Çinli Bir Klinik Kohortta Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanserinde m6A Okuyucu Protein YTHDC2'nin Ekspresyonu

Özet

Bu çalışma, biyoinformatik ve qRT-PCR kullanarak küçük hücreli dışı akciğer kanserinde YTHDC2 ekspresyonunu değerlendirmektedir. Veritabanı analizleri downregülasyona ve prognostik öneme işaret ederken, klinik doğrulama anlamlı bir fark göstermemiştir. Bulgular, tutarsızlıkları vurgulayarak sınırlı tanısal doğruluğa işaret etmekte ve klinik uygulama öncesinde daha fazla doğrulamaya ihtiyaç olduğunu belirtmektedir.

Özet

Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK), erken tanı ve prognoz için mevcut biyobelirteçlerin sınırlı olmasıyla birlikte, dünya genelinde kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenlerinden biri olmaya devam etmektedir. N6-metiladenozin (m6A) RNA modifikasyonu ve YTHDC2 gibi okuyucu proteinleri, gen düzenlenmesinde ve tümör oluşumunda kritik roller oynamaktadır. Bu çalışma, biyoinformatik ve kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) kullanarak KHDAK dokularındaki YTHDC2 ekspresyon profilini değerlendirmeyi, YTHDC2 ile klinikopatolojik özellikler arasındaki ilişkiyi saptamayı ve gelecekteki araştırmalar için potansiyel klinik ve biyolojik önemini araştırmayı amaçlamaktadır. Prognostik doğruluk için veri tabanlarından elde edilen gen ekspresyonu ve sağkalım verileri analiz edilmiştir. Çinli bir klinik kohorttaki KHDAK dokularında YTHDC2 ekspresyonu kantifiye edilmiş ve klinikopatolojik özellikler analiz edilmiştir. Kamu veri tabanı analizleri, YTHDC2'nin KHDAK dokularında düşük eksprese olduğunu (p < 0.05) ve prognostik performansı düşük olmasına rağmen (AUC ≈ 0.5) hasta sağkalımı ile ilişkili olduğunu göstermiştir. 19 çift tümör ve komşu normal dokunun qRT-PCR analizi, kanserli ve komşu dokular arasında YTHDC2 ekspresyonunda istatistiksel olarak anlamlı bir fark (p = 0.537) olmadığını göstermiştir. Toplu olarak, kamu veri tabanı analizleri YTHDC2'nin KHDAK'da düşük eksprese olabileceğini ve potansiyel prognostik öneme sahip olabileceğini düşündürse de, kohortumuzdaki bağımsız klinik doğrulama anlamlı bir diferansiyel ekspresyonu onaylamamıştır. Bu bulgular, büyük ölçekli veri setleri ile gerçek dünya kohortları arasındaki önemli heterojenliği vurgulayarak, YTHDC2'nin tek başına güvenilir bir diyagnostik veya prognostik biyobelirteç olarak hizmet etme olasılığının düşük olduğunu ve klinik uygulanabilirlik için ek moleküler belirteçlerle entegrasyon gerektirebileceğini göstermektedir.

Giriş

Skuamöz hücreli karsinom ve adenokarsinomu kapsayan küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK), en sık teşhis edilen akciğer kanseri türüdür ve küresel kanser ölümlerinin önde gelen nedenlerinden biridir¹. Küresel kanser istatistikleri, akciğer kanserinin kansere bağlı ölümlerin temel nedenlerinden biri olduğunu göstermektedir². Teşhis, cerrahi, radyoterapi ve moleküler hedefli tedavideki son gelişmeler, KHDAK'nin prognozunu önemli ölçüde iyileştirmemiştir; çünkü ilk teşhis geç evrede konulmakta ve hastalık erken evrelerde genellikle asemptomatik seyretmektedir³. Bu durum, KHDAK hastalarında hastalığı tanımlamak, prognozunu belirlemek ve tedavi etkinliğini değerlendirmek için yeni biyobelirteçlere duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır.

m6A, ökaryotlarda tanımlanan ilk ve en bol bulunan RNA modifikasyonudur; RNA stabilitesi, translasyon ve transkripsiyon ile ilişkili olduğu bilinmektedir⁴. m6A modifikasyonları; metiltransferazlar (yazıcılar), demetilazlar (siliciler) ve spesifik bağlanma proteinleri (okuyucular) aracılığıyla gerçekleştirilen dinamik ve tersinir süreçlerdir⁵. Bunlar arasında, temel bir m6A okuyucu protein olan YTHDC2, RNA stabilitesini ve translasyon hızını modüle eder⁶. Güncel çalışmalar, YTHDC2'nin hücre büyümesini ve invazyonunu baskılayarak veya hücre ölümünü tetikleyerek birçok kanser türünün regülasyonunda rol oynadığını göstermektedir⁷. Çalışmalar ayrıca, YTHDF1, YTHDF2 ve YTHDC1 dahil olmak üzere diğer m6A okuyucu proteinlerin akciğer kanseri progresyonu, immün regülasyon ve prognoz üzerindeki klinik önemini vurgulamış; bu durum, bağımsız hasta kohortlarında bireysel m6A okuyucuların sistematik olarak değerlendirilmesinin önemini ortaya koymuştur^8,9,10. NSCLC'de YTHDC2 seviyeleri anlamlı derecede düşüktür ve bu durum yüksek tümör evreleri, lenf nodu metastazı ve hastalar için kötü prognoz ile ilişkilendirilmiş olup, YTHDC2'nin anti-tümör bir faktör olabileceğine işaret etmektedir¹¹. In vitro ve in vivo deneyler de YTHDC2'nin yüksek ekspresyonunun akciğer kanserinde hücre proliferasyonunu ve metastazını inhibe ettiğini ortaya koymaktadır⁷.

Bu çalışmada, NSCLC'de YTHDC2 regülasyonu, entegre hesaplamalı analizler ve qRT-PCR aracılığıyla deneysel doğrulama yoluyla incelenmiştir. YTHDC2 ekspresyonu ile klinikopatolojik özellikler ve hasta prognozu arasındaki ilişki de araştırılmıştır. Genel veri tabanlarından gelen ve NSCLC'de YTHDC2 disregülasyonuna işaret eden kanıtlar artsa da, yayınlanmış çalışmalar YTHDC2 disregülasyonunun büyüklüğü ve klinik önemi konusunda tutarsız bulgular rapor etmiştir ve özellikle Asya popülasyonlarında, iyi karakterize edilmiş gerçek dünya klinik kohortlarındaki bağımsız doğrulamalar sınırlı kalmıştır. Ayrıca, önceki çalışmaların çoğu ağırlıklı olarak genel transkriptomik veri setlerine veya deneysel modellere dayanmış, biyoinformatik bulguları bağımsız klinik doğrulama ile entegre eden çalışmalar nispeten az sayıda olmuştur. Büyük ölçekli genel transkriptomik analizleri, Çinli bir klinik kohorttaki bağımsız qRT-PCR doğrulamasıyla birleştirerek, bu çalışma önceki bulguların tekrarlanabilirliğini değerlendirmeyi ve genel veri tabanı analizleri ile gerçek dünya klinik örnekleri arasındaki translasyonel boşluğu gidermeyi amaçlamıştır. Bu nedenle, bu çalışma entegre biyoinformatik ve klinik doğrulama yaklaşımlarını kullanarak YTHDC2 ekspresyonunu sistematik olarak değerlendirmeyi ve NSCLC'deki potansiyel biyolojik ve klinik ilişkisini belirlemeyi hedeflemiştir. YTHDC2 ekspresyonunun NSCLC'de disregüle olduğu ve biyoinformatik analizlerin bağımsız klinik doğrulama ile entegre edilmesinin, tanısal ve prognostik önemi hakkında her iki yaklaşımdan tek başına daha güvenilir bir değerlendirme sağlayacağı hipotezi kurulmuştur.

