Kortizol Tespitini Artırmak İçin Tükürük Ön Tedavisi İçin Elde Taşınan Cihaz

Özet

Bu protokol, kortizol tespitini iyileştirmek için hızlı tükürük ön tedavi yöntemini tanımlar. Elde tutulan bir filtrasyon cihazı, hedef analiti koruyarak müsinleri ve diğer parazit maddeleri çıkarmak için kullanılır. Önceden işlenmiş tükürük, daha tutarlı ve tekrarlanabilir test performansını sağlar.

Özet

Tükürük kortizol tespiti, kan bazlı analizlere invaziv olmayan bir alternatif sunar. Ancak, pratik uygulaması tükürüğün içsel viskozitesi ve müdahaleci bileşenlerin varlığı nedeniyle sınırlıdır. Özellikle, müsinler ve tükürük proteinleri kapiller kaynaklı akışı engeller ve sonraki lateral akış testlerinin (LFA) güvenilirliğini zayıflatır; bu nedenle etkili ve erişilebilir ön tedavi stratejileri gereklidir. Burada, noktada kortizol tespiti için SaliFilter adı verilen elde tutulan tükürük ön tedavi cihazını sunuyoruz. Cihaz, yüksek moleküler ağırlıklı interferens eden bileşenleri seçici olarak çıkaran ve kortizol dahil küçük moleküllerin geçişine izin veren bir filtrasyon mekanizması kullanır. Basit manuel basınçla çalışılan bu cihaz, harici ekipmana ihtiyaç duymadan hızlı örnek işleme (~2 dakika) mümkün kılar ve merkeziyetsiz ortamlar için uygundur. Cihazın performansı, bulanıklık ölçümleri, protein miktarı ve SDS-PAGE kullanılarak değerlendirildi; bu da müsin ve tükürük proteinlerinin verimli şekilde çıkarıldığını doğruladı. İşlenmiş örneklerde kapiler akışın artması gösterildi ve bu da kararlı ve güvenilir LFA çalışması sağladı. Nicel analiz, sinyal tekrarlanabilirliğinin arttığını gösterdi ve kortizol tespiti, klinik olarak ilgili konsantrasyon aralıklarında 1.47 ng mL⁻¹ tespit sınırı sağladı. Bu protokol, analit bütünlüğünü tehlikeye atmadan analitik hassasiyeti ve güvenilirliği artıran etkili bir tükürük ön tedavi stratejisi oluşturur. Önerilen yaklaşım, tükürük tabanlı tanılar için pratik ve taşınabilir bir çözüm sunar ve bakım noktası testi ile kendi kendini izleme için potansiyel uygulanabilirlik sunar.

Giriş

Adrenal korteks tarafından salgılanan bir glukokortikoid hormon olan kortizol, fizyolojik stres ^1,2'nin değerlendirilmesinde önemli bir biyobelirteçtir. Serum, plazma, idrar, interstisiyel sıvı ve tükürük dahil olmak üzere birden fazla biyolojik sıvıda ölçülebilir; klinik uygulamada en yaygın kullanılan kan ve^{tükürüktür3}. Kan bazlı ölçümler güvenilir nicel bilgi sağlamakla birlikte, invaziv veniptura ve eğitimli personel gerektirir; bu da sık veya uzunlamasına izleme için uygunluklarını^{sınırlar. 4,5,6}. Buna karşılık, tükürük kortizol ölçümü, bakım noktası ve kendi kendini izleme uygulamalarını mümkün kılan invaziv olmayan ve pratik bir alternatif^{sunar 7,8}. Özellikle, tükürük kortizol seviyeleri kan konsantrasyonlarıyla güçlü şekilde korelasyondur ve tükürüğü güvenilir bir taşıyıcı örnek^{olarak destekler 9}. Ancak, tükürüğün içsel viskozitesi ve müdahaleci bileşenlerin varlığı analitik performansı önemli ölçüde engeller ve analiz öncesi etkili ön tedavi gerektirir 10,11,12.

