İzofluran anestezisi altındaki sıçanlarda kuyruk arteri kan örneklemesi; nispeten yüksek kan hacimlerinin, düşük stres altında ve kontrollü bir şekilde toplanmasına olanak tanır. Hızlı iyileşme süreci ve tekrarlanan örneklemeler için uygunluğu, bu yöntemi güvenilir fizyolojik parametreler gerektiren boylamsal çalışmalar için ideal kılmaktadır.
Hızlı rapor
İzofluran ile Anestezi Altındaki Sıçanlarda Kuyruk Arterinden Kan Örneklemesi Stresi Azaltır ve Güvenilirliği Artırır
Bu makalede
Özet
Özet
Bu yöntem, izofluran ile anestezi uygulanmış sıçanlarda kuyruk arteri üzerinden kan örneklemesini açıklamaktadır. İzofluran kullanımı, savunma hareketlerini en aza indirerek hem hayvan hem de araştırmacı için kontrollü ve düşük stresli bir prosedür sağlar. İzofluranın kısa etkili doğası nedeniyle örnekleme sonrası hayvanların hızla iyileşmesi, tek bir ponksiyon noktasından nispeten yüksek hacimlerde kan toplayabilme imkanı ve tekniğin tekrarlanan kan örneklemeleri için uygunluğu diğer avantajlar arasındadır. Ayrıca, hızlı arteriyel kan akışı, mevcut çalışmada spesifik olarak değerlendirilmemiş olsa da, koagülasyon artefaktlarının olasılığını azaltabilir. Sonuçlar, bir farmakokinetik çalışmanın parçası olarak belirlenmiştir. Kan toplama işlemi tüm hayvanlarda başarılı olmuş ve %100 örnekleme başarı oranı elde edilmiştir. Kan örneklemesinden 24 saat sonra belirgin bir vücut ağırlığı kaybı gözlemlenmemiş ve hayvanlar, görünür bir stres belirtisi veya prosedürle ilişkili komplikasyon olmaksızın hızla iyileşmiştir. Genel olarak bu yaklaşım, minimum uygulama stresi ile güvenilir ve tekrarlanabilir kan toplama gerektiren deneysel ortamlar için oldukça uygundur. Kısa bir öğrenme aşamasından sonra prosedürün rutin deneysel kullanım için güvenilir olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, deneyler planlanırken ve sonuçlar yorumlanırken izofluran anestezisinin kan gazı, metabolik ve endokrin parametreler üzerindeki potansiyel etkisi göz önünde bulundurulmalıdır.
Giriş
Kan örneklemesi, fizyolojik ve farmakokinetik parametreleri değerlendirmek amacıyla sıçanların kullanıldığı deneysel araştırmalarda temel bir tekniktir. Önerilen teknikler arasında kuyruk insizyonu, lateral kuyruk veni, safen veni, sublingual ven, jugularis ven ve retro-orbital sinüsten örnekleme ile kateterizasyon yer almaktadır1,2,3,4,5,6,7. Ancak yöntem seçimi istenen sonuçlara bağlıdır ve her yöntemin kendine özgü kısıtlamaları vardır.
Lateral kuyruk veni örneklemesi ve kuyruk insizyonu sınırlı hacimler sağlayabilirken, retro-orbital örnekleme verimli olsa da daha invazivdir, iyileşme sürecini etkiler1 ve doku hasarı riskleri4,8 ile etik endişeler taşır. Safen veni örneklemesi, stres oluşturabilecek ve deneysel sonuçları etkileyebilecek bir sabitleme ve ponksiyon bölgesinin tıraş edilmesini gerektirir2. Safen veninden tekrarlanan kan alımları, venin kısa uzunluğu ve hemostaz nedeniyle zorlayıcı olabilir. Aynı durum sublingual ven için de geçerlidir. Juguler ven ponksiyonu yoluyla hızlı bir şekilde büyük kan hacimleri elde edilebilse de, pnömotoraksa yol açan akciğer yaralanması riski vardır. Ayrıca, ven görünür olmadığı için ponksiyon körlemesine gerçekleştirilmelidir6.
