$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu veritabanı tabanlı hesaplamalı çalışma, insan katılımcıları, hayvan deneyleri veya klinik örnekleri içermez. Çin'in İnsan Denekler İçin Yaşam Bilimleri ve Tıbbi Araştırmaların Etik İnceleme Ölçümleri'nin 32. Maddesine göre, yasal olarak elde edilen halka açık verileri kullanan, insan deneklere zarar vermeyen, hassas kişisel bilgi içermeyen ve ticari çıkarları olmayan çalışmalar etik incelemeden muaf tutulmaya hak kazanır. Bu nedenle, bu çalışma için etik onay gerekmemektedir.
Bu çalışmanın deneysel tasarımı ve analitik hattı akış şeması (Şekil 1) ile gösterilmiştir.
Şekil 1: Çalışmanın Genel İş Akışı. Akış şeması, ağ farmakolojisi ve moleküler kenetlenme analizlerinin ardışık iş akışını göstermektedir; bunlar arasında Sishen Demlendirmesinin (SSD) aktif bileşenleri ve hedeflerinin alınması, gut ile ilgili hedeflerin toplanması, örtüşen hedeflerin tanımlanması, ilaç-bileşen–hedef-hastalık ağı ve protein-protein etkileşimi (PPI) ağının inşası dahil, Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizleri yer alır. ve moleküler kenetlenme simülasyonları ile birlikte çalışmalarını içerir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
SSD'nin Aktif Bileşenleri ve Hedef Proteinlerinin Edinimi
2 Ocak 2026'da, SSD'yi oluşturan beş bitkinin aktif kimyasal bileşenleri olan Huangqi, Yuanzhi, Huainiuxi, Shihu ve Jinyinhua, Geleneksel Çin Tıp Sistemleri Farmakolojisi (TCMSP)veritabanı 21'den alındı. Farmakokinetik özelliklere dayalı tarama kriterleri uygulandı: oral biyoerişilebilirlik (OB) %30 ≥ ve ilaç benzerliği (DL) ≥0.1822. Bu kriterleri karşılayan bileşenler potansiyel aktif bileşenler olarak kabul edildi. Her bileşen için ilgili hedefler toplandı. TCMSP, Yuanzhi ve Shihu için tam veri içermediğinden, bu iki bitkinin kimyasal bileşenleri aynı gün Herb 2.0 veritabanından da alındı. Bileşen isimleri alındıktan sonra, TCMSP'de bileşen isimleri ve ilgili CAS numaraları anahtar kelime olarak kullanılarak hedef bilgiyi almak için ters arama yapıldı. Herb veritabanından elde edilen bileşikler için, yalnızca bileşen adı veya CAS numarası ile TCMSP'deki girişlerle başarılı eşleştirilenler korundu. Eşleşen bileşikler daha sonra aynı farmakokinetik tarama kriterlerine (OB ≥% 30 ve DL ≥ 0.18) uygulandı ve tam OB veya DL bilgisi olmayan bileşikler dışlandı. Tüm eşleştirilen ve filtrelenen bileşikler, yanlış tanımlamayı önlemek için orijinal Herb 2.0 kayıtlarıyla manuel olarak doğrulandı. Daha sonra, Herb veritabanından elde edilen hedef bilgiler, kalan bitkilerle birleştirilerek SSD için tam aktif madde hedefleri seti oluşturuldu.
Alınan tüm hedef proteinler, UniProt veritabanı kullanılarak resmi gen sembollerine standartlaştırıldı. Bire bir karşılık, yalnızca insan tarafından incelenmiş (İsviçre-Prot) girişlerin tutulması ve incelenmemiş (TrEMBL) girişlerin hariç tutulmasıyla kuruldu. Birden fazla izoform aynı gen sembolüne karşılık geldiğinde, kanonik izoform seçilirdi. Standartlaştırılmış hedef veri seti, sonraki kesişen gen analizi için korundu.
