Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

DNA-FISH Metafazı, İnsan Kanser Hücre Hatlarında Homojen Boyalı Bölgelerden Ekstrakromozomal DNA'yı Ayırt Etmek İçin Yayılır

402 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71970

⸱

4 Ağustos 2026

 ,  , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine

Bu makalede

Özet

Genom içindeki lokus kopya sayısını ve konumunu görsel olarak tespit eden bir DNA-FISH metafaz yayılım protokolü rapor ediyoruz. Bu yaklaşım, özellikle ekstrakromozomal DNA içeren ve homojen boyama bölgeleri içeren kanser hücre hatlarında amplifikasyon durumlarının tek hücre çözünürlükünü sağlar.

Özet

Tam genom dizileme, temel çift çözünürlüğüyle odak DNA amplifikasyonlarını tanımlar, ancak amplifikasyonlu dizilerin ekstrakromozomal DNA'da (ecDNA, çift dakika olarak da bilinir) mı yoksa kromozom olarak entegre homojen boyama bölgelerinde (HSR) mi bulunduğunu belirleyemez. DNA floresansı in situ hibridizasyon (DNA-FISH) metafaz dağılımları, bu amplifikasyon durumlarını tek hücre çözünürlükte ayırt etmek için altın standart olmaya devam etmektedir. Burada, insan kanser hücre hatlarını kullanarak DNA-FISH metafaz yayılımları için hücre kültürü, metafaza durdurma, hipotonik tedavi, fiksasyon, kromozom yayımı, floresan prob hibridizasyonu ve floresan görüntülemeyi kapsayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Protokol, başarılı kromozom dağılımı doğrulamak ve metafaza yayılım kalitesini optimize etmek için ara kalite kontrol adımlarını içeriyor; böylece iş akışı uzmanlaşmış sitogenetik uzmanlığı olmayan laboratuvarlar için erişilebilir hale getiriyor. Sonuçlar, lokus-spesifik problar kullanılarak ecDNA ve HSR amplifikasyon durumlarının net görselleştirilmesini ve yorumu etkileyebilecek yaygın teknik artefaktları göstermektedir. Bu protokol, kanser hücrelerinde onkogen amplifikasyonunun yapısal organizasyonunu incelemek için sağlam ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar.

Giriş

İnsan genomu sadece dizisine göre değil, aynı zamanda yapısına göre de organize edilir ve her iki dizi veya yapıdaki değişikliklerkansere yol açabilir 1,2,3,4. Onkogen amplifikasyonu, tüm tümörlerin yaklaşık %40'ında bulunur ve tümörün başlanmasına, büyümeye, metastaz ve ilaç direncine katkıdabulunur 5. Bazı durumlarda, amplifikasyon onkogenler, 6,7,8,9 doğrusal kromozomlarının dışında bulunan dairesel, kendini çoğalan, çift zincirli DNA elemanları olan ekstrakromozomal DNA'lar (ecDNA'lar, çift dakika olarak da adlandırılır) üzerinde taşınır. ecDNA'lar,10,11 boyutlarında yüzlerce kilobazdan megabaz aralığına kadar değişir. Centromer eksikliği nedeniyle, mitoz sırasında asimetrik olarak ayrılırlar ve bu da tek birçekirdekte 12,13,14,15,16,17,18 sayısında 100+ kopyaya ulaşır. Bu eşit olmayan ayrım, kız hücreler arasında kopya sayısı değişkenliği yaratır; bu da tümörün hızlı evrimini ve hasta sonuçlarının kötü olmasınısağlar 17,19.

ecDNA'lar, homojen boyama bölgeleriyle (HSR) dinamik bir ilişki içinde bulunur (Şekil 1A)8,18. HSR'ler, ecDNA'ların genomda tek bir lokusa yeniden entegre edilmesiyle ortaya çıkabilen odaklı, kromozom içi amplifikasyonlardır 8,10,18,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Bu iki durum, ecDNA ve HSR, birbirine dönüşebilir ve onkogen amplifikasyonunun yapısal olarak plastikolduğunu ortaya koyar. 24,25,32,33. Bu dönüşüm, ecDNA'larınilaçlar 32,33,34,35,36,37,38 varlığında HSR durumuna geçiş yapabilmesiyle terapötik bir öneme sahiptir. HSR durumuna geçiş sürecinden geçen hücreler, terapötikbasınç 33 altında ilaca dirençli hale gelir. HSR'ler ayrıca kötü huylu tümörlerde iyi huylu tümörlere göre daha sıkgörülmektedir 39. Klinik önemlerine rağmen, FDA onaylı hiçbir strateji HSR durumunu hedef almıyor; kısmen bu amplifikasyon yapılarını ayırt etme yöntemleri hâlâ yeterince kullanılmadığı için.

