Araştırma makalesi

Rab27A'nın N6-metiladenozin modifikasyonu, ovariektomize edilmiş fare modelinde osteoklastın farklılaşmasını etkileyerek osteoporozu teşvik eder

30 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/71964

⸱

11 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 2Department of Orthopedics, The People's Hospital of Pengzhou, 3Department of Clinical Skills Center, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 4Southwest Medical University, 5Stem Cell Immunity and Regeneration Key Laboratory of Luzhou, Affiliated Hospital of Southwest Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

YTHDC1, m6A ile modifiye edilmiş Rab27A'nın sitoplazmik ihracatını teşvik ederken, IGF2BP2 sitoplazmada Rab27A'yı stabilize ederek osteoklast farklılaşmasını artırır ve osteoporoza katkıda bulunur.

Özet

Osteoporoz için yeni tedavilerin geliştirilmesi giderek daha fazla ilgi çekmiştir. Rab27A, osteoklast farklılaşma sırasında yukarı regülasyonla hareket eder ve N6-metiladenozin (m6A) modifikasyonu ortopedik hastalıklarda önemli bir epigenetik düzenleyici olarak ortaya çıkmıştır. Biyoinformatik analizler, Rab27A'nın birden fazla m6A modifikasyon noktası içerdiğini ve birkaç m6A ile ilişkili proteinle etkileşime girdiğini öngördü. Rab27A'nın osteoklast farklılaşma ve osteoporozdaki rolü, yumurtalıktomlu (OVX) fare modeli kullanılarak değerlendirilmek için knockdown deneyleri yapıldı. OVX farelerinde Rab27A tükenmesi osteoporozu azalttı ve kemik oluşum yüzdesini %14,73'ten %28,13'e (P < 0,05) yükseltti. Western blotting ve nicel PCR, Rab27A'nın knockdown'un, osteoklast belirteçleri TRAP, NFATc1 ve c-FOS olarak protein ve mRNA ekspresyonunu azalttığını, böylece makrofaj kolonisi uyarıcı faktör (M-CSF) ve nükleer faktör-κB ligandının (RANKL) reseptör aktivatörü tarafından indüklenen kemik iliği kaynaklı makrofajların (BMM) osteoklast farklılaşmasını bastırdığını gösterdi. TRAP boyama ayrıca M-CSF ve RANKL indüksiyonundan sonra Rab27A tükenmesinin TRAP aktivitesini %24,1'den %12,9'a (P < 0,01) anlamlı şekilde azalttığını gösterdi. RNA immünopresipitasyon testleri, Rab27A ile m6A okuyucu proteinleri YTHDC1 ve IGF2BP2 arasındaki etkileşimleri doğruladı. Nükleer ve sitoplazmik fraksiyonlaşma, YTHDC1'in m6A ile modifiye Rab27A'nın sitoplazmik ihracatını kolaylaştırdığını göstermiştir. Buna ek olarak, q-PCR ve western blot analizleri, YTHDC1 veya IGF2BP2 etkisinin Rab27A ekspresyonunu azalttığını ve TRAP, NFATc1 ve c-FOS ekspresyonunu azalttığını, böylece M-CSF ve RANKL tarafından indüklenen osteoklast farklılaşmasını bastırdığını gösterdi. Bu bulgular birlikte, YTHDC1 aracılı sitoplazmik ihracatın ve m6A ile modifiye Rab27A'nın IGF2BP2 aracılı stabilizasyonunun osteoklast farklılaşmasını teşvik ettiğini ve OVX fare modelinde kemik kaybına katkıda bulunduğunu göstermektedir.

Giriş

Osteoporoz (OP), kemik mikromimarisinin bozulması ve kemik mineral yoğunluğunun azalmasıyla karakterize edilen yaygın bir iskelet rahatsızlığıdır ve bu da dünya çapında kırık riskini artırır 1,2,3. Osteoporotik kırıklar en sık ön kol, humerus, kalça ve omurgada görülür ve özellikle yaşlı yetişkinlerde yaygındır. Bu çatlaklar yaşam kalitesini önemli ölçüde düşürür ve hastalar, aileleri ve sağlık sistemleri üzerinde önemli fiziksel, psikolojik ve sosyoekonomik yükler yükleroluşturur 3. Sonuç olarak, osteoporozun önlenmesi, yönetimi ve tedavisi klinik ve halk sağlığı öncelikleri olarak kalmaktadır.

Osteoporoz için çeşitli tedavi stratejileri geliştirilmiştir ve genellikle iki kategoriye ayrılır: kemik oluşturan ajanlar ve anti-rezorpsiyontedavileri 4,5. Geleneksel anti-rezorpsiyon ilaçlar arasında bifosfonatlar, raloksifen ve stronsiyum ranelat bulunurken, yeni ajanlar denosumab, odanacatib ve saracatinib gibi maddelerdir. Kemik oluşturan tedaviler arasında paratiroid hormonu (PTH 1–84) bulunurken, MK-5442, AMG 785 ve BHQ 880 gibi birkaç ek aday da klinik geliştirme sürecindedir. 5. Bu tedaviler etkili olabilse de, birçoğu önemli yan etkiler, sınırlı uzun vadeli etkinlik veya uzun süreli kullanım kısıtlamalarıile ilişkilidir 4,6,7,8,9. Örneğin, aminobisfosfonatlar ve denosumabın uzun süreli uygulanması normal kemik remodelasyonunubozabilir 5. Bu nedenle, osteoporoz araştırmalarında daha güvenli ve etkili terapötik hedeflerin belirlenmesi önemli bir hedef olmaya devam etmektedir.

Rab proteinleri, hücre içi vezikül taşımacılığı ve hücre sinyalinin önemli düzenleyicileridir ve viral enfeksiyon, otofaji ve sitoskelet organizasyonu gibi çeşitli biyolojik süreçlerekatılırlar 10. Son yıllarda, Rab ailesi proteinlerinin kemik metabolizması ve osteoporozdaki rollerine giderek daha fazla dikkat çekilmiştir. Rab44'ün, nükleer faktör-κB ligandı (RANKL) ile işlenmiş makrofajların reseptör aktivatöründe hücre içi Ca2⁺ sinyalini modüle ederek ve aktive T hücreleri 1'in (NFATc1) nükleer faktörünü aktive ederek osteoklast farklılaşmasını düzenlediğibildirilmiştir. Osteoklastlar, makrofaj soyunun öncüllerinden türetilen çok çekirdekli hücrelerdir ve kemik rezorpsiyonu ile iskelethomeostazında temel roller oynarlar 12,13,14,15,16,17,18,19. Bu nedenle, osteoklast farklılaşmasını yöneten moleküler mekanizmaları anlamak, osteoporoz için yeni terapötik yaklaşımlar geliştirmek için kritik öneme sahiptir.

Rab27A, Rab GTPaz ailesinin önemli bir üyesidir ve sekretor ve bağışıklık hücrelerinde yaygın olarak eksprese edilir. Vezikül taşını, ekzositoz ve hücre içi sinyalgöndermede kritik roller oynar 20,21,22,23,24,25,26,27. Önceki çalışmalar, Rab27A'nın hava yolu iltihabı sırasında eozinofil degranülasyonunu düzenlediğini ve aktive makrofajlarda NADPH oksidaz aktivitesiyle ilişkili veziküler mobilizasyonu kontrol ettiğinigöstermiştir 20.23. Özellikle, biriken kanıtlar osteoklast farklılaşma sırasında Rab27A ifadesinin önemli ölçüde artırıldığını göstermektedir. Shimada-Sugawara ve ark., kemik iliği kaynaklı makrofajların (BMM) osteoklastlara ayrılması sırasında Rab27A ekspresyonunun arttığını bildirmiştir; bu da osteoklastogenezde potansiyel bir rol olduğunugöstermektedir 28. Bu bulgular toplamda, Rab27A'nın veziküler taşımayı ve hücre içi sinyal yollarını düzenleyerek osteoklast oluşumunu ve işlevinietkileyebileceğini göstermektedir 28,29.

