Oligonukleotid teslimatını değerlendirmek için insan tarafından indüklenen pluripotent kök hücre türevli kardioidleri model olarak kullandı

Özet

Bu protokol, insan tarafından indüklenen pluripotent kök hücrelerden kendi kendini organize eden kardiyomiyosit bazlı kardiyoidlerin üretilmesini mümkün kılar ve floresan etiketli oligonukleotit alımının mikroskobik değerlendirmesini sağlar.

Özet

Oligonukleotid bazlı tedaviler, kardiyovasküler hastalıkların tedavisinde önemli potansiyele sahip hızla gelişen bir ilaç sınıfını temsil eder; Ancak, kalp dokusuna verimli teslimat sağlamak kritik ve çözülmemiş bir zorluk olarak kalmaktadır. Önemli bir engel, oligonukleotid hücre alımı ve hücre içi dağılımın nicel olarak değerlendirilmesini destekleyebilen, sağlam, fizyolojik olarak ilgili insan in vitro modellerinin sınırlı bulunabilirliğidir. İnsan tarafından indüklenen pluripotent kök hücrelerden (iPSC) kendi kendini organize eden 3D kardioidler oluşturmak ve bunları floresan etiketli oligonukleotitlerin alımını değerlendirmek için bir platform olarak uygulamak için ayrıntılı ve adım adım bir protokol sunulmaktadır. Protokol, Wnt/β-katenin sinyalini zamansal olarak modüle ederek süspansiyon kültüründe yönlendirilmiş kalp farklılaşmasını sağlar; böylece mezoderm, kardiyak mezoderm ve kardiyosiit progenitor evreleri boyunca iPSC'lerin ardışık olarak tanımlanmasını sağlar. Bu koşullar altında, hücreler kendiliğinden kendiliğinden kendiliğinden oluşarak kanonik kardiyomiyosit belirteçlerini ifade eden atan, çüklü üç boyutlu yapılara dönüşür. Ortaya çıkan kardioidler, oligonukleotid alım verimliliğinin görüntüleme tabanlı değerlendirmesi için ölçeklenebilir, deneysel olarak yönetilebilir bir platform sağlar ve kardiyak uygulamalar için teslimat stratejilerinin geliştirilmesi ve optimizasyonunu destekler.

Giriş

Oligonukleotid bazlı tedaviler, öncelikle antisens oligonükleotidler (ASO) ve küçük interferensif RNA'lar (siRNA'lar), hem kalıtsal hem de edinilmiş hastalıklar dahil olmak üzere geniş hastalıkların tedavisinde dönüştürücü ve son derece spesifik bir yaklaşım^{olarak hızla ortaya çıkmaktadır 1,2,3}. Bu yöntemler, hedef transkriptlere dizi-spesifik bağlanma yoluyla mRNA seviyesinde gen ifadesinin doğrudan modülasyonunu sağlar; bu da genellikle geleneksel küçük molekül tedavilerinde erişilemeyen hastalıkla ilişkili genlerin gen susturulmasına veya birleştirilmesine olanak^{tanır 4,5}. Bu nedenle, oligonukleotid bazlı gen tedavileri, kardiyovasküler hastalıklar da dahil olmak üzere birçok hastalık alanında çeşitli patojenik mekanizmaları hedeflemek için çok yönlü bir platform sağlar⁶. Bugüne kadar, ASO'lar, siRNA'lar ve splice değiştirme ajanları dahil olmak üzere birkaç oligonukleotid bazlı tedavi yöntemi klinik kullanım için^{onaylanmış 7}. Bu ilerlemeye rağmen, hem preklinik hem de klinik ortamlarda terapötik etkinlikleri verimsiz hücre içi^{doğumla sınırlı kalmaktadır 8}. Mevcut tahminler, içselleştirilmiş oligonukleotidlerin %1'inden azının endozomal bölmelerden kaçarak sitozole ulaştığını ve hedef RNA'ya girdiğini ve böylece fonksiyonel aktiviteyi^{sınırladığını göstermektedir 9,10}. Bu sınırlama özellikle kalp dokusunda belirgindir; burada alım ve hücre içi taşım yeterince anlaşılmamaktadır.