ecDNA ve HSR durumlarının farklı klinik sonuçları olsa da, mevcut dizileme yaklaşımları bunları güvenilir şekilde ayırt edemez. Tam genom dizileme (WGS) artık baz çiftiçözünürlüğü 40 olan amplifikasyon bölgeleri tanımlıyor. WGS, ecDNA ve HSR'lerin dizi bileşimini tanımlamada değerli olmuştur, ancak bu durum mekânsal çözünürlük pahasına gerçekleşmiştir. Geleneksel sitogenetik yaklaşımların aksine, WGS tek başına amplifikasyonlu bir dizinin ecDNA'larda mı bulunduğunu yoksa HSR 41,42,43 olarak kromozoma entegre olup olmadığını belirleyemez. Sonuç olarak, amplifikasyonun mekansal bağlamını koruyan yöntemler, bu farklı durumların biyolojisini anlamak için hayati olmaya devam eder.

Son 40 yıldır, DNA floresansı in situ hibridizasyon (DNA-FISH) metafaz yayılımları, ecDNA ve HSR amplifikasyondurumlarının 42,44,45,46'nın tanımlanması ve ayırt edilmesinde altın standart olarak hizmet etmiştir. Aslında, ecDNA'lar ve HSR'ler ilk olarak metafaz tabanlı sitogenetik analizlerle tanımlanmışve karakterize edilmiştir 7,47. Flüoresan probların yaygın kullanımından önce, yerinde hibritizasyon radyo etiketli DNA probları kullanılarak gerçekleştirilmiştir; bu problar ecDNA veHSR'leri görselleştirmek için de kullanılmıştır 48,49. WGS popülerlik kazandıkça, DNA-FISH metafaz yayılımları daha az yaygınlaştı. İş akışının birçok yönü sitogenetik literatürde dağınık olarak dağılmıştır ve optimize edilmiş protokoller genellikle yöntemi özel olarak ele alan bireysel araştırma grupları veya sitogenetik laboratuvarlarındakorunur. Burada, tek hücre düzeyinde amplifikasyon durumunu görsel olarak çözmek için DNA-FISH metafaz yayılım protokolünü tanımlıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm insan hücre kültürü prosedürleri kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Kolsemid (N-metil-N-deasetil-kolşisin) kullanılarak metafazda hücreleri tutun

  1. Yaklaşık 2.0 × 106–2.0 × 107 kanser hücresi veya diğer kültürlenmiş hücrelerle başlayın. Çok az hücre daha az metafaz yayılımı sağlarken, çok fazla hücre yeterli fiksasyona yol açabilir.
  2. Deneysel sistem için uygun Colcemid kuluçka süresini belirleyin. Kuluçka süresi, elde edilen metafaz yayılımlarının sayısını ve kromozom uzunluğunu etkiler ve optimal koşullar hücre tipleri arasında değişiklik gösterir.
    NOT: Daha kısa kuluçka süreleri, toplanma sırasında metafazda daha az hücrenin durmasına yol açar. Daha uzun kuluçka süreleri, daha kısa kollara sahip daha yoğunlaşmış kromozomlar üretir ve bu da analizi zorlaştırır. Yaklaşık 24 saat ikiqat büyüme süresine sahip kanser hücre hatları için, 45 dakikadan gece boyunca değişen kuluçka dönemleri uygun metafaz yayılımları üretir. Daha yavaş ikiye çıkma sürelerine sahip hücreler için kuluçka süresini optimize edin. 2 saatlik kuluçka, analiz için uygun kromozom uzunluklarıyla yeterli sayıda metafaz yayılımı üretmek için genellikle yeterlidir.
  3. Uygun hücre kültür ortamında nihai 10 μL/mL konsantrasyonuna ulaşmak için gereken Kolsemid miktarını hesaplayın.
    NOT: Metafaz durmasından en az 24 saat önce hücreleri logaritmik büyümede tutun. Kültürler %70–%90 birleşime ulaştığında hücreleri Colcemid ile tedavi edin.
  4. Colcemid stok çözeltisini steril ultra saf suyla 1:1 seyreltin. Kültüre uygun hacmi ekleyin ve hücre kültüründe 45 dakika ile gece boyunca kuluçka yapın.