Protokol

Çalışma, Hainan Tıp Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylanmış (onay numarası HMC1984.24) ve Helsinki Deklarasyonu (2013 revizyonu) ile uyumlu olarak yürütülmüştür.

Çalışma denekleri

Hainan Eyaleti'ndeki Sanya Merkez Hastanesi'nde 2017 ve 2024 yılları arasında teşhis konulmuş 50 akciğer kanseri hastası üzerinde, Çin Tıp Birliği'nin Akciğer Kanseri Tanı ve Tedavi Klinik Kılavuzları (2024 Baskısı) kullanılarak bir çalışma yürütülmüştür. Çalışmalar arası karşılaştırılabilirliği sağlamak amacıyla, Çin kohortlarında doğrulandığı üzere¹², CSCO evrelemesi (2024) AJCC 8. Baskı ile uyumlu hale getirilmiş ve tutarlılığı sağlamak için iki bağımsız onkolog tarafından incelenmiştir. Hasta seçim süreci, doku mevcudiyeti, RNA kalite değerlendirmesi ve qRT-PCR analizi için nihai örnek dahil etme işlemleri Şekil 1'de özetlenmiştir.

Çalışma verileri

Bu çalışmada, NSCLC'deki YTHDC2 ekspresyon seviyelerini ve bunların klinikopatolojik özelliklerle ilişkisini analiz etmek ve potansiyel mekanizmalara dair içgörüler sunmak için biyoinformatik yöntemler kullanılmıştır. Biyoinformatik analizler, münhasıran GDC Veri Portalı (https://portal.gdc.cancer.gov/) üzerinden indirilen; akciğer adenokarsinomu (LUAD), akciğer skuamöz hücreli karsinomu (LUSC) ve ilgili normal akciğer dokusu örneklerini içeren The Cancer Genome Atlas (TCGA) halka açık RNA sekanslama verileri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. İndirilen veri seti, uygun TCGA-LUAD ve TCGA-LUSC vakaları için RNA sekanslama ekspresyon verilerinin yanı sıra mevcut klinik değişkenleri (hasta kimliği, örnek kimliği, yaş, cinsiyet, patolojik evre, sağkalım durumu ve genel sağkalım süresi) içermektedir. Gen ekspresyonu veya sağkalım bilgisi eksik olan örnekler, sonraki sağkalım ve ROC analizlerinden hariç tutulmuştur. Bu çalışmada kullanılan veri seti Ek Dosya 1 olarak sunulmuştur. Biyoinformatik analizler için Sanya Central Hospital'da toplanan herhangi bir klinik örnek kullanılmamıştır. GEPIA, Kaplan–Meier Plotter ve survivalROC analizlerine ilişkin ayrıntılı prosedürler, aşağıdaki Biyoinformatik analiz bölümünde verilmiştir. Veri edinimi, ön işleme, gen ekspresyon analizi, sağkalım analizi ve ROC analizini içeren eksiksiz biyoinformatik iş akışı Şekil 2'de özetlenmiştir.

Dahil etme ve hariç tutma kriterleri

Hastaların dahil edilme ve hariç tutulma kriterleri Tablo 1'de sunulmuştur. İstatistiksel güç analizi yazılımı kullanılarak yapılan güç analizi, grup başına en az 26 vakanın orta düzeyde bir etki boyutunu (d = 0.8, α = 0.05, çift kuyruklu) saptamak için %80 güç sağlayacağını belirlemiştir. Başlangıçtaki kayıt hedefi akciğer kanseri grubu için 50 çift olsa da, doku veya RNA kalitesi nedeniyle yapılan elemelerden sonra nihai qRT-PCR analizine 30 tümör örneği ve 19 normal komşu doku örneği dahil edilmiştir. Örneklem sayısındaki bu azalma, gerçek dünyadaki klinik kısıtlamaları yansıtmakta ve translasyonel çalışmalarda RNA bütünlüğünün ve doku mevcudiyetinin önemini vurgulamaktadır. Karşılaştırmalar için n = 19 olduğunda, saptanabilir minimum etki boyutu d = 1.0'dir (%80 güç, α = 0.05). Bu nedenle deney, YTHDC2 ekspresyonundaki büyük farkları saptamak için yeterli güce sahipti ancak küçük ila orta düzeydeki farkları saptamak için yeterli değildi.

Doku örnekleri ve kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR)

Patolojik tanılar, iki farklı patolog tarafından çift kör yöntemle belirlenmiştir. Tümör saflığı patologlar tarafından tahmin edilmiş (>%70 malign hücre) ve ESTIMATE (TCGA) aracılığıyla doğrulanmıştır. Stromal kontaminasyonu en aza indirmek için bitişik normal dokular makrodiseksiyon ile ayrılmıştır. Akciğer kanserinin histolojik tipleri arasında akciğer adenokarsinomu ve skuamöz hücreli karsinom yer almış olup, 26 akciğer adenokarsinomu ve 4 skuamöz hücreli karsinom vakası bulunmaktadır. 50 akciğer kanseri hastasının klinik evrelemesi, “Chinese Medical Association Clinical Guidelines for Lung Cancer (2024 Edition)” kılavuzunda belirtilen evreleme kriterlerine göre yapılmıştır. Patolojik olarak doğrulanmış NSCLC örnekleri (n = 50), tipik klinik dağılımları temsil etmektedir (bakınız Tablo 2). Başlangıçta dahil edilen 50 hastadan 30 tümör doku örneği ve 19 eşleştirilmiş bitişik normal doku örneği RNA kalite kriterlerini karşılamıştır. Eşli istatistiksel analiz, aynı hastadan alınan eşleştirilmiş örnekler gerektirdiğinden, tümör ile bitişik normal doku ekspresyonunun karşılaştırılması mevcut 19 eşleştirilmiş çift kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu klinik örnekler yalnızca qRT-PCR ile deneysel doğrulama için kullanılmış ve biyoinformatik analizler için kullanılan halka açık TCGA veri setlerinden bağımsız olarak analiz edilmiştir. Seçilen bu örnekler, patolojik doğrulamadan hemen sonra işlenmiş ve RNA ekstraksiyonu öncesinde RNaz-free koşullar altında muhafaza edilmiştir. Bu alt küme, hem yeterli doku miktarının hem de yüksek kaliteli toplam RNA'nın (RNA bütünlük numarası, RIN >7.0) elde edilebildiği vakaları yansıtmaktadır. Ters transkripsiyon öncesinde toplam RNA konsantrasyonu ve saflığı ölçülmüş ve yalnızca yeterli RNA kalitesine (RIN >7.0) sahip örnekler sonraki analizlere dahil edilmiştir. Kantitatif PCR öncesinde, üretici protokolüne uygun olarak eşit miktarlarda toplam RNA, komplemanter DNA'ya (cDNA) ters transkribe edilmiştir. Bu işlem, analiz edilen gen ekspresyon verilerinin geçerliliğini sağlamıştır. qRT-PCR deneyleri, bir real-time PCR termosiklatöründe, prob tabanlı bir kantitatif PCR testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Analitik tekrarlanabilirliği sağlamak amacıyla tüm reaksiyonlar, şablon kontrol (no-template control) örnekleri ile birlikte üç tekrarlı (triplicate) olarak yürütülmüştür. PCR amplifikasyonu aşağıdaki döngü koşulları altında gerçekleştirilmiştir: 95°C'de 10 dk başlangıç enzim aktivasyonu/denatürasyon adımı, ardından 95°C'de 15 sn denatürasyon ve 60°C'de 60 sn tavlama/uzama şeklinde 40 döngü. Floresan sinyalleri her amplifikasyon döngüsünün sonunda alınmıştır. Tüm reaktifler ve sarf malzemeleri ticari tedarikçilerden temin edilmiştir (bakınız Malzemeler Tablosu). qRT-PCR'da kullanılan primer ve prob dizileri Tablo 3'te sunulmuştur.

