Tuina'nın Hipotalamik Oreksin-A İfadesi ve Birincil Uykusuzluk Modelinde Uyku Davranışı Üzerindeki Etkisi

Özet

Bu çalışma, Tuina'nın hipotalamik oreksin-A ekspresyonunu davranışsal testler, immünohistokimya ve gerçek zamanlı nicel PCR kullanarak bir fare modelinde uykusuzluğu hafifledip hafifletmediğini araştırmaktadır.

Özet

Uykusuzluk, gündüz fonksiyonunun bozulmasına ve eşzamanlı hastalıkların riskini artıran yaygın bir uyku bozukluğudur; bu da hastaların yaşam kalitesini önemli ölçüde etkiler. Mevcut tedaviler, özellikle bilişsel davranışçı terapi ve farmakoterapi, ilaç bağımlılığı, tolerans ve yoksunluk geri dönüşü gibi sorunlarla sınırlıdır. Tuina terapisinin sinir, endokrin ve bağışıklık sistemlerini düzenlediği gösterilmiştir; orexin sistemi ise uyku-uyanık döngüsünün önemli bir düzenleyicisidir. Bu durum, Tuina'nın hipotalamik oreksin sistemini modüle ederek uykusuzluğu hafifletip hafifletmediğinin araştırılmasına yol açtı. Bu protokol, modifiye çok platformlu su ortamı yöntemiyle indüklenen birincil uykusuzluğun fare modelinde Tuina müdahale yöntemlerini açıklar. 64 Wistar faresini dört gruba ayırdık: kontrol, model, Tuina ve orexin antagonisti. Davranışsal değerlendirmeler (açık alan testi, pentobarbital kaynaklı uyku testi) yapıldı ve hipotalamustaki Orexin-A'nın ekspresyonu gerçek zamanlı nicel PCR ve immünohistokimya ile tespit edildi. Protokol, Tuina'nın etkinliğini değerlendirmeyi ve orexin sistemiyle ilgili potansiyel mekanizmasını incelemeyi amaçlamaktadır; bu da Tuina'nın uyku bozukluklarında uygulanması ve mekanik çalışması için bir referans sağlar.

Giriş

Uykusuzluk, uyku süresi veya kalitesinden memnuniyetsizlikle ve gündüz bozulmalarına yol açan, bireyler ve sağlık sistemleri üzerinde önemli bir yük taşıyan yaygın bir küresel sağlık^{sorunudur 1,2}. Çin'de uykusuzluğun yaygınlığı belirgin şekilde yüksektir ve bu da halk sağlığı etkisini daha da^{artırmaktadır 3}. Bu bozukluk, bilişsel fonksiyonun bozulması, kardiyovasküler hastalık riskinin artması ve depresyon ile anksiyete gibi psikiyatrik durumlarla yüksek eşzamanlı^{hastalıklarla ilişkilidir 4,5}. Mevcut klinik yönetim öncelikle bilişsel davranışçı terapi ve farmakoterapiye, özellikle benzodiazepinler ve benzodiazepinli olmayan sedatif hipnotiklere dayanmaktadır. Ancak, uzun vadeli uygulamaları ilaç bağımlılığı, tolerans, gündüz etkilerinin kalıntısı ve yoksunluk belirtileri nedeniyle sınırlıdır; bu da etkili farmakolojik olmayan alternatiflerin gerekliliğini^vurgular. Klinik uygulamada, Tuina özellikle ilaç bağımlılığı riski yüksek olan yaşlı bireyler ile hamile veya emziren kadınlar için özellikle farmakolojik olmayan müdahaleler arayan kronik primer uykusuzluk hastaları için uygundur⁷.

Geleneksel Çin Tıbbı dış tedavisinin temel taşlarından biri olan Tuina, uykusuzluğun tedavisinde benzersiz avantajlar^{göstermiştir 8}. Meta-analitik kanıtlar, Tuina'nın toplam etkili oranı (OR = 4.12), uyku kalitesi ve anksiyete-depresif durumlar açısından ilaçları veya akupunkturu tek başına önemli ölçüde geride bıraktığını ve yüksek güvenlik⁹. Belirli Tuina protokolleri belirgin avantajlar sunar: geleneksel Tuina balgam ısı tipi uykusuzlukta %89,5 etkililiğe ulaşırken, karın ovuşturması nüks oranını %14,7'ye düşürür (geleneksel Tuina ile %38,2 karşılaştırıldığında)¹⁰. Üç aşamalı Tuina yöntemi, bitkisel tedavi etkinliğini %80,49'dan %92,68'e yükseltirken, uyku mimarisi ve nörotransmitter profillerini^{iyileştirir. 11}. Klinik çalışmalar ve sistematik incelemeler, Tuina'nın uyku kalitesini önemli ölçüde iyileştirebileceğini, kaygı ve depresyon puanlarını azaltabileceğini ve 5-hidroksitriptamin (5-HT) gibi nörotransmitter serum seviyelerini modüle edebildiğini doğrulamıştır^. Terapötik etkilerinin, nöro-endokrin-bağışıklık ağının bütüncül düzenlemesi yoluyla aracılık edildiğine inanılmaktadır. Son araştırmalar, uyanıklığı teşvik etmek ve sürdürmek için kritik olan, lateral hipotalamustan kaynaklanan önemli bir nöropeptid sistemi olan orexin sistemine giderek daha fazla^{odaklanmıştır 13}. Orexin nöronlarının anormal aşırı aktivitesi uykusuzluğun patofizyolojisinde rol oynarken, bu yolun inhibisyonu terapötik potansiyel^{göstermiştir 14}. Ön kanıtlar, karın ovuşturması gibi manipülasyonların uykusuz farelerde beyin Orexin-A seviyelerini etkileyebildiğini^{gösteriyor 12}, ancak Tuina'nın uykusuzluk karşıtı etkilerini özellikle orexin sistemini modüle ederek gösterip göstermediğine dair sistematik bir inceleme eksiktir.