2. Hücreleri hasat et

  1. Taze Carnoy fiksatifi (3:1 metanol: asetik asit) hazırlayın. Fiksasyon işlemi boyunca fiksasyonu buzda tutun.
  2. Taze bir 0,075 M KCl çözeltisi hazırlayın ve 37 °C su banyosunda ısıtın.
  3. Hücreleri bir pelet olarak topla ve hücre sayısını kaydet. Bu değeri kullanarak nihai yeniden süspansiyon hacmini hesaplayın.
    NOT: Yapışkan hücreleri tripsizasyon yoluyla ayırın. Süspansiyon hücrelerini doğrudan 15 mL santrifüj tüplerine aktarın. Colcemid ve Colcemid içeren maddeleri kurumsal tehlikeli atık yönergelerine göre bertaraf edin.
  4. Hücreleri PBS ile yıkayın.
  5. Hücreleri 10 mL sıcak 0.075 M KCl'de nazikçe yeniden süspansiyona alın ve nazik ters çevirme ile karıştırın. Bu hipotonik tedavi, hücreleri şiştirerek slayt hazırlığı sırasında kromozomların patlamasına ve dağıtılmasına olanak tanır.
  6. Hücreleri 37 °C'lik su banyosunda 30 dakika kuluçka yapın.
  7. Yavaşça 2 mL buz gibi soğuk Carnoy fiksatorunu ekleyin ve süspansiyonu nazikçe ters çevirerek karıştırın.
  8. Hücrelerin 5 dakika boyunca ayakta durmasına izin verin.
  9. Oda sıcaklığında 500 × g boyunca santrifüj yapın.
  10. Süpernatantı dikkatlice aspire edin veya pipetle çıkarın.
  11. Her eklemeden sonra nazikçe karıştırarak 10 mL buz gibi soğuk Carnoy fiksatorunu 0,5 mL aralıklarla yavaşça ekleyin.
  12. Hücrelerin RT pozisyonunda 10 dakika beklemesine izin verin.
  13. 650 × g'de 5 dakika boyunca RT'de santrifüj yapın.
  14. 2.10–2.13 adımlarını iki kez tekrarlayın
  15. Son yıkama sırasında, hücreleri Carnoy'un fiksatorunda asılı bırakın.
    DURAKLATMA: Sabit hücre askısını −20 °C'de saklayın veya hemen 3. Bölüme geçin.
    NOT: Yaklaşık 3 ×10 6 hücreden daha az olan örneklerde, daha büyük konik tüpler yerine 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde fiksasyon yapılsın. Tüm kuluçka zamanları, sıcaklıklar ve santrifüj koşullarını koruyarak 0,075 M KCl ve Carnoy fiksatif hacimlerini 10 kat azaltın.

3. Masadan düşme

  1. Örneği −20 °C'den alın ve RT'ye kadar eritin.
  2. 800 × g seviyesinde 7 dakika boyunca RT'de santrifüj yapın.
  3. Cam slaytları etiketleyin ve buzun üzerine koyun.
  4. Fiksasyondan önce elde edilen hücre sayısı kullanılarak, peleti yaklaşık 5 ×10 6 hücre/mL nihai konsantrasyonda yeniden süspansiyona almak için gereken Carnoy fiksatif hacmi hesaplanın. Santrifüjlemeden sonra, pipetle süpernatantı dikkatlice çıkarın, hesaplanan fiksatif hacmi pelletin üzerinde bırakın.
  5. Carnoy fiksatifindeki sabit hücreleri P1000 pipeti kullanarak yeniden askıya alın.
  6. Yaklaşık 300 μL sabit hücreli süspansiyon 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarılır.
  7. Numuneyi P200 pipeti ile birkaç kez yukarı ve aşağı pipetle iyice yeniden askıya alın.
  8. Yeniden askıya alınmış hücrelerin 60 μL'sini P200 pipeti ile aspire edin.
  9. Pipet ucunu cam sürgüsünün yaklaşık 1 m üzerinde buzun üzerinde tutun ve kaydırağın ortasına doğru hedefleyin.
  10. Hücre süspansiyonundan bir damla sürgüye yavaşça verin.
    NOT: Sonraki adımlarda tanımlamayı kolaylaştırmak için sürgü kenarındaki düşüş noktasını etanol dirençli bir işaretleyiciyle işaretleyin.
  11. Hücrelerin 10 dakika buzda kurumasına izin verin.
  12. Slaytları 80 °C'de 10 dakika boyunca bir slayt kuluçka makinesine yerleştirin.
  13. Sürgüleri maşa ile çıkarın ve dokununca soğumasına izin verin.
  14. Slaytları 10× veya 20× hedefli bir faz kontrast mikroskobu ile inceleyin. Aşırı örtüşme olmadan birden fazla iyi dağılmış metafaz yayılımının varlığını doğrulayın.

