Bu çalışma, Sanqi Baiji San'ın etanol kaynaklı mide epitel hücre hasarına karşı koruyucu etkilerini ve PI3K/AKT ile ilgili sinyal kullanımındaki rolünü değerlendirmek için in vitro bir model tanımlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Araştırma makalesi
Bu çalışma, Sanqi Baiji San'ın etanol kaynaklı mide epitel hücre hasarına karşı koruyucu etkilerini ve PI3K/AKT ile ilgili sinyal kullanımındaki rolünü değerlendirmek için in vitro bir model tanımlar.
Bu çalışma, Sanqi Baiji San'ın (SQBJ) etanol kaynaklı mide epitel hücre hasarına karşı koruyucu mekanizmasını netleştirmeyi ve bunun mide ülseriyle (GU) potansiyel ilgisini araştırmayı amaçladı. Ağ farmakolojisi, SQBJ'nin aktif bileşenlerini (Geleneksel Çin Tıp Sistemleri Farmakoloji Veritabanı ve Analiz Platformu [TCMSP], Oral Biyoyararlanılım [OB] ≥%, İlaç Benzerliği [DL] ≥ 0.1), hedeflerinin haritalanması (Evrensel Protein Kaynağı [UniProt]), GU ile ilgili hedeflerin toplanması (GeneCards/OMIM/DrugBank) ve Gen Ontolojisi (GO)/Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme ve moleküler kenetlenme yoluyla örtüşen hedefleri analiz etmek için kullanıldı. Etanol hasarlı Gastrik Epitel Hücre Hattı-1 (GES-1) hücreleri SQBJ veya PI3K inhibitörü LY294002 ile tedavi edildi. CCK-8, optimal SQBJ konsantrasyonunu belirlemek için kullanıldı. Ağ farmakoloji analizleri, PI3K/AKT/MAPK ile ilgili kaskadlarda zenginleştirilmiş 126 ortak hedefi tespit etti ve ana SQBJ bileşenleri ile PI3K/AKT ile ilgili proteinler arasında potansiyel etkileşimler önerdi. Etanol zorluğu olan hücrelerde, SQBJ, hücre hasarını inflamatuar aracı salınımını ve oksidatif stresi azaltarak hafifletmiştir; bu, hücre içi reaktif oksijen türlerinin ve malondialdehit seviyelerinin azalmasıyla kanıtlanmıştır. SQBJ, mitokondriyal membran potansiyelini ve ATP içeriğini geri kazandırdı ve B-hücreli lenfoma-2, kesilmiş kaspaz-3 ve Bcl-2 ile ilişkili X protein seviyelerindeki apoptozla ilişkili değişiklikleri azalttı. SQBJ ayrıca PI3K/AKT ve MAPK ile ilişkili sinyal işaretleyicilerini modüle etti. Bu koruyucu etkiler LY294002 tarafından büyük ölçüde zayıflatıldı; bu da PI3K/AKT ile ilgili sinyalin SQBJ aracılı sitokorumada rol aldığını göstermektedir. Bu bulgular, SQBJ'nin GU'da potansiyel uygulanması için in vitro mekanik bir temel sağlar, ancak etanol kaynaklı mide ülserinin hayvan modellerinde daha fazla doğrulama gereklidir.
Mide ülseri (KU), dünya genelinde oldukça yaygın bir gastrointestinal bozukluktur ve yerel iltihaplanma, erozyon ve mide mukozasının ülserlenmesi ile karakterize edilir. 2021 Küresel Hastalık Yükü (GBD 2021) analizinin elde ettiği tahminlere göre, peptik ülser hastalığı (PUD) dünya genelinde milyonlarca hasta üzerinde önemli bir klinik ve ekonomik yük oluşturmaya devam etmektedir. PUD'nin genel yaygınlığı, yaygın ve yaygın klinik bağımlılıkla birlikte anti-enfektif rejimler ve asit baskılayıcı proton pompası inhibitörleri (PPI) nedeniyle azalmış olsa da, bu düşüş eğilimi sabit kalmış ve bazı bölgelerde bir toparlanmagözlemlenmiştir 1. Özellikle, alkol (etanol) tüketimi, Helicobacter pylori (H. pylori.) enfeksiyonu ve steroid olmayan anti-enflamatuar ilaç (NSAID) kullanımından bağımsız kritik bir patojenik faktördür. Uzun süreli aşırı alkol tüketimi mide mukoza bariyerini zedeleder, ülser gelişimini hızlandırır ve hatta mide kanserlerine yatkınlığı artırır—böylece bu durumu kritik bir uluslararası sağlık krizihaline getirir 2. Gelişmekte olan ülkelerde, alkolle ilişkili mide mukoza yaralanması vakası, alkol tüketiminin artması ve yaşam tarzı değişiklikleri gibi birçok faktör nedeniyle artmakta olup, etkili ve güvenli önleme ve tedavi stratejilerine acil ihtiyaç yaratmaktadır.
Etanol kaynaklı mide mukoza hasarının altında yatan patolojik mekanizma çok faktörlü ve çok katmanlıdır. Mide mukozasıyla doğrudan temas ettiğinde, etanol hızla mukus-bikarbonat bariyerini bozur ve kontrolsüz hücre içi reaktif oksijen türlerinin (ROS) yükselmesine neden olur. Bu oksidatif patlama, ardından lipid peroksidasyonunu (yüksek malondialdehit (MDA ile işaretlenen) tetikler, mide tabakasındaki endojen antioksidanları, süperoksit dismutaz (SOD) ve glutatyon (GSH) dahil olmak üzere tüketir ve nihayetinde mitokondriyal işlevbozukluğuna yol açar 3. Biriken kanıtlar, etanol tarafından indüklenen hücre içi ROS'un esas olarak mitokondrilerden kaynaklandığını ve iç mitokondriyal membran potansiyelinin (Δψm) çökmesi ile adenozin trifosfat (ATP) sentezinin inhibisyonuyla yakındanbağlantılı olduğunu göstermektedir. Bu arada, oksidatif stres, nükleer faktör-kappa B (NF-κB) komutası altında pro-inflamatuar kaskadları daha da aktive eder. Bu aktivasyon, başta tümör nekroz faktörü-α (TNF-α), interlökin-6 (IL-6) ve C-reaktif protein (CRP) gibi inflamatuar aracıların yoğun salınımını teşvik eder ve böylece "oksidatif stres-inflamatuar yanıt" kısır döngüsü oluşturur5. Bu temelde, mitokondri tarafından tetiklenen içsel apoptotik kaskad tetiklenir; bu, Bcl-2 ile Bax arasındaki oranın bozulması ve sisteinil aspartat-spesifik proteinaz 3'ün (Caspase-3) ardışık enzimatik proteolitik bölünmesiyle kanıtlanmaktadır; bu da sonunda mide mukozal epitel hücrelerinin büyük ölçüde ölümüne ve ülseroluşumuna yol açar. Buna göre, oksidatif stres, inflamatuar yanıt ve apoptoz gibi üç temel patolojik bağlantının eşzamanlı hedeflenmesi, alkolik mide mukoza hasarının etkili müdahalesi için önemli bir stratejiyi temsil eder.