Bu nedenle, birincil uykusuzluğun fare modeline dayanarak, bu çalışma şunları amaçlamaktadır: (1) Standartlaştırılmış Tuina müdahalesi sonrası uyku davranışının iyileşmesini davranış testleri kullanarak değerlendirmek; ve (2) Tuina etkisinin hipotalamustaki Orexin-A ekspresyonunun aşağı regulasyonuyla ilişkili olup olmadığını inceleyerek temel mekanizmayı inceleyerek ve etkinliğini bir oreksin reseptör antagonistiyle karşılaştırmak. Bu araştırma, uykusuzluğun tedavisinde Tuina'nın merkezi mekanizmasına dair deneysel kanıtlar sunmayı amaçlamaktadır.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler ve hayvan refahı değerlendirmeleri, Sincan Tıp Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı (etik onay numarası: IACUC-20020158). Protokol, hayvan bakımı ve kullanımı için kurumsal yönergeleri takip eder. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Hayvan hazırlığı

1. SPF bariyer sisteminde 18–22 °C sıcaklıkta, 12 saat ışık-karanlık döngüsünde 64 spesifik patojensiz (SPF) Wistar faresi (vücut ağırlığı 250 g ± 50 g, eşit cinsiyet dağılımı) bulundurun. Yiyecek ve su sağlayışın.
2. 1 haftalık adaptif beslenmeden sonra, fareleri rastgele olarak 4 gruba (grup başına n = 16) ayırın: kontrol (Grup A), model (Grup B), Tuina (Grup C) ve antagonist (Grup D).

2. Birincil uykusuzluk modelinin kurulması

NOT: Grup A hariç, Grup B, C ve D'deki fareler aşağıdaki modelleme prosedüründen geçer.

1. Fare kutusu olarak plastik silindirik bir kap (üst çap: 30 cm, yükseklik: 40 cm) hazırlayın.
2. Kabın altına silindirik bir platform (çap: 6 cm, yükseklik: 10 cm) sabitleyin.
3. Su seviyesi platform yüzeyinin 1 cm altına kadar kaba su ekleyin. Su sıcaklığını 20 °C'de tutun.
4. Konteynerin içine yatay şekilde, platformun 15 cm yukarısında dairesel bir demir ağ (çap: 25 cm, ağ boyutu: 1 cm) yerleştirin. Ağı ince demir tellerle kabın kenarına sabitleyin.
5. İçme suyu ve yiyecek demir ağın üzerine yerleştirin. Suyu her gün değiştirin ve kabı temizleyip dezenfekte edin.
6. Her konteyner için bir fare yerleştirin platformda 8 gün ardışık.

3. Pentobarbital sodyum sinerjistik uyku testi kullanılarak model değerlendirmesi

1. Pentobarbital sodyum çözeltisi, doğrudan ultrasaf su eklenerek hazırlanır. 1,0 g toz tartı, sterilize edilmiş ultra saf suyu 100 mL'ye ekleyin, çözün ve 0,22 μm filtreleyerek %1 (10 mg/mL) çözelti elde edin.
2. 9. günde, tüm farelere uykuyu tetikleyen minimum eşik dozda (ön deneylerde belirlenen) intraperitonal sodyum solüsyonunu enjekte edin.
3. Uyku gecikmesini (enjeksiyondan ilk düzeltici refleks kaybına kadar olan süre) ve uyku süresini (kayıptan iyileşmeye kadar olan süre) kaydedin. 1 dakikalık düzeltici refleks kaybını uyku başlangıcı, iyileşmesini ise uykunun sonu olarak tanımlayın.

4. Tuina müdahalesi

NOT: Müdahaleler, başarılı model değerlendirmesinden sonraki gün başlar ve 14 gün ardışık olarak günde bir kez devam eder. Grup A ve Grup B, günde 10 dakika boyunca fiksasyon çerçevesinde kısıtlama uygulanır. Operatörler, deneyden önce kuvvet, frekans ve ritimde tutarlılık sağlamak için titiz bir eğitim alır.

1. Grup C için, fareyi ameliyat masasında sırtüstü pozisyonda sabitleyin.
2. Sol elinin beş parmağıyla farenin dört uzvunu nazikçe sabitleyin, karın kısmını tamamen uzatın.
3. Sağ elinizle abdominal Tuina yapın: orta parmağın distal falanksındaki pulpu kullanarak Guanyuan noktasına (CV4, umbilicus'un 25 mm altında yer alır) kuvvet uygular. Kalan dört parmağı doğal olarak açık tutun.
4. Orta parmağınızı omuz ekleminden küçük anterolateral dairesel hareketlerle hareket ettirin; karın üzerinde saat yönünde dairesel translasyonel sürtünme uygulayın.
5. Jiuwei (CV15, xiphoid sürecinin 5 mm altında), Guanyuan (CV4) ve iki taraflı Daimai noktalarından (GB26, 12^. kaburganın serbest ucu ile iliak tepe üst sınırı arasındaki orta nokta) oluşan kapalı dairesel bir yolu takip edin.
6. Dakikada 5–7 döngü hızında akıcı, sabit ve sürekli dairesel hareket sürdürün.
7. 5 dakika saat yönünün tersine manipülasyon yapın, ardından saat yönünde 5 dakika manipülasyon yapın.
8. Kuvvetin sabit ve sağlam olduğundan emin olun, farenin sakin kalıp zorlanmamasını sağlayın. Müdahaleyi günde bir kez 14 gün boyunca uygulayın.

5. Antagonist yönetim

1. Grup D için, MK-4305 (10 mg/kg) günde bir kez intragastrik garaj ile 14 gün boyunca uygulanır. MK-4305'i normal salonda çözerek 5 mL bir çözelti hazırlanır.