4. Kaydırığı önceden tedavi edin

  1. Yıkama aşamaları için Coplin kavanozları hazırlayın
    1. Her reaktifi taze hazırlayın: %70 asetik asit (40 mL), PBS (40 mL), PBS (45 mL), %70 etanol (40 mL), %85 etanol (40 mL) ve %100 etanol (40 mL).
  2. Cam sürgüleri %70 asetik asit içinde 2 dakika koyun.
  3. Cam sürgüleri 40 mL PBS'ye 30 saniye boyunca yerleştirin.
  4. Cam slaytları 45 mL PBS içinde 5 dakika boyunca yerleştirin.
  5. Cam slaytlarını sıralı olarak 70%, %85 ve %100 etanol ile 1 dakika boyunca kurutun.
  6. Kaydırakları RT'de 10 dakika hava ile kurut.

5. Probu hazırlayın

NOT: Bu protokol, ilgi çekici genomik bölgeye hibritleşen ticari olarak mevcut lokus-spesifik DNA-FISH problarını kullanır.

  1. İncelenecek amplifikasyonlu lokusu hedefleyen bir prob seçin. Prob ve hibritleşme tamponu üreticinin talimatlarına göre çözülür. Kullanmadan önce sondanın RT noktasına ulaşmasına izin verin.
  2. Her cam slayt için 1 μL prob ve 4 μL hibridizasyon tamponu içeren bir prob karışımı hazırlayın.
    NOT: Optimal prob konsantrasyonu üreticiye ve proba bağlı olabilir. Burada belirtilen konsantrasyon, bu çalışmada kullanılan problara göre optimize edilmiştir. Ancak, her yeni lokus için prob konsantrasyonunu optimize edin.
  3. Cam slayttaki her damla konumunun ortasına 5 μL prob/hibridizasyon tamponu karışımı uygulanır.
    NOT: Problar ışığa duyarlıdır. Slaytları adımlar arasında ve diğer slaytları işlerken koyu bir çekmecede saklayarak kalan süreç boyunca ışık maruziyetini en aza indirin.
  4. Numunenin üzerine dikkatlice bir kapak yapıştırın.
  5. Kapak kenarlarını kauçuk çimentoyla mühürleyin.
  6. Cam sürgüleri nemli bir odaya yerleştirin.
  7. Probu üreticinin protokolüne göre hibritleştirin. Hibritleşmenin gece boyunca (12–18 saat) devam etmesine izin verin.