N6-metiladenosin (m6A), ökaryotik haberci RNA'larda ve kodlamayan RNA'larda en çok bulunan iç RNA modifikasyonudur ve RNA metabolizması ile gen ifadesinin kritik bir düzenleyicisi olarak hizmet eder. Memelilerde tanımlanan ilk mRNA modifikasyonu olan m6A, RNA stabilitesi, ekleme, taşıma ve çeviri gibi birçok biyolojik süreçte rol oynamıştır. Wang ve ark. korunan dizi motiflerinde yaygın olarak görülen m6A modifikasyonlarının, YTH alan içeren proteinler tarafından tanındığını ve mRNA stabilitesi ilemetabolizmasının düzenlenmesine katkıda bulunduğunu göstermiştir 30. Ayrıca, m6A modifikasyonu genom kararlılığı, transkripsiyonel düzenleme, kromatin organizasyonu, kanser ilerlemesi ve bağışıklık yanıtları gibi çeşitli biyolojik fonksiyonlarda rol oynamıştır31. Son çalışmalar, kemik kaynaklı hastalıklar ve osteoporozda m6A sinyalizasyonununönemli rollerini de ortaya koymuştur 32.

M6A okuyucu proteinleri arasında YTHDC1, RNA işleme ve nükleer ihracatı düzenleyen nükleer okuyucu olarak çalışırken, insülin benzeri büyüme faktörü 2 mRNA bağlayıcı protein 2 (IGF2BP2) sitoplazmada m6A modifiye edilmiş transkriptleri stabilize eder. Chen ve ark. YTHDC1'in, m6A modifiye circNSUN2'nin nükleer ihracatını teşvik ettiğini, bunun ardından HMGA2 mRNA'yı stabilize etmek ve kolorektal kansermetastazını teşvik etmek için IGF2BP2 ile etkileşime girdiğini göstermiştir. Bu bulgular, YTHDC1 ve IGF2BP2 tarafından koordineli düzenlemenin m6A modifiye transkriptlerin kaderini kontrol eden genel bir mekanizmayı temsil edebileceğini göstermektedir.

Mevcut çalışma, Rab27A mRNA'daki tahmin edilen m6A modifikasyon bölgelerini incelemiş ve YTHDC1 ile IGF2BP2 ile etkileşimlerini incelemiştir. YTHDC1'in, m6A modifiye Rab27A transkriptlerinin nükleer ihracatını kolaylaştırdığı bulundu; IGF2BP2 ise sitoplazmada Rab27A ile etkileşime girerek stabilitesini artırdı. Bu düzenleyici mekanizma sayesinde Rab27A, osteoklastın farklılaşmasını teşvik etti ve osteoporozun ilerlemesine katkıda bulundu. Bulgular, osteoklast farklılaşmasında YTHDC1, IGF2BP2 ve Rab27A'yı içeren daha önce tanınmamış m6A'ya bağlı bir düzenleyici yol tanımlamaktadır. Bu sonuçlar, osteoporozun moleküler patogenezi hakkında yeni bilgiler sağlar ve Rab27A'nın m6A aracılı regülasyonunu hedefleyen yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesini kolaylaştırabilir.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Southwest Medical University Bağlı Hastanesi'nin Hayvan Koruma ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı (Onay No. 2024-Etik-042). Tüm deneyler, ARRIVE yönergeleri, Birleşik Krallık Hayvanlar (Bilimsel İşlemler) Yasası 1986 ve ilgili yönergeler, AB Direktifi 2010/63/EU ile Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Rehberi (NIH Yayın No. 8023, revize 1978) doğrultusunda gerçekleştirildi. Fareler deneysel gruplara rastgele atandı ve tahsis dizisi araştırmacıdan gizlendi. Histolojik değerlendirme, mikro-bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) görüntü analizi ve istatistiksel analizler dahil olmak üzere tüm veri toplama ve analizler, grup dağılımı körlüğüne bağlı araştırmacılar tarafından gerçekleştirildi. Analizlerden hayvan veya örnek hariç tutulmadı. Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler, ekipmanlar, yazılımlar ve diğer kaynaklar Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Yumurtalıktomi (OVX) modelinin inşası

8 haftalık yirmi dört dişi vahşi tip C57BL/6 faresi osteoporoz modeli oluşturmak için kullanıldı. 1 haftalık bir aklimatlaşma döneminden sonra, fareler rastgele olarak Sham veya OVX grubuna atandı. OVX modeli, daha önce tanımlandığı gibi çift taraflı ovariektomiile kuruldu 34,35. Sahte ameliyat edilen fareler, yumurtalıkları ameliyatla maruz bırakıldı ve alınmadı.

Intrafemoral gen teslimatı için, sh-Rab27A veya sh-NC ifade eden lentiviral vektörler, OVX ameliyatından 7 gün sonra enjekte edildi (daha önce bildirildiği gibi) 36,37. Kısa süreliğine, konsantre lentiviral partiküller (1 ×10 6 transdüksiyon birimi/mL) anestezi altında 22 gauge iğne kullanılarak patellar yol yoluyla femura enjekte edildi. Her fare 20 μL lentiviral süspansiyon aldı. Kesi daha sonra dikildi ve hayvanlar iyileşme boyunca izlendi.

Tüm hayvan deneyleri belirli patojensiz koşullar altında gerçekleştirildi. Femoral örnekler ameliyattan 8 hafta sonra alındı. Histolojik analizler ve RNA veya protein ekstraksiyonu için her grup başına en az altı fare kullanıldı.

2. Canlı mikro-BT görüntüleme

Trabeküler kemik morfolojisini değerlendirmek için mikro-bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) gerçekleştirildi. Her farenin sağ tibiası, 14 haftalıkken OVX ameliyatından önce in vivo tarandı. Takip taramaları 22 haftaya kadar haftalık olarak yapıldı. Mikro-BT analizine her grup başına en az altı fare dahil edildi.

Fareler intraperitoneal sodyum pentobarbital (50 mg/kg vücut ağırlığı) ile anestezi edildi. Yeterli anestezi, parmak sıkıstırma refleksinin olmaması ve solunum hızının sürekli izlenmesiyle doğrulandı ve görüntüleme işlemi boyunca korundu. Tüm ötenazi prosedürleri, onaylanmış hayvan protokolü, kurumsal hayvan refahı yönergeleri ve laboratuvar hayvanı ötenazi ulusal düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

24 haftalıkken, fareler derin anestezi sonrası servikal dislokasyon ile ötenazi edildi ve her iki tibiae aynı görüntüleme protokolü kullanılarak ex vivo tarama için alındı. Tarama parametreleri arasında 10,4 μm voxel boyutu, 55 kV voltaj, 145 μA akım, 32 mm görüş alanı, projeksiyon başına 1500/750 örnek ve 100 ms entegrasyon süresi bulunuyordu.

Görüntüler, 1200 mg HA/cm3 fantomla kalibre edilmiş üçüncü dereceden polinom ışın sertleştirme düzeltme algoritması kullanılarak işlendi. Kemik hacmi fraksiyonu (BV/TV), trabeküler kalınlık (Tb.Th) ve trabeküler sayı (Tb.N), büyüme plakasına 1,0 mm proksimal konumda bulunan distal femoral metafizde nicelendirildi.

3. Plazmid transfeksiyonu

sh-Rab27A ve sh-NC plazmidleri üretilip lentivirüs üretiminde kullanıldı. Lentiviral ambalaj plazmidleri ve shRNA yapıları, üreticinin talimatlarına göre HEK293T hücrelere birlikte transfekte edildi. Viral titrer, daha önce tanımlandığı gibi intrafemoral uygulamadan öncebelirlenmiştir 36. Üç bağımsız biyolojik kopya gerçekleştirildi.

4. Hematoksilin ve eozin (HE) boyama

Femoral örnekler %4 paraformaldehit ile 24 saat sabitlenmiş, %10 EDTA ile 4 hafta kalsifiye edilmiş, %30 sukroz/PBS ile kriyokorumalı hale getirilmiş, parafine gömülü ve 5 μm kalınlıkta kesitlenmiştir. Doku kesitleri hematoksilin ve eosin ile boyanmış ve ışık mikroskobu ile incelenmiştir. Her grup için en az altı fare analiz edildi.

