Yöntem makalesi

Primer Fare CD8+ T Hücre Aktivasyonu ve Diferansiyasyonunda TCR Sinyal Gücü ve Süresi: Standartlaştırılmış Bir In Vitro Yaklaşım

83 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/71979

⸱

25 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Guangdong Province Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 2Institute of Immunology, Third Military Medical University, 3Institute for Immunology and Pathogenesis, College of Basic Medicine, Chongqing Medical University, 4Center for Immune Ageing and Rejuvenation, Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, primer fare naive CD8 T hücrelerini aktive etmek için sistematik bir yöntemi tanımlamaktadır.+ Kademeli bir TCR stimülasyon yaklaşımı kullanarak CD8 T hücrelerinin proliferasyonunun, aktivasyonunun ve sitokin üretiminin kapsamlı analizine olanak tanıyan T hücreleri+ Farklı TCR sinyal yoğunluklarındaki T hücreleri.

Özet

T hücresi reseptörü (TCR) sinyal yoğunluğu ve süresi; CD8⁺ T hücresi aktivasyonu, proliferasyonu ve fonksiyonel farklılaşmasının kritik belirleyicileridir. Ancak, farklı TCR sinyal girdilerinin T hücresi kaderini nasıl şekillendirdiğini sistematik olarak karşılaştıran standartlaştırılmış in vitro modeller hala sınırlıdır. Bu çalışma, plaka bağlı anti-CD3 ve çözünür anti-CD28 kullanılarak, interleukin-2 (IL-2) ile desteklenmiş bir şekilde primer fare T hücrelerini in vitro olarak aktive etmek için tekrarlanabilir bir yöntem sunmakta ve anti-CD3 konsantrasyonunun (sinyal gücü) ve stimülasyon süresinin (sinyal süresi) modüle edilmesinin T hücrelerinin aktivasyon sonuçlarını nasıl etkilediğini incelemektedir. C57BL/6 farelerinden naive T hücrelerinin izole edilmesi ve ardından bir dizi anti-CD3 konsantrasyonunda (0.1–10 µg/mL) ve süresinde (6–48 h) stimülasyon uygulanmasına yönelik bir protokol detaylandırılmıştır. mTORC1 (mechanistic target of rapamycin complex 1) aktivitesinin bir göstergesi olarak hücre içi fosforile S6 ribozomal protein (p-S6) üzerinden erken TCR kaynaklı sinyalleri değerlendirmek için akış sitometrik analizler yapmış; ardından yüzey aktivasyon belirteçleri (CD69, CD25, ICOS, PD-1), violet proliferasyon takip boyası (CTV) dilüsyonu yoluyla hücresel proliferasyon ve fonksiyonel farklılaşma göstergeleri olarak efektör molekül ekspresyonu (Granzyme B, TNF-α) dahil olmak üzere aşağı akış olaylarını değerlendirdik. Bu yöntem, tekrarlanabilir T hücresi stimülasyonlarının gerçekleştirilmesi için net, adım adım görsel bir kılavuz sağlayarak araştırmacıların spesifik TCR sinyal parametrelerinin T hücresi kader kararlarını nasıl yönlendirdiğini analiz etmelerine olanak tanır. Bu yaklaşım, yalnızca T hücresi aktivasyonu ve farklılaşmasının mekanistik çalışmalarını desteklemekle kalmaz, aynı zamanda adoptif immünoterapi için T hücresi koşullarının optimizasyonu ve in vitro priming deneyleri için bir platform sunar. Video gösterimini ayrıntılı protokol anlatımıyla entegre eden bu protokol, T hücresi immünolojisi araştırmalarında metodolojik şeffaflığı ve tekrarlanabilirliği artıracaktır.

Giriş

T hücreleri, patojenlere ve tümörlere karşı koruyucu bağışıklık yanıtları için vazgeçilmezdir. Naif T hücreleri, uzun vadeli hayatta kalmalarını ve kalıcılıklarını korumak için aktif olarak durgun bir durumda tutulurlar1. Antijen stimülasyonu üzerine T hücreleri durgunluktan çıkar, klonal ekspansiyona ve efektör farklılaşmaya uğrarlar2. T hücresi reseptörü (TCR) sinyalleri, adaptif bağışıklık yanıtlarının başlatılması ve düzenlenmesi için temel süreç olarak hizmet eder3. Antijen sunan hücrelerin (APC'lerin) yüzeyinde sunulan peptid-majör histokompatibilite kompleksi (pMHC) moleküllerinin spesifik olarak tanınmasıyla birlikte, bir sinyalizasyon olayları kaskadı tetiklenir ve böylece T hücrelerinin klonal ekspansiyonu ve fonksiyonel farklılaşması sağlanır4,5,6.

Antijen afinitesi, aviditesi ve konsantrasyonu gibi temel faktörler tarafından belirlenen TCR stimülasyonunun yoğunluğu; T hücresi aktivasyonunun büyüklüğünün, efektör fonksiyonların kazanılmasının ve farklı efektör veya bellek T hücresi alt kümelerine doğru farklılaşma yörüngesinin yönetilmesinde kritik bir rol oynar7,8,9. TCR bağımlı T hücresi aktivasyonunu incelemek için kullanılan mevcut in vitro modeller, ağırlıklı olarak hem TCR ligasyonunu hem de ko-stimülatör sinyalleri eş zamanlı olarak sağlayan plaka bağlantılı veya boncuk konjuge anti-CD3 ve anti-CD28 antikorlarını kullanmaktadır10,11. Bu sistemler yaygın olarak kullanılsa da, genellikle yalnızca tek bir ve çoğunlukla doyurucu anti-CD3 antikoru konsantrasyonu kullanırlar; bu durum, titre edilmiş bir stimülasyon gradyanı ile ulaşılabilir olan TCR sinyal güçlerinin dinamik aralığını yakalamak yerine, yalnızca T hücresi aktivasyonunun hep ya da hiç şeklinde ikili bir karşılaştırmasına izin verir12,13.

Burada açıklanan protokol, titrasyonlu anti-CD3 gradyanları (0.1–10 µg/mL) ve sabit anti-CD28 (1 µg/mL) kullanarak, dereceli TCR sinyal güçlerinin primer fare CD8+ T hücrelerinin aktivasyonunu, proliferasyonunu ve fonksiyonel fenotiplerini nasıl modüle ettiğini sistematik olarak değerlendirmek için standardize edilmiş ve tekrarlanabilir bir in vitro sistem sunmaktadır. Bu yaklaşım, 6 ila 48 saatlik bir zaman seyri boyunca hem mTORC1 (mechanistic target of rapamycin complex 1) aktivitesinin bir okuması olarak hücre içi fosforile S6 ribozomal protein (p-S6) aracılığıyla gerçekleşen yukarı akış sinyalleşmesini hem de CTV dilüsyonu ile izlenen proliferasyon, aktivasyon yüzey belirteçleri (CD69, CD25, indüklenebilir T-hücresi kostimülatörü [ICOS], programlanmış hücre ölümü proteini 1 [PD-1]) ve efektör molekül ekspresyonu (Granzyme B, tümör nekroz faktör-alfa [TNF-α]) dahil olmak üzere aşağı akış hücre sonuçlarını yakalayan çok parametreli akış sitometrisine odaklanmaktadır.

Protokolümüz, stimülasyon yoğunluğunu hassas bir şekilde modüle etmek için plakka bağlanmış anti-CD3 antikorlarının gradyan konsantrasyonunu kullanarak, böylece fizyolojik koşullar altında gözlemlenen farklı TCR bağlanma aviditesini taklit eder. Bu yöntem, TCR çapraz bağlanmasında yüksek verimlilik ve primer dinlenme halindeki T hücrelerinin güçlü aktivasyonunu sağlar. Standartlaştırılmış kaplama prosedürü, plak yüzeyinde üniform antikor dağılımı sağlayarak aynı partideki hücreler arasında tutarlı bir stimülasyona ve mükemmel deneysel tekrarlanabilirliğe yol açar. Bu format, T hücresi aktivasyonu için maliyet etkin ve operasyonel olarak basit bir yaklaşım sunar.