6. Açık alan testi

1. Müdahale süresinden sonra, açık alan testi siyah bir kübik kutu kullanılarak yapılabilir (taban: 100 cm × 100 cm, yükseklik: 40 cm). Zemini gri çizgilerle 25 eşit kareye ayırın (16 çevresel çizgi, 9 orta).
2. Fareyi orta kareye yerleştirin ve zamanlamaya başlayın.
3. Bir görüntü alma sistemi kullanarak toplam toplam mesafe, yetişme bölümleri sayısı ve merkezi alanda 3 dakika boyunca geçirilen zamanı kaydet.
4. Her testten sonra dışkıyı temizleyin ve zemin ile iç duvarları %75 etanol ile temizleyin.
5. Görüntü alma sistemi çalışması
   1. Görüntü alma sistemini kurun. Dijital CCD kamerayı (çözünürlük: 1280 × 720 piksel; kare hızı: 25 fps) açık alanın 1,5 m yukarısına dikey olarak monte edin. Kamerayı USB arayüzü üzerinden bir bilgisayara bağlayın.
   2. Takip yazılımını ve analiz ayarlarını yapılandırın. Davranışsal video analiz yazılımı kullanarak otomatik takip gerçekleştirin. İzleme parametrelerini aşağıdaki şekilde ayarlayın:
      1. İzleme odakını farenin merkez noktası (kütle merkezi) olarak tanımlayın.
      2. Hem görüntü alımı hem de analiz için kare hızını 25 fps olarak ayarlayın.
      3. Mekansal çözünürlüğü, her pikselin açık alan boyutlarına ve video çözünürlüğüne göre gerçek mesafenin 1,5 mm'sine karşılık gelmesini sağlayacak şekilde kalibre edin.
      4. Arka plan çıkarma eşiğini 15 gri seviyeye (aralık: 0–255) ayarlayın; böylece fareyi arka plandan ayırt edin.
      5. Gürültüden kaynaklanan yanlış pozitif algılamaları en aza indirmek için minimum olay süresini 0.2 saniye (5 kare) olarak ayarlayın.
      6. Açık alanı neredeyse olarak 5 × 5 eşit alanlı kareye (1–25 Bölgeler) bölünür. Merkezi bölgeyi 7, 8, 9, 12, 13, 14, 17, 18 ve 19 (merkezi 3 × 3 kare, toplam alanın %36'sını temsil eder) olarak tanımlayın. Çevresel bölgeyi kalan kareler olarak tanımlayın.
   3. Aşağıdaki çıktı parametrelerini kaydedin: toplam kat edilen mesafe (mm), ortalama hız (mm/s), hareketsiz kalan süre (s), hareket halinde geçirilen süre (s), her bölgede geçen süre, her bölgede taşınan mesafe (mm), her bölgeye giriş sayısı ve yetiştirme bölümü sayısı. Yetiştirme ataklarını manuel olarak doğrulayın.

7. İmmünohistokimya için perfüzyon

NOT: İmmünohistokimya için her gruptan 4 fare kullanın.

1. %0,9 tuzlu (önceden 37 °C'ye ısıtılmış) ve %4 paraformaldehit çözeltisi (4 °C'de saklanmış) hazırlayın.
2. Sıçanları intraperitoneal üretan (%25 çözelti, 0.6 mL/100 g vücut ağırlığı) ile derin anestezi altına alın. Pedal, kornea ve düzeltici reflekslerin kaybını doğrulayın.
3. Fareyi sırtüstü bir köpük tahtaya sabitleyin. Deri, fasya ve göğüs kabuğunu keserek göğüs boşluğunu hızla açın.
4. Kalbi nazikçe geri çekerek aortayı açığa çıkarın. Sol ventriküler apeksten aortaya iğne sokar, iğne ucu aort lümeninde görünür hale gelir. İğne, sol ventrikül ve aortanın yatay hizalı olduğundan emin olun.
5. Aort ve iğneyi hemostatik forseps ile birlikte kelepçe yapın. Hemen sağ atriyumu kesin ki kan akışı sağlansın.
6. 150–200 mL önceden ısıtılmış %0,9 tuzlu (37 °C) perfüze edilir. Başarılı perfüzyon karaciğer, mezenteri ve ön uzuvların ağartması ve sağ atriyumdan berrak sıvı ile belirtilir.
7. Soğuk %4 paraformaldehit (4 °C) ve perfüz 400 mL ile geçin. İlk perfüzyonu hızlı bir şekilde yapın, ta ki tüm vücut kas fasikülasyonları ve uzuv sertleşmesi oluşana kadar. Sonra akış hızını 2 damla/s'ye düşürerek tüm fiksator perfüze olun.
8. Beyin solgun ve sert göründüğünde başarılı bir takıntıyı doğrulayın.

8. Beyin diseksiyonu

1. Perfüzyondan sonra farenin kafasını kesin ve beynin tamamını dikkatlice kafatasından çıkarın.
2. Kafatasını makasla sagittal dikiş boyunca kesin. Parietal ve oksipital kemikleri kemik rongeurlarıyla soyun.
3. Beyni spatula ile nazikçe kaldırın, ince makasla kafatası ve optik sinirleri kesin.
4. İmmünohistokimya için: Tüm beyni hemen %4 paraformaldehite aktarın ve 24 saat boyunca 4 °C'de sabitleyin.
5. Gerçek zamanlı nicel PCR için: Beyin yüzeyini önceden soğutulmuş tuzlu suyla durulayın, filtre kağıdıyla kurutun, sıvı azotta 5–10 dakika dondurun ve –80 °C'de saklayın. Tüm adımları buz üzerinde yapın.