5. Tartrat dirençli asit fosfataz (TRAP) boyama

Femoral kesitlerin TRAP boyaması üreticinin talimatlarınagöre yapıldı 38. Kemik iliği kaynaklı makrofajlarda (BMM) TRAP aktivitesi, bir TRAP boyama testi kullanılarak değerlendirildi. Olgun osteoklastlar, en az üç çekirdek içeren TRAP pozitif çok çekirdekli hücreler olarak tanımlandı. Her biri üç teknik kopya içeren üç bağımsız biyolojik kopya gerçekleştirildi.

6. q-PCR

Toplam RNA, üreticinin talimatlarına göre TRIzol reaktifi kullanılarak izole edildi. Tamamlayıcı DNA, ters transkriptaz kullanılarak sentezlendi ve SYBR Green kimyası kullanılarak nicel gerçek zamanlı PCR'ye tabi tutuldu. Her biri üç teknik kopya içeren üç bağımsız biyolojik kopya gerçekleştirildi.

Giriş dizileri şu şekildeydi:

Rab27A: F, TTCCTGCTTCTCTTTCGACCT; R, GGCAGCACTGGTTTCAAAAT

TUZAK: F, TGTTGACAGGGTCCTCCATCTA; R, CCTCCTTCTTAACCCGAAGC

NFATc1: F, GGTGCTGTCTGGCCATAACT; R, GCGGAAAGGTGGTATCTCAA

C-FOS: F, TACTACCATTCCCCAGCCAGCCGA; R, GCTGTCACCGTGGGGATAAA

YTHDC1: F, GAAGTGGAAGCTCTGCATCAG; R, TTGATCTTTTCGGACAGCACG

IGF2BP2: F, GACTACCCCGACCAGAACTG; R, GAGGCGGGATGTTCCGAATC

β-aktin: F, GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG; R, TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG

7. Western blotting

Hücreler veya dokular, proteaz inhibitörleriyle desteklenen RIPA tamponu kullanılarak liz edildi. Protein konsantrasyonları Bradford testi kullanılarak belirlendi. Eşit miktarda protein (20 μg) SDS-PAGE ile ayrılarak poliviniliden florür (PVDF) veya nitroselüloz membranlarına aktarıldı. Zarlar, oda sıcaklığında %5 yağsız sütle 1 saat boyunca bloklandı ve TRAP, NFATc1, c-FOS, Rab27A, YTHDC1, IGF2BP2 veya β-aktine karşı birincil antikorlarla 4 °C'de gece boyunca kuluçka altına alındı. Yıkamadan sonra, zarlar uygun ikincil antikorlarla oda sıcaklığında 1 saat kuluçka edildi. Protein bantları standart tespit prosedürleriyle görselleştirildi. Üç bağımsız biyolojik kopya gerçekleştirildi.

8. Hücre kültürü

Kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMM) daha önce tanımlandığı gibi izoleedildi 39. Fare uyluk kemiğinden alınan kemik iliği hücreleri, %10 fetal sığır serumu, 30 ng/mL makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve %1 penisillin/streptomisin ile desteklenen minimum α minimum ortamda, %5 CO₂ içeren nemli atmosferde 37 °C'de gece boyunca kültürlendi. Yapışmayan hücreler, 30 ng/mL M-CSF IÇEREN STROMAL HÜCRESIZ BIR SISTEMDE TOPLANARAK KÜLTÜRLENDI. 3 gün sonra, yapışkan hücreler BMM olarak toplandı ve osteoklast farklılaşmasını sağlamak için 30 ng/mL M-CSF ve 50 ng/mL nükleer faktör-κB ligandı (RANKL) reseptör aktivatörü varlıklarında 72 saat boyunca kültürlendi.

9. RNA girişimi (RNAi)

Küçük interferens eden RNA'lar (siRNA'lar), üreticinin talimatlarına göre lipid bazlı transfeksiyon reaktifi kullanılarak sentezlenip transfekte edildi. Hücreler, transfeksiyondan önce altı kuyu plakalarında 2 ×10-4 hücre yoğunluğunda tohumlanmıştır. Üç bağımsız biyolojik kopya gerçekleştirildi.

Hedef dizileri şu şekildeydi:

si-Rab27A: GGACUUAAUCAUCTAAGAGAAUGGAA

si-YTHDC1: GCAAGGAGUGUGUUAUCUUAATT

si-IGF2BP2: CCGUUAACCAACAAGCCAATT

10. İmmünoflüoresans

Hücreler 20 dakika boyunca %4 paraformaldehit ile sabitlendi ve %0,1 Triton X-100 ile 10 dakika geçirimlileştirildi. %5 sığır serum albümini ile 30 dakika blok edildikten sonra, hücreler 4 °C'de gece boyunca primer antikorlarla inkübe edildi.

Yıkamadan sonra, florofor ile konjuge edilmiş ikincil antikorlar oda sıcaklığında 30 dakika uygulandı. Çekirdekler DAPI ile karşı boyanmış ve görüntüler konfokal mikroskopi kullanılarak alınmıştır. Üç bağımsız biyolojik kopya gerçekleştirildi.

11. Nükleer ve sitoplazmik ayrım

Nükleer ve sitoplazmik fraksiyonlar, üreticinin talimatlarına göre izole edildi. Hücreler 10 dakika boyunca buzda lizlendi ve 4 °C'de 3 dakika boyunca 500 × g sıcaklıkta santrifüjlendi. Sitoplazmik bileşenleri içeren süpernatant toplanırken, çekirdekleri içeren pelet ayrı ayrı yıkanıp işlenirdi.

12. RNA bağlayan protein immünopresipitasyonu (RIP)

RNA immünopresipitasyon (RIP) testleri üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirildi. Kısa bir süreliğine, hücreler 30 dakika boyunca buzda lizizlendi. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanlar gece boyunca antikorlar ve Protein A/G agaroz boncuklarıyla kuluçka edildi. Yıkamadan sonra, imimönüm presipitli proteinler western blotting ile analiz edildi ve ko-immünopresipitli RNA ise nicel gerçek zamanlı PCR ile analiz edildi. Üç bağımsız biyolojik kopya gerçekleştirildi.

13. Rab27A mRNA stabilite testi

Toplam RNA, devre IGF2BP2 ardından belirtilen zaman noktalarında çıkarıldı. Daha sonra ters transkripsiyon ve nicel gerçek zamanlı PCR yapıldı. Rab27A mRNA seviyeleri 0 saatte karşılık gelen si-NC grubuna normalleştirildi. Üç bağımsız biyolojik kopya gerçekleştirildi.

14. İstatistiksel analiz

Tüm deneyler en az üç biyolojik kopya kullanılarak bağımsız olarak gerçekleştirildi. Q-PCR, RNA girişimi, TRAP boyama, western blotting ve diğer hücre tabanlı testler için, her biyolojik replikasyon aksi belirtilmedikçe üç teknik kopya içeriyordu. Veriler, ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulur.

İstatistiksel analizler GraphPad Prism sürüm 9.0 ve SPSS yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. İki grup arasındaki karşılaştırmalar, iki kuyruklu Öğrenci t-testi kullanılarak yapıldı. Birden fazla grup arasındaki karşılaştırmalar, iki yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak analiz edildi ve ardından Tukey'nin çoklu karşılaştırma sonrası testi çoklu karşılaştırmaları ayarlamak için yapıldı. P değeri < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

Sonuçlar

Rab27A'nın etkisi osteoporozu in vivo azalttı.

Rab27A'nın osteoporozdaki rolünü araştırmak için, daha önce bildirilen yöntemler34,40 kullanılarak kurulan bir ovariektomize (OVX) fare modelinde Rab27A knockdown gerçekleştirildi. Genel çalışma tasarımı Şekil 1'de özetlenmiştir. Mikro-bilgisayarlı tomografi analizi, OVX farelerinde kemik mineral yoğunluğu, kemik hacmi fraksiyonu (BV/TV), trabeküler kalınlık (Tb.Th) ve trabeküler sayı (Tb.N) Sham kontrollerine kıyasla anlamlı şekilde azaldığını göstermiştir (Şekil 2A). Bu bulgular, osteoporoz modelinin başarılı bir şekilde kurulmasını doğruladı. Rab27A knockdown, ölçülen tüm kemik yapısal parametrelerini önemli ölçüde geri kazandı; bu da OVX kaynaklı kemik kaybı ve mikromimari bozulmanın zayıflamasını gösterdi (Şekil 2A).