Gut ile İlgili Hedeflerin Toplanması
2 Ocak 2026'da, GeneCards veri tabanı ve OMIM veritabanında sistematik aramalar yapıldı; hastalık anahtar kelimesi olarak "gut" kelimesi kullanılarak gutla ilişkili hastalık hedefleri belirlendi. İki veritabanından elde edilen hedefler WPS Elektronik Tabloları'na (sürüm 12.1.0) aktarıldı. OMI'den Gen Sembolü sütunu, GeneCards'taki Gen Sembolü sütununun yanına yerleştirildi ve yetkili hedefler, resmi gen sembollerinin tam eşleşmelerine göre "Kopyaları Kaldır" fonksiyonu kullanılarak küçük harf duyarsız şekilde kaldırıldı. İki veritabanındaki hedefler daha sonra birleştirilerek gut ilişkili hastalık hedeflerinden oluşan kapsamlı bir set oluşturuldu.
İlaç-hastalık Örtüşen Hedeflerin Tanımlanması
Aktif bileşen taramasından elde edilen ilaç hedef seti ile gut ilişkili hastalık hedef seti aynı proje klasörüne (D:\Venn) yerleştirildi. R yazılımı (sürüm 4.4.0) başlatıldı ve readxl paketi, hedef listeleri içeren Excel (.xlsx) dosyalarını içe aktarmak için kullanıldı. dplyr paketi, veri işleme için, kesişim analizinden önce sütunların filtrelenmesi ve yeniden adlandırılması için kullanıldı. İki hedef kümesi karakter vektörlerine dönüştürüldü ve örtüşen hedefler VennDiagram paketinden calculate.overlap() fonksiyonu kullanılarak belirlendi. VennDiagram paketi, CRA'dan install.packages("VennDiagram") komutu kullanılarak kuruldu ve varsayılan R kütüphane yolunda saklandı. Paketin zaten kurulduğunu gösteren bir mesaj belirdiğinde, kurulum başarılı sayılırdı. Çalışma dizini, giriş dosyalarını içeren klasörü belirleyen ve çıkış dizini olarak hizmet veren setwd("D:\\Venn") komutuyla ayarlandı. Daha sonra R yazısı, ilaç hedef seti ile gut ilişkili hastalık hedef seti arasındaki kesişimi hesaplamak için çalıştırıldı. Ortaya çıkan örtüşen hedefler, gut tedavisi için SSD'nin potansiyel terapötik hedefleri olarak tanımlandı.
"İlaç-Bileşen-Hedef-Hastalık" Ağı'nın İnşası
SSD hedefleri ile gut ile ilgili hedefler arasındaki örtüşmeden tespit edilen kesişen genler overlapping_targets.txt dosyası olarak kaydedildi ve SSD'nin aktif bileşen bilgileri drug_components.txt dosyası olarak kaydedildi. Her iki dosya da analiz için çalışma dizini olarak hizmet veren proje klasörüne (D:\Network) yerleştirildi. Tekrarlanabilirliği sağlamak için bu analiz R kullanılarak gerçekleştirildi. Veri okuma, filtreleme ve birleştirme işlemleri, read.table(), write.table() ve merge() gibi temel R fonksiyonlarının birleşimi ile veri çerçevesi manipülasyonu için dplyr paketi kullanılarak gerçekleştirildi. setwd("D:\Network") komutu çalışma dizinini açıkça tanımlamak için çalıştırıldı.
graph_from_data_frame() fonksiyonu temel entegrasyon fonksiyonu olarak kullanıldı. Her drug_components.txt satırı, resmi gen sembolleri kullanılarak aktif bir bileşeni ilgili hedef genine bağlardı. Yalnızca overlapping_targets.txt'de bulunan hedefler korundu ve kesişim gereksiniminin ötesinde ek bir filtreleme uygulanmadı. Ortaya çıkan ağ veri seti, kenar listesi formatında network.txt olarak dışa aktarıldı. Her satırda iki sütun (node1 ve node2) bulunurdu; burada node1 ya SSD formülünü ya da aktif bir bileşeni, node2 ise aktif bileşeni veya hedef geni temsil ederdi. Hastalık düğümü ("gut") SSD formülüne ayrı bir kenar olarak bağlanmıştı. Kenar ağırlıkları verilmedi ve tüm kenarlar eşit şekilde muamele edildi (kenar genişliği = 0.8).
network.txt dosyası Cytoscape (sürüm 3.7.2) ağ görselleştirme yazılımına aktarıldı. Yerleşik NetworkAnalyzer aracı, temel ağ yapısı elde etmek için Tools → Network Analysis → Analyze Network aracılığıyla erişildi ve analitik çerçeve olarak "Derece Dağılımı" seçildi. Düğüm şekilleri ve renkleri düğüm tiplerine göre atandı: mavi elmaslar SSD formülünü, mavi dikdörtgenler aktif bileşenleri, turuncu elipsler hastalık hedef genlerini, kırmızı sekizgenler ise gut hastalığı varlığını temsil ediyordu. Düğüm boyutu düğüm derecesine orantılı olarak ayarlandı (düğüm boyutu = 30 + derece × 5, maksimum boyut = 100).