Tarihsel olarak, kardiyovasküler tedavilerin preklinik değerlendirmesi, farmakokonetik, biyodağılım, etkinlik ve in vivo güvenliği değerlendirmek için vazgeçilmez olan hayvan modellerine büyük ölçüde dayanmıştır. Ancak, kalp fizyolojisi, gen düzenlemesi ve hücresel yanıtlardaki önemli türler arası farklılıklar, insanların terapötik etkinliğini ve toksisitesini doğru şekilde tahmin etme yeteneklerini sıklıkla sınırlar. Bu sınırlamalar, insan temelli in vitro modellerin geliştirilmiş fizyolojik önemi artmasına yol açmıştır. Bunlar arasında, insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisi, kardiyovasküler hastalık modellemesinde neredeyse sınırsız bir hücre kaynağı sağlayarak kardiyovasküler hastalık modellemesinde devrim niteliğinde bir boyut yaratmıştır. İnsan iPSC'den türetilen kardiomiyositler (iPSC-CM'ler), insan miyokardının moleküler, yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin çoğunu özetler ve hastalık mekanizmalarının, ilaç yanıtlarının ve ortaya çıkan tedavi yöntemlerinin araştırılması için yaygın bir platform haline^{gelmiştir 11}. Ancak, insan iPSC-CM'lerinin geleneksel iki boyutlu kültürlerinin önemli sınırlamaları vardır. Çoğu farklılaşma protokolü, yetişkin hücrelerden ziyade fetal hücrelere benzeyen kardiyomiyositler üretir ve olgunlaşmamış yapısal, elektrofizyolojik, metabolik ve kasılma özellikleri gösterir¹².

Ayrıca, tek katmanlı kültürler, kardiyomiyosit fonksiyonunu in vivo etkileyen üç boyutlu (3D) doku yapısı, çok hücreli etkileşimler ve hücre dışı matris bileşiminden yoksundur. Bu zorlukları ele almak için giderek daha gelişmiş 3B kardiyak modeller^{geliştirilmiştir 13}. Bunlar arasında, biyomateryal iskelelere iPSC-CM'lerin gömülüp mekanik ve elektriksel uyarım uygulanarak üretilen mühendislik ürünü kalp dokuları (EHT'ler), yapısal ve fonksiyonel olgunlaşmayı desteklerken, doğal miyokard^13'ün biyomekanik ortamını daha yakından yeniden üretir. EHT'ler hastalık modellemesi ve ilaç testi için fizyolojik olarak son derece önemli platformlar sağlasa da, üretimleri genellikle özel biyomühendislik uzmanlığı ve özel ekipman gerektirir. Spektrumun diğer ucunda, ex vivo kalp dokusu dilimleri en sadık şekilde doğal doku mimarisini ve hücresel bileşimini korur ancak birincil kalp dokusuna erişime bağlıdır, kültürde sınırlı yaşama sahiptir ve kolayca ölçeklenebilir değildir.

Daha yakın zamanda, kardiyak organoidler, kalp dokusu organizasyonu ve işlevinin temel yönlerini özetleyen erişilebilir 3D model^{sistemleri olarak ortaya çıkmıştır.} Kardioidler, ağırlıklı olarak içsel spesifikasyon, mekânsal desenleme ve morfogenez geçirerek oda benzeri, çürük içeren yapılar oluşturan kardiyomiyositlerden oluşan kendi kendine oluşan kardiyak^{organoidlerdir 15,16}. Kardioidleri oluşturma yöntemleri genellikle mezoderm spetsifikasyonunu indüklemek için Wnt sinyalinin başlangıçta aktivasyonuna dayanır, ardından kalp soyu bağlanmasını teşvik etmek için inhibisyona dayanır. Kardioidler, ölçeklenebilir üretimi destekler ve doku öz-organizasyonunu artıran statik veya karıştırılmış süspansiyon kültürlerinde^{üretilebilir;} 15,16,17,18,19. Endotelyal, epikardiyal veya diğer hücre tiplerini içeren daha karmaşık çok hatlı kardiyak organoidler, fizyolojik önemi artırır ancak daha ayrıntılı farklılaşma protokolleri, daha uzun kültür dönemleri ve kapsamlı optimizasyon gerektirir^13,14.