9. İmmünohistokimyasal boyama

1. Hipotalamik doku parafine gömülüp mikrotom kullanılarak 4–5 μm kalınlıkta koronal kesitler kesilir. Bölümleri anti-drop kaydırmalarına monte edin, 65 °C'de 1,5–2 saat pişirin.
2. Ksilen I ve II'de (her biri 10 dakika) bölümleri mumdan çıkar. Derecelendirilmiş etanol ile yeniden hidretleyin: susuz etanol I ve II (her biri 5 dakika), ardından %95, %90, %80, %70 etanol (her biri 5 dakika), ardından damıtılmış su (5 dakika).
3. Antijen toplama işlemi için kesitleri kaynar 0,01 M sitrat tamponuna (pH 6,0) basınçlı tencerede yerleştirin. Basınç valfi yükselene kadar ısıtın, sonra ısıyı kapatın. 10 dakika beklet, sonra doğal olarak oda sıcaklığına soğut.
4. Endogen peroksidazı, bölümleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca taze %3 H₂O₂ içinde batırarak inaktive edin. 3× adet PBS ile yıkayın (her biri 5 dakika).
5. İmmünohistokimya kalemi ile daire dokusunu çiz. Tavşan anti-HCRT/Orexin-A poliklonal antikoru uygulayın (seyreltme 1:50, slayt başına ~50 μL). Nemlendirilmiş bir kutuda 4 °C sıcaklıkta gece boyunca kuluçka yapın.
6. Ertesi gün, oda sıcaklığında 20 dakika ısıtın. 3× adet PBS ile yıkayın (her biri 5 dakika).
7. Horseradish peroksidaz etiketli ikincil antikor uygulayın. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın. 3× adet PBS ile yıkayın (her biri 3 dakika).
8. Werp peroksidaz etiketli streptavidin çalışma çözeltisi uygulayın. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın. 3× adet PBS ile yıkayın (her biri 5 dakika).
9. DAB kromojen çözeltisi hazırlayın (0,85 mL damıtılmış su + her biri 50 μL reaktifler A, B, C). Kesitlere uygulanır ve oda sıcaklığında mikroskop altında 3–10 dakika boyunca geliştirin. Tepkiyi 3 dakika musluk suyuna batırarak durdurun.
10. Hematosilinle 3 dakika karşı boyama yapın. %1 hidroklorik asit alkolünde 1–2 saniye diferentasyon yapın. Musluk suyunda 5 dakika mavi kalın.
11. Distile su (3 dakika), %70, %80, %90, %95 etanol (her biri 3 dakika) ve susuz etanol I ile II (her biri 5 dakika) ile kurutun. Ksilen I ve II'de (her biri 5 dakika) temiz.
12. Nötr balsam ve örtü sür. Gece boyunca 37 °C'de kuru.
13. Bir ışık mikroskobu ile bölümleri gözlemleyin ve fotoğraflayın (40×, 100×, 200×, 400×). ImageJ kullanılarak Orexin-A pozitif hücreleri (sitoplazmada kahverengi granül çökeltme) sayın.
14. Toplam puan (0–12) boyanma yoğunluğu puanı (0 = negatif, 1 = açık sarı, 2 = açık kahverengi, 3 = koyu kahverengi) pozitif hücre yüzdesi puanı ile çarpılır (0 = 0%, 1 = 1–25%, 2 = 26–50%, 3 = 51–75%, 4 = 76–100%). 1–5'i düşük ifade, 6–12'yi ise yüksek ifade olarak tanımlayın.

10. Orexin-A mRNA için Gerçek Zamanlı Nicel PCR

1. Doku eritmesinden sonra RNA işleme RNazsız koşullarda yapılmalıdır. Özel RNase içermeyen gereksinimler şunlardır:
   1. Çalışma ortamı: RNase dezinfektan ile silinmiş ve UV ışınına maruz kalmış özel bir RNA çalışma alanı kullanın.
   2. Tüketim malzemeleri: Sertifikalı RNase içermeyen santrifüj tüpleri ve pipet uçları kullanın veya alternatif olarak %0,1 DEPC suyla islatıp ardından otoklavlama işlemi yapılabilir.
   3. Reaktifler: RNase içermeyen lizin tamponu ve DEPC ile arıtılmış su kullanın.
   4. İşlem: İşlem boyunca tozsuz eldiven giyin, eldivenleri sık sık değiştirin ve tüketim malzemelerinin ve örneklerin iç kısmıyla doğrudan temas etmekten kaçının.
   5. Deneysel prosedür
      NOT: RNA çıkarımı ve ters transkripsiyon adımlarında, RNA veya ters transkripsiyon reaktifleriyle temas eden tüm sarf malzemeleri ve araçlar RNazsız olmalıdır. PCR amplifikasyon aşamasında, cDNA çift zincirli bir yapı olduğundan ve RNase çift zincirli DNA'yı bozunamadığından, bu aşamada tüketim malzemeleri ve aletler sadece PCR reaksiyonlarını engelleyebilecek DNaz ve diğer safsızlıklardan arınmış olmalıdır; ek RNazsız tedavi gerekmez. Donmuş hipotalamik dokuyu sıvı azot altında öğüt. 50–100 mg doku tozunu 1 mL Trizol içeren bir tüpe tartı. Oda sıcaklığında 15 dakika karıştırıp bekletin.
2. 200 μL klorofom ekleyin, ters çevirerek karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika bekletin. 12.000 × g'de 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın.
3. Üst sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. Eşit hacimde izopropanol ekleyin, karıştırın ve 35 dakika boyunca –20 °C'de bekletin. 12.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın. Üst yüzeyi at.
4. Çökeltiyi %75 etanol ile yıkayın, 12.000 × gr'de santrifüj yapın ve 4 °C'de 15 dakika boyunca kullanın. Üst yüzeyi atın ve yıkamayı bir kez tekrarlayın.
5. Oda sıcaklığında hava kurutma yağdırın. RNase içermeyen suda çözünür.
6. RNA konsantrasyonu ve saflığını ölçün (A260/A280 oranı 1.8–2.1). Bütünlüğü %1 agaroz jel elektroforezi ile değerlendirin (28S ve 18S bantları zayıf veya yok 5S bandı).
7. Ters transkripsiyon reaksiyonu (20 μL) hazırlanır: 800 ng toplam RNA, 1 μL Rastgele Primer (0.1 μg/μL), 10 μL 2× TS Reaksiyon Karışımı, 1 μL TransScript RT/RI Enzim Karışımı, 1 μL gDNA Çıkarıcı ve RNase içermeyen hacme su.
8. 25 °C'de 10 dakika kuluçka, ardından 85 °C'de 5 saniye kuluçka yapın ve birinci zincir cDNA'sı sentezlenin. RNase içermeyen suyla cDNA'yı 1:1 seyrelt.
9. QPCR reaksiyonu hazırlanın (10 μL): 5 μL EvaGreen 2× qPCR MasterMix, 0,3 μL ön primer (10 μM), 0,3 μL ters primer (10 μM), 1 μL cDNA şablonu, RNase içermeyen hacme su. Üçlü olarak koştur.
   NOT: Astarlar: Orexin-A-F: 5'-CGCCAGAAGACGTGTTCCT-3'; Orexin-A-R: 5'-GCCGCTTTCCCAGAGTGAG-3' (ürün uzunluğu 88 bp); β-Aktin-F: 5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'
   β-Actin-R: 5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3' (ürün uzunluğu 150 bp).
10. QPCR programı çalıştırın: 30 saniye boyunca 95 °C (denatürasyon öncesi); 40 döngü, 5 saniye boyunca 95 °C (denatürasyon) ve 60 °C (tavlama/uzatma) 30 saniye boyunca kullanılır.
11. Amplifikasyon ve erime eğrilerini doğrulayın. Spesifikliği doğrulamak için %2 agaroz jel üzerinde 5 μL ürün çalıştırın.
12. Dahili kontrol olarak β-Actin ile 2^⁻ΔΔCt yöntemiyle göreli Orexin-A mRNA ifadesini hesaplayın.