Histolojik incelemeler bu bulguları daha da destekledi. Hematoksilin ve eozin boyama, OVX farelerinde Sham grubuna kıyasla belirgin trabeküler kemik kaybı ve trabeküler mimarinin bozulması ortaya koymuştur (Şekil 2B). Buna karşılık, Rab27A tükenmesi trabeküler bozulmayı hafifletmiş ve kemik morfolojisini kısmen restore etmiştir (Şekil 2B). Rab27A, osteoklastfarklılaşmasında rol oynadığı için osteoklast aktivitesi tartrat-dirençli asit fosfataz (TRAP) boyama ile değerlendirildi. OVX farelerinde TRAP aktivitesi, Sham kontrollerine göre belirgin şekilde artmış ve Rab27A etkisinden sonra anlamlı şekilde azalmıştır (Şekil 2C).

Osteoklastla ilişkili belirteçlerin ekspresyonu daha sonra incelendi. Western blot analizi, OVX farelerinde Rab27A, TRAP, NFATc1 ve c-FOS protein seviyelerinin anlamlı şekilde arttığını ve Rab27A tükenmesinden sonra azaldığını göstermiştir (Şekil 2D). Transkripsiyon düzeyinde tutarlı sonuçlar elde edildi; nicel gerçek zamanlı PCR (q-PCR) Rab27A, TRAP, NFATc1 ve c-FOS mRNA ekspresyonunda benzer ifade kalıplarını gösterdi (Şekil 2E).

figure-results-1
Şekil 1: Osteoklast farklılaşması ve osteoporoz ilerlemesi sırasında m6A ile modifiye edilmiş Rab27A'nın YTHDC1 ve IGF2BP2 aracılı düzenlemesinin temelini tutan deneysel tasarımın ve önerilen düzenleyici mekanizmanın şematik genel bakışı. Osteoklastogenezdeki Rab27A'nın rolü, ovariektomize edilmiş (OVX) fare modeli ve nükleer faktör-κB ligandı (RANKL)/makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ile indüklenen osteoklast farklılaşma modeli ve reseptör aktivatörü kullanıldı. Osteoklast farklılaşma belirteçleri (TRAP, NFATc1 ve c-FOS), Rab27A ekspresyonu ve subhücresel lokalizasyonu değerlendirmek için Rab27A knockdown, nükleer ve sitoplazmik fraksiyonlama ile RNA immünopresipitasyon testleri gerçekleştirildi. YTHDC1, m6A ile modifiye edilmiş Rab27A'nın sitoplazmik ihracatını kolaylaştırırken, IGF2BP2 sitoplazmada Rab27A'yı stabilize etti. Bu koordineli düzenleyici mekanizmalar birlikte, osteoklastın farklılaşmasını teşvik etti ve OVX modelinde kemik kaybına katkıda bulundu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Rab27A'nın etkisi osteoporozu in vivo azalttı. (A) Trabeküler kemik morfometrik analizi. Kemik mineral yoğunluğu, kemik hacmi fraksiyonu (BV/TV), trabeküler kalınlık (Tb.Th) ve trabeküler sayı (Tb.N) nicelendirildi. **P < 0.01, ***P < 0.001. (B) Rab27A deplasyonu sonrası femoral trabeküler kemiğin histolojik değerlendirmesi. Distal femurdaki yapısal değişiklikleri değerlendirmek için hematoksilin ve eozin (HE) boyama işlemi yapıldı. OVX ve OVX + sh-NC grupları kontrol görevi gördü. Ölçeg çubuğu = 50 μm. ***P < 0.001. (C) Femoral kesitlerin TRAP boyaması. TRAP aktivitesi osteoklast aktivitesini değerlendirmek için değerlendirildi. OVX ve OVX + sh-NC grupları kontrol görevi gördü. Ölçeg çubuğu = 50 μm. ***P < 0.001. (D–E) Rab27A'nın tükenmesinden sonra Rab27A, TRAP, NFATc1 ve c-FOS ifadesi. Protein ekspresyonu western blotting (D) ile, mRNA ekspresyonu ise q-PCR (E) ile belirlendi. β-aktin yükleme kontrolü olarak hizmet verdi. **P < 0.01, ***P < 0.001. Sham grubu yumurtalıkların cerrahi maruziyeti uygulanırken yumurtalıkların ovariektomisi yapılmaması sağlanırken, OVX grubu iki taraflı ovarektomi geçirdi. sh-NC, negatif kontrol kısa saç tokası RNA. Her deneysel gruba altı fare dahil edildi. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmaktadır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Rab27A'nın Knockdown'ı, M-CSF ve RANKL tarafından indüklenen BMM'lerin osteoklast farklılaşmasını baskıladı

Osteoklastogenez sırasında Rab27A'nın rolünü daha iyi değerlendirmek için, kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMM) makrofaj kolonisi uyarıcı faktör (M-CSF) ve nükleer faktör-κB ligandının reseptör aktivatörü (RANKL) ile uyarılarak osteoklastfarklılaşmasını 28 indüklemiştir.

Kantitatif gerçek zamanlı PCR ve western blot analizleri, M-CSF ve RANKL uyarılarının Rab27A mRNA ve protein ekspresyonunu anlamlı şekilde artırdığını, si-Rab27A ile transfeksiyonun ise Rab27A ekspresyonunu etkili şekilde azalttığını göstermiştir (Şekil 3A, B). TRAP boyama, M-CSF ve RANKL tedavisinden sonra osteoklast aktivitesinde belirgin bir artış göstermiştir. Rab27A'nın etkisi, indüklenen gruba kıyasla TRAP aktivitesini anlamlı şekilde azaltmıştır (Şekil 3C).

Osteoklast farklılaşma belirteçlerinin ekspresyonu daha sonra incelendi. Nicel gerçek zamanlı PCR analizi, osteoklast indüksiyonundan sonra TRAP, NFATc1 ve c-FOS mRNA seviyelerinin anlamlı şekilde arttığını ve Rab27A azalmasıyla azaldığını göstermiştir (Şekil 3D). Benzer sonuçlar western blotting ile protein seviyesinde gözlemlenmiştir (Şekil 3E).

figure-results-3
Şekil 3: M-CSF ve RANKL tarafından indüklenen kemik iliği kaynaklı makrofajların (BMM) Rab27A'nın bastırılmış osteoklast farklılaşmasını etkisiz hale getirmesi. (A–B) Osteoklast indüksiyonu sonrası Rab27A'nın ekspresyonu. Rab27A mRNA (A) ve protein (B) seviyeleri sırasıyla q-PCR ve western blotting ile belirlendi. β-aktin yükleme kontrolü olarak hizmet verdi. P < 0.001. (C) BMM kaynaklı osteoklastların TRAP boyaması. M-CSF ve RANKL tarafından indüklenen artan TRAP aktivitesi, Rab27A etkisinin ardından bastırıldı. Ölçeg çubuğu = 50 μm. ***P < 0.001. (D–E) Rab27A azalmasından sonra osteoklast farklılaşma belirteçlerinin ekspresyonu. TRAP, NFATc1 ve c-FOS mRNA seviyeleri q-PCR (D) ile, protein seviyeleri ise western blotting (E) ile belirlendi. β-aktin yükleme kontrolü olarak hizmet verdi. **P < 0.01, ***P < 0.001. Kontrol, tedavi edilmemiş hücreler; si-NC, negatif kontrol siRNA. Üç bağımsız biyolojik kopya gerçekleştirildi. Veriler ortalama SD ± olarak sunulmaktadır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

M6A ile modifiye Rab27A'nın sitoplazmik ihracatı YTHDC1 tarafından kolaylaştırıldı

M6A modifikasyonunun Rab27A düzenlemesindeki potansiyel rolüne dair araştırmak için biyoinformatik analizler yapıldı. Rab27A transkriptinde birden fazla tahmin edilen m6A modifikasyon sitesi tespit edilmiştir (Şekil 4A). Ayrıca, etkileşim tahmin analizi Rab27A ile m6A okuyucu proteinleri YTHDC1 ve IGF2BP2 arasında potansiyel ilişkiler olduğunu öne sürdü (Şekil 4B).