6. Hibritleşme sonrası yıkamalar, karşı boyama, montaj ve görüntüleme

  1. Yıkama aşamaları için Coplin kavanozları hazırlayın
    1. Her reaktifi taze hazırlayın: 2× SSC (40 mL), 0,4× SSC (40 mL), %70 etanol (40 mL), %85 etanol (40 mL), %100 etanol (40 mL) ve PBS (45 mL).
    2. SSC'yi 20× stoklu çözelti olarak hazırlayın ve depolayın (3 M NaCl, 0,3 M sodyum sitrat, pH 7,0). 1 L hazırlamak için, 1 L ultrasaf suda 175,3 g NaCl ve 88,2 g sodyum sitratı çözün. Stoku seyrelterek 2× SSC ve 0.4 ×SSC çalışma çözeltileri hazırlanır.
  2. 0.4× SSC çözeltiyi su banyosunda 72 °C'ye ısıtın.
  3. Cam slaytları nemli odadan çıkarın ve kauçuk çimentonu dikkatlice çıkarın.
  4. Cam sürgüleri RT pozisyonunda 2× SSC ile 2 dakika boyunca koyun. Örtü kapaklarını dikkatlice çıkarın.
  5. Cam slaytları önceden ısıtılmış 0.4× SSC sıcaklıkta 72 °C'de 2 dakika boyunca koyun.
  6. Cam slaytları 2× SSC'ye 1 dakika RT pozisyonunda yerleştirin.
  7. Cam slaytlarını sıralı olarak 70%, %85 ve %100 etanol ile 1 dakika boyunca kurutun.
  8. Slaytları RT rejiminde 10 dakika karanlıkta hava ile kurut.
  9. 1 mg/mL DAPI 1:1000 PBS'ye kadar seyreldin ve son hacim 1 mL'ye ulaşın.
    NOT: Bu aliquot 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.
  10. Sulandırılmış DAPI'nin 10 μL pipetini işaretlenmiş düşüş noktasına her cam slayta yerleştirin.
  11. DAPI çözeltinin eşit şekilde yayılmasını sağlamak için numunenin üzerine dikkatlice bir örtü yerleştirin.
  12. Slaytları karanlıkta 5–10 dakika kuluçka edin.
  13. Cam slaytları PBS'ye 30 saniye koyun.
  14. Kapak kapaklarını çıkarın.
  15. Cam slaytları PBS'ye 2 dakika koyun.
  16. Cam slaytları yaklaşık 10 saniye boyunca 70%, %85 ve %100 etanol içinde kısa süreliğine daldırarak kurutun.
  17. Slaytları RT rejiminde 10 dakika karanlıkta hava ile kurut.
  18. Her cam kaydıra 15 μL montaj ortamı ekleyin, ardından üstüne bir kapak koyun.
  19. Montaj ortamının eşit şekilde yayılmasına izin verin, sonra fazlalıkları nazikçe silin.
  20. Örtü kenarlarını oje ile kapatın.
  21. Ojeyi RT ile karanlıkta 15 dakika kurumasına izin verin.
    DURAKLATMA: Slaytları uzun süreli depolama için 4 °C'de sakla.
  22. Slaytları gör.
    NOT: Görüntüler, 60× yağ batdırma hedefiyle ters floresans mikroskobu kullanılarak alındı.
  23. Her floresan kanalı için birden fazla z-yığını toplayarak metafaz yayılımının tam derinliğinde sinyali yakaladım.
  24. Sinyal netliğini artırmak ve odak dışı floresansı azaltmak için maksimum olasılıklı tahmin algoritması kullanarak görüntü yığınlarını dekonvolüye edin.
  25. ImageJ'de nihai görüntüleri işleyip analiz edin ve her metafaz dağılımı için optimal odak düzlemini seçin, ardından aşağı akış analizine girin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol (Şekil 1B), sitogenetik analiz için uygun, temiz, iyi dağılmış, sağlam metafaz kromozomları sağlar; kromozomlar ve DNA-FISH sinyalleri floresans mikroskopisiyle net şekilde görülebilir. Düşük büyütmede (10× veya 20×) parlak alan/faz kontrastlı mikroskop kullanmak, çekirdeklerin patladığını ve kromozomların dağılmasını doğrulamak için önemli bir kalite kontrol adımıdır (Şekil 2). Başarılı fiksasyon ve masaüstü düşürme...