Bu zorlukları ele almak için çeşitli ön tedavi stratejileri araştırılmıştır. Santrifüjleme, müsinler, proteinler ve hücresel kalıntılar gibi büyük bileşenleri çıkarmak için yaygın olarak kullanılır. Ancak, hacimli laboratuvar ekipmanları ve çoklu işlem adımları gerektirir, bu da merkeziyetsiz ortamlarda uygulanabilirliğini^{sınırlar 13,14}. Tampon çözeltileriyle seyreltme, viskoziteyi azaltabilir ve örnek^{akışını iyileştirebilir 15}. Buna rağmen, aynı anda analit konsantrasyonunu düşürür ve böylece analitik duyarlılığı zayıflar. Sonuç olarak, mevcut yaklaşımlar hızlı ve ekipmansız işleme ve hedef analizlerin korunması gereken bakım noktası uygulamaları için yetersizdir.

Bu sınırlamaları aşmak için, tükürük ön tedavisi için kullanılan ve bakım noktasında kortizol tespitine uygun elde taşınan bir cihaz olan SaliFilter'i geliştirdik. Cihaz, yüksek moleküler ağırlıklı interferant maddeleri seçici olarak çıkaran ve kortizol¹⁶ dahil küçük moleküllerin geçişine izin veren bir filtrasyon mekanizması kullanır. Manuel olarak çalıştırılan cihaz, harici enstrümantasyon gerektirmeden hızlı ve kullanıcı dostu işlem sağlar. Müdahaleci bileşenleri ortadan kaldırarak, bu yaklaşım lateral akış testlerinde kapiller akışı iyileştirir ve böylece analitik güvenilirliği artırır. Bu protokol, cihazın üretimini ve kortizol tespit öncesinde hızlı tükürük ön tedavisinde yan akış testleriyle kullanımını açıklar.

Protokol

Bu çalışmada ticari olarak elde edilen, kimliği dezenfekte edilmiş havuzlanmış insan tükürüğü kullanıldı. İnsan katılımcılar alınmadı ve kurumsal etik onayı gerekmiyordu.

1. Tükürük örneği hazırlama

1. Katılımcılara numune toplamadan önce en az 30 dakika boyunca yemekten veya içmekten kaçınmalarını söyle.
2. Tükürük örneğini tedarikçinin talimatlarına göre hazırlayın.
   NOT: Bu çalışma, protokol düzeyinde doğrulama için ticari olarak mevcut olan havuzlanmış insan tükürüğü kullandı.
3. Kullanımdan önce tükürük örneğini nazikçe karıştırarak homojenliği sağlanır.
4. Tükürük örneklerini 4 °C'de saklayıp tedarikçinin tavsiye ettiği depolama süresi içinde kullanın.

2. RBCM kaplı zarın hazırlanması (Şekil 1A)

1. Önceden bildirilen protokol^16'ya göre tam kandan RBCM'yi izole edin.
   1. Ticari olarak elde edilen K2EDTA ile antikoagüllenmiş insan tam kanını RBCM kaynağı olarak kullanın.
   2. Tüm kanı 800 × g ile 5 dakika boyunca santrifüjle yapın ve plazma ile buffy tüyünü çıkardıktan sonra kırmızı kan hücresi fraksiyonunu toplayın.
   3. İzole kırmızı kan hücresi pelletini nazik manuel karıştırma ile buz gibi 1× fosfatlı tuzlu (PBS) ile üç kez yıkayın.
   4. Yıkanmış kırmızı kan hücresi pelletini buz gibi 0,25× PBS içinde 30 dakika boyunca tekrar askıya alın ve hemoliz indüklensin.
   5. Serbest hemoglobini, lizlenmiş süspansiyonu 20.000 × g ile 30 dakika boyunca santrifüjlenerek ve RBCM pelletini toplayarak ayırın.
   6. Toplanan RBCM pelletini 0,25× PBS ile üç kez daha yıkayın ve soluk pembe RBCM pelletini −80 °C'de daha fazla kullanıma kadar saklayın.
2. 30 nm gözenek boyutu ve 13 mm çapında bir polietersülfon (PES) membranı hazırlanır.
3. PES membranının bir tarafına %2 (w/v) RBCM çözeltisi 100 μL biriktirin. Çözeltiyi nazikçe yayın veya damla olarak dağıtın, ta ki tüm membran yüzeyi tamamen ıslanana kadar.
4. Membranı 50 °C'de 30 dakika boyunca inkubasyon yapın, böylece kaplama ve kurutma sağlanır.
5. Kaplı membranı oda sıcaklığında saklayıp hazırlıktan sonraki 15 gün içinde^{kullanın 17}.
   NOT: RBCM kaplı PES membranının ayrıntılı karakterizasyonu önceki^{çalışmamızda tanımlanmıştır 16}.