İnsan iPSC'lerinden kendi kendini organize eden kardiyomiyosit bazlı kardiyositler üretmek ve floresan etiketli oligonukleotitlerin alımını değerlendirmek için uygulanan basit, tekrarlanabilir ve verimli bir protokol sunulmaktadır. Protokol, kardiyovasküler uygulamalar için oligonukleotid kimyasını ve dağıtım stratejilerini optimize etmek isteyen araştırmacılar için değerli olacaktır. Bu çalışmada kullanılan tüm materyaller Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.

Protokol

1. Farklılaştırma için iPSC'lerin kültürü ve hazırlanması

DIKKAT: Hücrelerin ve ortamların tüm açık taşınmasını sertifikalı Sınıf II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin. Laboratuvar önlüğü ve eldiven giy. İş yüzeylerini ve sıvı atıkları uygun bir dezenfektan ile dezenfekte edin.

1. iPSC'leri koruyun.
   1. Üreticinin talimatlarına göre uygun bazal zar matrisi ile katman kültür plakaları.
   2. iPSC'leri tanımlanmış, besleyicisiz pluripotent kök hücre ortamıyla besleyin ve her 24 saatte bir ortamı değiştirin.
   3. Kültürleri aşırı birleşme altında tutun ve hücreler %70–80 birleşmeye ulaştığında geçiş hücrelerini gerçekleştirin.
      NOT: iPSC'lerin yüksek kaliteli, farklılaşmamış bir morfolojiye sahip olduğundan ve farklılaşmadan önce mycoplasmasız olduklarının doğrulandığından emin olun.
2. Farklılaşma öncesi geçiş.
   1. iPSC'leri eritin ve hücreleri en az iki geçiş boyunca genişletin, ardından kalp farklılaşması başlatılır.
   2. Enzimsiz ayrıştırma yöntemi olan PBS-EDTA ile geçiş hücreleri, iPSC bakımıyla uyumlu.
      DURAKLAMA NOKTASI: iPSC'ler kültürde %70–80 birleşimlerine ulaşana kadar ve tipik morfolojiyi kendiliğinden farklılaşma belirtisi olmadan koruyana kadar devam edin.

2. Mikro kuyu plakalarında iPSC agregalarının hazırlanması

1. iPSC'leri tek hücreli bir askıya ayırın.
   1. Ortamı aspire edin ve hücreleri 1 mL 1× PBS ile bir kez yıkayın.
   2. 6 kuyu bir plakanın her kuyusunda 500 μL hücre ayırma çözeltisi (Accutase) ekleyin ve 37 °C'de 5–7 dakika kuluçka yapın.
   3. Her kuyuya 1,5 mL yıkama ortamı ekleyin ve nazikçe tekrar süspansiyon ile tek hücreli süspansiyon elde edin.
   4. Süspansiyonu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 200 × g sıcaklığında 3 dakika boyunca santrifüj yapın.
   5. Süpernatantı aspire edin ve hücre pelletini ROCK inhibitörü ile takviye edilmiş besleyicisiz iPSC ortamında yeniden süzülür (son 10 μM).
      NOT: Her iPSC hattı için ayrılmayı kontrol ederek 5 dakika sonra ayrılma süresini ayarlayın ve gerekirse kısa aralıklarla uzatın.
2. Hücreleri sayın ve kaplama yoğunluğunu hazırlayın.
   1. Canlı hücreleri standart bir hücre sayma yöntemiyle sayın.
   2. 800 μm mikrokuyu toplama plakasının her kuyusu için 0.9 ×^{10 6} hücre/mL ile tek hücreli süspansiyon hazırlayın (24 kuyu formatı, ~300 mikrokuyruk/kuyu).
      NOT: Hücre sayısını kuyu başına optimize edin, çünkü toplam boyut veya farklılaşma verimliliği iPSC hatları arasında değişir.
3. Mikro kuyu plakasını astar ve baloncukları çıkar.
   1. Her kuyuya 500 μL ROCK inhibitörü içeren besleyicisiz iPSC ortamı (son 10 μM) ekleyin.
   2. Mikro kuyu plakasını oda sıcaklığında 300 × g boyunca 3 dakika boyunca santrifüjle ederek mikro kuyulardan hava kabarcıklarını çıkarın.
      KRITİK: Tüm baloncukları tamamen kaldırın, böylece her mikro kuyunun dibinde eşit hücre birikintisi sağlanır ve verimli agregat oluşumunu destekler.
4. iPSC'leri mikro kuyruklara tohumlayın.
   1. Her kuyuyuya hazırlanan tek hücreli süspansiyondan 1,0 ml (0,9 ×^{10 6} hücre/mL) ekleyin; bu, her kuyu başına 0,9 × 10⁶ hücreye karşılık gelir.
   2. Kuyu içinde P1000 kullanarak 3–5 kez nazikçe tekrar süzülün ve hava kabarcıklarının oluşmasından kaçının.
   3. Plakayı 200 × g sıcaklığında oda sıcaklığında 3 dakika boyunca santrifüjle ederek hücreleri mikro kuyruklara pellet edin.
   4. Mikroskop altında hücrelerin mikro kuyruklara yerleştiğini doğrulayın ve plakayı %5 CO₂ ile 37 °C'ye 24 saat boyunca yerleştirin.
      KRITİK: Santrifüjlemeden sonra plakayı dikkatlice tutun. Plakayı kışkırtmayın veya sallayın, çünkü bu hücrelerin mikro kuyulardan çıkmasına neden olabilir.