YTHDC1 ile Rab27A mRNA arasındaki etkileşimi doğrulamak için RNA immünopresipitasyon (RIP) testleri yapıldı. Rab27A mRNA, anti-YTHDC1 antikoru ile immünopresipitlenmiş komplekslerde immünoglobulin G (IgG) kontrolüyle karşılaştırıldığında anlamlı zenginleştirildi (Şekil 4C).

YTHDC1, RNAihracat 41'de rol alan nükleer bir m6A okuyucu olarak işlev gördüğü için, nükleer ve sitoplazmik fraksiyon testleri yapıldı. YTHDC1'in etkisi Rab27A mRNA'nın nükleer tutulmasını önemli ölçüde artırırken sitoplazmik bolluğunu azalttı (Şekil 4D).

YTHDC1'in Rab27A ekspresyonu üzerindeki etkisi daha fazla değerlendirildi. Nicel gerçek zamanlı PCR analizi, YTHDC1 azalmasının Rab27A mRNA ekspresyonunu azalttığını göstermiştir (Şekil 4E). Tutarlı olarak, western blot analizi YTHDC1 knockdown'dan sonra Rab27A protein ekspresyonunun azaldığını gösterdi (Şekil 4F).

figure-results-4
Şekil 4: M6A modifiye Rab27A'nın sitoplazmik ihracatı YTHDC1 tarafından kolaylaştırıldı. (A) SRAMP tahmin aracı kullanılarak tanımlanan Rab27A içinde tahmin edilen m6A modifikasyon alanları. (B) StarBase kullanılarak tanımlanan Rab27A ile m6A okuyucu proteinleri YTHDC1 ve IGF2BP2 arasındaki öngörülen etkileşimler. (C) YTHDC1 ile Rab27A mRNA arasındaki etkileşimi gösteren RNA immünopresipitasyon (RIP) testi. **P < 0.01. IgG negatif kontrol görevi görüyordu. Rab27A zenginleştirmesi yüzde girdisine normalleştirildi. YTHDC1 immünoblot bandı immüstürpresipitasyon verimliliğini yansıtır. (D) YTHDC1'in devrilmesinden sonra Rab27A'nın nükleer tutulmasının arttığını gösteren nükleer ve sitoplazmik fraksiyonlaşma analizi. **P < 0.01, ***P < 0.001. (E–F) YTHDC1'in devrilmesinden sonra YTHDC1 ve Rab27A'nın ifadesi. mRNA ekspresyonu q-PCR (E) ile, protein ekspresyonu ise western blotting (F) ile belirlendi. β-aktin yükleme kontrolü olarak hizmet verdi. **P < 0.01. si-NC, negatif kontrol siRNA. Üç bağımsız biyolojik kopya gerçekleştirildi. Veriler ortalama SD ± olarak sunulmaktadır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Rab27A'nın IGF2BP2 ile etkileşim yoluyla stabilizasyonu

IGF2BP2 ile Rab27A arasındaki etkileşim RIP testleriyle incelendi. Rab27A mRNA, IgG kontrolüne kıyasla anti-IGF2BP2 antikorla immünopresipitli komplekslerde anlamlı zenginleştirilmiştir; bu da IGF2BP2 ile Rab27A mRNA arasında bir ilişki olduğunu gösterir (Şekil 5A).

İmmünofluoresans analizi, IGF2BP2 ve Rab27A'nın ağırlıklı olarak sitoplazma içinde birlikte lokalizasyonunu göstermiştir (Şekil 5B). IGF2BP2'nin Rab27A ekspresyonu üzerindeki fonksiyonel etkisini belirlemek için IGF2BP2 siRNA kullanılarak susturuldu. Nicel gerçek zamanlı PCR analizi, IGF2BP2 azalma sonrası Rab27A mRNA seviyelerinde anlamlı bir azalma göstermiştir (Şekil 5C). Bu bulgularla uyumlu olarak, western blot analizi, IGF2BP2 knockdown sonrası Rab27A protein ekspresyonunun azaldığını gösterdi (Şekil 5D).

IGF2BP2'nin Rab27A mRNA stabilitesi üzerindeki etkisi daha sonra değerlendirildi. IGF2BP2 azalma, Rab27A mRNA'nın yarı ömrünü önemli ölçüde kısaltmış ve transkript stabilitesini azaltmıştır (Şekil 5E).

figure-results-5
Şekil 5: Rab27A'nın IGF2BP2 ile etkileşim yoluyla stabilizasyonu. (A) IGF2BP2 ile Rab27A mRNA arasındaki ilişkiyi gösteren RNA immünopresipitasyon testi. IgG negatif kontrol görevi görüyordu. Rab27A zenginleştirmesi yüzde girdisine normalleştirildi. P < 0.001. (B) Sitoplazmada Rab27A ve IGF2BP2'nin birlikte lokalizasyonunu gösteren immünoflüoresans analizi. Çekirdekler DAPI ile karşı boyanmıştı. Ölçek çubuğu = 20 μm. (C–D) IGF2BP2 azalmadan sonra Rab27A'nın aşağı regulasyonu. Rab27A mRNA seviyeleri q-PCR (C) ile, protein seviyeleri ise western blotting (D) ile belirlendi. β-aktin yükleme kontrolü olarak hizmet verdi. **P < 0.01, ***P < 0.001. (E) Rab27A mRNA stabilitesi IGF2BP2 devrilme sonrası. Rab27A mRNA seviyeleri 0 saatte karşılık gelen si-NC grubuna normalize edildi. **P < 0.01. si-NC, negatif kontrol siRNA. Üç bağımsız biyolojik kopya gerçekleştirildi. Veriler ortalama SD ± olarak sunulmaktadır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

YTHDC1 veya IGF2BP2'nin susturulması, M-CSF ve RANKL tarafından indüklenen BMM'lerin osteoklast farklılaşmasını bastırdı

Osteoklast farklılaşması sırasında YTHDC1, IGF2BP2 ve Rab27A arasındaki fonksiyonel ilişkiyi daha fazla incelemek için, BMM'lerde knockdown deneyleri yapılmıştır.

M-CSF ve RANKL uyarıları, Rab27A, YTHDC1 ve IGF2BP2'nin mRNA ekspresyonunu anlamlı şekilde artırmıştır (Şekil 6A). Buna karşılık, osteoklast indüksiyonu sonrası bu moleküllerin protein ekspresyonu da yükselmiştir (Şekil 6B). YTHDC1 veya IGF2BP2'nin susturulması Rab27A ifadesini anlamlı şekilde azaltmış, oysa bir düzenleyicinin devrilmesi diğerinin ekspresyonunu önemli ölçüde etkilemiştir.

TRAP boyama, YTHDC1 veya IGF2BP2 azalmasının M-CSF ve RANKL tarafından indüklenen osteoklast aktivitesini anlamlı şekilde bastırdığını göstermiştir (Şekil 6C). Ayrıca, nicel gerçek zamanlı PCR analizi, YTHDC1 veya IGF2BP2 knockdown sonrası TRAP, NFATc1 ve c-FOS ekspresyonlarının azaldığını gösterdi (Şekil 6D). Western blot analizi, protein seviyesinde karşılık gelen indirgemeleri doğruladı (Şekil 6E).