Fosfoinositid 3-kinaz/protein kinaz B (PI3K/AKT) sinyal yolu, hücresel ömrü, çoğalma ve programlanmış ölümü yöneten merkezi bir düzenleyici eksen oluşturur ve mide mukoza homeostazını korumada hayati bir işlev görür. Aktivasyondan sonra, PI3K/AKT sinyalizasyonu birden fazla aşağı akış substratını fosforile eder, pro-apoptotik faktör Bad'ın aktivitesini inhibe eder; böylece hücre yıkıcı sitokrom c'nin mitokondriyal kaçışını engeller, ΔΨm homeostazını korur ve hücre hayattakalmasını destekler 7. Ayrıca, PI3K/AKT kaskadı ile mitogen-aktive protein kinaz (MAPK) ağları arasında karmaşık bir antagonistik çapraz iletişim vardır: PI3K/AKT'nin yukarı regülasyonlu aktivasyonu, p38, c-Jun N-terminal kinaz (JNK) ve ekstrahücresel düzenlenmiş protein kinazlar (ERK)8 dahil olmak üzere stres kinazlarının aktivasyonunu engelleyerek inflamatuar sinyal iletimi ve apoptotik kaskad reaksiyonları zayıflatabilir. Birçok çalışma, PI3K/AKT yolunun azalan aktivitesinin mide mukoza yaralanma modellerinde inflamasyonun şiddetlenmesi ve artan apoptozla yakından ilişkili olduğunu, bu yolun aktivitesinin geri kazanılmasının mukozal hasarı önemli ölçüdeiyileştirebileceğini göstermiştir9. Ancak, etanol kaynaklı mide mukoza hasarında PI3K/AKT'nin kesin düzenleyici mekanizması, özellikle MAPK yolu ile sinerjik ilişkisi konusunda sistematik nedensel deneysel doğrulama eksikliği vardır.
Modern farmakoterapi açısından, PPI'ler GU'nun klinik yönetiminde birinci sıradaki seçenektir, ancak uzun vadeli uygulamaları artan güvenlik endişelerini gündeme getirmiştir. Artan çalışmalar, kronik PPI kullanımını böbrek hastalığı, kardiyovasküler olaylar, osteoporotik kırıklar, besin eksiklikleri (demir, magnezyum ve vitamin B12), Clostridioides difficile. enfeksiyon ve hatta mide kanseri riskinin artması gibi çeşitli olumsuzsonuçlarla ilişkilendirmiştir 10. Ayrıca, PPI üretiminin kesilmesinden sonra geri dönen mide asidi hipersalgılanması olgusu, büyük ölçekli farmakovijilans verileriyledoğrulanmıştır 11. Bu güvenlik riskleri, hem klinik hem de temel araştırma topluluklarını, çoklu hedefli koruyucu mekanizmalara, minimal yan etkilere ve uzun vadeli kullanıma uygunluğa sahip alternatif tedavileri aktif olarak keşfetmeye yönlendirmiştir. Özellikle, geleneksel Çin tıbbından (TCM) alınan doğal bileşik preparatları, "çok bileşenli, çok hedefli ve çok yollu" eylem12 bütünsel terapötik konsepti nedeniyle geniş ilgi çekmiştir.
Sanqi Baiji Tozu (SQBJ), Panax notoginseng ve Bletilla striata'dan oluşan klasik bir TCM bileşik formülüdür ve 1:1 kütle oranındadır. Panax notoginseng , kan dolaşımını teşvik etme, kanamayı durdurma ve ağrılı şişliği hafifletme etkileriyle iyi bilinir. Başlıca biyoaktif bileşenleri, notoginsenosid R1 ile ginsenozidler (Rg1, Rb1) dahil olmak üzere önemli anti-inflamatuar, antioksidan ve mukoza onarıcı etkiler gösterir. Bletilla striata , kanamayı durduran, şişliği azaltan ve hasarlı dokuların yenilenmesini teşvik eden burucu etkileriyle karakterizedir. Aynı zamanda, birincil aktif ekstraktı olarak hizmet veren Bletilla striata polisakkaridi (BSP), JNK/p38 MAPK zincirini baskılamada etkinliği belgelenmiş olup, interlökin-1β (IL-1β), TNF-α ve IL-6 ifadesini azaltmış ve midemukozası 13'ün antioksidan savunma kapasitesini artırmıştır. Birikmiş literatür, Panax notoginseng. saponinleri (PNS) ve BSP'nin birlikte uygulanmasının alkolik mide ülseri modellerinde sinerjik bir etki yarattığınıdoğrulamıştır 14 ve SQBJ ile ilgili preparatlar, reflü özofajit ve peptik ülserin preklinik çalışmalarında mukozal koruyucu etkilergöstermiştir 15. Ancak, SQBJ'nin mide mukoza koruyucu etkisinin altında yatan sinyal yolu mekanizmasının sistematik in vitro deneysel doğrulanması yoktur; özellikle PI3K/AKT yolunun temel rolü ve MAPK ile düzenleyici ilişkisi. Bu arada, SQBJ'nin temel bileşen kimyasalları ile fonksiyonel reseptörleri arasındaki nedensel ilişki henüz tam olarak açıklanmamıştır.