Biyoenformatik analiz

YTHDC2 gen ekspresyonunun GEPIA veri tabanı analizi

NSCLC'de YTHDC2 ekspresyonunu analiz etmek için GEPIA veri tabanı kullanıldı. GEPIA web sunucusuna (http://gepia.cancer-pku.cn/) bir web tarayıcısı aracılığıyla erişildi. Expression DIY modülü seçildi, "YTHDC2" gen sembolü girildi, LUAD ve LUSC veri setleri seçildi, varsayılan normalizasyon parametreleri korundu ve diferansiyel ekspresyon kutu grafikleri doğrudan GEPIA arayüzü üzerinden oluşturuldu. İstatistiksel anlamlılık p < 0.05 olarak tanımlandı.

Akciğer kanseri hastalarının sağkalım analizi için Kaplan-Meier plotter veri tabanı

Çalışmada, Kaplan-Meier Plotter veri tabanı kullanılarak akciğer kanseri hastalarında YTHDC2 ekspresyonu ile prognoz arasındaki ilişki analiz edilmiştir. Akciğer kanseri veri seti seçilmiş, "YTHDC2" gen sembolü girilmiş, otomatik seçilen en iyi eşik değeri (best cutoff) seçeneği uygulanmış ve varsayılan analiz ayarları kullanılarak genel sağkalım ile progresyon sonrası sağkalım için Kaplan-Meier eğrileri oluşturulmuştur. Hastalar, Kaplan-Meier Plotter platformu tarafından belirlenen optimal eşik değeri kullanılarak otomatik olarak yüksek ve düşük ekspresyon gruplarına ayrılmış ve platformun varsayılan ayarları kullanılarak karşılık gelen %95 güven aralıklarıyla birlikte hazard oranları hesaplanmıştır.

ROC eğrisi çizimi için R yazılımında R paketlerinin çalıştırılması

Uygun TCGA-LUAD ve TCGA-LUSC vakaları için RNA sekanslama ekspresyon verileri ve bunlara karşılık gelen klinik metadata GDC Veri Portalı'ndan indirilmiştir. İndirilen veri setleri hasta tanımlayıcılarına göre birleştirilmiş ve sonraki analizler için R ortamına aktarılmıştır. 1, 3 ve 5 yıllık öngörü zaman noktalarında zamana bağlı ROC eğrileri oluşturmak için survivalROC paketi kullanılmış ve YTHDC2 ekspresyonunun prognostik performansını değerlendirmek için ilgili eğri altındaki alan (AUC) değerleri hesaplanmıştır. Sağkalım ROC analizine yalnızca RNA-seq ekspresyon ve sağkalım bilgileri mevcut olan TCGA-LUAD ve TCGA-LUSC hastaları dahil edilmiştir. Uzun süreli takip verileri mevcut olmadığı için yerel klinik kohort sağkalım öngörüsü için kullanılmamıştır.

qRT-PCR ile doku YTHDC2 ekspresyonu

Gen ekspresyon seviyelerini analiz etmek için qRT-PCR gerçekleştirildi. Üreticinin önerdiği reaksiyon koşullarına göre her reaksiyona eşit hacimlerde cDNA eklendi. Amplifikasyon, prob tabanlı bir kantitatif PCR analizi kullanılarak gerçekleştirildi ve floresan verileri her amplifikasyon döngüsünün sonunda otomatik olarak toplandı. Kısaca RNA ekstraksiyon süreci; numune hazırlama, deparafinizasyon, kalıntı sıvının uzaklaştırılması, proteinaz K sindirimi, inkübasyon, santrifüj, DNaz işlemi, DNaz I eklenmesi ve etanol çöktürmesi dahil olmak üzere birkaç adımdan oluştu. Numune daha sonra silika tabanlı bir RNA saflaştırma kolonuna bağlandı ve 8.000 × g hızda 30 s boyunca santrifüj edildi. Kolon daha sonra yıkama tamponu 1, yıkama tamponu 2 ve etanol ile seyreltilmiş yıkama tamponu 2 ile yıkandı ve 13.000 × g hızda 2 dk boyunca kurutuldu. Ardından, kolon membranının merkezine 70 µL RNase-Free Water eklenerek ve ardından 13.000 × g hızda 1 dk santrifüj edilerek RNA elüe edildi. Her primer çifti, bağıl gen ekspresyonu hesaplanmadan önce erime eğrisi analizi ile doğrulanan tek bir amplifikasyon ürünü sergiledi. Primer verimliliği (%90–110), numune analizinden önce standart eğriler kullanılarak doğrulandı. Erime eğrisi analizleri, tekil amplikonların varlığını ve primer dimerlerinin yokluğunu onayladı. Bağıl YTHDC2 ekspresyonu, Ct değerlerinin endojen referans gen GAPDH'ye normalize edildiği 2^-ΔCt yöntemi kullanılarak hesaplandı. Ekspresyon değerleri, bir kalibratör numuneye göre kat değişimleri yerine normalize edilmiş ekspresyon seviyeleri olarak sunulduğu için sonuçlar 2^−ΔCt değerleri olarak rapor edilmiştir. GAPDH, m6A çalışmalarındaki referans gen seçim kriterleriyle uyumlu olarak, test edilen alternatiflere (ACTB, CV = %12; 18S rRNA, CV = %18) kıyasla ekspresyonu minimum değişkenlik (CV < %5) gösterdiği için housekeeping gen olarak seçilmiştir.

İstatistiksel analiz

Grafik ve şemaların oluşturulması da dahil olmak üzere istatistiksel analizler, istatistiksel yazılımlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. NSCLC hastalarında YTHDC2 gen ekspresyonuna ilişkin nicel ve kategorik verileri analiz etmek için biyoinformatik analizler ve ROC eğrisi oluşturma aşamalarında R yazılımı kullanılmıştır. Sağkalımı öngörmede YTHDC2 ekspresyonunun tanısal performansını değerlendirmek için ROC eğrileri ve AUC kullanılmıştır. Regresyon tabanlı analizler için, uygun olan yerlerde ilgili %95 güven aralıklarıyla birlikte etki tahminleri (odds oranları) raporlanmıştır. Eşleşmiş tümör ve komşu normal doku örnekleri arasındaki YTHDC2 ekspresyonunu karşılaştırmak için Wilcoxon işaretli sıra testi kullanılırken, YTHDC2 ekspresyonu ile klinikopatolojik özellikler arasındaki ilişkiyi değerlendirmek için Pearson korelasyon analizi kullanılmıştır. Korelasyon katsayıları (r) ve ilgili p-değerleri raporlanmıştır. qRT-PCR verileri aynı hastalardan alınan eşleşmiş tümör ve komşu normal doku örneklerinden oluştuğu ve gen ekspresyon verileri normal dağılmadığı için, eşleşmiş dokular arasındaki YTHDC2 ekspresyon seviyelerini karşılaştırmak amacıyla Wilcoxon işaretli sıra testi kullanılmıştır. Bu test, verilerin normalliğini varsaymaz ve çarpık biyolojik veriler için yaygın olarak kullanılır. Tüm istatistiksel testler çift yönlüdür ve p <0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Sürekli değişkenler analizden önce normallik açısından değerlendirilmiştir. Sürekli değişkenler, uygun şekilde ortalama ± standart sapma veya medyan (çeyrekler arası aralık) olarak sunulmuştur.