Protein–Protein Etkileşimi (PPI) Ağının İnşası
Kesişen hedef genlerin filtrelenmiş kümesi, 2 Ocak 2026'da STRING veritabanına (sürüm 12.0) aktarıldı. Tür Homo sapiens ile sınırlandırılmış, minimum etkileşim güven eşiği yüksek güvenliğe (0.700) ayarlanmış, bağlantısı kopuk proteinler gizlenmiş, etkileşim kaynakları tüm mevcut kanıt kanallarını içeriyor ve bilinen ve tahmin edilen protein-protein etkileşimlerini elde etmek için diğer tüm parametreler varsayılan ayarlarında tutulmuştu. Ortaya çıkan ağ verileri, varsayılan dışa aktarma seçenekleri kullanılarak sekmeden ayrılmış değerler (TSV) formatında dışa aktarıldı.
İhtır edilen ağ, görselleştirme ve topolojik analiz için ağ görselleştirme yazılımına aktarıldı. Ağ özellikleri, yerleşik NetworkAnalyzer aracı (Tools → Network Analysis → Analyze Network kullanılarak hesaplandı). Hesaplanan metrikler arasında derece, aralık merkezi ve yakınlık merkezi yer alıyordu. Düğüm boyutları, sürekli bir eşleme fonksiyonu kullanılarak derece değerlerine eşlenmiştir (düğüm boyutu = 20 + derece × 3, maksimum boyut = 80).
Merkez hedefleri, tüm düğümler derece değerlerine göre azalan sırayla belirlendi. Daha yüksek derece değerlerine sahip düğümler ağ içinde daha merkezi kabul edilirdi. İzole düğümler (derece = 0) görselleştirmeden hariç tutuldu. Ağ düzeni, düğüm bağlantısına göre merkezden dışa doğru konsantrik daireler halinde düzenlenmiş ve düğüm renkleri, artan derece değerlerine karşılık gelen mavi-camgöbbür gradyanı kullanılarak haritalanmıştır. Ortaya çıkan ağ, SSD'nin guta karşı potansiyel terapötik etkilerinde yer alan çekirdek hub hedeflerini belirlemek için kullanıldı.
Gen Ontolojisi (GO) Zenginleştirme Analizi
Belirlenen örtüşen hedef genlere dayanarak, GO fonksiyonel zenginleştirme analizi R kullanılarak gerçekleştirildi. Gerekli Biyoiletken paketleri varsayılan R kütüphane yoluna yüklendi ve analiz ortamına yüklendi. Kesişen gen dosyası proje dizininde (D:\GO) saklanıyor ve çalışma dizini setwd() fonksiyonuyla tanımlanıyordu.
Gen tanımlayıcı dönüşümü ve açıklaması Bioconductor paket org kullanılarak gerçekleştirildi. Hs.eg.db (sürüm 3.20.0). Resmi gen sembolleri, clusterProfiler zenginleştirme analiz paketinde (sürüm 4.21.0) bitr() fonksiyonu kullanılarak Entrez Gen Kimliklerine dönüştürüldü. Sadece benzersiz bire bir eşlemeler gösteren genler sonraki analizler için korundu, belirsiz veya haritalanmamış girişler ise hariç tutuldu.
GO zenginleştirme analizi zenginleştirme analiz paketi kullanılarak yapılmıştır. EnrichGO() fonksiyonu, ontoloji kategorileri olan Biyolojik Süreç (BP), Hücresel Bileşen (CC) ve Moleküler Fonksiyon (MF) ile birlikte kullanılmıştır. İstatistiksel anlamlılık Benjamini–Hochberg çoklu test düzeltme yöntemi kullanılarak belirlendi ve ayarlanmış P< 0.05 anlamlı olarak değerlendirildi.