Bu bağlamda, iyi örnek kalitesini sağlarken hayvan acısını minimize eden geliştirilmiş yöntemler giderek daha önemli hale gelmektedir. İzofluran anestezisi altında kuyruk arteri kan örneklemesi böyle bir yaklaşım sunar. Kısa etkili inhalasyon anestezisinin kullanımı, tutma stresini azaltır ve kontrollü bir prosedürü kolaylaştırır. Ayrıca, hızlı kan akışı sayesinde pıhtılaşma artefaktı riskinin azaldığı, yüksek kaliteli kan örneklerinin arteriyel kan toplama ile elde edilmesi beklenir. Hayvanların hızla iyileşmesi ve fizyolojik rahatsızlığın minimize edilmesi nedeniyle bu teknik, özellikle tekrarlanan örneklemeler ve boylamsal çalışma tasarımları için uygundur. Genel olarak bu yöntem, teknik güvenilirliği gelişmiş hayvan refahı ile birleştirir ve bu nedenle hassas ve tekrarlanabilir kan ölçümleri gerektiren deneysel ortamlar için oldukça uygundur.
Protokol
Sunulan yöntemi içeren tüm deneyler, Viyana Tıp Üniversitesi Etik Kurulu ve Avusturya Eğitim, Bilim ve Araştırma Bakanlığı tarafından onaylanmıştır.
1. Hazırlık
NOT: Sürecin sorunsuz ve verimli ilerlemesini sağlamak için anesteziden önce gerekli tüm malzemeleri hazırlayın.
- Kan pıhtılaşmasını önlemek için şırıngayı %3,2 sitrat ile doldurun (miktar istenen parametrelere bağlıdır).
- Oksijen akışını 0,5 L/min olarak ayarlayın ve bunu indüksiyon haznesine ve maskeye yönlendirin.
- İndüksiyon gazının ve oksijenin yalnızca hazneye yönlendirildiğinden emin olmak için maskeye bağlı hortumu kapatın.
- Sıçanı kafesten çıkarın ve indüksiyon haznesine yerleştirin.
- Sıçanın kuyruğunun veya ayaklarının sıkışmadığından emin olarak indüksiyon haznesinin kapağını kapatın.
- İzofluranı %3'e ayarlayın (hortum sistemine bağlı olarak) ve hayvan spontane hareketlerini ve düzeltme refleksini kaybedene kadar bu seviyede tutun.
- Düzeltme refleksinin kaybını doğrulamak için hazneyi nazikçe ileri geri sallayın.
- Gazı ve oksijeni maskeye yeniden yönlendirmek için kutuya bağlı hortumu kapatın.
- Haznenin kapağını açın ve sıçanı çıkarın.
- Sıçanı, burnu maskede olacak şekilde sırt üstü pozisyonda ısıtma pedine (38 °C) yerleştirin (Şekil 1).
- Kuyruğu suyla temizleyin ve kağıt havluyla kurulayın.
- Kuyruğu alkol ile dezenfekte edin.
- Sıçanın arka ekstremite parmakları arasını sıkarak ve geri çekilme yanıtının olmadığını doğrulayarak interdigital refleksin yokluğunu teyit edin.
Şekil 1Sıçan pozisyonu. Sıçan, burnu anestezi maskesine yerleştirilmiş şekilde sırtüstü pozisyona getirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Kan örneği alma
NOT: Arter, kuyruğun ventral tarafında yer alır. Optimal ponksiyon bölgesi, kuyruğun orta ve distal kısımları arasında bulunur. Arter öncelikle anatomik konumuyla tanımlanır, ancak hafif pigmentli sıçanlarda (örneğin, Sprague Dawley), ventral kuyruk arteri bazen soluk mavimsi bir damar olarak görülebilir. Bu durumda, ventral kuyruk arteri genellikle kuyruk tabanında ventral orta hat üzerindeki anatomik konumu sayesinde kolayca tanımlanabilir. Tanımlandıktan sonra, seyri distal yönde hedeflenen ponksiyon bölgesine kadar takip edilebilir.
- Arteri proksimalden distale doğru takip edin.
- İğne eğimini yukarıya doğru yönlendirin.
- İğneyi yaklaşık 30 ° açıyla yerleştirin (Şekil 2).
- İğneyi kranyal yönde ve ardından kuyruğa paralel olarak ilerletin (Şekil 2).
- Şırıngaya kan çekin (Şekil 2).
NOT: İğne kolayca ilerletilebiliyorsa, ilgili kılavuzlara uygun olarak gerekli kan hacmini çekin. Kan basıncı örnekleme için çok düşükse, izofluran konsantrasyonunu %2,5'e düşürün ve iğneyi ponksiyon bölgesinden çıkarmadan işlemi tekrarlayın. Sonraki her kan alımı için ponksiyon bölgesi, önceki bölgenin kranyaline konumlandırılmalıdır. - İğneyi çıkarmadan önce enjeksiyon bölgesine bir pamukla bastırın.
- Gaz anestezisini kapatın ve giriş yerini kontrol edin.
NOT: Kanama durduğunda, sıçanı kendi kafesine geri koyun.