Sonuçlar

TCGA veri tabanına göre tümörlerde YTHDC2 geninin ekspresyonu

Şekil 3, TCGA veri tabanındaki GDC aracı kullanılarak farklı kanser türlerinde YTHDC2 ekspresyon seviyelerinin incelenmesi yoluyla, NSCLC ile YTHDC2 arasındaki ilişkiyi göstermektedir.

GEPIA veri tabanında NSCLC'de YTHDC2 geninin ekspresyonu

GEPIA veri tabanındaki akciğer adenokarsinomu (LUAD) ve akciğer skuamöz hücreli karsinomu (LUSC) içindeki YTHDC2 ekspresyon seviyelerinin ek taramasıyla 483 akciğer adenokarsinomu doku örneği, 347 normal akciğer doku örneği, 486 akciğer skuamöz hücreli karsinomu doku örneği ve 338 normal akciğer doku örneği elde edilmiştir. İstatistiksel analizler sonucunda, Şekil 4'te gösterildiği üzere, hem akciğer adenokarsinomu hem de akciğer skuamöz hücreli karsinomu dokularının normal akciğer dokularına göre önemli ölçüde daha düşük YTHDC2 ekspresyon seviyeleri sergilediği saptanmıştır (p < 0.05).

YTHDC2 ekspresyonunun patolojik evreler genelinde GEPIA analizi

NSCLC evreleri boyunca YTHDC2 diferansiyel ekspresyonunu değerlendirmek için bir evre grafiği oluşturmak amacıyla GEPIA (Gene Expression Profiling Interactive Analysis) veri tabanı kullanılmıştır. Şekil 5'te gösterildiği üzere, NSCLC'nin patolojik evreleri arasında YTHDC2 ekspresyonunda istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlemlenmemiştir (p = 0.644).

YTHDC2 ve akciğer kanseri sağkalımının Kaplan-Meier analizi

YTHDC2 geninin Kaplan-Meier sağkalım analizini gerçekleştirmek için Kaplan-Meier Plotter veri tabanı kullanılmıştır. Bulgulara göre, yüksek YTHDC2 ekspresyonuna sahip hastalar, düşük ekspresyona sahip olanlara göre anlamlı derecede daha yüksek genel sağkalım (OS) göstermiştir (p < 0.05). Şekil 6A'da (OS) görüldüğü üzere, daha yüksek düzeylerde YTHDC2 eksprese eden akciğer kanserli hastalar daha iyi bir prognoza sahip olmuştur ve bu fark istatistiksel olarak anlamlıdır (p < 0.05). Şekil 6B'ye (PPS) göre, Progresyon Sonrası Sağkalım (PPS) veri setinde yüksek YTHDC2 ekspresyonu olan grup, düşük ekspresyon olan gruba göre daha iyi bir prognoz sergilemiştir; aradaki fark istatistiksel olarak anlamlıdır (p < 0.05).

YTHDC2 sağkalım oranı tahmin modeli

TCGA RNA-seq ekspresyon ve sağkalım verilerine dayalı zamana bağlı ROC analizi, NSCLC sağkalımı için tek başına YTHDC2 ekspresyonunun sınırlı öngörü yeteneğine sahip olduğunu ortaya koymuştur; 1, 3, 5 ve 8. yıllarda AUC değerleri sırasıyla 0.50 (%95 GA: 0.38-0.62), 0.51 (%95 GA: 0.39-0.63), 0.52 (%95 GA: 0.40-0.64) ve 0.52 (%95 GA: 0.39–0.65) olarak belirlenmiştir (Şekil 7). Tüm AUC güven aralıkları 0.5 değerini içermekte olup, bu durum rastgele şansa eşdeğer bir performansa işaret etmektedir. Bu bulgular, tek başına YTHDC2 ekspresyonunun sağkalım tahmini için ayırt edici güçten yoksun olduğunu ve tek başına bir prognostik biyobelirteç olarak değerlendirilmemesi gerektiğini göstermektedir. Klinikopatolojik değişkenler veya çoklu gen imzaları ile entegrasyon, öngörü performansını artırabilir.

qRT-PCR ile kanserli ve normal dokularda YTHDC2 ekspresyonu

NSCLC hastalarından alınan hem malign hem de komşu normal dokularda YTHDC2 gen ekspresyonu qRT-PCR kullanılarak incelenmiştir. Normalize edilmiş YTHDC2 ekspresyonu (2^−ΔCt), malign dokularda 3,24 ± 2,34 ve yakın normal dokularda 3,60 ± 1,70 olarak bulunmuştur. Şekil 8'te gösterildiği üzere, 19 eşleşmiş NSCLC tümör dokusu ile bunlara karşılık gelen komşu normal dokular arasında YTHDC2 ekspresyonu açısından anlamlı bir fark saptanmamıştır (p = 0,537). Büyük veri setlerinin biyoinformatik analizleri NSCLC'de YTHDC2'nin anlamlı derecede downregüle olduğunu öne sürse de, bizim kohortumuzdaki qRT-PCR sonuçları anlamlı bir fark göstermemiş; bu durum kohort büyüklüğü, örnek heterojenliği ve teknik değişkenlikten kaynaklanan potansiyel tutarsızlıkları vurgulamıştır. Ek olarak, düşük AUC (0,5) değeri, YTHDC2'nin tek başına diagnostik veya prognostik doğruluktan yoksun olduğunu göstermektedir.

NSCLC'de YTHDC2 ekspresyonu ve klinik patolojik özellikler

Bu çalışma, NSCLC tanılı 50 bireyi kapsamıştır. Ortalama yaş 63,10 ± 9,85 yıl olmak üzere, 32 erkek hasta (%64,00) ve 18 kadın hasta (%36,00) yer almıştır. Yaş aralığı 37 ile 86 arasındadır. Hastaların 25'i geçmişte sigara içmiş, 25'i ise hiç sigara içmemiştir. Patolojik tipler arasında dokuz skuamöz hücreli karsinom (%18,00) ve kırk bir akciğer adenokarsinomu (%82,0) vakası bulunmuştur. CSCO klinik evrelemesine göre 22 hasta evre III–IV (%44,00) ve 28 hasta evre I–II (%56,00) aşamasındaydı. Yirmi dört hastada lenf nodu metastazı görülmezken, yirmi altı bireyde (%54,00) görülmüştür. Dokuz hastada kötü diferansiye kanserler (%18,00), 41 hastada ise iyi ila orta derecede diferansiye tümörler (%82,00) saptanmıştır.

NSCLC dokularındaki klinik patolojik özellikler ile YTHDC2 ekspresyon seviyeleri arasındaki ilişke incelenmiştir. Patolojik alt tipler arasında ve lenf nodu metastaz durumuna göre YTHDC2 ekspresyonunda farklılıklar gözlemlenmiştir (p < 0.05). Ancak, yalnızca dört skuamöz hücreli karsinom örneği mevcut olduğundan, patolojik alt tip karşılaştırması ihtiyatla yorumlanmalı ve keşifsel olarak değerlendirilmelidir. Şekil 9A,B'de gösterildiği gibi, YTHDC2 ekspresyonu skuamöz hücreli karsinomda akciğer adenokarsinomuna göre anlamlı derecede daha yüksek bulunmuş ve lenf nodu metastazı olan NSCLC dokularında, metastazı olmayanlara göre anlamlı derecede daha yüksek çıkmıştır (5.70 ± 2.53'e karşı 3.83 ± 0.91, p = 0.027). Bununla birlikte, sadece dört skuamöz hücreli karsinom örneği dahil edildiği için, patolojik alt tipler arasındaki karşılaştırma dikkatle yorumlanmalı ve daha büyük kohortlarda doğrulanana kadar keşifsel olarak değerlendirilmelidir. Lenf nodu metastazı olan hastalarda daha yüksek YTHDC2 ekspresyonu, YTHDC2 ile lenf nodu metastaz durumu arasında potansiyel bir ilişki olabileceğine işaret edebilir; ancak bu bulgu, sınırlı örneklem boyutu nedeniyle ihtiyatla yorumlanmalı ve daha büyük bağımsız kohortlarda doğrulanmalıdır. Öte yandan; yaş, sigara öyküsü, CSCO klinik evresi ve histolojik diferansiyasyon YTHDC2 ekspresyonunu anlamlı şekilde etkilememiştir (p > 0.05). Ek bilgiler Tablo 4, Tablo 5 ve Şekil 9'da yer almaktadır.