Bu bulgular toplu olarak, YTHDC1 ve IGF2BP2'nin Rab27A ekspresyonunun düzenlenmesiyle osteoklast farklılaşmasını teşvik ettiğini göstermektedir.

figure-results-6
Şekil 6: YTHDC1 veya IGF2BP2'nin susturulması, M-CSF ve RANKL tarafından indüklenen BMM'lerin osteoklast farklılaşmasını bastırmıştır. (A–B) YTHDC1 veya IGF2BP2 knockdown'dan sonra Rab27A'nın ifadesi. Rab27A mRNA (A) ve protein (B) seviyeleri sırasıyla q-PCR ve western blotting ile belirlendi. β-aktin yükleme kontrolü olarak hizmet verdi. P < 0.001. (C) YTHDC1 veya IGF2BP2 tüketime sonrası osteoklast aktivitesinin bastırılmasını gösteren TRAP boyama. Ölçek çubuğu = 50 μm. **P < 0.01, ***P < 0.001. (D–E) YTHDC1 veya IGF2BP2 azalmasından sonra osteoklast farklılaşma belirteçlerinin ekspresyonu. TRAP, NFATc1 ve c-FOS mRNA seviyeleri q-PCR (D) ile, protein seviyeleri ise western blotting (E) ile belirlendi. β-aktin yükleme kontrolü olarak hizmet verdi. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Kontrol, tedavi edilmemiş hücreler; si-NC, negatif kontrol siRNA. Üç bağımsız biyolojik kopya gerçekleştirildi. Veriler ortalama SD ± olarak sunulmaktadır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

VERİ ERIŞILEBILIRLIĞI:

Mevcut çalışma sırasında kullanılan ve/veya analiz edilen veri setleri (western blot verileri, görüntüleme veri setleri, nicel analizler ve kaynak dosyalar dahil) bu çalışma sırasında Ek Dosya 1'de sunulmuştur.

Ek Dosya 1: Bu çalışmanın veri setleri ve ham verileri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Osteoklast farklılaşması, kemik remodelasyonu, kemik rezorpsiyonu, kırık onarımı ve iskelet homeostazında temel roller oynar(12˒15˒17˒18˒42˒43). Aşırı osteoklast aktivitesi osteoporozun önemli bir nedenidir ve osteoklast farklılaşmasını kontrol eden düzenleyici yolların belirlenmesini önemli bir araştırma hedefi haline getirir. Osteoklast fonksiyonunu hedefleyen birkaç anti-rezorpsiyon tedavisi klinik etkinlikgöstermiştir 6,44,45. Örneğin, denosumab kırık insidansının azalması ve olumlu bir güvenlikprofili 6 ile ilişkilendirilmiştir; kathepsin K inhibitörü ONO-5334 ise ovariektomize edilmiş insan olmayan primatlarda kemik mineral yoğunluğu ve kemik gücü üzerinde faydalı etkilergöstermiştir 44. Mevcut çalışma, daha önce tanınmayan ve YTHDC1, Rab27A ve IGF2BP2 içeren osteoklast farklılaşmasını ve osteoporozun ilerlemesini teşvik eden m6A'ya bağlı bir düzenleyici mekanizmayı tespit etmiştir. Bu bulgular, osteoklastogenezin moleküler düzenlemesi hakkında yeni bilgiler sağlar ve osteoporoz için potansiyel terapötik hedefler önermektedir.

Rab27A, daha önce veziküler trafik ve hücre içi sinyalleşmenin düzenlenmesi yoluyla osteoklast farklılaşması ve kemik rezorpsiyonunda rol oynamış ve ayrıca RANKL kaynaklı sinyal zincirlerini de ana reseptörlerin endozomal geri dönüşümüyoluyla etkileyebilir 28,29. Bu raporlarla uyumlu olarak, osteoklast farklılaşması sırasında Rab27A ekspresyonu belirgin şekilde artmışken, Rab27A azalması in vitro osteoklast farklılaşmasını baskılamış ve osteoporozla ilişkili kemik kaybını in vivo azaltmıştır. Bu bulgular, Rab27A'nın osteoklast biyolojisinde kritik bir rolü desteklemekte ve önceki gözlemleri daha da genişleterek Rab27A aktivitesinin m6A'ya bağlı mekanizmalarla düzenlendiğini göstermektedir. Bulgular toplamda, m6A modifiye Rab27A'nın bu süreçleri transkripsiyon sonrası düzeyde düzenleyebileceğini ve dolayısıyla kemik rezorpsiyon aktivitesini etkileyebileceğini göstermektedir.

Biriken kanıtlar, m6A modifikasyonunun kemikle ilişkili hastalıkların gelişimi ve ilerlemesine katkıda bulunduğunugöstermektedir 32. Biyoinformatik analizler, Rab27A mRNA'sında birden fazla muhtemel m6A modifikasyon noktası tespit etmiş (Şekil 4A) ve fonksiyonel çalışmalar YTHDC1 ve IGF2BP2'nin Rab27A ifadesini ve osteoklast farklılaşmasını düzenlediğini göstermiştir (Şekil 4–6). Bu bulgular, m6A modifikasyonunun osteoklastogenez sırasında Rab27A fonksiyonunu kontrol eden önemli bir üst akış düzenleyici mekanizma olduğunu göstermektedir. Rab27A içinde birden fazla tahmin edilen m6A sitesi tespit edildiğinden, gelecekteki çalışmalar Rab27A düzenlemesi için bireysel sitelerin veya sitelerin kombinasyonlarının gerekli olup olmadığını belirlemelidir. M6A eksikliği olan Rab27A mutantlarının inşası ve ardından yapılan kurtarma deneyleri, bu yolda m6A modifikasyonunun işlevsel önemine doğrudan kanıt sağlar.

Mekanik olarak, mevcut çalışma YTHDC1'in Rab27A mRNA ile etkileşime girdiğini ve nükleer ihracatını kolaylaştırdığını göstermiştir. Sitoplazmik translokasyondan sonra, IGF2BP2 doğrudan Rab27A mRNA ile birleşir ve transkript stabilitesini artırır. Sonuç olarak, YTHDC1 veya IGF2BP2 azalması Rab27A ekspresyonunu azaltmış ve osteoklast farklılaşmasını bastırmıştır. Bu bulgular, YTHDC1 ve IGF2BP2'nin mRNA taşınımı ve stabilitesini koordine ederek Rab27A ifadesini korumak için iş birliği yaptığı bir modeli desteklemektedir. Bu düzenleyici mekanizma, osteoklast farklılaşmasının m6A aracılı düzenlenmesi konusundaki mevcut anlayışı genişletir ve bu yolun birden fazla bileşenini potansiyel terapötik hedefler olarak tanımlar.

Birkaç sınırlama kabul edilmelidir. Birincisi, Rab27A'nın osteoklast farklılaşmasını düzenlediği gösterilse de, osteoblast fonksiyonu üzerindeki potansiyel etkileri henüz araştırılmamıştır. Kemik homeostazı, osteoklast aracılı kemik rezorpsiyonu ile osteoblast aracılı kemik oluşumu arasındaki dengeye bağlı olduğundan, gelecekteki çalışmalar Rab27A'nın osteoblast farklılaşmasını veya aktivitesini de etkileyip etkilemediğini değerlendirmelidir. İkinci olarak, mevcut çalışma esas olarak işlev kaybı yaklaşımlarına dayanıyordu. Rab27A, YTHDC1 ve IGF2BP2'nin tamamlayıcı aşırı ekspresyonu ile birlikte m6A-eksikli Rab27A mutantlarının kullanıldığı kurtarma deneyleri, önerilen düzenleyici modeli daha da güçlendirecektir. Üçüncü olarak, Rab27A mRNA içindeki birkaç olası m6A sitesi biyoinformatik yaklaşımlarla tahmin edilmiş olsa da, Rab27A fonksiyonunu düzenleyen spesifik siteler henüz tanımlanmamış ve deneysel doğrulama gerektirmektedir. Son olarak, osteoklast farklılaşma sırasında Rab27A düzenlemesine diğer m6A okuyucu proteinlerinin, RNA bağlayan proteinlerin veya sinyal yollarının katılıp katılmadığını belirlemek için ek çalışmalar gereklidir.

Bağışıklık düzenlemesi, osteoporoz patogenezinin önemli bir bileşeniolarak ortaya çıkmıştır 46,47. Rab27A, bağışıklık hücresi salgılanması, sitotoksik granül salınımı, nötrofil degranülasyonu ve doku mikroortamının düzenlenmesi gibi 48,49,50,51,52,53,54,55 gibi işlevler sağlamıştır. Rab27A, bağışıklık regülasyonu ve kemik homeostazı arasındaki ilişkinin daha fazla araştırılması, osteoporozun patogenezi hakkında ek bilgiler sağlayabilir.