3. Mikro kuyular içindeki iPSC agregalarının genişletilmesi

1. Agregaları rahatsız etmeden veya yerinden çıkarmadan ortamı dikkatlice aspire edin ve değiştirin.
   1. Plakayı eğip her kuyidan yaklaşık 1.0 mL ortamı yavaşça P1000 pipeti kullanarak aspirasyon yapın; böylece agregalar mikro kuyruklarda sabit kalmasını sağlar.
   2. Kalan ~500 μL ortamı P1000 pipeti ile yavaşça aspire edin.
   3. Her kuyuya, serolojik pipet kullanarak kuyunun kenarından yavaşça dağıtarak 1,5 mL besleyicisiz iPSC ortamı ekleyin.
   4. 37 °C, %5 CO₂ sıcaklıkta kuluçka yapın ve ortam değişimini günlük olarak tekrarlayın.
      KRITİK: Malzemeyi kuyunun duvarına dağıtın ve agregalara doğrudan akışı önleyin.

4. iPSC agregalarının kardiyak farklılaşması (0. günden 12. güne kadar)

1. Mezoderm indüksiyonu (0. Gün).
   1. 3.1.1–3.1.2. Adımlarda tanımlanan hafif aspirasyon yöntemiyle ortamı çıkarın.
   2. Her kuyuyla 1,5 mL bazal ortam ekleyin, %2 B27 insülin çıkar ve Wnt/β-katenin yol aktivatörü (CHIR99021, nihai konsantrasyon: 11 μM) eklenin.
      NOT: Glikojen sitsez kinaz-3 (GSK-3) küçük moleküllü inhibitörü CHIR99021'in 10 mM stok çözeltisi hazırlanın. 11 μM nihai konsantrasyon elde etmek için, 1,5 mL ortama stok çözeltisinden 1,65 μL eklenin.
2. İndüksiyondan sonra orta değişim (1. gün).
   1. CHIR99021 eklendikten sonra 24 saat sonra, her kuyunun ortamını nazikçe aspire edin.
   2. Her kuyu başına 1,5 mL taze bazal ortam ekleyin, %2 B27 çıkar insülin ile takviye olun, ardından 48 saat kuluçka yapın.
      KRITİK: Wnt modülasyon adımlarının zamanlamasına sıkı sıkıya uyun, çünkü sapmalar farklılaşma verimliliğini zayıflatabilir.
      NOT: Wnt/β-katenin yol aktivatörüne maruz kaldıktan sonra bazı hücre ölümleri beklenmektedir. Yaygın toplam kaybı gözlemlenirse, gelecekteki deneylerde aktivatör konsantrasyonunu azaltmayı düşünebilirsiniz.
3. WNT inhibisyonu yoluyla kardiyak bağlılık (3. gün).
   1. Her kuyudan 760 μL harcanmış ortamı steril 50 mL konik bir tüpe aktararak koşullanmış ortam hazırlayın.
   2. Her kuyu için, havuzlanmış koşullanmış ortamı içeren tüpe %2 B27 çıkarılmış insülin takviyesi olan 760 μL taze bazal ortam ekleyin ve nazikçe karıştırın.
   3. Wnt yol inhibitörü IWP4'ü karışık ortama 5 μM nihai konsantrasyona kadar ekleyin ve tüpü birkaç kez nazikçe ters çevirerek karıştırın.
   4. Her kuyunun kalan ortamını dikkatlice aspire edin, ardından IWP4 ile takviye edilmiş her iyi koşullu ortam başına 1,5 mL ekleyin.
   5. %5 CO₂ ile 37 °C'de 48 saat kuluçka yapın.