Bu eksiklikleri gidermek için, mevcut çalışma ağ farmakolojisi ve in vitro deneysel doğrulamayı birleştiren entegre bir araştırma stratejisi benimsedi; etanol ile zorlanmış GES-1 hücre hattını, SQBJ'nin mide epitelyal koruyucu etkilerinin altında yatan potansiyel moleküler mekanizmayı incelemek için deneysel platform olarak kullandı; özellikle oksidatif stres, iltihap yanıtlar, apoptotik süreçler, PI3K/AKT ile ilgili sinyal izlemesi üzerine vurgu yapıldı. ve MAPK ile ilişkili değişiklikler. İlk olarak, PI3K/AKT sinyalizasyonunun katılımını ön değerlendirmek için PI3K inhibitörü LY294002'yi kullandık ve bu yolun inhibe edilmesinin SQBJ'nin koruyucu etkisini azalttığını bulduk; bu da PI3K/AKT ile ilgili sinyalin SQBJ aracılı sitokorumaya katkıda bulunduğunu göstermektedir. İkinci olarak, PI3K/AKT ile ilgili değişiklikler ile MAPK yol düzenlemesi arasındaki ilişkiyi inceledik ve MAPK sinyal değişikliklerinin PI3K/AKT ekseninin fonksiyonel yanıtının SQBJ modülasyonuyla bağlantılı olabileceğine dair ön kanıtlar sağladık. Bu çalışma, SQBJ'nin etanol kaynaklı mide epitelyal hasarını nasıl azalttığını değerlendirmek için in vitro moleküler bir çerçeve oluşturur ve alkollü mide mukozal hasarında TCM bileşik formüllerinin daha ileri incelenmesi için ön kanıtlar sunar. Ancak, bu hücresel koruyucu etkilerin in vivo'ya çevrilip çevrilemeyeceğini doğrulamak için hayvan deneyleri gereklidir. alkol kaynaklı mide ülserinin deneysel modelleri içinde terapötik etkililik (Ek Şekil S1).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu çalışma insan katılımcıları, insan doku örnekleri, klinik örnekler veya hayvan deneylerini içermemiştir. Kamuya açık ve anonimleştirilmiş veri tabanı kaynakları ağ farmakoloji analizi için kullanıldı ve ticari olarak mevcut GES-1 hücreleri in vitro deneyler için kullanıldı. Bu nedenle, resmi etik onay ve bilgilendirilmiş onay gerekmiyordu. Ana reaktifler, antikorlar, test kitleri, aletler, üreticiler, katalog numaraları ve Araştırma Kaynak Tanımlayıcıları (RRID'ler) hakkında ayrıntılı bilgiler, Malzeme Tablosu'nda özetlenmiştir.
SQBJ sulu ekstraktının hazırlanması ve kalite kontrolü
Bitkisel malzemeler
Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen (kök ve köksap) ve Bletilla striata'nın ham maddeleri.(Thunb. ex. A. Murray) Rchb. f. (yumru) ticari bir geleneksel Çin tıbbı tedarikçisinden temin edilmiş ve daha sonra Çin Farmakopeisi (2025 baskısı) sonrası kıdemli bir TCM eczacısı tarafından doğrulanmıştır. Kupon örnekleri (No. SQBJ-20240301, No. PN-20240301, No. BS-20240301) kurumumuzun herbaryumuna yatırıldı. İki ot, 1:1 kütle oranında ezildi ve karıştırıldı, böylece SQBJ tozu hazırlandı.
SQBJ sulu ekstraktının hazırlanması
SQBJ tozu, seans başına 1 saat boyunca 1:10 (g/mL) katı ve sıvı oranında deiyonize su ile ardışık iki reflü ekstraksiyonu geçirdi. Daha sonra, toplanan ekstraktlar birleştirilip dört katman tıbbi gazlı bezden geçirilerek kalıntı maddeler çıkarıldı. Ortaya çıkan filtrat, 60 °C basınçta konsantre edildi ve göreceli yoğunluk 1,05–1,10 arasında elde edildi, ardından vakumda dondurularak SQBJ sulu ekstrakt tozu elde edildi; nihai ekstraksiyon verimi %18,2 ± %0,6 idi. Ekstrakt tozu mühürlenip −20 °C'de saklandı, serumsuz DMEM ortamında çözündü ve hücre deneylerinden önce sterilizasyon için 0,22 μm bir zar filtresinden geçirildi.
SQBJ sulu ekstraktının kalite kontrolü
SQBJ sulu ekstraktının partiden partiye tutarlılığını ve standartlaştırmasını değerlendirmek için, yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) parmak izi profili ile birlikte nicel belirleme yaptık. Malzeme Tablosu , HPLC sistemiyle ilgili kapsamlı teknik parametreleri listeler. Her iki bileşen bitkinin kimyasal profillerine dayanarak, dört temsilci belirteç hedefledik: notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenozid Rb1 ve militarine. Ancak, bu HPLC tabanlı kalite kontrol stratejisi esas olarak birkaç temsilci bileşeni yansıtmakta ve SQBJ'deki tüm aktif bileşiklerin kapsamlı bir kimyasal profilini sağlamamıştır.
Kromatografik ayrım, ters faz C18 kolonu (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) ile sağlandı. İşlem, 30 °C sütun sıcaklığında sürdürüldü, 1,0 mL/dakika akış hızı, 10 μL enjeksiyon hacmi ve 203 nm tespit dalga boyu ile gerçekleştirildi. Hareketli fazın bileşimi, asetonitril (A) ve %0,1 fosforik asit sulu çözeltisi (B) içeriyordu ve aşağıdaki gradyan elülasyon koşusu kullanıldı: 0–15 dakika, %19 A; 15–35 dk, %19–%35 A; 35–55 dk, %35–%55 A; ve 55–60 dakika, %55–%19 A. Detaylı alet ve sütun bilgileri Malzeme Tablosu'nda verilmiştir.
Referans madde hazırlama
Nicel analiz yapmak için, notoginsenozid R1, ginsenozid Rg1, ginsenozid Rb1 ve militarin için ticari standartlar edindik ve hepsi saflığı %98≥ Bireysel referans kimyasallar hassas ölçülüp tek bir metanol stokuna çözünerek her bileşen için nihai konsantrasyon 50 μg/mL olan tekez bir referans çözeltisi elde edildi.
Örnek hazırlığı:
SQBJ sulu ekstraktlı kuru toz (50 mg) hassas ölçüldü, ardından 25 mL analitik kalitede metanol kullanılarak çözüldü. Bu karışım, kontrollü enstrümantasyon parametreleri altında 30 dakika ultrasonik banyo işlemi geçirdi (güç: 250 W; frekans: 40 kHz). Ortam oda sıcaklığına denge sağlandıktan sonra, sıvı 0,22 μm organik filtre membranından geçirilerek nihai analitik test çözeltisi elde edildi.