NSCLC'de lenf nodu metastazının binom lojistik regresyon analizi

Korelasyon analiziyle uyumlu olarak, YTHDC2 ekspresyonu lenf nodu metastazı ile anlamlı düzeyde ilişkili bulunmuştur (p < 0.05). Bağımlı değişken olarak lenf nodu metastazı; bağımsız değişkenler olarak ise yaş, cinsiyet, sigara öyküsü, tümör evresi, patolojik tip, YTHDC2 ekspresyon düzeyi ve diferansiyasyon derecesi kullanılarak, NSCLC hastalarında binary lojistik regresyon analizi gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar, NSCLC hastalarındaki YTHDC2 ekspresyonunun lenf nodu metastazı ile anlamlı düzeyde ilişkili olduğunu göstermiştir (p = 0.027, OR = 2.286, 95% CI: 1.101–4.748).

Genel klinik verilerde, KHNSK hastalarının tümör evresi ile lenf nodu metastazı arasında istatistiksel olarak anlamlı bir korelasyon saptanmıştır (p = 0.007, OR = 27, 95% CI: 2.504-291.186). Ancak, Tablo 6'da gösterildiği üzere yaş, cinsiyet, sigara öyküsü, patolojik tip ve diferansiyasyon derecesinin KHNSK'da lenf nodu metastazı ile anlamlı bir korelasyonu bulunmamıştır (p > 0.05).

Veri Kullanılabilirliği: Bu çalışmanın bulgularını destekleyen veri setleri Zenodo deposunda (DOI: 10.5281/zenodo.21409961) mevcuttur. Depo; biyoinformatik analizler için kullanılan TCGA klinik meta verilerini, örnek açıklamalarını, veri erişim spesifikasyonlarını ve analiz manifestosunu içermektedir. Ek veriler, makul talep üzerine sorumlu yazardan temin edilebilir.

Şekil 1: qRT-PCR analizi için hasta seçimi ve doku dahil etme sürecine ait akış şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. NSCLC'de YTHDC2 ekspresyonunu ve prognostik önemini değerlendirmek için gerçekleştirilen biyoinformatik analizlerin iş akışı Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: TCGA Veri Tabanında YTHDC2 Geninin Ekspresyonu. Akciğer adenokarsinomu (LUAD) ve akciğer skuamöz hücreli karsinomundaki (LUSC) YTHDC2 ekspresyon seviyeleri, Genomic Data Commons (GDC) Veri Portalı aracılığıyla The Cancer Genome Atlas'tan (TCGA) elde edilen RNA sekanslama verileri kullanılarak normal akciğer dokularındakilerle karşılaştırılmış ve GEPIA web platformu kullanılarak analiz edilmiştir. Veriler GEPIA platformu üzerinden analiz edilmiştir. İstatistiksel anlamlılık p-değeri < 0.05 olarak belirlenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: GEPIA veri tabanı analizine göre NSCLC'de YTHDC2'nin diferansiyel ekspresyonu. Akciğer adenokarsinomu (LUAD) ve akciğer skuamöz hücreli karsinomundaki (LUSC) YTHDC2 ekspresyon seviyeleri, GEPIA platformu aracılığıyla The Cancer Genome Atlas (TCGA) ve Genotype-Tissue Expression (GTEx) projelerinden alınan veriler kullanılarak normal akciğer dokularındakilerle karşılaştırılmıştır. Kutu grafikleri normalize edilmiş gen ekspresyon seviyelerini temsil etmektedir. İstatistiksel anlamlılık p-value < 0.05 ile belirlenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: GEPIA veri tabanı kullanılarak NSCLC'de YTHDC2'nin evre bazlı ekspresyon analizi. YTHDC2 ekspresyon seviyeleri, GEPIA platformu kullanılarak NSCLC'nin farklı patolojik evrelerinde (I–IV) analiz edilmiştir. Evre grafiği, tümör evreleri arasındaki gen ekspresyonundaki varyasyonu göstermektedir. Evreler arasında YTHDC2 ekspresyonunda istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlemlenmemiştir (p = 0.644). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6: NSCLC hastalarında YTHDC2 ekspresyonunun Kaplan–Meier sağkalım analizi (Kaplan–Meier Plotter). (A) Genel sağkalım (OS): Kaplan–Meier Plotter aracı tarafından sağlanan optimal kesme noktası ayarı (“auto-select best cutoff”) kullanılarak, yüksek (n = 140) ve düşük (n = 364) YTHDC2 ekspresyon gruplarına ayrılmış NSCLC hastalarındaki genel sağkalımı karşılaştıran Kaplan–Meier sağkalım eğrileri. İstatistiksel anlamlılığı değerlendirmek için log-rank testi kullanılmıştır (p = 0.0093); risk oranı (HR) = 0.61; %95 güven aralığı (CI): 0.42–0.89. Artmış YTHDC2 ekspresyonu, anlamlı derecede daha iyi genel sağkalım ile ilişkilidir. (B) Progresyon sonrası sağkalım (PPS): Kaplan–Meier Plotter aracı tarafından sağlanan optimal kesme noktası ayarı (“auto-select best cutoff”) kullanılarak, yüksek (n = 181) ve düşük (n = 296) YTHDC2 ekspresyon gruplarına ayrılmış NSCLC hastalarındaki progresyon sonrası sağkalımı karşılaştıran Kaplan–Meier sağkalım eğrileri. İstatistiksel karşılaştırma için log-rank testi kullanılmıştır (p = 4.2 × 10⁻⁵); risk oranı (HR) = 0.63 (%95 güven aralığı: 0.51–0.79). Yüksek YTHDC2 ekspresyonu, anlamlı derecede daha uzun progresyon sonrası sağkalım ile ilişkilidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7: YTHDC2 sağkalım oranı tahmin modeli. RNA-seq ekspresyon ve sağkalım verileri mevcut olan TCGA-LUAD ve TCGA-LUSC hastalarında, 1, 3, 5 ve 8 yıllık zaman noktalarında YTHDC2'nin genel sağkalım için tahmin doğruluğunu değerlendiren alıcı işletim karakteristiği (ROC) eğrileri. AUC değerleri: 1 yıl = 0,50, 3 yıl = 0,51, 5 yıl = 0,52 ve 8 yıl = 0,52. Kesikli diyagonal çizgi rastgele şansı (AUC = 0,5) göstermektedir. Analiz, R'deki survival ROC paketi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: qRT-PCR ile ölçülen eşleşmiş NSCLC tümör ve komşu normal dokulardaki YTHDC2 ekspresyonu. Göreceli YTHDC2 ekspresyonu 2^–ΔCt yöntemi kullanılarak hesaplanmış ve GAPDH'ye göre normalize edilmiştir. Ekspresyon değerleri, bir kalibratör örneğe göre kat değişimlerinden ziyade normalize edilmiş ekspresyon seviyelerini temsil etmektedir. İstatistiksel analiz, eşleşmiş karşılaştırma için mevcut olan 19 eşleşmiş tümör-komşu normal doku çifti kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Veriler, ortalama ± standart sapma ile birlikte bireysel eşleşmiş gözlemler olarak sunulmuştur. Eşleşmiş örnekler arasındaki farklar Wilcoxon işaretli sıra testi ile analiz edilmiştir (p = 0.537). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: NSCLC hastalarında YTHDC2 ekspresyonu ile klinikopatolojik özellikler arasındaki ilişki. (A) Farklı patolojik tiplerde YTHDC2 ekspresyonu; skuamöz hücreli karsinomda adenokarsinoma göre daha yüksek ekspresyon görülmektedir (p < 0.05). (B) Lenf nodu metastaz durumuna göre YTHDC2 ekspresyonu; lenf nodu metastazı olan hastalarda metastazı olmayanlara göre daha yüksek ekspresyon saptanmıştır (p < 0.05). (C) Farklı histolojik diferansiyasyon derecelerinde YTHDC2 ekspresyonu; istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktur (p = 0.181). (D) CSCO klinik evrelerine göre YTHDC2 ekspresyonu; istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktur (p = 0.08). YTHDC2 ekspresyon seviyeleri kantitatif real-time PCR (qRT-PCR) ile ölçülmüş ve GAPDH'ye normalize edilerek 2^–ΔCt yöntemi kullanılarak hesaplanmıştır. Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulmuştur. İstatistiksel karşılaştırmalar Wilcoxon sıra toplamı testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. *p < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Sıra No.	Dahil edilme kriterleri	Dışlama kriterleri
1	Cinsiyetten bağımsız olarak 18 yaş ve üzeri.	Diğer malignitelerin teşhisi.
2	Çin Tıbbi Birliği Akciğer Kanseri Klinik Kılavuzları'na (2024 Basımı) göre doğrulanmış KHDAK tanısı.	Kronik solunum veya kardiyovasküler hastalıkların varlığı (örneğin KOAH, pulmoner kalp hastalığı, kalp yetmezliği).
3	İmzalı bilgilendirilmiş onamla birlikte; demografik detaylar, serum tümör belirteçleri ve kontrastlı göğüs BT görüntülemesini içeren eksiksiz klinik verilerin mevcudiyeti.	renal yetmezlik (eGFR) dahil olmak üzere şiddetli organ disfonksiyonu <30 ml/dk/1,73m²²) veya karaciğer sirozu.
4	Daha önce tümöre yönelik tedavi almamış, tedaviye naiîf hastalar.	Gebe veya emziren kadınlar dahil olmak üzere özel popülasyonlar (şu şekilde doğrulanmış: β-uygun olan durumlarda hCG testi).
5	Moleküler analiz için uygun olan yeterli tümör ve/veya komşu doku örneklerinin mevcudiyeti.	Yetersiz doku veya bozunmuş RNA (patolog incelemesi ile doğrulanmış) dahil olmak üzere düşük numune kalitesi.