      NOT: Wnt yol inhibitörü IWP4'ün 1 mM stok çözeltisi hazırla. 5 μM nihai konsantrasyon elde etmek için, her kuyu için toplam ortamın 1.52 mL'sine (760 μL koşullu ortam + 760 μL taze bazal ortam) 7,6 μL stok çözeltisi ekleyin.
4. Mikro kuyruklarda orta değişim (5. Gün).
   1. Maddeyi 3.1.1–3.1.2. Adımlarda tanımlanan hafif aspirasyon yöntemiyle değiştirin.
   2. Her kuyuya %2 B27 ile insülin takviyesi olan 1,5 ml bazal ortam ekleyin, ardından %5 CO₂ ile 37 °C'de 48 saat kuluçka yapın.
5. Agregaları mikro kuyulardan 6 kuyruklu plakalara aktarın (7. Gün).
   1. Her kuyunun ortamını dikkatlice aşerin, Adımlar 3.1.1–3.1.2'de açıklanan nazik aspirasyon yöntemiyle kullanın.
   2. Mikrokuyunun her bir kuyusuna %2 B27 ile takviye edilmiş 1.0 ml bazal ortam ekleyin. P1000 pipeti kullanarak, mikro kuyruklardaki agregaları yerinden çıkarıp süspansiyona aktarmak için pipet ucunu dairesel bir hareketle kuyu yüzeyinde harekete geçirerek ortamı beş kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin.
   3. Agrega süspansiyonu, işlenmemiş 6 kuyuyla kültür plakasının tek bir kuyusuna aktarın.
   4. Mikro kuyu plakasının her kuyusunu ek olarak 1.0 mL taze medyumla iki-üç kez durulayın, kalan agregaları geri kazanmak için her durulamayı 6 kuyu tabağının aynı kuyusuna aktarın.
   5. %5 CO₂ ile 37 °C'de 72 saat kuluçka yapın.
      NOT: Agregat transferinden sonra ölü hücreler ve hücresel kalıntıların varlığı beklenmektedir. Çoğu enkaz sonraki ortam değişimi sırasında temizlenir.
6. Askı kültüründe orta değişim (10. gün).
   1. Plakayı hafifçe karıştırarak gevşek bağlı agregaları çıkarın.
   2. Agregaların kurşunun dibine yerçekimiyle yerleşmesini sağlamak için plakayı eğin.
   3. Kullanılmış ortamı agregaları rahatsız etmeden veya aspire etmeden dikkatlice aspire edin.
   4. Her kuyuya 2,0 ml taze bazal ortam ve %2 B27 insülin takviyesi ekleyin ve %5 CO₂ ile 37 °C'de 48–72 saat boyunca inkübe yapın.
      NOT: Kendiliğinden dayak genellikle yaklaşık 10. günden itibaren gözlemlenir.
      DURAKLAMA NOKTASI: Vuran kardioidler, ortamı her 2–3 günde bir değiştirerek uzun olgunlaşma için süspansiyon kültüründe tutulabilir.

5. Kardioidlerin mikroskobik karakterizasyonu

NOT: Bu yöntem, kriyoseksiyonlar kullanılarak kardioidlerin histolojik karakterizasyonu için bir iş akışı sağlar. Ortaya çıkan bölümler, genel doku mimarisini değerlendirmek için hematoksilin ve eozin (H&E) boyama ve kardiyomiyosit kimliğini değerlendirmek için immünoflüoresans etiketleme gibi çeşitli histolojik analizler için kullanılabilir.