11. İstatistiksel analiz

1. Veri analizi için SPSS 26.0 kullanın. Tüm verileri ortalama ± standart sapma olarak ifade edin. İki grup arasındaki karşılaştırmalar için, veriler normal şekilde dağılımsa, bağımsız örnekler t-testi kullanın; aksi takdirde Mann-Whitney U testini kullanın.
2. Birden fazla grup arasında karşılaştırmalar için, homojen varyanslar için tek yönlü ANOVA ile LSD post-hoc testi veya heterojen varyanslar için Tamhane testini kullanın. Veriler normal olarak dağıtılmıyorsa, Kruskal-Wallis H testi kullanın. P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak değerlendirin.

Sonuçlar

Tablo 1, grup A ile karşılaştırıldığında, B, C ve D gruplarındaki uyku gecikmesinin anlamlı şekilde uzadığını ve modellemeden sonra uyku süresinin önemli ölçüde kısaldığını göstermektedir; bu da birincil uykusuzluk fare modelinin başarıyla kurulduğunu göstermektedir. Tablo 2 ve Tablo 3'teki bulgular, uykusuzluğun tedavisinde Tuina'nın terapötik etkisi için ön destek sunmaktadır. Açık Alan Testi (OFT), kemirgenlerde kaygı benzeri davranışları değerlendirmek için davranışsal sinirbilimde en klasik ve yaygın kullanılan paradigmalardan^{biridir 15}. Çalışmalar, dört köşe alanına tercih edilmesin, anksiyete benzeri davranışları ölçmek için hassas bir gösterge olduğunu ve orta ile düşük kaygı seviyelerinde merkezi alan göstergesinden daha ayırt edici olabileceğini göstermiştir. Uykusuzluk model fareleri, keşif davranışlarında^16,17 anksiyete benzeri davranışlar ve değişiklikler sergilerken, Tuina müdahalesi bu farelerde kaygı benzeri davranışları etkili bir şekilde azalttı. Tablo 4 ve Tablo 5'te sunulan moleküler biyoloji sonuçları ve Şekil 1'de sunulan Tuina'nın uykusuzluk model sıçanlarının hipotalamusunda Orexin-A'nın aşırı ifadesini etkili bir şekilde aşağı regule ettiğini göstermektedir.

Şekil 1: Her gruptaki sıçanların hipotalamusunda Orexin-A'nın immünohistokimyasal boyama sonuçları (40×, 100×, 200×, 400×). (A) Orexin-A pozitif nöronlar sıçan hipotalamik dokusunda gözlemlendi ve koyu kahverengi granüler sinyaller olarak görüldü. Boyama yoğunluğu puanı 3 puan, pozitif hücrelerin oranı %40 (%26–%50 aralığında 2 puan) ve toplam puan 6 puan olup, yüksek ifade aralığına giriyor. (B) Fare hipotalamik dokusunda Orexin-A pozitif nöron sayısı, normal gruba kıyasla anlamlı şekilde artmış, pozitif hücrelerin daha yoğun dağılımı vardı. Boyama yoğunluğu puanı 3 puan (koyu kahverengi), pozitif hücrelerin yüzdesi %80'e ulaştı (%76–%100 aralığında yer alarak 4 puan aldı) ve toplam puan 12 puan oldu ki bu yüksek ifade aralığına giriyordu. (C) Fare hipotalamik dokusunda Orexin-A pozitif nöron sayısı model gruba kıyasla azalmıştır. Boyama yoğunluğu puanı 3 puan (koyu kahverengi), pozitif hücrelerin yüzdesi %75 (%51–%75 aralığında 3 puan) ve toplam puan 9 puan olup, yüksek ifade aralığına giriyor. (D) Fare hipotalamik dokusunda Orexin-A pozitif nöron sayısı da model grubuna göre azalmıştır. Boyama yoğunluğu puanı 3 puan (koyu kahverengi), pozitif hücrelerin yüzdesi %60 (%51–%75 aralığında yer alıyor ve 3 puan alıyor) ve toplam puan 9 puan olup, yüksek ekspresyon aralığına giriyor. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Grup	Uyku Gecikmesi / min	Uyku Süresi / dakika
A	4.13 ± 1.80	49.75 ± 38.46
B	6.31 ± 2.80*	22.13 ± 11.41*
C	6.33 ± 2.60*	24.93 ± 14.43*
D	6.53 ± 1.90*	24.73 ± 17.59*

Tablo 1: Modelleme sonrası gruplar arasında pentobarbital sodyumla indüklenen uyku testlerinin karşılaştırılması. * kontrol grubuna kıyasla P < 0.05'i gösterir.

Grup	Yetiştirme Sıklığı	Hareketsizlik Süresi(ler)	Hareket Süresi(ler)	Hareket Mesafesi (m)	Merkez Bölgesi(ler)de Süre(ler)	Merkez Bölgesindeki Mesafe (m)	Corner Zone'da Süre	Corner Zone'daki mesafe (m)	Corner Zone'da Süre	Yan Bölgedeki Mesafe (m)
A	1.875 ± 0.835	76.700 ± 34.324	103.350 ± 34.307	18.318 ± 16.314	8.750 ± 7.718	2.937 ± 5.112	103.000 ± 28.582	6.315 ± 3.893	56.600 ± 27.772	6.705 ± 3.666
B	7.125 ± 5.668	31.513 ± 10.964	148.488 ± 10.964	22.399 ± 9.159	16.275 ± 10.703	3.244 ± 2.991	75.088 ± 21.561	6.578 ± 1.972	85.463 ± 23.374	11.724 ± 4.959
T-değeri	-2.592	3.547	-3.545	-0.617	-1.613	-0.146	2.205	-0.171	-2.249	-2.302
P-değeri	0.035	0.007*	0.007*	0.547	0.129	0.886	0.045*	0.867	0.041*	0.037*

Tablo 2: Kontrol grubu (A) ile model grubu (B) arasındaki her gösterge seviyesinin etkisinin analizi.* P < kontrol grubuna kıyasla 0,05 olduğunu gösterir.