İçerik belirleme sonuçları:
Üç ardışık SQBJ sulu ekstrakt partisindeki temel karakteristik bileşenlerin ortalama içeriği şu şekildedir: notoginsenosid R1 3.12 ± 0.11 mg/g, ginsenozid Rg1 8.45 ± 0.23 mg/g, ginsenozid Rb1 5.26 ± 0.18 mg/g ve militarin 2.78 ± 0.09 mg/g şeklindedir; her bileşenin RSD'si partiler arasında %5 < olup, ekstraktın partiler arasında iyi bir tutarlılığını doğrular.
Etik ve uyum bildirisi
Bu çalışma boyunca ne hayvan testleri ne de insan klinik örnekleri, doku biyopsileri ve canlı deneklerin dahil edilmesi yapılmadı. Ağ farmakoloji analizi, TCMSP, UniProt, GeneCards, OMIM, DrugBank, STRING, Metascape, PubChem ve RCSB PDB gibi halka açık veri tabanları kullanılarak gerçekleştirildi. Bu veritabanlarından alınan tüm veriler kamuya açık ve anonimleştirilmişti; Bu nedenle, biyobilişim profili resmi bilgilendirilmiş onay veya ek etik denetim gerektirmekten tamamen muaftı.
Mevcut in vitro. deneyler, ticari olarak bulunan insan mide mukozal epitel hücre hattı GES-1 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Birincil insan hücresi veya hasta kaynaklı biyolojik materyal kullanılmamıştır. Hücre hattı, doğrulanmış bir hücre deposundan alındı ve kurumsal biyogüvenlik ve hücre kültürü yönergelerine uygun şekilde işlendi. Bu çalışma yalnızca yerleşik hücre hatlarını ve kamuya açık veri tabanlarını içerdiği için, resmi kurumsal etik komite onayı dışında tutuldu. Tüm deneysel prosedürler, ilgili kurumsal laboratuvar güvenliği ve araştırma uyum gereksinimlerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
Ağ farmakolojisi çalışmaları
Aktif madde hedeflerinin tanımlanması ve taraması
SQBJ'nin iki bileşen bitkisi olan Panax notoginseng ve Bletilla striata.'nın aktif bileşenleri, halka açık veritabanlarından alındı. Bu çalışmada kullanılan tüm veritabanı kaynaklı bilgiler kamuya açık olup, tanımlanabilir kişisel bilgiler içermiyordu. Botanik isimleri sorgulama olarak kullanarak, Geleneksel Çin Tıp Sistemleri Farmakoloji Veritabanı ve Analiz Platformu'ndan (TCMSP) aday fitokimyasallar tespit ettik. Uygun biyoaktif molekülleri belirlemek için, tarama protokolü oral biyoyararlanılım (OB) eşiklerini %20 ≥ ve ilaç benzerliği (DL) ≥ 0.1 uyguladı. Sonrasında, bu aday bileşenlerle ilişkili potansiyel aşağı akım gen hedeflerini belirledik, geçerli gen hedefleri eşleşmeyen bileşenleri çıkardık. Tüm hedef genler, Evrensel Protein Kaynağı (UniProt) aracılığıyla notalanıp standartlaştırıldı; referans veritabanı araması yalnızca Homo sapiens ile sınırlandırıldı ve böylece fonksiyonel SQBJ aktif bileşenleri için nihai hedef gen listesi oluşturuldu.
Patolojiyle ilgili hedeflerin geri alınması
Bu duruma bağlı genleri derlemek için üç kamuya açık veritabanını sorguladık: GeneCards, Online Mendel Inheritance in Man (OMIM) ve DrugBank; arama terimi "mide ülseri". Çapraz platform veri seti daha sonra birleştirildi ve ardından, mide ülseriyle ilişkili hedef genlerin standartlaştırılmış listesini oluşturmak için gereksiz girişler ortadan kaldırıldı.
Bileşenler, hedefler ve hastalıklar için ağ inşası
SQBJ aktif bileşenleri ile mide ülseri arasında örtüşen hedef genleri belirledik. Daha sonra, ağ görselleştirme yazılımı kullanılarak çok katmanlı bir etkileşim ağı inşa edildi. Düğümün önemini değerlendirmek için, entegre topolojik değerlendirme algoritması her düğümün topolojik parametrelerini, derece ve aralık merkeziyeti dahil olmak üzere hesapladı. Bu hesaplanan değerlere dayanarak, SQBJ'nin mide ülseri tedavisinde aktif bileşenlerini ve temel fonksiyonel hedeflerini belirledik.
Protein-protein etkileşim (PPI) ağlarının haritalanması
SQBJ ile mide ülseri arasında paylaşılan belirlenen uzlaşma hedefleri STRING veritabanıyla çapraz referans alındı. Sorgumuz, analitik arka planı Homo sapiens ile sınırlarken çoklu protein analiz şablonunu belirtti. PPI'lar, minimum etkileşim güven eşiği olan orta güven (> 0.4) ile filtrelendi.
Ortaya çıkan fonksiyonel bağlantı kayıtları TSV dosyası olarak dışa aktarıldı ve ardından PPI analizi için özel ağ görselleştirme yazılımına entegre edildi. Hesaplanan bağlantı topoğrafyasına dayanarak, ağdaki temel fonksiyonel düğümleri her düğümün belirli derece değerini sıralayarak değerlendirdik.
Aşağı akış fonksiyonel açıklaması ve yol haritalaması
Paylaşılan kesişim düğümlerinin biyolojik rollerini açıklamak için, web erişimine uygun bir biyoinformatik notasyon aracı kullanarak Gen Ontolojisi (GO) fonksiyonel zenginleştirme analizi ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) yol zenginleştirme analizi yaptık. Fonksiyonel sınıflandırma genleri üç klasik kategoriye ayırır: biyolojik süreç (BP), hücresel bileşen (CC) ve moleküler fonksiyon (MF). Zenginleştirme sonuçları için balon grafikleri ve bar grafikler, SQBJ'nin mide ülseri üzerindeki terapötik etkisiyle ilişkili birincil biyolojik süreçler ve sinyal yollarını haritalamak için çevrimiçi bir biyoinformatik grafik platformu kullanılarak oluşturuldu.