3. SaliFilter cihazının üretimi (Şekil 1B)

1. RBCM kaplı membranı belirlenen filtre tutucuya yerleştirin.
2. Cihazı giriş ve çıkış bileşenlerini güvenli bir şekilde bağlayarak monte edin.
3. Cihazın girişine 1 mL bir şırınga takın.
   DIKKAT: Çalışma sırasında sızıntıyı önlemek için tüm bileşenlerin sıkıca kapatıldığından emin olun.

4. Tükürük ön tedavisi

1. SaliFilter cihazına bağlı şırıngaya 500 μL tükürük yükleyin.
2. Tükürük örneğini zardan geçirmek için nazik manuel baskı uygulayın (~ 2 dakika).
3. Önceden işlenmiş tükürüğü çıkıştan toplayın.
4. Önceden işlenmiş örneği hemen kullanın veya daha fazla analiz yapılana kadar 4 °C'de saklayın.

5. Tükürük proteinlerinin SDS-PAGE analizi

1. 15 μL örnek ile 5 μL Laemmli örnek tamponu karıştırın.
2. Karışımı %8 SDS-PAGE jelinin ayrı kuyularına yükleyin.
3. 150 V'da 40 dakika boyunca elektroforez yapın.
4. Jeli Coomassie mavisiyle 2 saat boyayın.
5. Jeli gece boyunca damıtılmış suda defile edin.
6. Jelin fotoğraflarını bir akıllı telefon veya görüntüleme sistemi ile çekin.

6. Lateral Flow Assay (LFA) ile kortizol tespiti

1. LFA şeridinin örnek pedine 150 μL önceden işlenmiş tükürük uygulayın.
2. Numunenin şerit boyunca 10 dakika boyunca hareket etmesine izin verin.
3. Test sonuçlarının görüntülerini bir akıllı telefon veya görüntüleme sistemi kullanarak yakalayın.
4. ImageJ'de LFA görüntüsünü açın ve RGB kanallarını ayırmak için Image > Color > Split Channels ile kullanın.
5. Test çizgisi yoğunluk analizi için yeşil kanal görüntüsünü kullanın.
6. Test çizgisini kapsayan 100 × 10 piksellik dikdörtgen bir İlgi Bölgesi (ROI) seçin ve tüm şerit görüntülerine aynı yatırım getirisi boyutunu uygulayın.
7. Test hattı ROI'nin ortalama yoğunluk değerini ölçün. Aynı yatırım getirisi boyutuna sahip bitişik bir boş zar bölgesi seçin ve arka plan yoğunluğunu ölçün.
8. Normalleştirilmiş test çizgisi yoğunluğunu şu şekilde hesaplayın: normalleştirilmiş yoğunluk = test çizgisi şiddeti − arka plan yoğunluğu.