Şekil 2Punksiyon bölgesiPunksiyon bölgesi, kuyruğun orta ve distal üçte birlik kısmının arasında ventralde yer alır ve iğne şu açıyla yerleştirilmelidir: 30°. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. Kan işleme
- Toplanan kanı bir tüpe boşaltın.
- Santrifüj işlemine kadar kanı buz üzerinde saklayın.
Sonuçlar
Bu yöntem makalesinde sunulan veriler bir farmakokinetik çalışma sırasında elde edilmiştir. Çalışmaya yalnızca 6–8 haftalık, vücut ağırlıkları 393 g ile 429 g arasında değişen erkek Sprague Dawley sıçanlar dahil edilmiştir. 0. günde kuyruk arterinden tek bir kan örneği (0,3 mL) alınmıştır. Vücut ağırlığı, kan alımından hemen önce ve örneklemeden 24 saat sonra tekrar kaydedilmiştir. Anestezik gaz hızla solunmuş ve hayvanlar çabuk iyileşmiştir. Kısa bir süre sonra yemek yemeye başlamışlar ve genel sağlık durumlarında herhangi bir bozulma belirtisi göstermemişlerdir. Sıçanlar, sonraki kan örneklemesi için kafesten çıkarıldıklarında herhangi bir stres veya korku belirtisi sergilememişlerdir. Ayrıca, prosedürü takip eden günlerde hiçbir savunma davranışı gözlemlenmemiştir. Prosedür doğru şekilde uygulandığında kuyrukta herhangi bir hematom görülmemiştir. Hayvanlar, kan alımından hemen sonra veya takip eden günlerde herhangi bir ağrı belirtisi göstermemiş olup, kuyruklarındaki kan alım bölgeleri dokunulduğunda da ağrısızdır. Kan alımından sonraki 24 saat içinde herhangi bir vücut ağırlığı kaybı gözlemlenmemiştir. Ortalama vücut ağırlığı 0. günde 409 g'dan 1. günde 419 g'a yükselmiş olup, bu durum %2,6 ± 1,1'lik bir ortalama vücut ağırlığı artışına tekabül etmektedir ve kan örnekleme prosedürünün iyi tolere edildiğini göstermektedir (Şekil 3).
Şekil 3Vücut ağırlığı değişimiSıçanlarda (n = 12) kan örneği alımı öncesindeki (d0) ve 24 saat sonrasındaki (d1) vücut ağırlığı (g). Kan toplama sonrası herhangi bir vücut ağırlığı kaybı gözlenmemiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tartışma
Sunulan kuyruk arteri kan alma tekniği, özellikle tekrarlanan kan örneklemesi veya nispeten büyük kan örneği hacimleri gerektiren çalışmalar için uygundur. Kuyruk veni örneklemesine kıyasla bu teknik, tek bir ponksiyon bölgesinden daha büyük kan hacimlerinin toplanmasını kolaylaştırır ve tekrarlanan örneklemeler için pratik avantajlar sunabilir; zira tekrarlanan venipunksiyonlar, hematom oluşumu ve ven erişilebilirliğinin azalması nedeniyle daha zor hale gelebilir. Die Gesellschaft für Versuchstierkunde / Society of Laboratory Animal Science (GV-SOLAS) ve Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) tavsiyelerine göre, tek bir kan alımı dolaşımdaki kan hacminin %10'unu aşmamalı, günlük tekrarlanan örneklemeler ise uygun bir toparlanma dönemini takiben 24 h başına dolaşımdaki kan hacminin yaklaşık %1'i ile sınırlandırılmalıdır. Açıklanan teknik, önerilen bu örnekleme hacimlerinin güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde elde edilmesini sağlayarak, hem tek seferlik hem de tekrarlanan kan toplama protokolleri için uygun hale gelmektedir.
İdeal bir kan toplama tekniği, prosedürel stresi minimize ederken ve yüksek kaliteli örnekler sağlarken amaçlanan analizler için yeterli kan hacimlerini sunmalıdır. Retro-orbital venöz pleksus ve sublingual venden kan toplama, doku travması nedeniyle koagülasyon sorunlarına yol açabilir8,9, bu da koagülasyon çalışmaları için suboptimal olacaktır. Benzer şekilde, kuyruk veninin "sağılması" gibi damlatma teknikleri de örnekleme kaynaklı koagülasyona yol açabilir. Bu örnekleme yöntemleriyle karşılaştırıldığında, kuyruk yoluyla elde edilen arteriyel kan, prematüre pıhtılaşmaya daha az eğilimli görünmektedir. Bu durum; hızlı toplama işlemine, doku travmasının olmamasına ve kanın şırıngadaki sitrat ile hemen temas ederek koagülasyonu etkili bir şekilde önlemesine bağlanabilir. Juguler ven ponksiyonu gibi diğer teknikler organ hasarı riski taşır1,6 ve önerilen kateterizasyon prosedürleri genel anestezi, ardından postoperatif bakım ve yara yönetimi gerektirir. Tıkanıklıkları önlemek için kateterin düzenli olarak yıkanması gereklidir ve hayvanların kateteri yerinden çıkarma riski her zaman mevcuttur.