Ancak, bu yaklaşımın belirli kısıtlamaları kabul edilmelidir. Anti-CD3/CD28 antikorları aracılığıyla yapılan stimülasyon, in vivo fizyolojik bağlamdan belirgin şekilde farklıdır. T hücresi aktivasyonunu değerlendirmek için yalnızca agonistik anti-CD3 ve anti-CD28 antikorlarını kullanan deneysel yöntemler, aktivasyonun etkili okumalarını sağlayabilse de, antijen sunan hücreler ile T hücreleri arasındaki etkileşimleri ve fizyolojik koşullar altında meydana gelen ko-stimülatör mikroçevreyi tam olarak yeniden canlandırmakta yetersiz kalırlar14.

Bu sınırlamalara rağmen, bu protokol, TCR sinyal gücüne bağlı T hücresi yanıtlarını incelemek için değerli ve erişilebilir bir araç görevi gören sistematik ve tekrarlanabilir bir platform sunmakta olup daha karmaşık antijenle özgü modelleri tamamlayabilmektedir.

Protokol

Bu çalışmadaki tüm hayvan deneyleri, Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Reaktiflerin ve plakların hazırlanması

  1. Plakaya bağlanmış anti-CD3'ü steril PBS içinde 0.1, 0.5, 1, 5 ve 10 µg/mL konsantrasyonlarında hazırlayın.
  2. Düz tabanlı 96 kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna 50 µL anti-CD3 kaplama çözeltisi ekleyin.
  3. Plakaları sızdırmazlık filmi ile kapatın ve 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.
  4. Hücreleri eklemeden önce kaplama çözeltisini aspire edin ve her kuyucuğu 200 µL steril PBS ile iki kez yıkayın.

2. Fare dalağından naive CD8+ T hücrelerinin izolasyonu

  1. 6–8 haftalık erkek C57BL/6 fareleri (Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.'den temin edilen) seçin ve CO2 inhalasyonu ve ardından servikal dislokasyon ile ötanazi uygulayın. Fareler, 12 saatlik ışık/karanlık döngüsü ile yiyecek ve suya serbest erişimin olduğu spesifik patojensiz koşullarda barındırılır. Bağımsız deney başına minimum 3 fare kullanılır.
  2. Dalak görünür hale gelecek şekilde peritonu cerrahi makasla dikkatlice kesin, dalağı pens ile tutup hasat edin ve önceden soğutulmuş %2 fetal bovine serum(FBS) ile desteklenmiş RPMI 1640 (R2) içeren bir toplama kabına yerleştirin. Dissosiyasyona kadar kabı buz üzerinde tutun.
    NOT: Tüm hayvan kadavralarını ve hücre kültürü atıklarını belirlenmiş biyotehlike torbalarında toplayın ve imhadan önce 121 °C'de 20 dakika boyunca otoklavlayın.
  3. Dalağı toplama kabından çıkarın ve 3 mL 1 × amonyum-klorür-potasyum (ACK) lizis tamponu içeren 60 mm'lik bir kaba aktarın.
  4. Dalağı, 3 mL'lik bir şırınga pistonu kullanarak 70 µm'lik bir hücre süzgecinden nazikçe ezerek tek hücre süspansiyonu hazırlayın.
  5. Süspansiyonu oda sıcaklığında(RT) 1 dakika inkübe edin, ardından amonyum-klorür-potasyum (ACK) lizis tamponunu nötralize etmek için 3 mL önceden soğutulmuş R2 besiyeri ekleyin.
  6. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 × g hızda santrifüjleyin.
  7. Santrifüj sonrası süpernatantı aspire edin ve peleti 10 mL akış sitometrisi boyama tamponunda (%2 FBS içeren PBS) yeniden süspanse edin.
  8. Süspansiyonu 70 µm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek yeni bir 15 mL'lik konik tüpe filtreleyin, ardından 4 °C'de 5 dakika boyunca tekrar 500 × g hızda santrifüjleyin.
    NOT: Fonksiyonel analizler için hücre canlılığını korumak amacıyla akış sitometrisi boyama tamponuna sodyum azid eklenmemelidir. Tüm örnekler 4 °C'de tutulmalı ve hemen analiz edilmelidir.
  9. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini, fare dalağı başına 200 µL biyotinize antikor kokteylinde (anti-CD16/32 (Fc blok), anti-TER-119, anti-CD19, anti-CD4, anti-B220, anti-NK1.1, anti-Ly-6G, anti-CD11b, anti-CD11c, anti-CD49b, anti-CD44 ve anti-F4/80 içerir) yeniden süspanse edin.
  10. Tam karışmayı sağlamak için tüpü her 5 dakikada bir nazikçe altüst ederek buz üzerinde 25 dakika inkübe edin.
  11. Hücreleri yüksek hacimli akış sitometrisi boyama tamponu ile yıkayın, 500 × g hızda 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı atın.
  12. Peleti, biyotinize antikor kokteyli için kullanılanla aynı hacimdeki akış sitometrisi boyama tamponunda yeniden süspanse edin, bu hacmin yarısı kadar streptavidin kaplı manyetik boncuk ekleyin ve tam karışmayı sağlamak için tüpü her 5 dakikada bir nazikçe altüst ederek buz üzerinde 15 dakika inkübe edin.
  13. Tüpü kısa süreliğine santrifüjleyin, 2–3 dakika boyunca manyetik standa yerleştirin ve süpernatantı (zenginleştirilmiş naive CD8+ T hücreleri) dikkatlice yeni bir 15 mL'lik konik tüpe aktarın.
  14. Toplanan hücreleri akış sitometrisi boyama tamponu ile bir kez yıkayın, tekrar 500 × g hızda 5 dakika santrifüjleyin.
  15. Süpernatantı atın ve peleti, sonraki uygulamalar için %10 FBS ile desteklenmiş RPMI 1640 (R10) içerisinde yeniden süspanse edin.

3. Proliferasyon takibi için menekşe proliferasyon takip boyası (CTV) ile etiketleme

  1. Kullanımdan hemen önce 2 × taze CTV çalışma çözeltisi (10 µM) hazırlayın. 5 mM CTV stok çözeltisini (dimetil sülfoksit [DMSO] içinde) vorteksleyerek tamamen karıştırın ve 10 µM nihai konsantrasyon elde etmek için steril PBS ile daha fazla seyreltin.
    DİKKAT: DMSO, toksik bileşiklerin cilt tarafından emilimini kolaylaştırdığından, CTV stok çözeltisini (DMSO içinde hazırlanan) bir çeker ocak altında nitril eldivenlerle kullanın. Solumaktan ve ciltle temastan kaçının.
  2. İzole edilen naif CD8+ T hücrelerinin yarısını, 8 × 107 hücre/mL yoğunluğunda önceden soğutulmuş PBS içinde yeniden süspande edin.
  3. Hücre süspansiyonuna hızla eşit hacimde 2 × CTV çalışma çözeltisi (10 µM) ekleyin ve pipetleme yoluyla iyice karıştırarak 5 µM nihai CTV konsantrasyonu elde edin.
  4. Hücreleri oda sıcaklığında, karanlıkta 20 dk inkübe edin; tam karışımı sağlamak için tüpleri her 5 dk'da bir hafifçe ters çevirin.
  5. Hücrelere 5 hacim kültür medyumu (en az %10 FBS içeren) ekleyin ve serbest boyayı uzaklaştırmak için buz üzerinde 5 dk inkübe edin.
  6. Hücreleri 500 × g hızda 5 dk santrifüjleyin ve peleti, anti-CD28 (nihai konsantrasyon: 1 µg/mL) ve IL-2 (nihai konsantrasyon: 10 ng/mL) ile takviye edilmiş, taze ön ısıtılmış komple R10 medyumu içinde yeniden süspande edin.
  7. Önceden kaplanmış 96 kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna 250 µL hücre süspansiyonu (6 × 105 hücre içeren) ekleyin.
  8. Hücreleri 37 °C'de %5 CO₂ ile 48 saate kadar kültüre edin.