7. İstatistiksel analiz

1. Nicel verileri ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunun, aksi belirtilmedikçe. Hata çubuklarını SD olarak tanımlayın.
   NOT: Bu çalışmada, bildirilen tüm N değerleri, ticari olarak elde edilen insan tükürüğü aliquotları kullanılarak yapılan teknik tekrarları temsil etmektedir.
2. 0–8 ng mL⁻¹ kortizol konsantrasyonlarından elde edilen normalize test çizgisi yoğunluk değerleriyle doğrusal regresyon analizi yapın ve uyarlanan eğriden belirlenme katsayısını (R²) hesaplayın.
3. Tespit sınırını (LOD) aşağıdaki denklekle hesaplayın: LOD = 3.3 × SE / |eğim|, burada SE, y-kesişme ve |eğim| standart hatasıdır. doğrusal regresyon denkleminden elde edilen eğimin mutlak değeridir. Eğimin mutlak değerini kullanın çünkü rekabetçi LFA negatif eğim üretir.
   NOT: Bu çalışmada herhangi bir çıkarımsal istatistiksel test yapılmadı ve herhangi bir anlamlılık kriteri uygulanmadı.

Sonuçlar

Etkili tükürük ön tedavisi, aşağı akış analitik performansını olumsuz etkileyen müsinler ve proteinler dahil olmak üzere parazit bileşenlerin çıkarılmasını gerektirir. SaliFilter'in filtrasyon kapasitesi ilk olarak ticari tükürük toplama kitleriyle elde edilen bulanıklık değişiklikleriyle karşılaştırılarak değerlendirildi (Şekil 2A). İşlenmemiş tükürük yüksek bulanıklık gösterirken, SaliFilter ile işlenmiş örnekler gözle görülür şekilde berrak görünüyordu ve...

Tartışma

Tükürük tabanlı tanılar, kan analizine invaziv olmayan bir alternatif sunar. Ancak, tükürüğün içsel viskozitesi ve müsinler, proteinler gibi müdahaleci bileşenlerin varlığı nedeniyle daha geniş benimsenmeleri kısıtlanmıştır. Bu faktörler, kapiller kaynaklı akışı bozur ve LFA'lar dahil basit analitik platformların performansını zayıflatır; bu nedenle etkili örnek ön işleme gereklidir.

Bu çalışmada, önerilen el filtrasyon cihazı SaliFilter'in, kortizol gibi küçü...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Artificial saliva	Solarbio, China	A7990
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent	Bio-Rad, USA	5000006	Bradford tayini için
Coomassie blue	Abcam, UK	ab119211	Protein band görselleştirme için
Cortisol ELISA Kiti	Abcam, UK	ab154996
Cortisol LFA	Şirket içi
Sıcak plaka	Daihan Scientific, Kore Cumhuriyeti)
Hydrokortizon (Kortizol)	Sigma-Aldrich, USA	PHR1014
Laemmli örnek tamponu	GenDEPOT, USA	L1200-001	SDS-PAGE öncesi protein denatürasyonu için
Membran tutucu	GVS Filter Technology	1220950	13mm çaplı tutucu
Mini-PROTEAN® Tetra Cell for 0.75 mm Jel	Bio-Rad, USA	1658000	Jel elektroforezi için
Muksin	Sigma-Aldrich, USA	M2378
NanoDrop 2000 spektrofotometre	Thermo Fisher Scientific, USA		Protein tayini için
PES membranlar	STERLITECH, USA	PES00313100	0.03 Mikron, 13 mm PES membran
Fosfat tamponlu salin (PBS)	DUKSAN, Kore Cumhuriyeti	LB004
Grup İnsan Tükürüğü	Innovative Research Inc., USA	IRHUSL5ML
RBCM	Şirket içi
PAGE için Çözücü Jel Tamponu	Bio-Rad, USA	1610798	Çözücü jel hazırlanması için
Salivette Kortizol	SARSTEDT, Almanya	51.1534.500	Tükürük toplama kiti
PAGE için Katıştırma Jel Tamponu	Bio-Rad, USA	1610799	Katıştırma jel hazırlanması için
Super•SAL™	Oasis Diagnostics, USA	SSAL-601	Tükürük toplama kiti
Şırınga	koreavaccine, Kore Cumhuriyeti)		1 mL hacim
TEMED	Bio-Rad, USA	1610800	Akrilamid polimerizasyonu için