Grup	Yetiştirme Sıklığı	Hareketsizlik Süresi(ler)	Hareket Süresi(ler)	Hareket Mesafesi (m)	Merkez Bölgesi(ler)de Süre(ler)	Merkez Bölgesindeki Mesafe (m)	Corner Zone'da Süre	Corner Zone'daki mesafe (m)	Corner Zone'da Süre	Yan Bölgedeki Mesafe (m)
B	5.875 ± 2.295	29.819 ± 12.871	150.219 ± 12.867	19.165 ± 8.054	24.838 ± 13.068	3.178 ± 2.438	69.075 ± 13.992	5.823 ± 1.422	83.019 ± 15.464	9.878 ± 4.393
C	6.357 ± 0.627	35.993 ± 32.237	144.021 ± 32.246	23.291 ± 4.873	14.321 ± 3.774	3.106 ± 2.214	87.057 ± 12.658 △	8.087 ± 1.496 △	68.943 ± 9.240	10.420 ± 1.225
D	6.667 ± 1.633	30.808 ± 15.389	149.200 ± 15.380	18.584 ± 4.969	27.792 ± 12.460	3.085 ± 1.114	74.600 ± 22.248	5.744 ± 1.291▲	74.192 ± 17.011	9.465 ± 3.380

Tablo 3: Model grubu (B), Tuina grubu (C) ve antagonist grubu (D) arasındaki her gösterge seviyesinin etkisinin analizi. ^△P < model grubu (B) ile karşılaştırıldığında 0,05; ^▲P < Tuina grubu (C) ile karşılaştırıldığında 0,05'tir.

Grup	Orexin-A
A	1.011 ± 0.173
B	10.436 ± 2.512△
C	2.392 ± 0.998▲
D	3.227 ± 1.703▲

Tablo 4: Hipotalamik dokuda Orexin-A mRNA ekspresyon seviyeleri. ^△P < kontrol grubu (A) ile karşılaştırıldığında 0,05; ^▲P < model grubu(B) ile karşılaştırıldığında 0.05.

Grup	Orexin-A
	Boyama Yoğunluğu	Pozitif Hücrelerin Yüzdesi	Yüzde Puanı	Skor
A	3	40%	2	6
B	3	80%	4	12
C	3	75%	3	9
D	3	60%	3	9

Tablo 5: Her gruptaki farelerin hipotalamusunda Orexin-A'nın immünohistokimyasal boyama skorları. Boyama yoğunluğu puanlama kriterleri: 0 = negatif boyama (renksiz), 1 = açık sarı, 2 = açık kahverengi, 3 = koyu kahverengi. Pozitif hücrelerin puanlama kriteri: 0 = 0%, 1 = %1–25%, 2 = %26–%50, 3 = %51–75%, 4 = %76–%100. Toplam puan = boyama yoğunluğu puanı × yüzde puanı. 1–5 toplam puanlar düşük ifade olarak, 6–12 puanları ise yüksek ekspresyon olarak tanımlandı.

Tartışma

Bu çalışma, Tuina'nın birincil uykusuzluk sıçan modelindeki etkinliğini değerlendirmeyi ve hipotalamik oreksin sistemiyle ilişkili potansiyel mekanizmasını incelemeyi amaçladı. Mevcut bulgular, standartlaştırılmış Tuina protokolünün uyku gecikmesini ve süresini önemli ölçüde iyileştirdiğini, kaygı benzeri davranışları hafiflettiğini ve hipotalamustaki hem mRNA hem de protein seviyelerinde Orexin-A'nın aşırı ifadesini etkili bir şekilde azalttığını göstermektedir. Özellikle, Tuina'nın etkisi orexin reseptör antagonisti MK-4305'in etkisiyle karşılaştırılabilir olup, orexin sisteminin modülasyonunun Tuina'nın uykusuzluğu hafifletmesinde kritik bir mekanizma olabileceğini düşündürmektedir.

Farmakolojik müdahalelere kıskında, Tuina invaziv olmayan bir dış tedavi olarak güvenlik, minimal yan etkiler ve hasta uyumu açısından avantajlar^{sunar 12,18}. Uykusuzluk için terapötik faydaları, uyku kalitesi ve psikolojik durumdaki iyileşmeleri gösteren klinik kanıtlarla^{desteklenmektedir 18,19}. Mekanizma çok yüzeylidir; hipotalamus-hipofiz-adrenal ekseninin düzenlenmesi, otonom sinir sistemi homeostazı ve 5-HT^18,20 gibi temel nörotransmitterleri içerir. Sonuçlar, oreksin sistemini belirli bir hedef olarak belirleyerek bu anlayışı genişletir. Orexin nöronları uyanıklığın merkezi iticileridir ve aşırı uyarılmaları uyku instabilitesi^{ile bağlantılıdır} 21,22,23. Tuina'dan sonra gözlemlenen oreksin-A'nın aşağı regulasyonu, yeni uykusuzluk ilacı çift oreksin reseptör antagonistinin etkisiyle tutarlı görünmekte, farmakolojik ve farmakolojik olmayan müdahaleler arasında olası bir yakınsamak yolunu^{ortaya koymaktadır 24,25}.

Bu çalışma, abdominal Tuina ve orexin-A^{düzenlemesi 25} ile ilgili daha önce yayımlanmış çalışmalarımıza dayansa da, mevcut el yazması, orijinal raporun ötesinde önemli bir uzantı ve metodolojik iyileştirmeyi temsil etmektedir. Özellikle, bu çalışma istatistiksel gücü artırmak için örneklem büyüklüğünü 64 fareye çıkarıyor ve uyku mimarisi ve anksiyete benzeri davranışları sistematik olarak değerlendirmek için açık alan testi ve pentobarbital kaynaklı uyku testleri dahil olmak üzere kapsamlı bir davranışsal değerlendirme paketi sunuyor; bu davranışlar önceki çalışmada ele alınmamıştı. Önceki çalışmanın aksine, oksidatif stres ve klasik nörotransmitterler üzerine yoğunlaşan bu makale, orexin sisteminin fonksiyonel doğrulamasını entegre davranışsal sonuçlar ve moleküler testler yoluyla önceliklendirir ve önceki bulguları tekrarlamak yerine tamamlayıcı bağımsız bir mekanik araştırma olarak hizmet eder.