Gelecekteki soruşturmalar birkaç önemli alana öncelik vermelidir. İlk olarak, YTHDC1 ve IGF2BP2 aracılı düzenlemede rol alan fonksiyonel bağlanma noktalarını belirlemek için Rab27A içindeki tahmin edilen m6A sitelerinin sistematik mutagenezi gereklidir. İkinci olarak, Rab27A, YTHDC1 ve IGF2BP2'nin aşırı ifade edilmesi, m6A-eksikli Rab27A mutantlarının kullandığı kurtarma deneyleriyle birlikte, YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2 düzenleyici ekseninin doğrudan katkısını belirlemek için hayati öneme sahiptir. Üçüncü olarak, bu yolun ek osteoporoz modellerinde doğrulanması ve osteoblastlarda Rab27A fonksiyonunun değerlendirilmesi mevcut bulguları daha da doğrulamak için önemli olacaktır.

Sonuç olarak, mevcut çalışma osteoklast farklılaşmasını ve osteoporozun ilerlemesini teşvik eden yeni bir YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2 düzenleyici eksen tespit etmiştir. YTHDC1, m6A modifiye Rab27A mRNA'nın nükleer ihracatını kolaylaştırırken, sitoplazmada Rab27A mRNA stabilitesini IGF2BP2 artırdı. Bu koordine düzenleyici olaylar, Rab27A ifadesini artırdı ve osteoklastogenezi teşvik etti. Bulgular topluca, osteoporozda m6A aracılı düzenlemenin mevcut anlayışını genişletmekte ve YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2 yolunu hedefleyen terapötik stratejiler geliştirmek için temel sağlamaktadır.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarlar veya çıkar çatışmaları belirtmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Pengzhou Halk Hastanesi ile Güneybatı Tıp Üniversitesi arasında Lian Tang'a sağlanan Bilimsel ve Teknolojik Stratejik İşbirliği Projesi (Hibe No. 2023PZXNYD01) tarafından maddi olarak desteklendi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4% ParaformaldehydeThermo Fisher ScientificA5818101Tissue and cell fixation
Alexa Fluor 488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11001Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534069
Alexa Fluor 546 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11035Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534093
Bovine serum albumin (BSA)MerckA2153Blocking reagent
Bradford Protein AssayMerckB6916Protein quantification
C57BL/6JSlac miceShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.—Female, 8 weeks old; RRID: MGI:2159769
c-FOS antibodyAbcamab222699Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2891049
Confocal laser scanning microscope (SP8)Leica MicrosystemsSP8Immunofluorescence image acquisition; RRID: SCR_018169
DAPIThermo Fisher ScientificD3571Nuclear counterstain for immunofluorescence; RRID: AB_2307445
EDTAMerckV900081-500GTissue decalcification reagent
EosinSolarbioG1100Histological cytoplasmic stain
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher ScientificA5669701Cell culture supplement
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0Statistical analysis software; RRID: SCR_002798
HematoxylinCell Signaling Technology#14166Histological nuclear stain
IBM SPSS StatisticsIBMWindows versionStatistical analysis software; RRID: SCR_016479
IGF2BP2 antibodyProteintech11601-1-APPrimary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_2122672
Inverted light microscope (DMi8)Leica MicrosystemsDMi8Histological image acquisition; RRID: SCR_026672
Lentiviral titer quantification kitTakara Bio631235Lentiviral titer determination
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015Plasmid transfection reagent
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150siRNA transfection reagent
M-CSFMedChemExpressHY-P7085Osteoclast differentiation factor
Micro-computed tomography systemScanco MedicalVivaCT80Bone morphometric analysis
M-MLV Reverse TranscriptasePromegaM1701cDNA synthesis
NFATc1 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-7294Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2152503
PARIS KitThermo Fisher ScientificAM1556Nuclear and cytoplasmic fractionation
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Antibiotic supplement for cell culture
Power SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific4367659Quantitative real-time PCR
Protease inhibitor cocktailThermo Fisher Scientific78429Prevention of protein degradation
Protein A/G agarose beadsMerckIP05Immunoprecipitation
PVDF membraneThermo Fisher Scientific88520Protein transfer membrane for western blotting
Rab27A antibodyAbcamab55667Primary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_945112
RANKLMedChemExpressHY-P7425Osteoclast differentiation factor
Real-time PCR systemApplied BiosystemsABI7900HTQuantitative real-time PCR instrument
RIPA bufferThermo Fisher Scientific78501Protein extraction buffer
RNA Immunoprecipitation (RIP) KitMilliporeRIP-12RXNRNA immunoprecipitation assay
SDS-PAGE reagentsThermo Fisher ScientificBT041210BOXProtein electrophoresis
shRNA plasmidsRiboBio—Gene silencing by RNA interference
Small interfering RNAs (siRNAs)GenePharma—Gene silencing by RNA interference
SRAMPOnline resource—Prediction of m6A modification sites; RRID: SCR_024500
StarBase (ENCORI)Online resource—RNA interaction prediction database; RRID: SCR_016303
TRAP antibodyAbcamab2391Primary antibody for western blotting; RRID: AB_303034
TRAP staining kitMerck387ADetection of osteoclast activity
Triton X-100Thermo Fisher Scientific85111Cell permeabilization reagent
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026CNTotal RNA isolation
YTHDC1 antibodyAbcamab122340Primary antibody for western blotting; RRID: AB_11128253
α-MEMFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation139-15651Cell culture medium
β-Actin antibodyMerckA5441Loading control for western blotting; RRID: AB_476744