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İyi bilinen avantajlarına rağmen, DNA-FISH metafaz yayılımları WGS döneminde yeterince kullanılmamaktadır. Amplifikasyonlu DNA'nın fiziksel organizasyonu işlevsel olarak anlamlıdır; çünkü aşağı akımda biyolojik davranışı ve terapötik yanıtıetkileyebilir 61,62,63,64. Foksel olarak amplifikasyonlu onkogenler ecDNA veya HSR'ler içinde bulunabilir ve bu iki amplifi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, NIH R00HG011467 ve CPRIT RR23004 G.S.E.'ye destek vermiştir. Bu proje için görüntüleme, Baylor Tıp Fakültesi Entegre Mikroskopi Çekirdeği tarafından NIH (P30 DK056338, P30 CA125123, S10OD030414) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, Dr. Pawel Stankiewicz'e erken dönemdeki tavsiyeleri için teşekkür ediyor. Yazarlar ayrıca GBM39ec ve GBM39hsr hücre hatlarını sağladığı için Dr. Paul Mischel'e (Stanford Üniversitesi) teşekkür ediyorlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15-mL konik santrifüjherhangi bir kaynakNASantrifüjleme. 
15-mL konik tüplerherhangi bir kaynakNAHücre toplanması.
200 proof etanolherhangi bir kaynakNAYıkama adımları. 
Asetik Asit, buzlu, %99,7Millipore Sigma695092Carnoy'un fiksatif ve slayt yıkama adımları.
Antifade Montaj OrtamıFisherScientificNC9265087Tamamlanmış slayt hazırlığı sonrası slayt montajı
Vakuum çıkışlı biyolojik güvenlik kabiniherhangi bir kaynakNAKimyasallar için depolama.
Colcemid (N-metil-N-deasetil-kolşisin)Millipore Sigma10295892001Tübülin'e bağlanır, hücreleri metafazda durdurur.
Coplin kavanozlarıherhangi bir kaynakNAYıkama adımları. 
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindole)Milipore SigmaD8417-1MGFloresan DNA boyası.
EGFR/CON7 FISH probu Empire GenomicsEGFR-CHR07Loka spesifik floresan prob. 
Elmer's kauçuk tutkalıherhangi bir kaynakNAGece boyunca prob hibridizasyonu sırasında kapak camının yerinde tutulması.
Etanole dayanıklı kalıcı kalemherhangi bir kaynakNASlayt etiketleme.
Floresan mikroskopherhangi bir kaynakNASlayt görüntüleme. 
Cam Kapak Camı, 22 x 22mmThermoFisher50-143-780Slayt üzerinde prob hibridizasyonu.
Cam Slayt, ön temizlenmişVWR48311-703Metafaz yayılmalarını bırakmak ve DNA-FISH gerçekleştirmek için
Nemli CO2 İnkübatörüherhangi bir kaynakNACanlı hücre inkübasyonu.
Hibridizasyon TamponuEmpire GenomicsHyb-BufferProb ile kullanılan tampon. 
Buz kovasıherhangi bir kaynakNACarnoy'un fiksatif'ini soğuk tutmak. 
KCl (2M)ThermoFisherAM9640GFiksasyon öncesi hücreleri şişirmek. 
Metanol, %99,9, HPLC sınıfıMillipore Sigma1060351000Carnoy'un fiksatif'i için. 
Mikrosantrifüjherhangi bir kaynakNASantrifüjleme. 
Mikrosantrifüj tüpleriherhangi bir kaynakNAFiksasyon sırasındaki hücreler ve prob hazırlama için. 
MYC / SE 8 ProbLeicaKI-10106Loka spesifik floresan prob. 
PBS, pH 7.4Gibco10010-023Yıkama adımları. 
Faz kontrast mikroskopherhangi bir kaynakNAMetafaz yayılmalarının düşürülmesinden hemen sonra görüntüleme
Pipet uçlarıherhangi bir kaynakNAPipetleme.
Sodyum klorürMillipore SigmaS9888SSC tamponu için.
Sodyum sitratMillipore Sigma567446SSC tamponu için.
Steril ultra saf suherhangi bir kaynakNAYıkama adımları. 
ThermoBrite programlanabilir slayt inkübatörüherhangi bir kaynakNASlayt inkübasyonu.
Maşaherhangi bir kaynakNASlayt yıkama adımları için. 
Su banyosuherhangi bir kaynakNAKCl inkübasyonu için. 