Hesaplamalı moleküler kenetlenme simülasyonu
SQBJ'nin temel aktif bileşenlerinin mekansal geometri dosyaları, kamuya açık bileşik veritabanlarından indirildi ve dosya işleme yazılımı kullanılarak MOL2 dosyaları olarak kaydedildi. Ayrıca, Protein Veri Bankası'nı sorgulayarak çekirdek hedef proteinlerin üç boyutlu kristal yapılarını elde ettik. Bu makromoleküler yapılar, orijinal ligandlar ve su molekülleri çıkarılarak ön işlenmiş ve ortaya çıkan temiz modeller PDB formatında kaydedilmiştir. Reseptör-ligand bağlanma enerjisini simüle etmek için, çekirdek aktif bileşenler ve hedef proteinleri içeren kenetlenme doğrulaması standart hesaplamalı moleküler kenetlenme yazılımı aracılığıyla gerçekleştirildi. Kenetlenme sonuçları optimize edilip moleküler görselleştirme yazılımı kullanılarak render edildi.
Hücre kültürü
GES-1 insan kaynaklı mide epitel hücreleri, %10 fetal sığır serumu ve %1 penisillin-streptomisin ile entegre edilmiş RPMI-1640 ortamı kullanılarak 37 °C'de, %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir atmosferde yetiştirildi. Kaynak kültürü, orijinal stokları doğrulanmış bir hücre deposundan elde eden yerleşik bir hücre hattı olarak tanımladık. %80–90 oranında gözlemlenen birleşimde, monokatmanlar PBS ile 2 kez durulandırıldı ve ardından %0,25 tripsin-EDTA ile 37 °C'de 2 dakika boyunca ayrıldı. Enzimatik bölünme reaksiyonunu sonlandırmak için eşit hacimde tam ortam ekledik. Ortaya çıkan hücresel süspansiyon, 1.000 × g. üzerinde 5 dakika santrifüjlendi, ardından pelet taze tam ortamda yeniden süspanse edilip uygun yoğunlukta yeniden tohumlandı. Kültürler aynı kuluçka koşullarına geri döndürüldü. Yayılma dönemi boyunca, hücre yaşamı, morfolojisi ve büyüme durumu değerlendirilmek için ters faz kontrast mikroskopu kullanıldı ve logaritmik büyüme fazındaki hücreler rutin olarak sonraki analizler için toplandı.
Etanol kaynaklı GES-1 hücre hasarı modelinin oluşturulması ve tedavisi
Logaritmik faz GES-1 hücreleri, 6 kuyu plakalarında 5 ×10 5 hücre aralığında veya 96 kuyu plakalarında 1 × 104 hücre/kuyuyla tohumlanarak gece boyunca kuluçka altına alındı. Etanol kaynaklı hasar, hücrelerin takviyesiz RPMI-1640 içinde 500 mmol/L etanole 4 saat boyunca maruz bırakılmasıyla belirlenmiştir. Bu durum, ön konsantrasyon ve zaman tepki deneylerine dayanarak seçildi. Ön testte, 4 saat boyunca 250 mmol/L etanol sadece hafif hasara yol açtı; hücre canlılığı yaklaşık %78,6 ± %5,4'te kaldı; 750 mmol/L etanol ise canlılığı %32,8 ± %4,7'ye düşürdü ve bu aşırı sitotoksisiteyi gösterdi. 4 saat boyunca 500 mmol/L etanole maruz kalmak, hücre canlılığını %54,7 ± %4,9'a düşürdü; bu da tekrarlanabilir orta ila şiddetli hasar yarattı ve sonraki müdahale ve mekanik testler için yeterli canlı hücrelerin korunmasını sağladı. Bu nedenle, model kurulum için 4 saat için 500 mmol/L etanol seçildi. Bu durum, in vitro akut etanol kaynaklı epitel yaralanmasını simüle etmek için kullanıldı ve in vivo mide mukozasının fizyolojik maruziyet desenini tam olarak yeniden üretemez.
Farmakolojik müdahale için, etanol meydan okumasından hemen sonra üç SQBJ sulu ekstraktı (5, 10 ve 50 μg/mL) seçilip uygulandı. PI3K inhibitisyon kolunda, hücreler etanol ve optimal SQBJ konsantrasyonu ile birlikte tedavi edilmeden önce 30 dakika boyunca 20 μmol/L LY294002 ile preinkübe edildi. Pozitif bir kontrol grubu, etanol maruziyetinden hemen sonra 20 μmol/L omeprazol aldı. Omeprezol, doz eşdeğeri karşılaştırıcı yerine referans gastroprotektif ajan olarak kullanıldı. Konsantrasyon, ön sitotoksisite değerlendirmesi ve yaygın kullanılan in vitro müdahale aralıklarına dayanarak seçildi ve hücresel koruma için farmakolojik bir referans sağlamak amacıyla tasarlandı. Kontrol hücreleri, etanol veya ek ajan olmadan tam ortamda tutuldu. Tüm kuluçkalar, 37 °C'de %5 CO₂ içeren nemli bir atmosferde gerçekleştirildi. Her deneysel grup en az üç çoğaltma kuyudan oluşuyordu ve tüm protokol 3 kez bağımsız olarak yürütülüyordu.
CCK-8 yöntemiyle optimal SQBJ konsantrasyonunun belirlenmesi
Log-faz HGE/GES-1 elemanları, 1 × 104 hücre/kuyu yoğunluğunda 96 kuluk vektörlere yerleştirildi ve yapışma sağlanması için standart koşullarda (37 °C, %5 CO₂) tam RPMI-1640 ortamında gece boyunca inkübe edildi. Kültürler dört gruba rastgele ayrıldı: araç kontrolü (sadece tam ortam), düşük dozlu SQBJ müdahalesi (5 μg/mL), orta dozlu SQBJ müdahalesi (10 μg/mL) ve yüksek dozlu SQBJ müdahalesi (50 μg/mL); bu üç konsantrasyon terapötik tarama için kullanıldı ve SQBJ'nin PBS'de çözülmesiyle hazırlandı. Tüm koşullar en az üç paralel kuyuda analiz edildi ve toplam protokol üç farklı deneysel partide tekrarlandı. Belirlenen tedavi süresinden sonra, her kuyu 10 μL CCK-8 reaktifi aldı ve ardından 37 °C'de 2 saatlik kuluçka dönemi uygulandı. 450 nm'deki optik yoğunluk (OD) mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçüldü. Hücre canlılık yüzdesi (absorbance_treatment / absorbance_control) olarak %100 × olarak hesaplandı ve böylece sonraki deneyler için en etkili SQBJ konsantrasyonu belirlendi.
qPCR
Log-faz GES-1 elementleri, 6 delikli plakalarda (5 × 105 hücre/kuyyu) kültürlendi ve yapışma sağlanması için %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir kuluçka asatöründe gece boyunca 37 °C'de tutuldu. Daha sonra, hücreler önceden belirlenmiş optimal SQBJ konsantrasyonuna maruz kaldı ve başlangıç (0 saat) ile tedavi sonrası 6, 12, 24 ve 48 saat içinde sinyal moleküllerinin dinamik yanıtını belirlemek için hasat edildi. Zaman süreci sonuçlarına dayanarak, 24 saat aralığı sonraki mekanik testler için seçildi çünkü hücre stabil yaşamını korurken en güçlü sinyal yanıtını gösterdi. Her zaman noktası üç üçlü kuyu ile temsil edildi ve tüm deney bağımsız olarak 3 kez tekrarlandı.