Kaynaklar

  1. Kanis JA. Assessment of fracture risk and its application to screening for postmenopausal osteoporosis: synopsis of a WHO report. WHO Study Group. Osteoporos Int. 1994;4(6):368-81.
  2. Leslie WD, Morin SN. Osteoporosis epidemiology 2013: implications for diagnosis, risk assessment, and treatment. Curr Opin Rheumatol. 2014;26(4):440-6.
  3. Chen P, Li Z, Hu Y. Prevalence of osteoporosis in China: a meta-analysis and systematic review. BMC Public Health. 2016;16(1):1039. doi: 10.1186/s12889-016-3712-7.
  4. Sambrook P, Cooper C. Osteoporosis. Lancet. 2006;367(9527):2010-8.
  5. Rachner TD, Khosla S, Hofbauer LC. Osteoporosis: now and the future. Lancet. 2011;377(9773):1276-87.
  6. Bone HG, et al. 10 years of denosumab treatment in postmenopausal women with osteoporosis: results from the phase 3 randomised FREEDOM trial and open-label extension. Lancet Diabetes Endocrinol. 2017;5(7):513-23.
  7. Siris ES, et al. Impact of osteoporosis treatment adherence on fracture rates in North America and Europe. Am J Med. 2009;122(2 Suppl):S3-13.
  8. Cheung EYN, Tan KCB, Cheung CL, Kung AWC. Osteoporosis in East Asia: Current issues in assessment and management. Osteoporos Sarcopenia. 2016;2(3):118-33.
  9. Kohno N, et al. Zoledronic acid significantly reduces skeletal complications compared with placebo in Japanese women with bone metastases from breast cancer: a randomized, placebo-controlled trial. J Clin Oncol. 2005;23(15):3314-21.
  10. Stenmark H. Rab GTPases as coordinators of vesicle traffic. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009;10(8):513-25.
  11. Yamaguchi Y, et al. Rab44, a novel large Rab GTPase, negatively regulates osteoclast differentiation by modulating intracellular calcium levels followed by NFATc1 activation. Cell Mol Life Sci. 2018;75(1):33-48.
  12. Xiang Q, et al. Beyond resorption: osteoclasts as drivers of bone formation. Cell Regen. 2024;13(1):22. doi: 10.1186/s13619-024-00205-0.
  13. Teitelbaum SL. Bone resorption by osteoclasts. Science. 2000;289(5484):1504-8.
  14. Suda T, Takahashi N, Martin TJ. Modulation of osteoclast differentiation. Endocr Rev. 1992;13(1):66-80.
  15. Durdan MM, Azaria RD, Weivoda MM. Novel insights into the coupling of osteoclasts and resorption to bone formation. Semin Cell Dev Biol. 2022;123:4-13.
  16. Boyle WJ, Simonet WS, Lacey DL. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 2003;423(6937):337-42.
  17. Tosun B, et al. Osteoclasts and Macrophages-Their Role in Bone Marrow Cavity Formation During Mouse Embryonic Development. J Bone Miner Res. 2022;37(9):1761-74.
  18. Xie H, et al. PDGF-BB secreted by preosteoclasts induces angiogenesis during coupling with osteogenesis. Nat Med. 2014;20(11):1270-8.
  19. Hattner R, Epker BN, Frost HM. Suggested sequential mode of control of changes in cell behaviour in adult bone remodelling. Nature. 1965;206(983):489-90.
  20. Kim JD, et al. An essential role for Rab27a GTPase in eosinophil exocytosis. J Leukoc Biol. 2013;94(6):1265-74.
  21. Goishi K, Mizuno K, Nakanishi H, Sasaki T. Involvement of Rab27 in antigen-induced histamine release from rat basophilic leukemia 2H3 cells. Biochem Biophys Res Commun. 2004;324(1):294-301.
  22. Johnson JL, et al. Munc13-4 restricts motility of Rab27a-expressing vesicles to facilitate lipopolysaccharide-induced priming of exocytosis in neutrophils. J Biol Chem. 2011;286(7):5647-56.
  23. Ejlerskov P, et al. NADPH oxidase is internalized by clathrin-coated pits and localizes to a Rab27A/B GTPase-regulated secretory compartment in activated macrophages. J Biol Chem. 2012;287(7):4835-52.
  24. Kariya Y, et al. Rab27a and Rab27b are involved in stimulation-dependent RANKL release from secretory lysosomes in osteoblastic cells. J Bone Miner Res. 2011;26(4):689-703.
  25. Johnson JL, et al. Rab27a and Rab27b regulate neutrophil azurophilic granule exocytosis and NADPH oxidase activity by independent mechanisms. Traffic. 2010;11(4):533-47.
  26. Yokoyama K, et al. Rab27a negatively regulates phagocytosis by prolongation of the actin-coating stage around phagosomes. J Biol Chem. 2011;286(7):5375-82.
  27. Jancic C, et al. Rab27a regulates phagosomal pH and NADPH oxidase recruitment to dendritic cell phagosomes. Nat Cell Biol. 2007;9(4):367-78.
  28. Shimada-Sugawara M, et al. Rab27A regulates transport of cell surface receptors modulating multinucleation and lysosome-related organelles in osteoclasts. Sci Rep. 2015;5:9620. doi: 10.1038/srep09620.
  29. Johnson JL, et al. Vesicular trafficking through cortical actin during exocytosis is regulated by the Rab27a effector JFC1/Slp1 and the RhoA-GTPase-activating protein Gem-interacting protein. Mol Biol Cell. 2012;23(10):1902-16.
  30. Wang X, et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 2014;505(7481):117-20.
  31. Boulias K, Greer EL. Biological roles of adenine methylation in RNA. Nat Rev Genet. 2023;24(3):143-60.
  32. Wu Y, et al. Mettl3-mediated m(6)A RNA methylation regulates the fate of bone marrow mesenchymal stem cells and osteoporosis. Nat Commun. 2018;9(1):4772. doi: 10.1038/s41467-018-06898-4.
  33. Chen RX, et al. N(6)-methyladenosine modification of circNSUN2 facilitates cytoplasmic export and stabilizes HMGA2 to promote colorectal liver metastasis. Nat Commun. 2019;10(1):4695. doi: 10.1038/s41467-019-12651-2.
  34. Wu X, et al. Caffeic acid 3,4-dihydroxy-phenethyl ester suppresses receptor activator of NF-kappaB ligand-induced osteoclastogenesis and prevents ovariectomy-induced bone loss through inhibition of mitogen-activated protein kinase/activator protein 1 and Ca2+-nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1 signaling pathways. J Bone Miner Res. 2012;27(6):1298-308.
  35. Luo J, et al. Regulation of bone formation and remodeling by G-protein-coupled receptor 48. Development. 2009;136(16):2747-56.
  36. Jing H, et al. Epigenetic inhibition of Wnt pathway suppresses osteogenic differentiation of BMSCs during osteoporosis. Cell Death Dis. 2018;9(2):176. doi: 10.1038/s41419-017-0231-0.
  37. Yang C, et al. TET2 regulates osteoclastogenesis by modulating autophagy in OVX-induced bone loss. Autophagy. 2022;18(12):2817-29.
  38. Blumer MJ, et al. Role of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) in long bone development. Mech Dev. 2012;129(5-8):162-76.
  39. Sakai E, et al. Suppression of RANKL-dependent heme oxygenase-1 is required for high mobility group box 1 release and osteoclastogenesis. J Cell Biochem. 2012;113(2):486-98.
  40. Roberts BC, et al. PTH(1-34) treatment and/or mechanical loading have different osteogenic effects on the trabecular and cortical bone in the ovariectomized C57BL/6 mouse. Sci Rep. 2020;10(1):8889. doi: 10.1038/s41598-020-65921-1.
  41. Roundtree IA, et al. YTHDC1 mediates nuclear export of N(6)-methyladenosine methylated mRNAs. Elife. 2017;6. doi: 10.7554/eLife.31311.
  42. Flick LM, et al. Effects of receptor activator of NFkappaB (RANK) signaling blockade on fracture healing. J Orthop Res. 2003;21(4):676-84.
  43. Takeyama K, Chatani M, Takano Y, Kudo A. In-vivo. imaging of the fracture healing in medaka revealed two types of osteoclasts before and after the callus formation by osteoblasts. Dev Biol. 2014;394(2):292-304.
  44. Yamada H, et al. Effects of 16-month treatment with the cathepsin K inhibitor ONO-5334 on bone markers, mineral density, strength and histomorphometry in ovariectomized cynomolgus monkeys. Bone. 2016;86:43-52.
  45. McClung MR, et al. Odanacatib for the treatment of postmenopausal osteoporosis: results of the LOFT multicentre, randomised, double-blind, placebo-controlled trial and LOFT Extension study. Lancet Diabetes Endocrinol. 2019;7(12):899-911.
  46. Tao R, et al. Advances in immune mechanisms and developing immune-targeted therapies for osteoporosis: A systematic review. Pharmacol Res. 2025;218:107835. doi: 10.1016/j.phrs.2025.107835.
  47. Qi Z, Luo J, Xiao Z, Yang D. Functional roles of immune cells in osteoporosis. Front Immunol. 2025;16:1698283. doi: 10.3389/fimmu.2025.1698283.
  48. Krzewski K, Cullinane AR. Evidence for defective Rab GTPase-dependent cargo traffic in immune disorders. Exp Cell Res. 2013;319(15):2360-7.
  49. Adnani L, et al. Immune cell infiltration into brain tumor microenvironment is mediated by Rab27-regulated vascular wall integrity. Sci Adv. 2025;11(21):eadr6940. doi: 10.1126/sciadv.adr6940.
  50. Brauer N, et al. Immunodeficiency with susceptibility to lymphoma with complex genotype affecting energy metabolism (FBP1, ACAD9) and vesicle trafficking (RAB27A). Front Immunol. 2023;14:1151166. doi: 10.3389/fimmu.2023.1151166.
  51. Ramadass M, Catz SD. Molecular mechanisms regulating secretory organelles and endosomes in neutrophils and their implications for inflammation. Immunol Rev. 2016;273(1):249-65.
  52. Menasche G, et al. Mutations in RAB27A cause Griscelli syndrome associated with haemophagocytic syndrome. Nat Genet. 2000;25(2):173-6.
  53. Prashar A, Schnettger L, Bernard EM, Gutierrez MG. Rab GTPases in Immunity and Inflammation. Front Cell Infect Microbiol. 2017;7:435. doi: 10.3389/fcimb.2017.00435.
  54. Stinchcombe JC, et al. Rab27a is required for regulated secretion in cytotoxic T lymphocytes. J Cell Biol. 2001;152(4):825-34.
  55. Catz SD. The role of Rab27a in the regulation of neutrophil function. Cell Microbiol. 2014;16(9):1301-10.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kemik li i MakrofajlarTRAP BoyamasWestern BlotYTHDC1IGF2BP2

İlgili makaleler