Kaynaklar

  1. Albertson DG. Gene amplification in cancer. Trends Genet. 2006;22:447-455.
  2. Bagci O, Kurtgöz S. Amplification of cellular oncogenes in solid tumors. N Am J Med Sci. 2015;7:341-346.
  3. Schimke RT, et al. Gene amplification and drug resistance in cultured animal cells. Cancer Treat Rev. 1984;11:9-17.
  4. Baker TM, Waise S, Tarabichi M, Van Loo P. Aneuploidy and complex genomic rearrangements in cancer evolution. Nat Cancer. 2024;5:228-239.
  5. Ohshima K, et al. Integrated analysis of gene expression and copy number identified potential cancer driver genes with amplification-dependent overexpression in 1,454 solid tumors. Sci Rep. 2017;7:641.
  6. Pecorino LT, Verhaak RGW, Henssen A, Mischel PS. Extrachromosomal DNA (ecDNA): An origin of tumor heterogeneity, genomic remodeling, and drug resistance. Biochem Soc Trans. 2022;50:1911-1920.
  7. Cox D, Yuncken C, Spriggs AI. Minute chromatin bodies in malignant tumours of childhood. Lancet. 1965;286:55-58.
  8. Kohl NE, et al. Transposition and amplification of oncogene-related sequences in human neuroblastomas. Cell. 1983;35:359-367.
  9. Giollant M, et al. Characterization of double minute chromosomes' DNA content in a human high-grade astrocytoma cell line using comparative genomic hybridization and fluorescence in situ hybridization. Hum Genet. 1996;98:265-270.
  10. Stephens PJ, et al. Massive genomic rearrangement acquired in a single catastrophic event during cancer development. Cell. 2011;144:27-40.
  11. Zhang CZ, et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 2015;522:179-184.
  12. Lange JT, et al. The evolutionary dynamics of extrachromosomal DNA in human cancers. Nat Genet. 2022;54:1527-1533.
  13. Turner KM, et al. Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour evolution and genetic heterogeneity. Nature. 2017;543:122-125.
  14. Wu S, et al. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature. 2019;575:699-703.
  15. Deshpande V, et al. Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect. Nat Commun. 2019;10:392.
  16. Levan A, Levan G. Have double minutes functioning centromeres? Hereditas. 1978;88:81-92.
  17. Stöber MC, et al. Intercellular extrachromosomal DNA copy-number heterogeneity drives neuroblastoma cell state diversity. Cell Rep. 2024;43:114711.
  18. Kaufman RJ, Brown PC, Schimke RT. Amplified dihydrofolate reductase genes in unstably methotrexate-resistant cells are associated with double minute chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76:5669-5673.
  19. Kim H, et al. Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers. Nat Genet. 2020;52:891-897.
  20. Schlesinger HR, et al. Establishment and characterization of human neuroblastoma cell lines. Cancer Res. 1976;36:3094-3100.
  21. Balaban-Malenbaum G, Gilbert F. Double minute chromosomes and the homogeneously staining regions in chromosomes of a human neuroblastoma cell line. Science. 1977;198:739-741.
  22. Gilbert F, et al. Homogeneously staining region in a retinoblastoma cell line: Relevance to tumor initiation and progression. J Natl Cancer Inst. 1981;67:301-306.
  23. Quinn LA, Moore GE, Morgan RT, Woods LK. Cell lines from human colon carcinoma with unusual cell products, double minutes, and homogeneously staining regions. Cancer Res. 1979;39:4914-4924.
  24. Montgomery KT, Biedler JL, Spengler BA, Melera PW. Specific DNA sequence amplification in human neuroblastoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983;80:5724-5728.
  25. Singer MJ, et al. Amplification of the human dihydrofolate reductase gene via double minutes is initiated by chromosome breaks. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97:7921-7926.
  26. Shimizu N. Gene amplification and the extrachromosomal circular DNA. Genes (Basel). 2021;12:1533.
  27. Carroll SM, et al. Double minute chromosomes can be produced from precursors derived from a chromosomal deletion. Mol Cell Biol. 1988;8:1525-1533.
  28. Alitalo K, et al. Homogeneously staining chromosomal regions contain amplified copies of an abundantly expressed cellular oncogene (c-myc) in malignant neuroendocrine cells from a human colon carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983;80:1707-1711.
  29. George DL, Powers VE. Amplified DNA sequences in Y1 mouse adrenal tumor cells: Association with double minutes and localization to a homogeneously staining chromosomal region. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982;79:1597-1601.
  30. Storlazzi CT, et al. Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: Origin and structure. Genome Res. 2010;20:1198-1206.
  31. Biedler JL, Meyers MB, Spengler BA. Homogeneously staining regions and double minute chromosomes, prevalent cytogenetic abnormalities of human neuroblastoma cells. In: Fedoroff S, Hertz L, editors. Advances in Cellular Neurobiology. Academic Press; New York, NY; 1983. p. 267-307.
  32. Shoshani O, et al. Chromothripsis drives the evolution of gene amplification in cancer. Nature. 2021;591:137-141.
  33. Nathanson DA, et al. Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA. Science. 2014;343:72-76.
  34. Song K, et al. Plasticity of extrachromosomal and intrachromosomal BRAF amplifications in overcoming targeted therapy dosage challenges. Cancer Discov. 2022;12:1046-1069.
  35. Kang X, et al. Extrachromosomal DNA replication and maintenance couple with the DNA damage pathway in tumors. Cell. 2025;188:3405-3421.e27.
  36. Pommier Y, Nussenzweig A, Takeda S, Austin C. Human topoisomerases and their roles in genome stability and organization. Nat Rev Mol Cell Biol. 2022;23:407-427.
  37. Coquelle A, et al. Expression of fragile sites triggers intrachromosomal mammalian gene amplification and sets boundaries to early amplicons. Cell. 1997;89:215-225.
  38. Coquelle A, et al. A new role for hypoxia in tumor progression: Induction of fragile site triggering genomic rearrangements and formation of complex double minutes and homogeneously staining regions. Mol Cell. 1998;2:259-265.