Deneysel tasarım, karın ve Guanyuan (CV 4) gibi spesifik akupunktur noktalarına odaklanarak TCM teorisine bağlı kalmıştır; Guanyuan'ın ilkel Qi'yi tonlaştırdığı ve visseral fonksiyonu düzenlediğine inanılan bu akupunktur noktaları kapalı döngülü manipülasyon^{yolu içinde 26,27} bulunmaktadır. Parametreler (sıklık, süre, kurs) tutarlılık ve tekrarlanabilirlik sağlamak için ön çalışmalara dayanarak standartlaştırıldı; bu mekanik hayvan çalışmaları için kritik bir^{unsurdur 12}.

Ancak bu protokolün sınırlamaları vardır. İlk olarak, müdahale modelleme sonrası tek bir zaman noktasında uygulandı. Gelecekteki çalışmalar, Tuina için optimal bir "doz-yanıt" ilişkisi oluşturmak amacıyla farklı müdahale sürelerini ve sıklıklarını incelemelidir. İkinci olarak, bu çalışma gözlemsel bir araştırma tasarımıdır. Tuina ile Orexin-A'nın azalmış ekspresyonu ile davranışsal iyileşme arasında bir korelasyon bulunmuş olsa da, bu ilişkinin Tuina veya diğer faktörlerin doğrudan mı dolaylı bir etkisi olduğu hâlâ belirsizdir. Gelecekteki araştırmalar, gen etkisi, kemogenetik inhibisyon veya antagonist blokaj gibi deneysel stratejiler kullanarak Tuina'nın Orexin-A ifadesini düzenleyerek uykusuzluk davranışını iyileştirip iyileştirmediğini daha iyi doğrulayabilir ve böylece nedensel mekanizmasını aydınlatabilir. Son olarak, bu çalışma sahte bir operasyon veya plasebo müdahale kontrol grubu oluşturmadı. Ancak, bu çalışma tasarım sırasında bunu dikkate aldı ve tüm hayvan grupları aynı düzeyde kavrama ve fiksasyon işlemleri aldı; bu da belirli olmayan stres faktörlerinin etkisini bir ölçüde kontrol altına aldı. Ayrıca, bu çalışmadaki Tuina programının sıklığı, yoğunluğu ve eylem yolu, müdahalenin tutarlılığı ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için ön deneylere dayanarak standartlaştırıldı. Gelecekteki araştırmalar, Tuina operasyonlarının özel etkilerini netleştirmek için temassız simülasyon veya minimal dokunsal uyarım gibi daha titiz kontrol yöntemleri geliştirmeye odaklanmalıdır.

Bu protokolün başarısı için kritik olan temel adımlar şunlardır: birincisi, modifiye çok platformlu su ortamı yönteminde su sıcaklığı ve platform boyutlarının sıkı kontrolü; ikincisi, alt eşik pentobarbital sodyum dozunun deney öncesi titrasyonu; üçüncüsü, Tuina manipülasyon parametrelerinin standartlaştırılması (dakikada 5–7 döngü, saat yönünün tersine ve sonra saat yönünde 5 dakika manipülasyon) ve operatör eğitimi; dördüncüsü, Hipotalamik dokunun sıvı azotta hızlı dondurulması ve ardından RNazsız işlem yapılarak Orexin-A mRNA'nın stabilitesini sağlamak.

Olası değişiklikler arasında: birincisi, operatörler arası değişkenliği azaltmak için otomatik mekanik bir Tuina cihazının geliştirilmesi; ikincisi, pentobarbital sodyum uyku testinin yerine EEG/EMG telemetrisinin kullanılması ve böylece sürekli uyku evresi izlenmesini mümkün kılmak; ve üçüncüsü, Tuina'nın etkilerini arabuluculuk etmede orexin nöronların gerekliliğini doğrulamak için kemogenetik veya optogenetik yaklaşımların birleşimi.

Bu protokolün tekrarlanabilirliği, ayrıntılı operasyonel yörüngeler ve parametreler, pozitif kontrol ilacının kullanımı, protein ve mRNA seviyelerinde çift boyutlu tespit ve titiz istatistiksel raporlama ile desteklenmektedir. Pratik kullanılabilirliği şu yönlerde yansımaktadır: pahalı telemetri sistemlerine ihtiyaç olmadan davranışsal testler için düşük ekipman gereksinimleri; modelleme için sadece 8 gün ve Tuina müdahalesi için 14 gün süren toplam deneysel döngü, 4 hafta içinde tamamlanır; bu döngü, çoğu rutin araştırma projesinin finansman döngüleri ve laboratuvar programlarıyla iyi uyum sağlar, hızlı veri toplama ve metodolojik doğrulamayı kolaylaştırır. Ayrıca, Tuina manipülasyon protokolü operasyonel yörünge (CV15 → CV4 → çift taraflı GB26 → CV15'e dönüş), frekans (5–7 döngü/dakika), yön dizisi (saat yönünün tersine ve ardından saat yönünde) ve süre (seans başına 10 dakika) açısından açıkça nicelendirilmiştir. Bu özellikler, farklı operatörlerin kısa eğitimden sonra tekniği ustalıkla ustalaşmasını sağlar ve böylece manuel manipülasyon çalışmalarında yaygın olarak görülen bireysel farklılıklardan kaynaklanan kötü tekrarlanabilirlik riskini azaltır.