4. Akış sitometrisi ile CTV tespiti

  1. Hücreleri 6, 36 ve 48. saatlerde 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakada toplayın. 500 × g hızında 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve akış sitometrisi boyama tamponu ile iki kez yıkayın.
  2. Yüzey boyaması için hücreleri; anti-CD8, fikse edilebilir canlılık boyası ve anti-CD44 içeren 50 µL'lik bir antikor kokteyli ile buz üzerinde karanlıkta 30 dakika inkübe edin.
    NOT: Florofor konjuge antikorlar içeren tüm süpernatantları, dekontaminasyon için %0,5 sodyum hipoklorit eklenmiş belirlenmiş atık kaplarında toplayın ve kurumsal biyotehlikeli atık protokollerine göre imha edin.
  3. Hücreleri akış sitometrisi boyama tamponu ile iki kez yıkayın ve akış sitometresi kazanımı için 200 µL akış sitometrisi boyama tamponu içinde yeniden süspande edin.
  4. Örnekleri üç lazerle donatılmış bir akış sitometresinde analiz edin. Kompansasyon parametrelerini ayarlamak için boyanmış hücreleri kullanarak tek renkli kontrol tüpleri hazırlayın.
  5. Şu kapılama (gating) stratejisini uygulayın: ileri saçılım (FSC) ve yan saçılım (SSC) kapılaması ile döküntüleri (debris) hariç tutun, singlet kapılaması ile dubletleri eleyin ve analiz için canlı (fikse edilebilir canlılık boyası-negatif) CD8+ T hücrelerini seçin.
  6. Örnek başına en az 1 × 104 kapılan CD8+ T hücresi olayı toplayın. Verileri akış sitometrisi analiz yazılımı kullanarak analiz edin ve proliferasyon analiz modülünü kullanarak bir veya daha fazla bölünme geçirmiş hücrelerin oranını hesaplayın.

5. Aktivasyon ve sinyalizasyon için yüzey ve hücre içi boyama

  1. Naive CD8+ T hücrelerinin diğer yarısını, 1 µg/mL anti-CD28 ve 10 ng/mL IL-2 ile takviye edilmiş R10 içerisinde 2,4 × 106 hücre/mL konsantrasyonda yeniden süspande edin.
  2. Önceden kaplanmış 96 kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna 250 µL hücre süspansiyonu (6 × 105 hücre) ekleyin.
  3. Hücreleri 37 °C'de %5 CO₂ ile 48 saate kadar kültüre edin.
  4. Belirtilen zaman noktalarında (6, 10, 12, 24 ve 36 sa), hücreleri 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakta toplayın.
    NOT: 6. saat erken TCR sinyalini (fosfo-S6) ve CD69'u yakalar; CD69, tam kinetiğini belirlemek için ayrıca 12, 24 ve 36. saatlerde de değerlendirilir. CD25, PD-1 ve ICOS 10, 12, 24 ve 36. saatlerde izlenir; 48. saat zaman noktası proliferasyon (Bölüm 4) ve sitokin tespiti (Bölüm 6) için ayrılmıştır.
  5. 500 × g hızda 1 dk santrifüjleyin ve hücre peletini 200 µL akış sitometrisi boyama tamponunda yeniden süspande edin.
  6. 500 × g hızda 1 dk santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Hücreleri 200 µL akış sitometrisi boyama tamponu ile iki kez yıkayın.
  7. Yüzey boyama için hücreleri; anti-CD69, anti-CD25, anti-CD8, anti-PD-1, anti-ICOS ve fikse edilebilir canlılık boyası içeren 50 µL'lik bir antikor kokteyli ile buz üzerinde, karanlıkta 30 dk inkübe edin.
  8. Bağlanmamış antikorları uzaklaştırmak için hücreleri akış sitometrisi boyama tamponu ile üç kez yıkayın.
  9. Hücre peletini 200 µL %1 paraformaldehit içerisinde yeniden süspande edin ve hücreleri oda sıcaklığında, karanlıkta 15 dk fikse edin.
    DİKKAT: Buharların solunmasını önlemek için paraformaldehit içeren tüm adımları çeker ocak altında gerçekleştirin. Fiksatif içeren tüm sıvı atıkları, tehlikeli kimyasal bertarafı için işaretlenmiş ayrı bir kapta toplayın.
  10. 500 × g hızda 1 dk santrifüjleyin ve akış sitometrisi boyama tamponu ile bir kez yıkayın.
  11. 5 × liz/fiks tamponunu oda sıcaklığında ön ısıtmaya tabi tutun ve distile su ile 1 × çalışma çözeltisi hazırlayın.
  12. Her kuyucuğa 200 µL çalışma çözeltisi (1 × liz/fiks tamponu) ekleyin, hücreleri oda sıcaklığında, karanlıkta 30 dk inkübe edin.
  13. Fosfo-epitop boyama için 1 × permeabilizasyon/yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Peleti, fosfo-epitop boyama için 1 × permeabilizasyon/yıkama tamponu ile yeniden süspande edin ve oda sıcaklığında, karanlıkta 10 dk inkübe edin.
  14. 500 × g hızda 1 dk santrifüjleyin ve süpernatanları uzaklaştırın.
  15. Hücre içi boyama için hücreleri, anti-p-S6 içeren 50 µL'lik bir antikor kokteyli ile oda sıcaklığında, karanlıkta 60 dk inkübe edin.
  16. Hücreleri fosfo-epitop boyama için 1 × permeabilizasyon/yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.
  17. Sekonder antikor boyama için hücreleri, anti-tavşan sekonder antikor içeren 50 µL'lik bir antikor kokteyli ile buz üzerinde, karanlıkta 30 dk inkübe edin.
  18. Hücreleri fosfo-epitop boyama için 1 × permeabilizasyon/yıkama tamponu ile üç kez yıkayın ve akış sitometrisi boyama tamponu ile bir kez yıkayın.
  19. Hücre peletini 200 µL akış sitometrisi boyama tamponunda yeniden süspande edin ve örnekleri aynı akış sitometresinde analiz edin.
  20. Bölüm 4.5'te açıklanan aynı gating stratejisini uygulayın ve örnek başına en az 1 × 104 CD8+ T hücresi toplayın.
  21. Akış sitometrisi analiz yazılımını kullanarak her bir belirteç için medyan floresan yoğunluğunu (MFI) analiz edin.