Toplam RNA'yı özel bir ekstraksiyon reaktifi kullanarak izole ettik, verimin konsantrasyonunu ve kalitesini spektrofotometre kullanarak değerlendirdik. Tüm örneklerde 1.8 ve 2.0 aralığında A₂₆₀/A₂₈₀ absorbans oranı gösterildi. 1 μg toplam RNA'dan cDNA'yı tersine transkribe etmek için gDNA silecekli ters transkripsiyon kiti kullanıldı. Gerçek zamanlı PCR analizi, PI3K, AKT, p38, JNK, ERK ve referans gen GAPDH için primerlerle niceliksel bir PCR sistemi ile gerçekleştirildi. PCR sistemi, reaktifler ve primer sentezi hizmetinin detayları Malzemeler Tablosu'nda detaylandırılmıştır. Primerler, ilgili insan genlerinin belirli bölgelerine göre tasarlandı. qPCR protokolü: 30 saniye boyunca 95 °C'de sıcak başlatma aktivasyonu, ardından 5 saniye boyunca 95 °C'de 40 döngü denatürasyon ve 30 saniye boyunca 60 °C'de tavlama/uzatma. Hedef gen mRNA ifadesi hesaplaması, 2-ΔΔCt yöntemiyle uygulanan nisbətli nicel PCR yöntemine dayanıyordu.
ELISA
Süpernatantlar 1.200 × g. sıcaklıkta 10 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjle temizlenerek hücresel kalıntıların uzaklaştırılması için temizlendi. İnflamatuar aracıların (CRP, IL-6, TNF-α) ve oksidatif stres indekslerinin (SOD, MDA, GSH) seviyeleri, üreticilerin özel talimatlarını takip ederek ticari ELISA kitleri kullanılarak değerlendirildi. Bu hedeflerin konsantrasyon profilleri, tedarikçilerin talimatlarına göre ticari test formülasyonlarıyla doğrulandı. Her deneysel grup üç çoğaltma kuyudan oluşuyordu ve prosedür, deneysel verilerin tekrarlanabilirliğini doğrulamak için üç ayrı hücre kültürü partisi üzerinde gerçekleştirildi. Kısaca, 100 μL standart veya aydınlaştırılmış süpernatantlar önceden kaplanmış reaksiyon plakalarına dağıtıldı ve 37 °C'de 90 dakika boyunca kuluçka edildi. Üç ardışık yıkama döngüsünün ardından, her boşluğa 37 °C'de 60 dakikalık kuluçka için 100 μL spesifik tespit antikoru verildi ve ardından üç yıkama döngüsü daha yapıldı. Sonrasında substrat çözeltisi (100 μL) eklendi ve örnekler 15 dakika boyunca ışıktan korundu, ardından enzimatik reaksiyon 50 μL stop çözeltisi ile engellendi. 450 nm'de optik yoğunluk, mikroplaka okuyucu aracılığıyla tespit edildi. Konsantrasyonlar, ilgili standart eğrilerden interpolasyon yapıldı. Hücre sayısındaki farklılıklar veya tedavi kaynaklı hücre canlılığı değişikliklerinden kaynaklanan yanlılığı en aza indirmek için, MDA, SOD, GSH, CRP, TNF-α ve IL-6 profilleri, BCA testiyle belirlenen her analitik örnekteki protein içeriğine göre kalibre edilmiş ve kontrol grubuna kıyasla göreceli değerler olarak ifade edilmiştir.
DCFH-DA floresan prob kullanılarak GES-1 hücrelerinde hücre içi ROS'un tespiti
Hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) seviyelerini nicelendirmek için membran geçirimli florojenik gösterge DCFH-DA'yı kullandık. Toplanan hücreler, 10 μmol/L DCFH-DA içeren takviyesiz RPMI-1640 ile yeniden süspansiyona getirildi ve karanlıkta standart kültür koşullarında (37 °C, %5 CO₂) 20 dakika boyunca tutuldu. Serumsuz ortamla ardışık üç yıkamadan sonra, bağlanmamış probu temizlemek için floresans yoğunluğu akış sitometrisiyle 488 nm uyarılma ve 525 nm emisyonla izlendi. Her tedavi grubu için ortalama floresans yoğunluğu olarak göreceli ROS seviyeleri, CCK-8 testi kullanılarak paralel kuyruklarda belirlenen canlı hücre sayısına normalleştirilmiş ve ilgili kontrol grubuna göre ifade edilmiştir.
Mitokondriyal zar potansiyelinin (ΔΨm) belirlenmesi
Mitokondriyal membran potansiyelindeki (ΔΨm) değişiklikleri ticari bir JC-1 test seti kullanarak değerlendirdik. Kısaca, hasat edilen hücreler, kit tarafından sağlanan JC-1 boyası ve boyama tamponu karışımının eşit hacimli karışımı olan taze hazırlanmış JC-1 çalışma çözeltisinde yeniden askıya alındı ve nihai hücre konsantrasyonu 1 ×10 6 hücre/mL oldu. %5 CO₂ içeren nemli bir ortamda, %5 CO₂ içeren nemli bir ortamda 20 dakika kuluçka sonrası, beyazlatmayı önlemek için ışıktan korundu; örnek santrifüjle (800 × g., 5 dakika) toplandı ve 1 mL buzla soğutulan JC-1 boyama tamponu ile bir kez durulandı. Floresans daha sonra akış sitometrisi ile edinildi.
JC-1 agregaları (sağlam ΔΨm göstergesi) FL2 kanalı üzerinden 488 nm uyarılma ve 590 nm emisyon dalga boyları kullanılarak izlenirken, JC-1 monomerleri (ΔΨm dağılışını gösteren) 488 nm uyarılma ve 525 nm emisyon ayarlarıyla FL1 kanalı üzerinden takip edildi. ΔΨm, kırmızı-yeşil floresan sinyal oranı olarak ifade edildi; düşen değerler mitokondriyal depolarizasyonu gösterir.