Tablo 1: Çalışmadaki NSCLC hastaları için dahil etme ve dışlama kriterleri

Doku tipi	Analiz edilen eşleştirilmiş örnekler (n)	Bağıl ekspresyon (Ortalama ± SD)
Tümör dokusu	19	3.24 ± 2.34
Eşleşmiş bitişik normal doku	19	3.60 ± 1.70

Tablo 2: Eşleştirilmiş NSCLC Tümör ve Komşu Normal Dokularda YTHDC2 Ekspresyonu. YTHDC2'nin bağıl ekspresyonu 2^–ΔCt yöntemi kullanılarak ölçülmüş ve GAPDH'ye göre normalize edilmiştir. Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulmuştur. 19 eşleşmiş tümör–komşu normal doku çiftinin istatistiksel karşılaştırması Wilcoxon işaretli sıra testi ile yapılmıştır (p = 0.537).

Hedef gen	Primer/Prob	Dizilim (5′→3′)
YTHDC2	İleri (F)	CCTGTCACCAATAAAGAGCG
	Geri (R)	CACTGGAATCTGAGGTATGCC
	Prob (P)	AGCAAGACAAGTGGGCGACTCAA
GAPDH	İleri (F)	AATCCCATCACCATCTTCCAG
	Geri (R)	ATGACCCTTTTGGCTCCC
	Prob (P)	CCAGCATCGCCCCACTTGATTTT

Tablo 3: Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) için kullanılan primer ve prob dizileri. YTHDC2 ekspresyonu, internal kontrol olarak GAPDH kullanılarak TaqMan kimyası ile kantifiye edilmiştir.

Karakteristik	Kategori	n	%
Patolojik tip	Adenokarsinom	41	82
	Yassı hücreli karsinom	9	18
CSCO evrelemesi	I–II	28	56
	III–IV	22	44
Lenf nodu metastazı	Hayır	24	48
	Evet	26	52
Diferansiyasyon derecesi	Düşük diferansiyasyon	9	18
	Orta–yüksek diferansiyasyon	41	82
Yaş	≥60 yaş	36	72
	<60 yıl	14	28
Cinsiyet	Erkek	32	64
	Dişi	18	36
Sigara öyküsü	Evet	25	50
	Hayır	25	50

Tablo 4: KHDAK hastalarının klinik ve patolojik özellikleri. Veriler, toplam çalışma popülasyonuna (n = 50) dayalı olarak sayılar (n) ve yüzdeler (%) şeklinde sunulmuştur.

Klinikopatolojik özellik	Grup	n	YTHDC2 ekspresyonu (Ortalama ± SD)	p-değeri
Doku tipi	Tümör	30	3.24 ± 2.34	0.537
	Bitişik normal	19	3.60 ± 1.70
Patolojik tip	Adenokarsinom	26	4.13 ± 1.29	0.022*
	Yassı hücreli karsinom	4	7.50 ± 3.41
CSCO evrelemesi	I–II	22	4.29 ± 1.94	0.08
	III–IV	8	5.05 ± 1.51
Lenf nodu metastazı	Hayır	19	3.83 ± 0.91	0.027*
	Evet	11	5.70 ± 2.53
Histolojik diferansiyasyon	Orta-iyi diferansiye	25	4.33 ± 1.90	0.181
	Kötü diferansiye	5	5.18 ± 1.60
Yaş	≥60 yaş	20	4.62 ± 2.10	0.835
	<60 yıl	10	4.16 ± 1.12
Sigara öyküsü	Lütfen çevirmemi istediğiniz metni paylaşın.	12	4.62 ± 2.40	0.845
	Hayır	18	4.38 ± 1.40

Tablo 5: NSCLC hastalarında YTHDC2 ekspresyonu ile klinikopatolojik özellikler arasındaki ilişki. YTHDC2 ekspresyonu qRT-PCR ile ölçülmüş ve GAPDH'ye normalize edilerek 2^–ΔCt yöntemi kullanılarak hesaplanmıştır. Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulmuştur. Grup boyutları (n), analiz edilen geçerli örnek sayısını temsil etmektedir. Gruplar arasındaki istatistiksel karşılaştırmalar Wilcoxon sıralama toplamı testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. *p < 0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.

Değişken	β	Wald	p-değeri	OR	%95 GA
Yaş (≥60 vs <60)	0.07	0.01	0.93	1.08	0.20–5.68
Cinsiyet (Kadın vs Erkek)	0.53	0.4	0.525	1.7	0.33–8.67
Sigara Öyküsü (Evet vs Hayır)	0.54	0.46	0.496	1.71	0.36–8.09
Tümör Evresi (III–IV vs I–II)	3.3	7.38	0.007*	27	2.50–291.18
Diferansiyasyon (Kötü vs Orta–iyi)	–1.29	1.62	0.204	0.28	0.04–2.02
YTHDC2 Ekspresyonu	0.83	4.91	0.027*	2.29	1.10–4.75

Tablo 6: NSCLC hastalarında lenf nodu metastazı ile ilişkili faktörlerin çok değişkenli lojistik regresyon analizi. Lenf nodu metastazı bağımlı değişken olarak kullanılarak ikili lojistik regresyon gerçekleştirilmiştir. %95 güven aralıkları (CI) ile birlikte odds oranları (ORs) bildirilmiştir. Referans kategoriler: yaş (<60 yıl), cinsiyet (erkek), sigara öyküsü (yok), tümör evresi (I–II) ve diferansiyasyon (orta–iyi). *p < 0,05 istatistiksel anlamlılığı belirtir.