6. Hücre içi sitokin blokajı ve deteksiyonu

  1. Hasattan 5 h önce, kuyucuk başına PMA (50 ng/mL), ionomycin (1 µg/mL), protein taşıma inhibitörleri (monensin) (1:1000) ve protein taşıma inhibitörleri (brefeldin A tabanlı) (1:1000) ile desteklenmiş 100 µL taze R10 ekleyin. Sitokin salınımını engellemek ve hücre içi birikime izin vermek için plakaları nazikçe karıştırın ve 37 °C'deki inkübatöre geri yerleştirin.
  2. İstenilen zaman noktasında, hücreleri 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakaya toplayın.
  3. 500 × g'de 1 min santrifüjleyin ve hücre peletini 200 µL akış sitometrisi boyama tamponunda yeniden süspande edin.
  4. 500 × g'de 1 min santrifüjleyin ve süpernatantı aspire edin. 200 µL akış sitometrisi boyama tamponu ile iki kez yıkayın.
  5. Yüzey belirteç boyaması için hücreleri; anti-CD44, anti-CD8 ve fikse edilebilir canlılık boyası içeren 50 µL'lik bir antikor kokteyli ile buz üzerinde, karanlıkta 30 min inkübe edin.
  6. Bağlanmamış antikorları uzaklaştırmak için akış sitometrisi boyama tamponu ile üç kez yıkayın.
  7. 200 µL fiksasyon ve permeabilizasyon çözeltisi ekleyerek hücreleri permeabilize edin ve buz üzerinde, karanlıkta 30 min inkübe edin.
    DİKKAT: Buharların solunmasını önlemek için Fiksasyon/Permeabilizasyon Çözeltisi (paraformaldehit içerir) içeren tüm adımları çeker ocak altında gerçekleştirin. Fiksatif içeren tüm sıvı atıkları, tehlikeli kimyasal bertarafı için işaretlenmiş ayrı bir kapta toplayın.
  8. 500 × g'de 1 min santrifüjleyin ve süpernatantı tehlikeli kimyasal atık kutusuna boşaltın.
  9. Hücreleri 1 × permeabilizasyon/yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.
  10. Hücre içi sitokin boyaması için; anti-TNF-α ve anti-Granzyme B içeren 50 µL'lik bir antikor kokteyli ile buz üzerinde, karanlıkta 30 min inkübe edin.
  11. Bağlanmamış antikorları uzaklaştırmak için hücreleri 1 × permeabilizasyon/yıkama tamponu ile üç kez yıkayın ve akış sitometrisi boyama tamponu ile son bir yıkama gerçekleştirin.
  12. Hücre peletini 200 µL akış sitometrisi boyama tamponunda yeniden süspande edin ve örnekleri aynı akış sitometresinde analiz edin.
  13. Bölüm 4.5'te açıklanan gating stratejisini uygulayın ve örnek başına en az 1 × 104 CD8+ T hücresi toplayın. Akış sitometrisi analiz yazılımını kullanarak her belirteç için pozitiflik yüzdesini ve MFI değerini analiz edin.

Sonuçlar

Farklı anti-CD3 stimülasyon yoğunluklarının T hücresi aktivasyonu üzerindeki etkilerini araştırmak için, in vitro kültür amacıyla fare splenositlerini izole ettik ve CD8+ T hücrelerini saflaştırdık; ardından T hücresi aktivasyon deneylerini ve akış sitometrisi analizini gerçekleştirdik. Veri analizi için lenfositler önce FSC-A ve SSC-A kombinasyonu kullanılarak seçildi, ardından FSC-H ve FSC-W aracılığıyla singletler, sonrasında ise SSC-H ile SSC-W seçildi. Canlı CD8+ T hücreleri, sonraki analizler için CD8 ile fikslenebilir viabilite boyası kombinasyonu kullanılarak ayrıca seçildi (Şekil 1A).

Plak tabanlı antikor stimülasyon sisteminin T hücrelerini in vitro ortamda etkili bir şekilde aktive ettiğini doğrulamak için, mTORC1 aktivitesinin iyi bilinen bir alt okuması olan ve TCR sinyallezmesinin altındaki PI3K-mTOR ile MEK-ERK MAPK yolaklarının birleşme noktası olan ribozomal protein S6'nın fosforilasyonunu (p-S6) inceledik15,16. Bu bulgularla uyumlu olarak, artan anti-CD3 konsantrasyonlarında (0.1–10 µg/mL), stimülasyondan 6 saat sonra p-S6 seviyelerinde doza bağlı bir artış gözlemledik (Şekil 1B); bu durum, plak tabanlı anti-CD3 sisteminin TCR-mTORC1-S6 aksını sinyal gücüne bağlı bir şekilde aktive ettiğini doğrulamaktadır. Bu erken fosforilasyon olayı, sonraki T hücresi proliferasyonunu ve efektör farklılaşmasını destekleyen mTORC1-bağımlı metabolik yolakların etkileşimi ile uyumludur.

Hücre proliferasyonu, dereceli anti-CD3 konsantrasyonları (0.1–10 µg/mL) ile TCR stimülasyonu sonrası stimülasyonu takip eden üç zaman noktasında (6, 36 ve 48 sa) CTV dilüsyon akış sitometrisi ile değerlendirildi. Erken 6 sa'lik sinyalizasyon zaman noktasında, tüm stimülasyon koşullarında yalnızca minimal proliferatif dilüsyon gözlendi. 36. saate gelindiğinde, düşük doz stimülasyon grubu (0.1 µg/mL) hala belirgin bir klonal ekspansiyon indüklemezken, orta ve yüksek doz grupları (5 ve 10 µg/mL), hücre döngüsü ilerlemesinin başladığını gösteren iyi çözümlenmiş CTV dilüsyon pikleri sergiledi. 48. saatte, stimülasyon konsantrasyonları arasındaki farklı proliferatif fenotipler en belirgin halini aldı. Zayıf TCR stimülasyonu (0.1 µg/mL), yalnızca %1.25 proliferatif hücre ve tek bir seyreltilmemiş CTV piki vererek suboptimal aktivasyonu gösterdi. Orta düzeydeki stimülasyon (1–5 µg/mL), proliferatif fraksiyonların %70.8'den %84.0'a yükseldiği üç çözümlenmiş bölünme piki indükledi. Güçlü stimülasyon (10 µg/mL), en yüksek proliferatif fraksiyona (%89.5) ulaştı; maksimal bölünme nesli sayısını sergileyerek proliferasyon doygunluğunun tespitini kanıtladı (Şekil 2).

Ardından, erken aktivasyon belirteçleri olan CD69 ve CD25'in ekspresyonunu inceledik. Özellikle mevcut çalışma, medyan floresan yoğunluğuna (MFI) dayanarak, CD69 ekspresyonunda hızlı ve doza bağımlı bir artış olduğunu ortaya koymuştur. Orta ve güçlü stimülasyon altında (5 ve 10 µg/mL), CD69 seviyeleri 24. saatte hızla yükselmiş, ardından 24 ile 36. saatler arasında kademeli bir düşüş göstermiştir. Ancak, zayıf stimülasyon altında (0.1, 0.5 ve 1 µg/mL), CD69 tüm stimülasyon penceresi boyunca aşamalı olarak yükselmiştir. CD69'un yukarıda belirtilen kinetik ekspresyon profili, erken T hücresi aktivasyon belirteci olarakki rolü ile tutarlıdır (Şekil 3A)17. İlginç bir şekilde, CD25 ekspresyonunun doz ve zamana bağımlı bir şekilde kademeli bir artış sergilediğini gözlemledik (Şekil 3B). Önceki araştırmalarla uyumlu olarak, özellikle optimal stimülasyonda CD25'teki artış, CD69'unkine göre daha yavaş gerçekleşmiştir18,19.

TCR stimülasyon gücünün CD8+ T hücrelerindeki inhibitör reseptörlerin ve ko-stimülatör moleküllerin ekspresyonu üzerindeki düzenleyici etkisini daha ayrıntılı incelemek için PD-1 ve ICOS ekspresyon seviyelerini analiz ettik. PD-1'in indüklenebilir ekspresyonu, yüksek yoğunluklu TCR stimülasyonuna bağlıdır. Düşük yoğunluklu stimülasyon grubunda (0.5–1 µg/mL), tüm stimülasyon süresi boyunca PD-1 düşük seviyelerde eksprese edilmiştir. Buna karşılık, orta-yüksek yoğunluklu stimülasyon grubunda (5–10 µg/mL), PD-1 ekspresyonu 10. saatten itibaren kademeli olarak artmış ve 36. saatte zirveye ulaşmıştır (Şekil 4A). ICOS ekspresyonu da artan stimülasyon gücüyle paralel olarak yükselmiş ve 36. saatte 5–10 µg/mL dozunda maksimum seviyeye ulaşmıştır (Şekil 4B). Bu sonuçlar, yüksek yoğunluklu TCR stimülasyonunun PD-1 ve ICOS ekspresyon seviyelerini anlamlı derecede artırabileceğini göstermektedir.