Her ontoloji kategorisi için, önemli ölçüde zenginleştirilmiş terimler zenginleştirme faktörüne göre sıralandı:
EF = (gen sayısı / toplam arka plan genleri) ÷ (terim büyüklüğü / toplam genom genleri)
Detaylı analiz için en iyi 10 terim seçildi. Aynı zenginleştirme faktörleri ortaya çıktığında, daha düşük ayarlanmış P-değerlerine sahip terimler daha yüksek sıralanmıştır.
Zenginleştirme sonuçları ggplot2 (sürüm 3.5.1) ve enrichplot (sürüm 1.24.0) kullanılarak görselleştirildi. Baloncuk grafikleri ve çubuk grafikler dotplot() ve barplot() fonksiyonları kullanılarak oluşturuldu. Balon büyüklüğü zenginleştirilmiş genlerin sayısını temsil ederken, renk zenginleşme anlamlılığına karşılık gelir ve −log10 (ayarlanmış P-değeri) olarak ifade edilirdi. Varsayılan çizim parametreleri her zaman kullanıldı.
KEGG Yol Zenginleştirme Analizi
SSD ve gut kesişen hedeflerinin KEGG yol zenginleştirme analizi, R ve daha önce açıklanan zenginleştirme analiz paketi kullanılarak gerçekleştirildi. Gen sembolleri, zenginleştirme analiz paketi tarafından sağlanan bitr() fonksiyonu kullanılarak KEGG uyumlu tanımlayıcılara dönüştürüldü ve KEGG annotasyon kaynağı olarak hizmet verdi. Yol zenginleştirme analizi, hipergeometrik teste dayalı enrichKEGG() fonksiyonu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. İstatistiksel anlamlılık Benjamini–Hochberg (BH) çoklu test düzeltme yöntemiyle belirlendi ve ayarlanmış P-değeri 0.05 < yollar anlamlı zenginleştirilmiş olarak kabul edildi.
Zenginleştirme sonuçları, Openxlsx paketi (sürüm 4.2.8.1) ve write.xlsx() fonksiyonu kullanılarak Microsoft Excel uyumlu çalışma defteri dosyalarına aktarıldı ve ardından inceleme ve şekil hazırlama için kullanıldı.
Daha sonra ağ görselleştirme yazılımı kullanılarak çok katmanlı bir hedef–yol etkileşim ağı oluşturuldu. Ağ verileri, File → File from File → Network ile ithal edildi. Düğümler, hedef gen düğümlerinden ve önemli ölçüde zenginleştirilmiş KEGG yol düğümlerinden oluşuyordu (BH ile ayarlanmış P-değeri < 0.05), kenarlar ise hedef genler ile zenginleştirilmiş yollar arasındaki belgelenmiş ilişkileri temsil ediyordu. Ağ görselleştirme, ağ görselleştirme yazılımının Style paneli kullanılarak gerçekleştirildi; hedef genler gri elips olarak, yollar ise camgöbeği dikdörtgenler olarak gösterildi. Ek eklenti kullanılmadı. Ağ, temel hedefler ile önemli ölçüde zenginleştirilmiş yollar arasındaki ilişkileri görselleştirmek için zenginleştirme çıktı tablosundan manuel olarak oluşturuldu.
Moleküler Kenetlenme Doğrulaması
"İlaç–bileşen–hedef–hastalık" ağında hedef bağlantıya göre sıralanan en iyi 10 aktif bileşenin 3D yapı dosyaları (MOL2 formatı) TCMSP veritabanından indirildi. Hedef bağlantı, düğüm derecesi olarak tanımlandı (yani, aktif bir bileşen ile ağdaki hedef genler arasındaki doğrudan bağlantı sayısı). Aktif bileşenler, derece değerlerine göre azalan sırayla sıralandı ve moleküler kenetlenme analizi için en iyi 10 bileşen seçildi.
PPI ağından tanımlanan en üst 10 hub hedef proteinin kristal yapıları, 23 Ocak 2026'da RCSB Protein Veri Bankası'ndan (PDB) alınmıştır. Tür, sadece Homo sapiens ile sınırlıydı. Her hedef protein için, mutasyonsuz en yüksek kristalografik çözünürlüğe (en düşük şdeğerine) sahip yapı tercihli olarak doğal ligand veya inhibitörle birlikte kristalize edilmiştir. Birden fazla yapı bu kriterleri karşılıyorsa, en yüksek çözünürlüklü ve en tam protein dizisi kapsayıcısına sahip yapı seçilirdi. Aşağıdaki PDB yapıları kullanılmıştır: 1GKC (MMP9), 5WHH (BCL2), 2P33 (JUN), 1RHJ (CASP3), 1WT5 (EGFR), 7APJ (AKT1), 1DU3 (TNF), 1T4Q (IL1B), 4NI9 (IL6) ve 9CKJ (TP53).