Kaudal arterden kan alımı, hayvanların sırt üstü pozisyona getirilmesi gerektiği ve ponksiyonun ağrılı olması nedeniyle savunma amaçlı hareketlerin gerçekleşme olasılığı yüksek olduğundan, kısa süreli sedasyon gerektirir. İzofluran anestezisinin kullanımı, savunma hareketlerini minimize ederek prosedürün kontrollü ve verimli bir şekilde gerçekleştirilmesine olanak tanır. Sonuç olarak, istenilen miktarda kan toplamanın daha uzun sürebileceği kuyruk veni kullanılan venipunksiyon tekniklerine kıyasla kan alımı hızla tamamlanabilir ve böylece hayvan üzerindeki genel yük azaltılmış olur. Savunma hareketlerinin olmaması, tekrarlayan iğne batırmaları olasılığını da düşürür. Önemli bir nokta olarak, hayvanlar prosedürü bilinçli olarak algılamazlar, hızla iyileşirler ve genellikle örneklemeden kısa bir süre sonra normal davranışlarına dönerler1. Kan alımının ardından hayvanlar izofluran anestezisinden hızla kurtulmuş ve tipik olarak kısa bir süre sonra normal davranışlarına geri dönmüşlerdir. Mevcut çalışmada, kan örneklemesinden 24 saat sonra ölçülen vücut ağırlığı, başlangıç değerine kıyasla hafif bir artış göstermiştir; bu durum, gıda alımının prosedürden olumsuz etkilenmediğini göstermekte ve sorunsuz bir kısa vadeli iyileşme sürecini desteklemektedir.
İzofluranın kan basıncını düşürdüğü bilinmektedir10,11 ve bu durum, venöz dolumun azalması nedeniyle venöz kan örneklemesini zorlaştırabilir. Buna karşılık, anestezi olmadan venöz örnekleme yapmak zapt etmeyi gerektirir1,2; bu da belirgin bir strese yol açabilir ve potansiyel olarak deneysel sonuçları etkileyebilir. Bunun yanı sıra stres, kan toplamayı daha da zorlaştırabilen vazokonstriksiyona neden olur. Düşük kan basıncı arteriyel örneklemeyi de etkileyebilir; ancak deneyimlerimize göre bu sorun, İzofluran konsantrasyonu ayarlanarak ve böylece örnekleme için yeterli kan akışı sağlanarak kolayca yönetilebilir.
Bununla birlikte, izofluranın solunum depresyonu nedeniyle fizyolojik parametreleri, özellikle kan gazı değerlerini etkilediği bilinmektedir12,13. İzofluran, solunum fonksiyonunu ve gaz değişimini etkileyerek arteriyel oksijen ve karbondioksit seviyelerini potansiyel olarak değiştirebilir. Çeşitli çalışmalar; izofluranın kan glukozu, laktat, insülin, kortikosteron ve lipid metabolizması dahil olmak üzere metabolik ve endokrin parametreleri de değiştirebileceğini göstermiştir14,15,16. Buna rağmen, izofluranın diğer birçok anestezik rejime kıyasla stresle ilişkili parametrelerde daha az değişikliğe yol açtığı; hızlı indüksiyon, kısa derlenme süresi ve anestezik derinliğin hassas kontrolü gibi avantajlar sağladığı gösterilmiştir, bu da onu rutin kan alma prosedürleri için uygun hale getirmektedir14. Sonuç olarak, anestezi altında alınan arteriyel kan örnekleri bazal fizyolojik koşulları doğru yansıtmayabileceği için, deneylerin planlanması ve yorumlanması sırasında izofluranın potansiyel etkisi göz önünde bulundurulmalıdır. Ancak farmakokinetik çalışmalar için bu etkiler, elleçleme kaynaklı stresi minimize ederken tekrarlanabilir kan örnekleri elde etmenin faydalarına kıyasla genellikle düşük öneme sahiptir.