Son olarak, stimülasyondan 24 saat ve 48 saat sonra PMA ve ionomycin yeniden stimülasyonu üzerine stimüle edilmiş T hücrelerinin fonksiyonel kapasitesini inceledik. 24. saatte, TNF-α ve Granzyme B üretimini niceledik ve TNF-α+, Granzyme B+ ve TNF-α+Granzyme B+ hücre frekanslarının anti-CD3 dozuna bağlı olarak kademeli bir şekilde arttığını gözlemledik (Şekil 5A, B). Buna paralel olarak, TNF-α ve Granzyme B'nin MFI değerleri de konsantrasyona bağlı bir artış gösterdi ve yüksek yoğunluklu stimülasyon altında (10 µg/mL) maksimum seviyeye ulaştı (Şekil 5C); bu durum, kademeli TCR sinyal gücü tarafından yönlendirilen doza bağlı erken efektör farklılaşmasını yansıtmaktadır. Ancak 48. saatte bu örüntü belirgin şekilde tersine döndü. Daha yüksek anti-CD3 konsantrasyonları, TNF-α+Granzyme B+ hücrelerinin yüzdelerini önemli ölçüde azalttı ve efektör moleküllerin hücre başına ekspresyon seviyelerini aşağıye çekti.

Gösterilen tüm veriler 3 bağımsız deneyi temsil etmektedir. İstatistiki analizler, Tukey post-hoc testi ile birlikte tek yönlü veya iki yönlü ANOVA kullanılarak gerçekleştirilmiştir; veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. Hücre canlılığı tutarlı bir şekilde %90'ın üzerinde seyretmiş ve örnek başına minimum 1 × 104 canlı CD8+ T hücresi olayı elde edilmiştir.

Akış sitometrisi verileri: hücre popülasyonu kapılama diyagramları, protein kantifikasyon histogramları ve sütun grafiği.
Şekil 1: CD8+ T hücrelerinin in vitro aktivasyonu ve akış sitometrik analizi. (A) Fare splenositlerinden saflaştırılan CD8+ T hücreleri, sabit konsantrasyondaki anti-CD28 (1 µg/mL) ile kombine edilen değişken konsantrasyonlardaki anti-CD3 (0.1–10 µg/mL) ile in vitro ortamda 6 ila 48 saat boyunca stimüle edilmiş ve ardından hücresel aktivasyonun akış sitometrik analizi yapılmıştır. Hücresel debris, ileri saçılım (FSC) ve yan saçılım (SSC) üzerinden kapılama yapılarak hariç tutulmuş, dubletler singlet kapılama yoluyla elenmiş ve son olarak aşağı akış analizleri için fikse edilebilir canlılık boyası-negatif, CD8+ T hücreleri kapılanmıştır. (B) Belirtilen anti-CD3 (0.1–10 µg/mL) konsantrasyonları ve sabit anti-CD28 (1 µg/mL) ile stimülasyondan 6 saat sonra CD8+ T hücrelerinde ribozomal protein S6 fosforilasyonu (p-S6). Temsili histogram (solda) ve MFI özeti (sağda). Akış sitometrisi grafikleri 3 bağımsız deneyin temsilcisidir. Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilmiştir. İstatistik: Tukey post-hoc testi ile tekrarlanan ölçümlü tek yönlü ANOVA. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; ns, anlamlı değil. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Hücre proliferasyon analizi, zaman içinde CTV ile proliferasyon yüzdesini gösteren histogram grafiği.
Şekil 2: Dereceli TCR stimülasyonu altındaki primer fare CD8+ T hücrelerinin mor proliferasyon izleme boyası (CTV) tabanlı proliferasyon analizi. CTV ile işaretlenmiş ve in vitro ortamda 0,1–10 µg/mL gradiyent konsantrasyonlarda anti-CD3 ile 6 ila 48 saat boyunca stimüle edilmiş CD8+ T hücreleri. Hücre proliferasyonu, akış sitometrik analiz yoluyla CD8+ T hücrelerindeki CTV floresansının dilüsyonu ve zayıflamasına göre değerlendirilmiştir. Histogramlar, her konsantrasyon grubunun CTV floresans dağılımını göstermekte olup bir veya daha fazla bölünme geçiren hücrelerin yüzdesi etiketlenmiştir. Akış sitometrisi grafikleri 3 bağımsız deneyin temsilcisidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Akış sitometrisi analizi, CD69 ve CD25 ekspresyonu, histogram ve çizgi grafiği, immün hücre aktivasyonu.
Şekil 3: Anti-CD3 stimülasyonu sonrası CD8+ T hücrelerinde erken aktivasyon markörleri CD69 ve CD25'in ekspresyon kinetiği. Naive CD8+ T hücreleri, belirtilen konsantrasyonlarda (0.1–10 µg/mL) plakka bağlı anti-CD3 ve sabit anti-CD28 (1 µg/mL) ile stimüle edilmiştir. CD69 düzeyleri 6, 12, 24 ve 36. saatlerde; CD25 düzeyleri ise 10, 12, 24 ve 36. saatlerde ölçülmüş ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Sol paneller belirtilen zaman noktalarındaki temsili histogramları göstermektedir; sağ paneller ise MFI değerlerindeki zamanla meydana gelen dinamik değişimleri sunmaktadır. (A) CD69. (B) CD25. Akış sitometrisi grafikleri 3 bağımsız deneyi temsil etmektedir. Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilmiştir. İstatistik: Tukey post-hoc testi ile tekrarlanan ölçümlü iki yönlü ANOVA. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; ns, anlamlı değil. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Akış sitometrisi analizi, PD-1 ve ICOS ekspresyonu, histogramlar ve grafikler, zamanla hücresel yanıt.
Şekil 4: Anti-CD3 stimülasyonu sonrası CD8+ T hücrelerinde inhibitör reseptör PD-1 ve ko-stimülatör molekül ICOS'un ekspresyon kinetiği. Naive CD8+ T hücreleri, belirtilen konsantrasyonlarda (0.1–10 µg/mL) plaka yüzeyine bağlanmış anti-CD3 ve sabit miktarda anti-CD28 (1 µg/mL) ile stimüle edilmiştir. Hücreler 10, 12, 24 ve 36. saatlerde toplanmış ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Sol paneller belirtilen zaman noktalarındaki temsili histogramları; sağ paneller ise MFI değerlerindeki dinamik zamanla değişimleri göstermektedir. (A) PD-1. (B) ICOS. Akış sitometrisi grafikleri 3 bağımsız deneyi temsil etmektedir. Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilmiştir. İstatistik: Tukey post-hoc testi ile tekrarlanan ölçümlü iki yönlü ANOVA. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; ns, anlamlı değil. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Akış sitometrisi analiz sonuçları, TNF-α ve Granzyme B ekspresyonu, sütun ve dağılım grafikleri, immünolojik çalışma.
Şekil 5: CD8+ T hücreleri tarafından gerçekleştirilen hücre içi sitokin üretimi TCR gücüne bağlıdır. Naif CD8+ T hücreleri, artan anti-CD3 konsantrasyonları (0.1–10 µg/mL) ve sabit anti-CD28 (1 µg/mL) ile stimüle edilmiştir. Stimülasyon sonrası 24. ve 48. saatlerde hücreler, sitokin salınımını engellemek ve hücre içi birikime izin vermek amacıyla PMA ve ionomycin varlığında protein taşıma inhibitörleri (monensin ve brefeldin A) ile 5 saatlik inkübasyonun ardından hasat edilmiştir. (A) Kontur grafikleri, belirtilen her konsantrasyon ve zaman noktasındaki TNF-α- ve Granzyme B-pozitif hücrelerin frekanslarını göstermektedir. Stimüle edilmemiş hücreler negatif kontrol olarak kullanılmıştır. (B) TNF-α+, Granzyme B+ ve TNF-α+ Granzyme B+ hücrelerin oranları. (C) TNF-α ve Granzyme B'nin MFI değerleri. Akış sitometrisi grafikleri 3 bağımsız deneyin temsilcisidir. Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilmiştir. İstatistik: Tukey post-hoc testi ile tekrarlanan ölçümlü iki yönlü ANOVA. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; ns, anlamlı değil. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokol, TCR sinyal gücüne bağlı T hücresi yanıtlarını incelemek için sistematik ve tekrarlanabilir bir yöntem sunmaktadır. Kademeli anti-CD3 kaplama stratejisi, stimülasyon yoğunluğu üzerinde hassas kontrol sağlayarak araştırmacıların TCR girdisi ile alt akış fonksiyonel sonuçları arasındaki kantitatif ilişkiyi çözümlemesine olanak tanır. Temel prosedür noktaları arasında naive CD8⁺ T hücrelerinin saflaştırılması, anti-CD3 kaplama konsantrasyonunun hassas gradyan kontrolü ve kuyuk başına hücre sayısının sıkı normalizasyonu yer almaktadır. Deneyler arası veri karşılaştırılabilirliğini sağlamak için ayrıca tutarlı cihaz ayarları, kompanzasyon matrisleri ve gating stratejileri kullanılmasını ve mümkün olduğunda aynı antikor lotlarının ve fikse edilebilir canlılık boyası partilerinin uygulanmasını öneriyoruz. Bu kritik adımların güvenilirliği, deneysel sonuçların, değişen TCR stimülasyon yoğunluklarının T hücresi fenotipik dinamikleri üzerindeki etkilerini doğru bir şekilde yansıtıp yansıtmayacağını doğrudan belirler.