Tartışma

YTH ailesindeki en büyük N6-metiladenozin (m6A) bağlayıcı protein olan YTHDC2, ATP'ye bağımlı RNA helikaz aktivitesi ile benzersizdir ve bu özelliği onu RNA metabolizmasının temel bir düzenleyicisi olarak ayırır¹³. Diğer YTH ailesi üyelerinin aksine, YTHDC2 hem çekirdekte hem de sitoplazmada bulunur ve burada mRNA translasyonunu ve RNA stabilitesini düzenler¹⁴. Önceki deneysel çalışmalar, YTHDC2'nin ADIRF ve MRPL12 mRNA ekspresyonunu inhibe ederek, apoptozu artırarak ve hücre proliferasyonu ile metastazı azaltarak akciğer adenokarsinomu (LUAD) progresyonunu baskıladığını göstermiştir^15,16. Yine önceki deneysel çalışmalar, YTHDC2'nin LUAD proliferasyonunu baskılamak için ZNRD1-AS1 gibi lncRNA'ları stabilize ettiğini; CYLD ve SLC7A11 gibi m6A-modifiye mRNA'ları modüle ederek NF-κB sinyal yolunu, sistein alımını ve antioksidan süreçleri inhibe ederken, ferroptozu ve anti-kanser aktiviteyi teşvik ettiğini öne sürmüştür^17,18.

Bu çalışmada, NSCLC'de m6A okuyucu protein YTHDC2'nin ekspresyonu ve klinik önemi, biyoinformatik analizler ve deneysel doğrulamanın birleştirildiği entegratif bir yaklaşımla incelenmiştir. TCGA ve GEPIA veri tabanlarının bu biyoinformatik analizi, NSCLC tümör dokularında normal akciğer dokularına kıyasla YTHDC2'nin anlamlı düzeyde aşağı regüle olduğunu ortaya koymuş ve daha yüksek YTHDC2 ekspresyonu, iyileşmiş genel ve progresyon sonrası sağkalım ile ilişkilendirilerek potansiyel bir prognostik role işaret etmiştir. İlginç bir şekilde, mevcut kohorttaki mevcut 19 eşleştirilmiş tümör ve komşu normal doku örneği kullanılarak yapılan qRT-PCR deneylerimiz, tümör ve komşu normal dokular arasında YTHDC2 ekspresyonunda istatistiksel olarak anlamlı bir fark göstermemiştir. Bu uyumsuzluk, büyük ölçekli kamu veri setlerinden elde edilen bulguların bağımsız klinik kohortlara aktarılmasındaki zorlukları vurgulamakta ve in silico analizlerin dikkatli yorumlanması gerekliliğinin altını çizmektedir. Bu farklılıkların ardındaki nedenlerin anlaşılması, YTHDC2'nin NSCLC'de bir biyobelirteç ve terapötik hedef olarak faydasının doğru bir şekilde değerlendirilmesi açısından kritiktir. Mevcut çalışmanın YTHDC2'ye odaklanması, YTH okuyucuları arasındaki benzersiz helikaz aktivitesi ile uyumludur¹⁹, ancak güncel pan-kanser analizleri diğer aile üyeleri için bağlama bağlı roller olduğunu ortaya koymaktadır. Örneğin, Li ve ark., YTHDF1/2'nin çoğu kanserde (örneğin, LIHC, LUAD) yukarı regüle olduğunu ve kötü prognoz ile korelasyon gösterdiğini, YTHDC1/2'nin ise KIRC ve BRCA'da tümör baskılayıcı etkiler gösterdiğini kanıtlamıştır²⁰. Özellikle, YTHDF1'in Wnt/β-catenin aktivasyonu yoluyla onkojenik rolü, YTHDC2'nin NSCLC'deki anti-metastatik fonksiyonu ile tezat oluşturmakta ve alt tipe özgü biyobelirteç stratejilerine olan ihtiyacı vurgulamaktadır. Yerleşik prognostik belirteçlerle (örneğin, immünoterapi yanıtı için PD-L1) karşılaştırıldığında, pan-kanser immün infiltrasyon analizlerinin önerdiği üzere, YTHDC2'nin öngörücü gücü diğer m6A regülatörleri (örneğin, METTL3, YTHDF1) veya immün kontrol noktası genleri ile birleştirilerek artırılabilir. Önceki çalışmalar YTHDC2'nin NF-κB/CYLD yolunu regüle ettiğini öne sürse de¹², mevcut çalışma immünohistokimya veya Western blotting kullanılarak yapılan protein düzeyinde doğrulamanın yanı sıra fonksiyonel doğrulamanın yokluğu nedeniyle sınırlı kalmıştır. Gelecekteki çalışmalar, doğrudan hedefleri haritalamak için nakavt (knockdown) analizlerini m6A-sekanslama ile birleştirmelidir.

Önceki analizler, YTHDC2 ekspresyonunun NSCLC dokularında azaldığını ve kötü prognoz ile ilişkili olduğunu ortaya koymuştur²¹. Kaplan-Meier analizi, YTHDC2 ekspresyonu daha yüksek olan hastalarda daha uzun sağkalım olduğunu göstermiş, ancak ROC eğrisi analizi sağkalım için sınırlı öngörü gücüye işaret etmiştir²⁰. Mevcut çalışmadaki sağkalım ROC analizi, yerel klinik kohortumuz için uzun süreli takip bilgileri mevcut olmadığından, TCGA RNA-seq ekspresyon ve sağkalım verileri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Önemli bir nokta olarak, bu çalışmada gözlemlenen düşük AUC değerleri (~0.5), YTHDC2 ekspresyonunun tek başına bir biyobelirteç olarak klinik kullanım için yeterli hassasiyet ve özgüllüğe sahip olmadığını göstermektedir²². Bu kısıtlılık, tek gen biyobelirteçlerinin NSCLC gibi kompleks hastalıklar için genellikle yetersiz olduğuna ve klinik olarak anlamlı bir öngörü performansı elde etmek için multi-omik yaklaşımların ve entegre biyobelirteç panellerinin giderek daha fazla gerekli olduğuna dair ortaya çıkan kanıtlarla örtüşmektedir. Lenf nodu metastazı olan NSCLC dokularında daha yüksek YTHDC2 ekspresyonu gözlemlenmiş olup, bu durum mevcut kohortta YTHDC2 ekspresyonu ile lenf nodu metastatik durumu arasında potansiyel bir ilişki olduğunu düşündürmektedir. YTHDC2 ekspresyonunda adenokarsinom ve skuamöz hücreli karsinom arasında da farklılıklar gözlemlenmiş olsa da, analiz için yalnızca 4 skuamöz hücreli karsinom örneğinin mevcut olması bu alt grup karşılaştırmasının istatistiksel gücünü önemli ölçüde sınırladığından, bu karşılaştırma dikkatle yorumlanmalıdır. Klinik evre, diferansiyasyon, yaş veya sigara öyküsünde anlamlı farklılıklar gözlemlenmemiştir; bu durum muhtemelen örneklem büyüklüğü ve tek merkezli tasarım dahil olmak üzere çalışma kısıtlılıklarından kaynaklanmaktadır. Azalmış YTHDC2 ekspresyonu ile lenf nodu metastazı arasında gözlemlenen ilişki, NSCLC'de potansiyel bir biyolojik role işaret etse de, düşük ayırt edici gücü (AUC ~0.5) ve qRT-PCR ile tutarsız tespiti, tek başına bir klinik belirteç olarak kullanımını engellemektedir. Gelecekteki çalışmalar, YTHDC2'nin diğer m6A ile ilişkili proteinlerle kombine edilmesinin öngörü değerini artırıp artırmayacağını araştırmalıdır.