Hücre içi ATP seviyesinin belirlenmesi
Mitokondriyal işlevsellik, ATP test kiti kullanılarak hücre içi ATP niceliklendirme yöntemiyle değerlendirildi. ATP içeriğini belirlemek için lusiferin–luciferaz biyolüminesans reaksiyonu kullanıldı; bu içeriğin mitokondriyal aktiviteyle doğrudan orantılıdır. Kısa süreliğine, hasat edilen hücreler buz gibi soğuk ATP lizis tamponu içinde yeniden askıya alındı ve buz üzerinde 5 dakikalık bir liz penceresi boyunca tutuldu. Santrifüjasyon daha sonra 12.000 × g. ile 4 °C'de 5 dakika boyunca gerçekleştirildi; ardından elde edilen temizlenmiş süpernatanttan 20 μL 96 kuyu beyaz opak mikroplakalara aktarıldı. Daha sonra, her boşluğa 100 μL taze hazırlanmış ATP tespit çalışma çözeltisi—uygulanan protokole uygun olarak hazırlanmış lusiferaz reaktifi ve lusiferin substratı karışımı—yerleştirildi. Ortaya çıkan lüminesans sinyali hemen bir lüminesans mikroplaka okuyucusuyla yakalandı. Göreceli ATP seviyelerini elde etmek için, ham lüminesans değerleri, ticari bir BCA protein test setiyle nicele edilen bireysel üst protein konsantrasyonlarına normalize edilmiş ve böylece hücre sayısındaki değişimler düzeltilmiştir.
Hücre apoptozunun Annexin V/PI çift boyama ile tespiti
Apoptotik hücre tespiti, üretici tarafından belirtildiği ticari bir Annexin V-FITC/PI hücre ölüm testi konfigürasyonu ile gerçekleştirildi. Yıkamadan sonra, peletler Annexin V-FITC bağlanma tamponunda 1 ×10 6 hücre/mL (örnek başına 195 μL) hücre yoğunluğuna yeniden süzüldü. Sonrasında her bağımsız tüpte 5 μL Annexin V-FITC ve ardından 10 μL PI boyama çözeltisi verildi. Numune nazikçe girdablandırıldı ve oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika kuluçka içinde tutuldu. Bu sürecin ardından apoptotik hücreler akış sitometresi ile izlendi. İlgili floresan kanallar, canlı hücreler (Annexin V⁻/PI⁻), erken apoptotik hücreler (Annexin V⁺/PI⁻) ve geç apoptotik/nekrotik hücreler (Annexin V⁺/PI⁺) arasındaki farklılaşmayı kolaylaştırdı. Her gruptaki apoptotik hücrelerin yüzdesi bu kapı parametreleri izleyerek nicelendirildi.
Western Blot
Zarlar, Bcl-2, Bax, kesilmiş Kaspaz-3, AKT, p38 MAPK, JNK, ERK1/2 ve GAPDH'ye karşı birincil antikorlarla gece boyunca 4 °C'de kuluçka edildi. Antikorlar insan örnekleri ve western blot uygulamaları için doğrulama bilgilerine göre seçildi. Antikor Kaydı veya RRID Portalı'nda kayıtları mevcut olan tüm antikorlar için RRID'ler eklendi. Hedef protein seviyeleri GAPDH'ye normalleştirildi. Standart yıkama protokollerinden sonra, lekeler oda sıcaklığında 1 saat boyunca HRP ile konjuge edilmiş ikincil antikorlara maruz bırakıldı. Bantlar ECL substrat çözeltisi kullanılarak tespit edildi. Western blot band gri değerleri dijital görüntü analiz yazılımı kullanılarak değerlendirildi.
İmmünofloresans boyama
GES-1 monokatmanları, belirtilen işlemlerden önce 24 kuyruklu plakalar içindeki cam kaplama yüzeylerinde oluşturulmuştur. Tedaviden sonra, oda sıcaklığında %4 paraformaldehit kullanılarak 15 dakika fiksasyon yapıldı, ardından PBS'de %0,3 Triton X-100 ile membran geçirimsizliği 10 dakika ve %5 sığır serum albümini ile 37 °C'de 30 dakika bloklandı. Coverslipler, AKT, p38, JNK ve ERK hedeflenmiş birincil antikorlarla 4 °C'de gece kuluçka için transfer edildi. Üç ardışık PBS yıkamasının ardından, örnekler oda sıcaklığında 1 saat boyunca floresansla konjuge edilmiş anti-tavşan ikincil antikoru ile ışıktan korunarak kuluçka altına alındı. Çekirdekleri görselleştirmek için 5 dakika boyunca DAPI karşı boyama uygulandı. Coverslipler daha sonra anti-fade reaktifiyle monte edildi ve veri toplama, hedef proteinlerin subhücre dağılımını belirlemek için konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak gerçekleştirildi. Tüm immünoflüoresans görüntüleri aynı görüntüleme parametreleri altında 20× objektif bir lens kullanılarak çekildi. Tüm temsil immünofluoresans görüntülerine 50 μm ölçülü ölçek çubukları eklendi.
İstatistiksel analiz
Nicel değerler, her bir örneği üçlü olarak doğrulanan en az üç bağımsız deneysel çalışmadan kaynaklanan ortalama ± standart sapma (SD) olarak gösterilir. İstatistiksel analizler özel sayısal analiz araçları aracılığıyla gerçekleştirildi. Birden fazla kohort arasındaki belirgin varyasyonları belirlemek için, gruplar arası karşılaştırmalar için Tukey'nin post hoc testiyle birlikte tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullandık. P iki kuyruklu eşik < 0.05 olarak belirlenen istatistiksel anlamlılık.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
SQBJ aracılı mekanizmaların mide ülserinde biyoinformatik diseksiyonu
SQBJ'nin GU'ya farmakolojik etkilerini nasıl uygulayabileceğini incelemek için, başlangıçta birincil biyoaktif bileşenlerine karşılık gelen hedefleri tahmin ettik. R programlaması kullanarak, bu biyoaktif bileşenler arasındaki gereksiz girişleri çıkardık ve temizledik ve sonunda 411 aday hedef elde ettik. Daha sonra, GU ile bağlantılı patolojik hedefler GeneCards ve OMIM platformları sorgulamasıyla ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu araştırmanın temel amacı, Panax notoginseng ve Bletilla striata'dan oluşan klasik bir TCM bileşik formülü olan SQBJ'nin, GES-1 hücre modelinde etanol tetikleyici mide mukozal epitel hasarına karşı sitoprotektif aktiviteye sahip olup olmadığını değerlendirmekti; PI3K/AKT ile ilişkili sinyal ileminin ve inflamatuar aracılar, oksidatif stres göstergeleri, mitokondriyal disfonksiyon ve apoptotik olayların azalmasıyla birlikte. Mevcut çalışmanın başlıca bulguları şunlardı...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.