Bu protokolde, TCR-CD3 kompleksini çapraz bağlamak için anti-CD3 antikorlarının doğrudan kültür plakası yüzeyine kaplandığı plaka bağlı antikor stimülasyonu yöntemini kullandık. Bu yaklaşım; maliyet etkinliği, üniform antikor dağılımı, kuyucuklar arası minimum değişkenlik ve mükemmel tekrarlanabilirlik sunar. Özellikle, kaplama antikoru konsantrasyonlarının titrasyonu, stimülasyon yoğunluğunun hassas ve kademeli modülasyonuna olanak tanır; bu özellik, ligand yoğunluğunun genellikle doygunluk seviyesinde sabitlendiği ve ince ayarlı sinyal modülasyonunu sınırladığı boncuk konjugeli stimülasyondan bu sistemi ayıran bir özelliktir14. Bununla birlikte, plaka bağlı stimülasyon, antijen sunan hücrelerdeki peptid-MHC komplekslerinin indüklediği geçici ve afiniteye bağlı etkileşimden temelden farklı olan, suprafizyolojik ve sürekli bir TCR çapraz bağlama sağlar. pMHC tabanlı stimülasyon fizyolojik olarak daha ilgili olsa da teknik açıdan zorludur, multimer üretimi için uzmanlık gerektirir ve önemli ölçüde daha yüksek maliyetlere yol açar. Hücre izolasyonu için basit, hızlı ve maliyet etkin olan negatif immunmanyetik seleksiyonu kullandık. FACS ile karşılaştırıldığında daha düşük saflık sağlasa da, ayrıştırılan hücrelerin fizyolojik durumunu bozabilecek mekanik stres ve floresan işaretlemeden kaçınılmasını sağlar20,21.

Protokol uygulaması sırasında ortaya çıkabilecek temel sorunlar arasında düşük ayırma saflığı, zayıf proliferasyon, CTV kaynaklı sitotoksisite, kültür sonrası düşük canlılık ve tutarsız boyama yer almaktadır. Düşük saflık durumu için, hücrelerin biyotinlenmiş antikor kokteyli ve streptavidin kaplı boncuklar ile yeterince karıştırıldığından emin olun, gerekirse manyetik ayırma süresini uzatın ve her yeni reaktif lotu için boncuk-antikor oranını optimize edin. En yüksek anti-CD3 konsantrasyonunda bile minimal proliferasyon gözlemlenirse, izole edilen naive hücrelerin canlılığını ve saflığını (özellikle CD44hi kontaminasyonunu) doğrulayın, anti-CD3 kaplama prosedürünü teyit edin (4 °C'de gece boyu inkübasyon sırasında plakaları sızdırmazlık filmi ile kapatın ve antikor kaplamanın homojen olduğundan emin olun) ve T hücresi genişlemesini desteklemek için temel olan IL-2 konsantrasyonunu valide edin. CTV kaynaklı sitotoksisite için, bölünme piklerinin net çözünürlüğünü koruyarak boyama konsantrasyonunu düşürün ve kalıntı serbest boyayı uzaklaştırmak için söndürme (quenching) adımının tam 5 dk boyunca kesinlikle buz üzerinde gerçekleştirildiğinden emin olun22,23. Kültür sonrası düşük canlılık için hücre yoğunluğunu kontrol edin, yeterli besiyeri hacmi sağladığınızdan emin olun ve steril tekniği koruyun. Tutarsız boyama veya yüksek akış sitometrisi varyabilitesi gözlemlenirse, antikor kokteyllerini master mix olarak hazırlayın, boyanmış tüm örnekleri ışıktan koruyun ve tekrarlar arasında aynı antikor lotlarını ve fikslanabilir canlılık boyası serilerini kullanın.

Yine de, bu protokolün belirli sınırlamaları vardır. Bir in vitro sistem olduğu için sekonder lenfoid organların karmaşık doku mikroçevresini, hücresel etkileşimlerini veya sitokin ortamını yeniden oluşturamaz. Kültür penceresi 48 h ile sınırlıdır; bu durum analizleri erken aktivasyon olaylarıyla kısıtlamakta ve geç evre farklılaşma, tükenmişlik veya bellek oluşumunun değerlendirilmesini engellemektedir. Ayrıca protokol, bağımsız deneyler arasında cihaz ayarlarının, kompanzasyon matrislerinin ve kapılama stratejilerinin titiz bir standardizasyonunu gerektiren akış sitometrisi okumalarına büyük ölçüde dayanmaktadır. Dahası, bu anti-CD3/CD28 tabanlı sistemle elde edilen bulgular yalnızca CD8+ T hücrelerinden türetilmiştir ve aktivasyon eşikleri, ko-stimülatuar gereksinimleri ve alt diferansiyasyon yörüngelerinin farklı olduğu bilinen CD4+ T hücrelerine doğrudan genellenemeyebilir12,24,25. Ek olarak, T hücrelerinin bazal aktivasyon durumu, komensal mikrobiyota farklılıkları nedeniyle bireysel fare kolonileri arasında değişiklik gösterebilir; bu durum, çalışmalar arası sonuçlar yorumlanırken dikkate alınması gereken potansiyel bir laboratuvarlar arası değişkenlik kaynağı oluşturur.