Moleküler kenetlenme simülasyonları, CB-Dock 2 çevrimiçi sunucusu (web versiyonu, 23 Ocak 2026 erişim tarihi) kullanılarak gerçekleştirildi; bu sunucu kenetlenme motoru olarak AutoDock Vina'yı kullanıyor. Protein yapıları, sunucu tarafından otomatik olarak ön işlenir; heteroatomların çıkarılması ve reseptör yapılarının hazırlanması dahil. Ligandlar MOL2 formatında yüklendi. Şablondan bağımsız çürük tespiti kullanıldı ve her protein yapısı için otomatik olarak beş potansiyel bağlanma boşluğu tespit edildi. Kenetlenme hesaplamaları, kenetlenme motorunun varsayılan parametreleri kullanılarak yapıldı: tükeniksizlik = 8, enerji aralığı = 4 ve maksimum bağlama modları sayısı = 9.
Her hedef–bileşik çifti için, tespit edilen beş boşluk içinde bağımsız olarak kenetlenme gerçekleştirildi. Kenetleme pozları, kenetlenme motoru puanlama fonksiyonu kullanılarak değerlendirildi ve her boşlukta en düşük bağlanma enerjisine sahip poz, o boşluğun temsilci konformasyonu olarak korundu. Beş temsilci konformasyon arasında, küresel olarak en düşük bağlanma enerjisine sahip kenetleme pozu, o hedef–bileşik çifti için nihai kenetlenme sonucu olarak seçildi ve sonraki analizler için kullanıldı.
Her kenetlenme sonucu için elde edilen en düşük bağlama enerjisi değeri, bir elektronik tabloya kaydedildi ve varsayılan parametrelerle bir ısı haritası oluşturmak üzere Weishengxin çevrimiçi grafik platformuna (erişim tarihi: 23 Ocak 2026) aktarıldı. Isı haritası, sarıdan kırmızıya renk gradyanı, tam bağlantı hiyerarşik kümeleme ve kümeleme metrikleri olarak Öklid mesafesini kullandı.
Hidrojen-bağ etkileşimleri, geometrik kriterlere dayanarak kenetlenme sunucusu analiz modülü tarafından otomatik olarak tanımlandı. Hidrojen bağı, donör-alıcı mesafesi 3,5 şve donör-hidrojen-alıcı açısı 120° ≥≤ etkileşim olarak tanımlanmıştır. Hidrojen bağları, hem iki boyutlu hem de üç boyutlu etkileşim diyagramlarında kesik çizgiler olarak gösterildi. Tüm kenetlenme kombinasyonları arasında küresel olarak en düşük bağlanma enerjisine sahip hedef protein-aktif bileşen çifti, ayrıntılı etkileşim analizi için seçildi. Bu seçim, bireysel bir kenetlenme pozisyonu yerine tek bir hedef–bileşik çiftine dayanıyordu ve ağ içindeki en güçlü tahmini etkileşimi belirlemeyi amaçlamıştı. Bu hedef-bileşik çiftine karşılık gelen son temsilci kenetlenme pozu, görselleştirme ve etkileşim analizi için kullanıldı.
Üç boyutlu ve iki boyutlu etkileşim diyagramları sırasıyla ChimeraX versiyon 1.5 ve LigPlot+ sürüm 2.2 kullanılarak oluşturuldu. ChimeraX'te proteinler varsayılan çizgi film temsili kullanılarak gösteriliyor, ligandlar çubuk modunda, hidrojen bağları kesik çizgiler olarak gösteriliyor ve varsayılan renk şeması uygulanıyordu. LigPlot+'da, hidrojen bağ tanımlaması HBPLUS algoritması kullanılarak 3.9 şdonör-alıcı mesafe eşiği ve 90° açı eşiği ile gerçekleştirildi. Diğer tüm görselleştirme parametreleri varsayılan ayarlarında korundu.