Bu çalışma, Jiangsu Eyaleti Geleneksel Çin Tıbbı Bilim ve Teknoloji Geliştirme Planı Proje-Genel Proje (2023), Proje Numarası: MS2023118 tarafından finanse edilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Apoptosis assay | Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit | Beyotime | C1062L |
| ATP assay | Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 |
| Buffer | PBS | Solarbio | — |
| Cell digestion reagent | 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 |
| Cell line | GES-1 human gastric mucosal epithelial cells | Cell Bank, Chinese Academy of Sciences | SCSP-533 |
| Cell viability assay | CCK-8 reagent | — | — |
| Confocal microscope | LSM 880 confocal microscope | Zeiss | LSM 880 |
| Culture medium | RPMI-1640 | Gibco | — |
| ELISA kit | Human CRP ELISA Kit | R&D Systems | DCPR00 |
| ELISA kit | Human IL-6 ELISA Kit | R&D Systems | DTAM00D |
| ELISA kit | Human TNF-α ELISA Kit | R&D Systems | — |
| Flow cytometer | FACSCalibur / FACSCanto II | BD Biosciences | — |
| Herbal material | Bletilla striata (Thunb. ex A. Murray) Rchb. f. (tuber) | Anguo Traditional Chinese Medicine Market | Voucher No. BS-20240301 |
| Herbal material | Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen (root and rhizome) | Anguo Traditional Chinese Medicine Market | Voucher No. PN-20240301 |
| Herbal material | Sanqi Baiji San powder | In-house preparation | Voucher No. SQBJ-20240301 |
| HPLC column | ZORBAX SB-C18 column | Agilent Technologies | 4.6 mm × 250 mm, 5 μm |
| HPLC system | 1260 Infinity II HPLC system | Agilent Technologies | 1260 Infinity II |
| IF secondary antibody | Alexa Fluor 594–conjugated anti-rabbit IgG | Invitrogen | A11012 |
| Inverted microscope | CKX41 inverted phase-contrast microscope | Olympus | CKX41 |
| Luminescence reader | Infinite 200 PRO microplate reader | Tecan | Infinite 200 PRO |
| Membrane | PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 |
| Microplate reader | iMark microplate reader | Bio-Rad | iMark |
| Mitochondrial membrane potential kit | JC-1 Assay Kit | Beyotime | C2006 |
| Nuclear stain | DAPI | Beyotime | C1002 |
| Online platform | Online bioinformatics plotting platform | Bioinformatics online analysis platform | Online platform |
| Online platform | Web-based enrichment analysis platform | Metascape | Online platform |
| Oxidative stress assay | GSH Assay Kit | Beyotime | S0052 |
| Oxidative stress assay | MDA Assay Kit | Beyotime | S0131 |
| Oxidative stress assay | SOD Assay Kit | Beyotime | S0109 |
| PI3K inhibitor | LY294002 | MCE | S1105 |
| Positive control drug | Omeprazole | MCE | HY-B0053 |
| Primary antibody | AKT | Cell Signaling Technology | 4691 |
| Primary antibody | Bax | Cell Signaling Technology | 5023 |
| Primary antibody | Bcl-2 | Cell Signaling Technology | 15071 |
| Primary antibody | Cleaved Caspase-3 Asp175 | Cell Signaling Technology | 9664 |
| Primary antibody | ERK1/2 | Cell Signaling Technology | 4695 |
| Primary antibody | GAPDH | Abcam | ab8245 |
| Primary antibody | JNK / SAPK-JNK | Cell Signaling Technology | 9252 |
| Primary antibody | p-AKT Ser473 | Cell Signaling Technology | 4060 |
| Primary antibody | p-ERK1/2 Thr202/Tyr204 | Cell Signaling Technology | 4370 |
| Primary antibody | p-JNK Thr183/Tyr185 | Cell Signaling Technology | 4668 |
| Primary antibody | p-p38 MAPK Thr180/Tyr182 | Cell Signaling Technology | 4511 |
| Primary antibody | p-PI3K p85 Tyr458 / p55 Tyr199 | Cell Signaling Technology | 4228 |
| Primary antibody | p38 MAPK | Cell Signaling Technology | 8690 |
| Primary antibody | PI3K p85 | Cell Signaling Technology | 4257 |
| Primer | AKT forward | — | — |
| Primer | AKT reverse | — | — |
| Primer | ERK forward | — | — |
| Primer | ERK reverse | — | — |
| Primer | GAPDH forward | — | — |
| Primer | GAPDH reverse | — | — |
| Primer | JNK forward | — | — |
| Primer | JNK reverse | — | — |
| Primer | p38 forward | — | — |
| Primer | p38 reverse | — | — |
| Primer | PI3K forward: | — | — |
| Primer | PI3K reverse | — | — |
| Protease inhibitor | PMSF | Beyotime | ST506 |
| Protein assay | BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0010 |
| Protein lysis buffer | RIPA buffer | Beyotime | P0013B |
| Public database | DrugBank | DrugBank Online | Online database |
| Public database | GeneCards | Weizmann Institute of Science | Online database |
| Public database | Online Mendelian Inheritance in Man | Johns Hopkins University | Online database |
| Public database | PubChem compound database | National Center for Biotechnology Information | Online database |
| Public database | RCSB Protein Data Bank | RCSB PDB | Online database |
| Public database | STRING protein interaction database | STRING Consortium | Online database |
| Public database | Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform | TCMSP | Online database |
| Public database | Universal Protein Resource | UniProt Consortium | Online database |
| Real-time PCR system | CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 |
| Reverse transcription kit | PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser | Takara Bio | RR047A |
| RNA extraction reagent | TRIzol reagent | — | — |
| ROS probe | DCFH-DA | Beyotime | S0033 |
| Secondary antibody | HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 7074 |
| Software | Cytoscape | Cytoscape Consortium | 3.9.1 |
| Software | GraphPad Prism | GraphPad Software |