Burada açıklanan kademeli stimülasyon sistemi, araştırmacıların farklı okumalarda gözlemlenen belirgin yanıt paternlerine dayanarak TCR sinyal gücünü belirli deneysel hedeflere göre uyarlamasına olanak tanır. Bu veriler, anti-CD3 konsantrasyonu ve hasat zamanı seçiminin, ele alınan biyolojik soruya göre belirlenmesi gerektiğini ortaya koymaktadır. Erken aktivasyon belirteçleri için, CD69 artışı tüm konsantrasyonlarda 6–12 h kadar erken bir zamanda tespit edilebilir ancak belirgin kinetikler sergiler: yüksek konsantrasyonlar (5–10 µg/mL) hızlı bir pik ve ardından düşüşle sonuçlanırken, düşük konsantrasyonlar (0.5–1 µg/mL) kademeli ve sürdürülebilir bir artış sağlar. Proliferasyon analizleri için 1 µg/mL altındaki konsantrasyonlar suboptimaldir ve dahili negatif kontroller olarak hizmet edebilir; öte yandan 5–10 µg/mL, 48 h'de CTV dilüsyonu ile tespit edilebilen güçlü bir klonal ekspansiyonu güvenilir şekilde indükler. Ko-inhibitör reseptör PD-1 ve ko-stimülatör molekül ICOS'un ekspresyonu yüksek yoğunluklu stimülasyon (5–10 µg/mL) gerektirir ve 36 h'de zirveye ulaşır; bu durum, bu molekülleri inceleyen çalışmaların daha erken veya daha düşük dozlu koşullardan kaçınması gerektiğini göstermektedir. Efektör fonksiyon okumaları (TNF-α ve Granzyme B) için stimülasyon gücü ile sitokin üretimi arasındaki ilişki zamana bağlıdır ve belirgin bir bifazik patern izler. 24 h'de efektör molekül üretimi, anti-CD3 konsantrasyonu ile pozitif yönde ölçeklenir ve daha yüksek dozlar daha fazla sitokin çıktısını tetikler. Ancak 48 h'e gelindiğinde, sitokin üreten hücrelerin mutlak seviyeleri 24 h ile karşılaştırıldığında tüm koşullarda önemli ölçüde yükselmiş olsa da, doz-yanıt ilişkisi tersine döner: düşük stimülasyon konsantrasyonları (0.5–1 µg/mL), yüksek dozlara (5–10 µg/mL) kıyasla nispeten daha yüksek TNF-α⁺ Granzyme B⁺ hücre frekansları sağlar. Bu tersine dönme, başlangıçtaki efektör diferansiyasyonunu teşvik etmesine rağmen, sürekli güçlü TCR sinyallerinin hücre başına sitokin üretim kapasitesinin sürdürülmesi üzerinde göreceli bir kısıtlama yaratabileceğini ve bunun potansiyel olarak aktivasyon kaynaklı tükenmişlik veya hiporesponsivitenin başlangıcını yansıttığını düşündürmektedir.

Kolektif olarak bu ampirik gözlemler, protokolümüzü kullanıcıların belirli alt uç noktalara göre stimülasyon koşullarını önceden seçmelerine olanak tanıyan, böylece deneysel tasarım verimliliğini ve veri yorumlanabilirliğini artıran bir referans çerçeve olarak konumlandırmaktadır. Temel mekanistik çalışmaların ötesinde bu sistem, TCR sinyal gücünün hassas düzenlemesinin farklılaşmayı uygun efektör veya bellek fenotiplerine yönlendirmeye yardımcı olabileceği adoptif immünoterapi için T hücresi ekspansiyon protokollerinin optimizasyonuna da bilgi sağlayabilir26,27,28.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğal Bilimler Vakfı (No. T2394504, LY) ve Lilin Ye Baş Bilim İnsanı Araştırma Başlangıç Fonu (No. R2045, LY) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 mL konik tüpLabgicCD-002-15ASteril 15 mL konik santrifüj tüpü
4% paraformaldehitBeyotimeP0099Boyama öncesinde hücreleri korumak için %4'lük sulu fiksatör
60 mm kapLabgic1221160 mm hücre kültürü kabı
70 µm hücre süzgeciLabgicBS-70-CSTek hücreli süspansiyonlar hazırlamak için 70 µm naylon ağ süzgeç
96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı plakaBeyotimeFPT016Hücre kültürü ve boyama için 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı plaka
ACK lizis tamponuBeyotimeC3702Amonyum klorür bazlı eritrosit lizis tamponu
anti-mouse CD25Biolegend101910Akım sitometrisi için APC-konjuge anti-mouse CD25 antikoru, klon 3C7
anti-mouse CD28Bio X CellBE0015-1T hücresi kostimülasyonu için purifiye anti-mouse CD28 antikoru, klon 37.51
anti-mouse CD3Bio X CellBP0001-1T hücresi aktivasyonu için purifiye anti-mouse CD3ε antikoru, klon 145-2C11
anti-mouse CD69BD Biosciences553237Aktivasyon markörü boyaması için PE-konjuge anti-mouse CD69 antikoru
anti-mouse CD8Invitrogen17-0081-82Akım sitometrisi için APC-konjuge anti-mouse CD8a antikoru, klon 53-6.7
anti-mouse GZMBBiolegend372212Hücre içi akım sitometrisi için PerCP/Cyanine5.5-konjuge anti-human/mouse granzyme B antikoru, klon QA16A02
anti-mouse ICOSBD Biosciences565886Akım sitometrisi için BV421-konjuge anti-mouse ICOS (CD278) antikoru
anti-mouse PD-1Biolegend135220Akım sitometrisi için BV605-konjuge anti-mouse PD-1 (CD279) antikoru, klon 29F.1A12
anti-mouse TNF-αInvitrogen46-7321-82Hücre içi akım sitometrisi için PerCP-eFluor 710-konjuge anti-mouse TNF-α antikoru, klon MP6-XT22
anti-mouse/human CD44Biolegend103030Akım sitometrisi için PE/Cyanine7-konjuge anti-mouse/human CD44 antikoru, klon IM7
biotin anti-mouse CD11bBiolegend101204Lineage deplesyonu için biotin-konjuge anti-mouse CD11b antikoru
biotin anti-mouse CD11cBiolegend117304Lineage deplesyonu için biotin-konjuge anti-mouse CD11c antikoru
biotin anti-mouse CD16/32Biolegend156604Lineage deplesyonu için biotin-konjuge anti-mouse CD16/32 antikoru
biotin anti-mouse CD19Biolegend115504Lineage deplesyonu için biotin-konjuge anti-mouse CD19 antikoru
biotin anti-mouse CD4Biolegend100508Lineage deplesyonu için biotin-konjuge anti-mouse CD4 antikoru
biotin anti-mouse CD44Biolegend103004Lineage deplesyonu için biotin-konjuge anti-mouse CD44 antikoru
biotin anti-mouse CD45RBiolegend103204Lineage deplesyonu için biotin-konjuge anti-mouse CD45R/B220 antikoru
biotin anti-mouse CD49bInvitrogen13-5971-85Lineage deplesyonu için biotin-konjuge anti-mouse CD49b antikoru
biotin anti-mouse F4/80Biolegend123106Lineage deplesyonu için biotin-konjuge anti-mouse F4/80 antikoru
biotin anti-mouse Ly6GBiolegend127604Lineage deplesyonu için biotin-konjuge anti-mouse Ly6G antikoru
biotin anti-mouse NK1.1Biolegend108704Lineage deplesyonu için biotin-konjuge anti-mouse NK1.1 antikoru
biotin anti-mouse TER119Biolegend116204Lineage deplesyonu için biotin-konjuge anti-mouse TER-119 antikoru
C57BL/6 farelerSibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.N/ADeneylerde kullanılan 6–8 haftalık erkek fareler
Karbondioksit (CO2) inkübatörüThermo Fisher3120Memeli hücre kültürü için nemlendirilmiş CO2 inkübatörü
CellTrace Violet boyasıInvitrogenC34557Hücre proliferasyonunu izlemek için mor floresan boya
DMSOSigmaD2650Dimetil sülfoksit; reaktif stok çözeltileri hazırlamak için çözücü
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Sekonder Antikor, Alexa Fluor™ 488InvitrogenA-21206Alexa Fluor 488-konjuge donkey anti-rabbit IgG (H+L) sekonder antikor
D-PBSVivaCell BiosciencesC3590-0500Yıkama ve reaktif hazırlama için Dulbecco’s fosfat tamponlu salin
Fetal bovin serumu (FBS)GibcoC11995500BTMemeli hücre kültürü ortamı için serum takviyesi
Fixable Viability DyeInvitrogen65-0865-14Akım sitometrisi sırasında ölü hücreleri dışlamak için fixable viabilite boyası
Fixation and Permeabilization SolutionBD Biosciences51-2090KZHücre içi boyama için fikse etme ve permeabilizasyon reaktifi
Düz tabanlı 96 kuyucuklu plakaLabgic11510Hücre kültürü ve stimülasyon analizleri için 96 kuyucuklu düz tabanlı plaka
Akım sitometresiBD BiosciencesLSRFortessa-3 laserÇok renkli floresan kazanımı için üç lazerli akım sitometresi
Golgi PlugBD Biosciences51-2301KZHücre içi sitokin boyaması için Brefeldin A bazlı protein taşıma inhibitörü
Golgi StopBD Biosciences51-2092KZHücre içi sitokin boyaması için Monensin bazlı protein taşıma inhibitörü
Ionomisin kalsiyum tuzuSigmaI3909-1MLHücre stimülasyonu için PMA ile birlikte kullanılan kalsiyum ionoforu
Perm/Wash BufferBD Biosciences51-20911KZHücre içi boyama için permeabilizasyon ve yıkama tamponu
Phosflow Lyse/Fix BufferBD Biosciences558049Eritrosit lizisi ve lökosit fiksasyonunu aynı anda gerçekleştirmek için 5× tampon
Phosflow Perm/Wash Buffer IBD Biosciences557885Hücre içi fosfoprotein boyaması için metanol bazlı permeabilizasyon tamponu
Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) Tavşan Monoklonal AntikorCell Signaling4858SPhospho-S6 ribozomal proteine (Ser235/236) özgü tavşan monoklonal antikor, klon D57.2.2E
PMASigmaP1585-1MGForbol 12-miristat 13-asetat; ex vivo hücre stimülasyonu için kullanılan aktivatör
Rekombinant Mouse Interleukin-2Gibco200-02-50UGT hücresi kültürü ve ekspansiyonu için rekombinant mouse interleukin-2
RPMI 1640Life-LabAC01L064Memeli hücre kültürü için Roswell Park Memorial Institute 1640 ortamı
Streptavidin Manyetik BoncuklarBEAVER22307Biotin-antikor bazlı hücre deplesyonu için streptavidin kaplı manyetik boncuklar
Akım sitometrisi boyama tamponuBelirtilmemişBelirtilmemişAkım sitometrisi boyama tamponu; tedarikçi veya hazırlama formülü sağlanmamıştır
Parafilm M laboratuvar filmiAmcorPM996Plakaların, tüplerin ve kültür kaplarının kapatılması için esnek, kendi kendini mühürleyen laboratuvar filmi
Lyse/Fix BufferBD Biosciences558049Eritrosit lizisi ve lökosit fiksasyonunu aynı anda gerçekleştirmek için 5× tampon
FlowJoBD Biosciencesv10.8.1Akım sitometrisi veri analizi için yazılım, versiyon 10.8.1