1. Fiksasyon ve kriyoseksiyon.
   1. Kardioidleri %4 paraformaldehit ile gece boyunca 4 °C'de sabitleyin.
      DIKKAT: Paraformaldehit toksiktir ve muhtemel bir kanserojendir; Uygun kişisel koruyucu ekipman takarak kimyasal bir buhar kaputu içinde kullanın. Tüm paraformaldehit içeren atıkları (fiksator ve yıkama ürünleri) aldehit/kimyasal tehlikeli atıklar için açıkça etiketlenmiş bir kapta toplayın ve kurumsal tehlikeli atık prosedürlerine uygun olarak bertaraf edin.
      GÜVENLİK: Tüm paraformaldehit fiksasyonu ve kullanımı kimyasal bir buhar kaputu ile uygun kişisel koruyucu ekipman takarak gerçekleştirin.
   2. PBS ile üç kez yıkayın ve sabit kardioidleri %30 (w/v) sukrozda gece boyunca 4 °C'de kriyoprotektive yapın.
   3. Kardioidleri jelatine göm, dondur ve 10 μm kalınlığında kriyoseksiyonları mikroskop slaytlarına kes. Bölümleri kullanana kadar −20 °C sıcaklıkta sakla.
2. İmmünoetiketleme.
   1. Bölümleri oda sıcaklığında 15 dakika erit.
   2. Bölümleri PBS'de 37 °C'de 10 dakika boyunca, iki kez yıkayın.
   3. Her slayttaki ilgi alanını hidrofobik bir kalemle daire altına alarak bloklama ve antikor çözeltilerini tutan bir kuyu oluşturun.
   4. Kesitleri 2–3 dakika boyunca permeabilizasyon tamponunda (PB; PBS, %0,1 Tween-20 içerir) içerir ve Coplin kavanozunda bulunur.
   5. PB'den slaytları çıkarın, fazla çözeltiyi boşaltın ve kaydırakları nemli bir kamyaya yerleştirin.
      KRITİKLİK: Bu noktadan itibaren bölümlerin kurumasına izin vermemek çok önemli.
   6. Bölümleri, %5 fetal sığır serumu (FBS) içeren 200–300 μL PB ile nemli bir odada 90 dakika boyunca oda sıcaklığında bloklayın.
   7. Bloklayıcı çözeltiyi çıkarın ve bölümleri 4 °C'de gece boyunca 100 μL primer antikor (anti-cMYBP-C; 1:50) bloklayıcı çözeltide (%1 FBS içeren PB) sulandırılmış şekilde inkübe yapın.
   8. Slaytları PB ile üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında yeşil floresan anti-fare ikincil antikor (1:200), uzak kırmızı floresan falloidin (1:400) ve DAPI (1 μg/mL) ile 2 saat kuluçka yapın.
   9. PB'de üç kez yıkayın ve antiifade montaj ortamıyla monte edin.
      DIKKAT: Tüm floresan boya içeren çözeltiler (ikincil antikor, falloidin ve DAPI boyama çözeltileri ile ilgili yıkamalar) bir kapta toplan ve kurumsal yönergelere uygun olarak kimyasal atık olarak bertaraf edilsin.
3. Görüntü alımı.
   1. 10× ve 63×/1.40 yağ batdırma objektif kullanarak süper çözünürlüklü görüntüleme dedektörüyle donatılmış lazer taramalı konfokal mikroskop kullanarak konfokal görüntüler alın.
   2. Uzak kırmızı florofor, yeşil florofor ve nükleer boyayı, sırasıyla %4,0, %4,0 ve %1,0 lazer geçirimiyle 639 nm, 488 nm ve 405 nm lazer hatlarıyla uyarın.
   3. 0.0353 piksel boyutu × 0.0353^{μm 2} piksel boyutuna sahip tek optik kesitler elde edinin; tek yönlü tarama, tarama hızı 6, zoom 1,7, satır ortalaması 1 ve piksel başına 0,935 μs piksel bakışı süresi.
   4. Otomatik Wiener filtreleme kullanarak dizi dedektörlü süper çözünürlüklü görüntü işleme uygulanır.