Bu protokolün uygulanması sırasında birkaç yaygın sorun ortaya çıkabilir ve uygun sorun giderme önlemleri önerilir. Birincisi, değiştirilmiş çoklu platform su ortamı prosedürü sırasında fareler platformdan düşebilir. Bu genellikle aşırı kaygan bir platform yüzeyinden kaynaklanır. Çözüm, platform yüzeyini ince zımpara kağıdıyla hafifçe püre ederek sürtünmeyi artırmaktır. Ayrıca, her kapta karşılıklı rahatsızlık önlemek için sadece bir fare barındırmalıdır. İkinci olarak, pentobarbital sodyum uyku testi gruplar arasında anlamlı farklar gösteremeyebilir. Çözüm, pilot deneyler sırasında ayrı bir hayvan kohortu (her grup başına 3–4 kişi) kullanılarak minimum eşik altı dozun 5 mg/kg artışlarla yeniden titrelenmesidir. Enjeksiyonlar, sirkadiyen varyasyonu en aza indirmek için her gün aynı saatte (tercihen 09:00 ile 11:00 arasında) yapılmalıdır. Üçüncüsü, fareler Tuina manipülasyonu sırasında zorlanabilir veya ses çıkarabilirler; bu genellikle aşırı güç veya uygunsuz kısıtlama anlamına gelir. Operatör, fare sakin kalana kadar uygulanan kuvveti azaltmalıdır. Kuvvet uygulamasını standartlaştırmak için basınç algılayıcı bir mankenle önceden eğitim yapılması önerilir. Fare, dört uzuvunun tamamı nazikçe ama güvenli şekilde sabitlenmiş şekilde sırtüstü konumlandırılmalıdır, böylece karın tamamen açıktır. Dördüncüsü, aynı deneysel gruptaki Orexin-A pozitif hücrelerin yüzdesinde büyük değişkenlik genellikle hipotalamus boyunca tutarsız kesit düzlemlerinden, öznel sayım yanlılığından veya partiden partiye boyama değişiminden kaynaklanır. Önerilen çözüm, anatomik seviyeyi standartlaştırmak ve hipotalamik analiz için bregma'dan –1,8 mm'den –3,3 mm'ye kadar olan koronal kesitleri toplayan bir fare beyin atlasına (örneğin Paxinos & Watson) başvurmaktır. Grup dağılımı kör olan iki bağımsız gözlemci hücre sayımı yapmalı ve ortalama değer kullanılmalıdır. Belirli bir sonuç ölçümü için tüm örnekler aynı partide boyanmalıdır ve gözlemci öznelliğini azaltmak için ImageJ kullanılarak yarı otomatik eşik analizi teşvik edilir.

Sonuç olarak, bu çalışma standart bir Tuina müdahale protokolü ve birincil uykusuzluk modelinde çok katmanlı bir değerlendirme sistemi oluşturdu. Bu belge, Tuina'nın uykusuzluk davranışlarını iyileştirdiğine, muhtemelen hipotalamik Orexin-A'nın aşırı ifadesini bastıran bir mekanizma yoluyla olduğuna dair ikna edici kanıtlar sunar. Bu metodolojik çerçeve, Tuina'nın merkezi mekanizmalarını araştırmak için tekrarlanabilir bir paradigma sunmakla kalmaz, aynı zamanda uyku bozuklukları için diğer farmakolojik olmayan müdahalelerin mekanik çalışmaları için bir referans sağlar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
5x All-In-One RT MasterMix	abm	G492	cDNA synthesis
Acetylcholine (Ach)	Nanjing Jiancheng	A105-1	ELISA reagent
Adhesion microscope slides	Jiangsu ShiTai Experimental Equipment Co., Ltd.	N/A	Tissue section mounting
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai)	A811BA0014	Gel electrophoresis
Anhydrous ethanol	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	Tissue dehydration
Antibody diluent	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	ZLI-9029	Primary antibody dilution
Basket	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	N/A	Slide holder
Citrate powder	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	MVS-0066	Antigen retrieval buffer preparation
Coverslip	Jiangsu ShiTai Experimental Equipment Co., Ltd.	N/A	Microscopy
DAB chromogen kit	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	DAB-1031	Chromogenic detection
DEPC	Sangon Biotech (Shanghai)	B417BA0001	RNase-free treatment
Dopamine (DA)	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08660r	ELISA reagent
Electrophoresis cell	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYCZ-21	Gel electrophoresis
Electrophoresis power supply	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYY-6C	Gel electrophoresis
EvaGreen Express 2× qPCR MasterMix-Low Rox	abm	G891 / MasterMix-EL	qPCR reagent
Gamma-aminobutyric acid (γ-GABA)	AMOKE	AE91068Ra	Neurotransmitter ELISA reagent
Gel imaging system	Shanghai Tanon	2500	Gel documentation
H2O2 (30%)	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	Endogenous peroxidase blocking
Hematoxylin staining solution	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	CTS-1097	Counterstain
High-speed refrigerated centrifuge	Shanghai Lishen Scientific Equipment Co., Ltd.	Nefuqe 15R	Sample centrifugation
Histamine (HIS)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	EH171-1	ELISA reagent
Hot air drying oven	Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.	DHG series	Drying samples
IHC staining humidity chamber	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	BOX-1001	Humid incubation chamber
Immunohistochemistry staining kit	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	SP9000	IHC staining
Incubator	Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.	DNP-9272	Temperature-controlled incubation
Induction cooker	Guangdong Midea Living Electric Manufacturing Co., Ltd.	C21-RK2101	Heating source
Microplate reader	Bio-Rad, China	xMark	Absorbance measurement
Microscope	Nikon	E200	Microscopy imaging
MK-4305	Meilun Bio	MB3773	Experimental reagent
Neutral balsam	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	ZLI-9555	Mounting medium
Norepinephrine (NA)	Nanjing Jiancheng	H096	ELISA reagent
Nucleic acid and protein quantifier	Beijing Kaiao	K5500	Nucleic acid quantification
Orexin A	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08860r	ELISA reagent
PCR thermal cycler	Bio-Rad, USA	MyCycler Thermal Cycler	PCR amplification
Phosphate-buffered saline (PBS)	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	PBS-0060/0061	Wash buffer
Pipette	Eppendorf, Germany	Dragon lab	Liquid handling
Pressure cooker	Zhejiang Supor Co., Ltd.	YW20F1	Antigen retrieval
Protein quantification kit	TransGen Biotech	DQ111-01	BCA protein assay kit
Rabbit anti-HCRT (Orexin-A) polyclonal antibody	Sangon Biotech (Shanghai)	D163595	Primary antibody
Real-time PCR instrument	ABI (Thermo Fisher)	QuantStudio 6 Flex	qPCR analysis
Refrigerator	Hefei Meiling Co., Ltd.	BCD-249LCK	Sample storage
Serotonin (5-HT)	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08364r	ELISA reagent
Staining jar	Generic	N/A	Slide staining container
Super immunohistochemistry pen	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	PEN-0002	Hydrophobic barrier pen
Trans2K DNA Marker	TransGen Biotech	BM101	DNA ladder
TRIzol Reagent	Ambion	15596026	RNA extraction
Vortex mixer	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.	GL-88B	Laboratory mixer
Xylene	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	Deparaffinization