Kaynaklar

  1. De Boer RJ, Yates AJ. Modeling T cell fate. Annu Rev Immunol. 2023;41:513–32.
  2. Chapman NM, Boothby MR, Chi H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nat Rev Immunol. 2020;20(1):55–70.
  3. Liu D, et al. Key links in the physiological regulation of the immune system and disease induction: T cell receptor-CD3 complex. Biochem Pharmacol. 2024;227:116441.
  4. Mariuzza RA, Agnihotri P, Orban J. The structural basis of T-cell receptor (TCR) activation: an enduring enigma. J Biol Chem. 2020;295(4):914–25.
  5. Smith-Garvin JE, Koretzky GA, Jordan MS. T cell activation. Annu Rev Immunol. 2009;27:591–619.
  6. Brownlie RJ, Zamoyska R. T cell receptor signalling networks: branched, diversified and bounded. Nat Rev Immunol. 2013;13(4):257–69.
  7. Au-Yeung BB, et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 2014;15(7):687–94.
  8. Daniels MA, et al. Thymic selection threshold defined by compartmentalization of Ras/MAPK signalling. Nature. 2006;444(7120):724–9.
  9. Snook JP, Kim C, Williams MA. TCR signal strength controls the differentiation of CD4+ effector and memory T cells. Sci Immunol. 2018;3(25):eaas9103.
  10. Flaherty S, Reynolds JM. Mouse naïve CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into T cell subsets. J Vis Exp. 2015;(98):e52739.
  11. Trickett A, Kwan YL. T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol Methods. 2003;275(1–2):251–5.
  12. Kaech SM, Wherry EJ, Ahmed R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nat Rev Immunol. 2002;2(4):251–62.
  13. Gottschalk RA, et al. Distinct NF-κB and MAPK activation thresholds uncouple steady-state microbe sensing from anti-pathogen inflammatory responses. Cell Syst. 2016;2(6):378–90.
  14. Gjergjova F, et al. A fine-tuned comprehensive overview of antibody-driven ex vivo assays for primary murine T cell activation. J Immunol Methods. 2026;548:114055.
  15. Rosenlehner T, et al. Reciprocal regulation of mTORC1 signaling and ribosomal biosynthesis determines cell cycle progression in activated T cells. Sci Signal. 2024;17(859):eadi8753.
  16. Salmond RJ, Emery J, Okkenhaug K, Zamoyska R. MAPK, phosphatidylinositol 3-kinase, and mammalian target of rapamycin pathways converge at the level of ribosomal protein S6 phosphorylation to control metabolic signaling in CD8 T cells. J Immunol. 2009;183(11):7388–97.
  17. Motamedi M, Xu L, Elahi S. Correlation of transferrin receptor (CD71) with Ki67 expression on stimulated human and mouse T cells: the kinetics of expression of T cell activation markers. J Immunol Methods. 2016;437:43–52.
  18. Kalia V, et al. Prolonged interleukin-2Ralpha expression on virus-specific CD8+ T cells favors terminal-effector differentiation in vivo. Immunity. 2010;32(1):91–103.
  19. Caruso A, et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 1997;27(1):71–6.
  20. Sutermaster BA, Darling EM. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 2019;9(1):227.
  21. Llufrio EM, Wang L, Naser FJ, Patti GJ. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox Biol. 2018;16:381–7.
  22. Quah BJ, Parish CR. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 2012;379(1–2):1–14.
  23. Lemieszek MB, Findlay SD, Siegers GM. CellTrace Violet flow cytometric assay to assess cell proliferation. Methods Mol Biol. 2022;2508:101–14.
  24. Whitmire JK, Ahmed R. Costimulation in antiviral immunity: differential requirements for CD4+ and CD8+ T cell responses. Curr Opin Immunol. 2000;12(4):448–55.
  25. Seder RA, Darrah PA, Roederer M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nat Rev Immunol. 2008;8(4):247–58.
  26. Carbone F, et al. Cellular and molecular signaling towards T cell immunological self-tolerance. J Biol Chem. 2024;300(4):107134.
  27. Daniels MA, Teixeiro E. TCR signaling in T cell memory. Front Immunol. 2015;6:617.
  28. Knudson KM, et al. Cutting edge: the signals for the generation of T cell memory are qualitatively different depending on TCR ligand strength. J Immunol. 2013;191(12):5797–801.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

CD8 T H crelerin Vitro Stim lasyonAnti CD3 Stim lasyonuAnti CD28 Kostim lasyonuAk SitometrisiNaif T H cresi zolasyonumTORC1 AktivitesiT H cresi Diferansiyasyonu
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.