Ek bir husus, deney yapan kişinin izoflorana mesleki maruziyetidir. Sistem tamamen kapalı olmadığı için işlem sırasında anestezik gaz maruziyeti riski bulunmaktadır. Laminer akışlı bir çeker ocak altında veya uygun tahliye sistemleri ile çalışmak maruziyeti en aza indirecektir ancak bu tür ekipmanlar tüm deneysel ortamlarda mevcut olmayabilir.
Genel olarak, açıklanan teknik, beklenen iyi örnek kalitesini azaltılmış stres ve iyileştirilmiş uygulama koşullarıyla birleştirerek geleneksel kan alma yöntemlerine değerli bir alternatif sunmaktadır. Hayvan refahı ve prosedürel verimlilik açısından belirgin faydalar sağlamaktadır. Uygunluğu nihayetinde spesifik araştırma sorusuna bağlıdır, ancak güvenilir kan parametrelerinin ve minimum fizyolojik rahatsızlığın temel gereklilik olduğu deneysel ortamlarda özellikle avantajlıdır.
Açıklamalar
Yazarın beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Yazar, bu yöntemi yayınlaması konusunda kendisine ilham verdiği için Katharina Tillmann'a teşekkür etmek ister.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Anestezi Sistemi | Dräger | https://www.draeger.com/en-us_us/Productfinder/Anaesthesia/Anaesthesia-Machines#products | Gaz Anestezi |
| Sitrat Vacuette (Sodyum sitrat %3,2) | Greiner Bio-One | 454332 | Antikoagülan |
| Eppendorf Tüp 1,5 mL | Eppendorf | 3,01,25,150 | Kan saklama |
| İzofluran Sıvısı (Isospire) | Dechra | Gaz Anestezi | |
| İğne (25 G ´ 5/8'') | BD Microlance | 300600 | Kan Örneği Alma |
| Şırınga 1 mL (Tüberkül Luer) | Chirana | CHTUB01 | Kan örneği alma |
| Thermomaquet 2000 | Maquet | Thermomaquet 2000 | Isıtma sistemi |
| Zelletten Selüloz Tampon 5 cm ´ 4 cm | Lohmann&Rauscher | Hemostaz |
Kaynaklar
- Toft, M., Peterson, M. H., Dragsted, N., Hansen, A. K. The impact of different blood sampling methods on laboratory rats under different types of anaesthesia. Laboratory Animals. 40, 261-274 (2006).
- Hem, A., Smith, A. J., Solberg, P. Saphenous vein puncture for blood sampling of the mouse, rat, hamster, gerbil, guineapig, ferret and mink. Laboratory Animals. 32, 364-368 (1998).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S. P., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- National Institutes of Health, Office of Animal Care and Use. . Guidelines for survival blood collection in mice and rats. , (2025).
- Xu, Y., Zhu, Y., Lin, J., Borlak, J. Serial blood collection in anaesthetised rats: Enhancing animal welfare without the need for jugular vein catheterisation. Regul Toxicol Pharmacol. 164, 105988 (2026).
- Fluttert, M., Dalm, S., Oitzl, M. S. A refined method for sequential blood sampling by tail incision in rats. Laboratory Animals. 34, 372-378 (2000).
- Salemink, P. J. M., Korsten, J., de Leeuw, P. Prothrombin times and activated partial thromboplastin times in toxicology: a comparison of different blood withdrawal sites for Wistar rats. Comp Haematol Int. 4, 173-176 (1994).
- Seibel, J., et al. Comparison of haematology, coagulation and clinical chemistry parameters in blood samples from the sublingual vein and vena cava in Sprague-Dawley rats. Laboratory Animals. 44, 344-351 (2010).
- Albrecht, M., et al. Influence of repeated anaesthesia on physiological parameters in male Wistar rats: a telemetric study about isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl. BMC Vet Res. 10, 310 (2014).
- Janssen, B. J. A., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, H1618-H1624 (2004).
- Flecknell, P. . Laboratory animal anaesthesia. , (2009).
- Tsukamoto, A., et al. Combining isoflurane anesthesia with midazolam and butorphanol in rats. Exp Anim. 65 (3), 223-230 (2016).
- Arnold, M., Langhans, W. Effects of anesthesia and blood sampling techniques on plasma metabolites and corticosterone in the rat. Physiol Behav. 99, 592-598 (2010).
- Rauch, E., Ari, C., D'Agostino, D. P., Kovács, Z. Exogenous ketone supplement administration abrogated isoflurane-anesthesia-induced increase in blood glucose level in female WAG/Rij rats. Nutrients. 16 (10), 1477 (2024).
- Wren-Dail, M. A., et al. Effect of isoflurane anesthesia on circadian metabolism and physiology in rats. Comp Med. 67 (2), 122-132 (2017).
Yeniden basım ve izinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste