlerinden kaçının.
- Meningeal ve vasküler bağlantıların temizlenmesi (adım 3.4) ve dorsal telensefalik kondrokraniumun açılması (adım 3.5) sırasında yalnızca #55 pensetin uçlarını kullanın. Pensetin derinlemesine girmesi, kaudal telensefalik çatının hemen altında yer alan pineal beze zarar verebilir.
- Beyni çıkarmadan önce superior sagital sinüsün transeksiyonunu (adım 3.6) ve transvers sinüsün bilateral transeksiyonunu (adım 3.8) tamamlayın. Bu kesiler, dorsal venöz ağdaki gerilimi azaltır ve beyin çıkarımı sırasında pineal bezin yırtılmasını önler.
- Adım 3.9'da, dorsal orta hattın bozulmasına izin vermeden, kapalı penset kullanarak beyni nazikçe yerinden oynatın. Tüm meningeal ve vasküler bağlantılar serbest bırakıldığında, beyin kranyal kubbeden kolayca ayrılmalıdır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu diseksiyon protokolü, pineal bezin doğal anatomik konumunda korunduğu E16.5–P7 dönemindeki embriyonik ve erken postnatal fare beyinlerinin tutarlı bir şekilde izole edilmesini sağlar (Şekil 1).
Kondrokranyumun basamaklı olarak çıkarılması, meningeal ve vasküler bağlantıların dikkatle temizlenmesiyle birleştirildiğinde, pineal bez üzerinde istenmeyen makaslama stresini önler. Ayrıca, superior sagittal sinüsün (SSS) rostral ucundan kontrollü bir şekilde kesilmesi...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İnsan fetal/bebek beyni için standartlaştırılmış pineal bez diseksiyon yöntemleri geliştirilmiş olup, bu yöntemler adli patologların ani bebek ölümü sendromunun nedenini anlamalarına yardımcı olmaktadır11. Önceki protokoller, pineal bezin yüzey damarları, meninges ve koroid pleksus ile birlikte çıkarıldığını göstermiştir12; ancak, fare veya diğer kemirgenlerin erken gelişim evrelerinde, diensefalik tavanla bağlantılı, sağlam bir pineal bezin güvenilir bir şekilde korunmasın...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Mükemmel destekleri için Dr. Shital Suryavanshi'ye ve Tata Temel Araştırmalar Enstitüsü hayvanevi personeline teşekkür ederiz. Prosedürün videosunu kaydetmek için laboratuvarındaki Olympus MVX10 stereo makro zoom mikroskobunun kullanımına cömertçe izin verdiği için Dr. Sundar Naganathan'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Hindistan Hükümeti Atom Enerjisi Departmanı'ndan (DAE) alınan RTI4003 ve RTI4015 (ST) Proje Tanımlama No'lu hibe; ICMR-DHR SUG hibesi GAP00303 ve ANRF PMECRG hibesi GAP00313 (AP) tarafından finanse edilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Aydınık alan mikroskobu | Olympus | IX73 | Renkli kameraya sahip herhangi bir aydınık alan mikroskobu uygundur. |
| Konfokal mikroskop | Olympus | FV3000 | Gerekli çözünürlüğe bağlı olarak herhangi bir konfokal mikroskop veya epifloresan mikroskop uygundur |
| CRX antikoru | Invitrogen | PA5-32182 | Parichha et al.9 tarafından tanımlanan immün boyama protokolü. |
| CRX probu | Custom made | Custom made | Parichha et al.10 in situ hibridizasyon protokolü. |
| Hassas pens # 5 | F.S.T | 11251-23 | Herhangi bir şirketin benzer araçlarıyla değiştirilebilir. |
| Hassas pens # 55 | F.S.T | 11255-20 | Herhangi bir şirketin benzer araçlarıyla değiştirilebilir. |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | Herhangi bir şirketin benzer ürünleriyle değiştirilebilir. |
| Petri kabı | Corning | CLS351029 | Herhangi bir şirketin benzer ürünleriyle değiştirilebilir. |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9782 | RNaseZap RNase Dekontaminasyon Solüsyonu, temas anında RNase'leri yok eden bir yüzey dekontaminasyon solüsyonudur |
| Yaylı makas (mikrodiseksiyon makası) | F.S.T | 15020-15 | Herhangi bir şirketin benzer araçlarıyla değiştirilebilir. |
| Stereo zoom mikroskop | Nikon | SMZ745 | Herhangi bir diseksiyon mikroskobu uygundur |
Kaynaklar
- Nakahara D, Nakamura M, Iigo M, Okamura H. Bimodal circadian secretion of melatonin from the pineal gland in a living CBA mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(16):9584-9.
- Christ E, Pfeffer M, Korf HW, von Gall C. Pineal melatonin synthesis is altered in Period1-deficient mice. Neuroscience. 2010;171(2):398-406.
- Rath MF. Homeobox gene-encoded transcription factors in development and mature circadian function of the rodent pineal gland. J Pineal Res. 2024;76(3):e12950.
- Rath MF, Rohde K, Klein DC, Møller M. Homeobox genes in the rodent pineal gland: roles in development and phenotype maintenance. Neurochem Res. 2013;38(6):1100-12.
- Estivill-Torrús G, Vitalis T, Fernández-Llebrez P, Price DJ. The transcription factor Pax6 is required for development of the diencephalic dorsal midline secretory radial glia that form the subcommissural organ. Eur J Neurosci. 2001;14(6):1011-22.
- Dias M, et al. Transection of the superior sagittal sinus enables bilateral access to the rodent midline brain structures. eNeuro. 2021;8(4):ENEURO.0146-21.2021.
- Matsunaga MM, et al. Morphologic analysis of mice's pineal gland. J Morphol Sci. 2011;28(3):157-60.
- Boeckmann D. Morphological investigation of the deep pineal of the rat. Cell Tissue Res. 1980;210(2):283-94.
- Parichha A, et al. Constitutive activation of canonical Wnt signaling disrupts choroid plexus epithelial fate. Nat Commun. 2022;13:633.
- Parichha A, et al. Dentate gyrus morphogenesis is regulated by β-catenin function in hem-derived fimbrial glia. Development. 2022;149(21):dev200953.
- Sparks DL, Coyne CM, Sparks LM, Hunsaker JC 3rd. Recommended technique for brain removal to retain anatomic integrity of the pineal gland in order to determine its size in sudden infant death syndrome. J Forensic Sci. 1997;42(1):100-2.
- Bowyer JF, et al. A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain. J Vis Exp. 2012;69:e4285.
- Calvo J, Boya J. Embryonic development of the rat pineal gland. Anat Rec. 1981;200(4):491-500.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