Biyoenformatik analizler, YTHDC2 ekspresyonunun NSCLC'de azaldığını ve daha iyi hasta sonuçlarıyla ilişkili olabileceğini göstermiştir. Lenf nodu metastazı olan hastalarda da azalmış ekspresyon gözlemlenmiş ve patolojik alt tipler arasında farklılıklar kaydedilmiş olsa da, özellikle skuamöz hücreli karsinom için sınırlı örneklem boyutu nedeniyle bu alt grup bulguları dikkatle yorumlanmalıdır. Ancak, bu bulgular klinik kohortumuzda yapılan qRT-PCR analizi ile doğrulanmamıştır; bu durum muhtemelen kohort özelliklerindeki farklılıkları, örneklem boyutunu, teknik değişkenliği, transkripsiyon sonrası düzenlemeleri veya protein düzeyinde doğrulamanın eksikliğini yansıtmaktadır. Gelecekteki araştırmalar, in vitro ve in vivo deneyler aracılığıyla diğer akciğer kanseri alt tiplerinde YTHDC2 mekanizmalarını incelemelidir. Bu tür çalışmalar, YTHDC2'nin biyolojik rolünü daha da netleştirebilir ve tek başına bir biyobelirteç olmaktan ziyade, çoklu belirteç yaklaşımının bir parçası olarak herhangi bir klinik faydası olup olmadığını belirleyebilir.

Kısıtlamalar

Bu çalışmanın birkaç kısıtlılığı bulunmaktadır. Nispeten küçük bir örneklem boyutuna sahip, tek merkezli retrospektif bir çalışma olması, genellenebilirliği sınırlayabilir. FFPE dokuların kullanımı, RNA kalitesini ve qRT-PCR hassasiyetini etkilemiş olabilir. Ek olarak, yalnızca YTHDC2 mRNA ekspresyonu değerlendirilmiş olup, immünohistokimya (IHC) veya Western blotting kullanılarak protein düzeyinde doğrulama yapılmamıştır. Post-transkripsiyonel regülasyon nedeniyle mRNA ekspresyonunun protein bolluğu ile her zaman korelasyon göstermemesi, klinik bulgularımız ile halka açık veri tabanı analizleri arasındaki tutarsızlığı kısmen açıklayabilir. Çalışmada ayrıca uzun süreli takip verileri eksiktir ve alt grup analizleri (örneğin, skuamöz hücreli karsinom) yetersiz güçtedir.

Gelecekteki yönelimler

Gelecekteki araştırmalar, fonksiyonel rolünü daha iyi anlamak için NSCLC'deki YTHDC2 mekanizmalarını in vitro ve in vivo deneyler aracılığıyla incelemelidir. Bulguları doğrulamak ve genellenebilirliği artırmak için daha geniş örneklem büyüklüklerine sahip çok merkezli çalışmalara ihtiyaç vardır. Ek olarak, YTHDC2'nin diğer m6A ile ilişkili regülatörler ve klinikopatolojik değişkenlerle entegrasyonu, öngörücü ve prognostik faydasını artırabilir. YTHDC2 disregülasyonunun altında yatan biyolojik mekanizmaları aydınlatmak için transkriptomik, proteomik ve epigenomik dahil olmak üzere çoklu omik yaklaşımları içeren daha fazla çalışma gereklidir. mRNA ve protein ekspresyonu arasındaki uyumu değerlendirmek için immünohistokimya (IHC) veya Western blotting ile protein düzeyinde doğrulama da yapılmalıdır. Örnek işleme ve doğrulama tekniklerinin standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve klinik uygulanabilirliği sağlamak açısından kritik öneme sahip olacaktır.

Sonuç

Bu çalışma, biyoinformatik analizleri klinik qRT-PCR doğrulamasıyla entegre ederek NSCLC'de YTHDC2 ekspresyonunun keşifsel bir değerlendirmesini sunmaktadır. Ancak, farklı analitik platformlar arasındaki tutarsız tespiti ve sınırlı tanısal doğruluğu (AUC ≈0.5), şu an için tek başına bir klinik biyobelirteç olarak kullanımını engellemektedir. Biyoinformatik analizler potansiyel bir prognostik öneme işaret etse de, bağımsız klinik doğrulama, tanısal veya prognostik uygulamalar için güvenilirliğini desteklememektedir. Bu bulgular ihtiyatla yorumlanmalı ve herhangi bir klinik uygulama değerlendirilmeden önce protein düzeyindeki ve fonksiyonel çalışmalarla birlikte, daha geniş çok merkezli kohortlarda doğrulanmalıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Özel Primerler ve Problar	Sangon Biotech Co., Ltd., Şanghay, Çin	Özel sentez	Primer ve prob sekansları Tablo 6'da listelenmiştir
DNase I	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Çin	DNase I (HiPure FFPE RNA Kit)	Genomik DNA kontaminasyonunun giderilmesi
ESTIMATE algoritması	Yoshihara et al.	R paketi (Versiyon 1.0.13)	Tümör saflığı tahmini
FFPE RNA Ekstraksiyon Kiti	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Çin	HiPure FFPE RNA Kit (R4130-02)	FFPE dokudan RNA ekstraksiyonu
GDC Veri Portalı	National Cancer Institute (NCI), NIH, ABD	https://portal.gdc.cancer.gov	TCGA veri setlerinin indirilmesi
GEPIA web sunucusu	Pekin Üniversitesi, Çin	http://gepia.cancer-pku.cn	Gen ekspresyon analizi
Kaplan–Meier Plotter	Semmelweis Üniversitesi, Macaristan	https://kmplot.com	Sağkalım analizi
Mikrosantrifüj	Eppendorf AG, Hamburg, Almanya	5424 R	RNA saflaştırma prosedürleri
NanoDrop Spektrofotometre	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD	NanoDrop 2000/2000c	RNA kantifikasyonu
Prob tabanlı qPCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD	TaqMan Universal PCR Master Mix II (4440040)	Kantitatif PCR amplifikasyonu
R İstatistik Yazılımı	R Foundation for Statistical Computing, Viyana, Avusturya	Versiyon 4.4.1	İstatistiksel analizler ve ROC analizi
Real-time PCR Sistemi	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, ABD	CFX Opus 96	Kantitatif real-time PCR
Ters Transkripsiyon Kiti	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD	RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622)	cDNA sentezi
RNA Saflaştırma Kolonu	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Çin	HiPure Mini Column I	Silika membran RNA saflaştırma kolonu
RNase-Free Su	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Çin	RNase-Free Water	RNA elüsyonu
SPSS Statistics	IBM Corp., Armonk, NY, ABD	IBM SPSS Statistics Versiyon 27.0	İstatistiksel analizler
survivalROC paketi	CRAN (R Foundation for Statistical Computing)	Versiyon 1.0.3.1	Zamana bağlı ROC analizi
TCGA veri tabanı	National Cancer Institute (NCI), NIH, ABD	https://portal.gdc.cancer.gov	Kamuya açık kanser genomik veri tabanı
Yıkama Tamponu RW1	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Çin	Buffer RW1	RNA saflaştırma yıkama tamponu
Yıkama Tamponu RW2	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Çin	Buffer RW2	RNA saflaştırma yıkama tamponu