  39. Mandahl N, Mertens F, Mitelman F. Gene amplification in neoplasia: A cytogenetic survey of 80,131 cases. Genes Chromosomes Cancer. 2024;63:e23214.
  40. Roepman P, et al. Clinical validation of whole genome sequencing for cancer diagnostics. J Mol Diagn. 2021;23:816-833.
  41. Ho SS, Urban AE, Mills RE. Structural variation in the sequencing era. Nat Rev Genet. 2020;21:171-189.
  42. Rajkumar U, et al. EcSeg: Semantic segmentation of metaphase images containing extrachromosomal DNA. iScience. 2019;21:428-435.
  43. Purshouse K, Pollard SM, Bickmore WA. Imaging extrachromosomal DNA (ecDNA) in cancer. Histochem Cell Biol. 2024;162:53-64.
  44. Shapiro DN, et al. Detection of N-myc gene amplification by fluorescence in situ hybridization: Diagnostic utility for neuroblastoma. Am J Pathol. 1993;142:1339-1346.
  45. Krupina K, et al. Chromothripsis and ecDNA initiated by N4BP2 nuclease fragmentation of cytoplasm-exposed chromosomes. Science. 2025;390:1156-1163.
  46. Trask BJ, Hamlin JL. Early dihydrofolate reductase gene amplification events in CHO cells usually occur on the same chromosome arm as the original locus. Genes Dev. 1989;3:1913-1925.
  47. Biedler JL, Spengler BA. A novel chromosome abnormality in human neuroblastoma and antifolate-resistant Chinese hamster cell lines in culture. J Natl Cancer Inst. 1976;57:683-695.
  48. Nunberg JH, Kaufman RJ, Schimke RT, Urlaub G. Amplified dihydrofolate reductase genes are localized to a homogeneously staining region of a single chromosome in a methotrexate-resistant Chinese hamster ovary cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 1978;75:5553-5556.
  49. Gapski GR, et al. Synthesis of a fluorescent derivative of amethopterin. J Med Chem. 1975;18:526-528.
  50. Verma RS, Babu A. Tissue culture techniques and chromosome preparation. In: Human Chromosomes: Manual of Basic Techniques. Pergamon Press; 1989. p. 4-45.
  51. Moorhead PS, et al. Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood. Exp Cell Res. 1960;20:613-616.
  52. Ohara H, Terasima T. Colcemid effects on mitotic synchrony and synchronized cells. Cell Struct Funct. 1976;1:187-195.
  53. Kaufman RJ, Brown PC, Schimke RT. Loss and stabilization of amplified dihydrofolate reductase genes in mouse sarcoma S-180 cell lines. Mol Cell Biol. 1981;1:1084-1093.
  54. Marsden CG, Dragon JA, Wallace SS, Sweasy JB. Base excision repair variants in cancer. Methods Enzymol. 2017;591:119-157.
  55. Nichols A, et al. Chromosomal tethering and mitotic transcription promote ecDNA nuclear inheritance. Mol Cell. 2025;85:2839-2853.e8.
  56. Henegariu O, et al. Improvements in cytogenetic slide preparation: Controlled chromosome spreading, chemical aging, and gradual denaturing. Cytometry. 2001;43:101-109.
  57. Lichter P, et al. Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization using recombinant DNA libraries. Hum Genet. 1988;80:224-234.
  58. Pinkel D, et al. Fluorescence in situ hybridization with human chromosome-specific libraries: Detection of trisomy 21 and translocations of chromosome 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988;85:9138-9142.
  59. Sumner AT, Evans HJ, Buckland RA. New technique for distinguishing between human chromosomes. Nature New Biol. 1971;232:31-32.
  60. Howe B, Umrigar A, Tsien F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. 2014;e50203.
  61. Cavalli G, Misteli T. Functional implications of genome topology. Nat Struct Mol Biol. 2013;20:290-299.
  62. Kosak ST, Groudine M. Form follows function: The genomic organization of cellular differentiation. Genes Dev. 2004;18:1371-1384.
  63. Sehgal P, Chaturvedi P. Chromatin and cancer: Implications of disrupted chromatin organization in tumorigenesis and its diversification. Cancers (Basel). 2023;15:466.
  64. Misteli T. Beyond the sequence: Cellular organization of genome function. Cell. 2007;128:787-800.
  65. Zhu Y, et al. Oncogenic extrachromosomal DNA functions as mobile enhancers to globally amplify chromosomal transcription. Cancer Cell. 2021;39:694-707.
  66. Hung KL, et al. ecDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression. Nature. 2021;600:731-736.
  67. Taghbalout A, et al. Extrachromosomal DNA associates with nuclear condensates and reorganizes chromatin structures to enhance oncogenic transcription. Cancer Cell. 2025;43:2191-2205.e6.
  68. Hsu TC, Pomerat CM. Mammalian chromosomes in vitro: II. A method for spreading the chromosomes of cells in tissue culture. J Hered. 1953;44:23-30.
  69. Erwin GS, Bhimsaria D, Eguchi A, Ansari AZ. Mapping polyamide-DNA interactions in human cells reveals a new design strategy for effective targeting of genomic sites. Angew Chem. 2014;126:10288-10292.
  70. Erwin GS, et al. Synthetic genome readers target clustered binding sites across diverse chromatin states. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113:E7418-7427.
  71. Erwin GS, et al. Synthetic transcription elongation factors license transcription across repressive chromatin. Science. 2017;358:1617-1622.
  72. Erwin GS, et al. Recurrent repeat expansions in human cancer genomes. Nature. 2023;613:96-102.
  73. Shimizu N, Kanda T, Wahl GM. Selective capture of acentric fragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nat Genet. 1996;12:65-71.
  74. Jaworski JJ, et al. ecDNA replication is disorganized and vulnerable to replication stress. Nucleic Acids Res. 2025;53:gkaf711.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

BiyolojiSayı 234Sayı 234Boş DeğerSayıFloresan İn Situ HibridizasyonMetafaz YayılımıKromozomecDNAEkstrakromozomal DNAHomojen Boyanan BölgeHSRKaryotipGen Amplifikasyonu
DNA-FISH Metafazı, İnsan Kanser Hücre Hatlarında Homojen Boyalı Bölgelerden Ekstrakromozomal DNA'yı Ayırt Etmek İçin Yayılır
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.