6. Floresan oligonukleotid alım testi

1. Lipofilisiteyi artırmak için floresan etiketli oligonukleotidin palmitik asite ile konjuge edilmiş stok çözeltisi hazırlanır.
   1. Liyofilize, floresan olarak etiketlenmiş oligonukleotidi nükleazsız suda 1 mM nihai konsantrasyona yeniden yapılandırın. Girdap kısa süreliğine ve 3.000 × g sıcaklığında 30 saniye boyunca santrifüj yapın, böylece tüpün altındaki çözelti toplandı.
   2. 1 mM stok çözeltisinden tek kullanımlık aliquotlar hazırlayın ve ışıktan korunaklı −20 °C'de saklayın.
   3. Deney günü, 1 mM stoktan 1 μL kardioid kültür ortamına eklenerek nihai oligonukleotid konsantrasyonu 1 μM. Nazik plaka çaltımı ile karıştırın.
2. Floresan etiketli oligonukleotid (1 μM nihai konsantrasyon) ile serumsuz ortamda, %5 CO₂ ile 37 °C'de, 24 saat boyunca inkübe edilir.
3. Kardioidleri fosfatla tamponlanmış salin (PBS) ile üç kez yıkayarak ekstraselulyar oligonukleotidi çıkarabilirsiniz.
4. Kardioidleri %4 paraformaldehit ile oda sıcaklığında 20 dakika sabitleyin, PBS ile üç kez yıkayın ve görüntülemeden önce floresan etiketleme ile devam edin.
5. Sağlam sabit kardioidleri gece boyunca 4 °C'de, ışıktan korunarak, yeşil florofor ile konjuge edilmiş 5 μg/mL buğday tohumu agglutinin (WGA) içeren PBS içinde kuluçka edin. PBS'de üç kez yıkayın ve antiifade montaj ortamı ile monte edin.
   DIKKAT: Tüm oligonukleotid ve floresan boya içeren ortam ve yıkamalar, 6.2. adımdan etiketlenmiş oligonukleotid kuluçka ortamı ve WGA/DAPI boyama çözeltisi dahil, ayrı bir kapta toplan ve bunları kurumsal yönergelere uygun olarak kimyasal/biyotehlike atıkları olarak bertaraf etmelidir.
6. Oligonukleotit alımı ve dağılımının konfokal görüntülerini alın.
   1. Süper çözünürlüklü görüntüleme için bir dizi dedektörü ve 40× suya batma hedefiyle donatılmış lazer taramalı konfokal mikroskop kullanarak konfokal görüntüler alın. Görüntüleri, 2 μm z-adım boyutuna sahip 8 bölümlü z-yığınları olarak alın, toplam 16 μm derinliği kaplar.
   2. Nükleer boya, membran işaretleyicisi ve uzak kırmızı floresan etiketli oligonukleotidi sırasıyla 405 nm, 488 nm ve 639 nm lazer hatları ile 0,9%, %0,2 ve %3,0 lazer geçirimiyle uyarın.
   3. 0.0449 × 0.0449 × 2^{μm 3} voxel boyutuna sahip görüntüler, çift yönlü tarama, tarama hızı 5, satır ortalaması 1 ve piksel başına 1.51 μs piksel bulaşma süresi elde edin. Otomatik Wiener filtreleme kullanarak Airyscan/süper çözünürlüklü görüntü işleme uygulayın.
   4. Tüm alım ayarlarını (lazer gücü, dedektör kazancı, z-adım ve voxel boyutu) tüm z-pozisyonlarında ve tüm örneklerde sabit tutun, böylece koşullar arasında geçerli oligonukleotid sinyal karşılaştırılması sağlanır.

Sonuçlar

Şekil 1 , farklılaşma iş akışını özetler ve protokolün her aşamasında beklenen karakteristik morfolojik değişiklikleri gösterir; iPSC toplamasından kendini organize eden kardioidlerin oluşumuna kadar. Süspansiyon tabanlı mikro kuyu toplama, büyük sayıda boyut kontrollü kardiyoidin paralel üretimi için basit ve standart bir yaklaşım sunar. Başarılı farklılaşma, eşit boyutlarda agregaların oluşması, ardından iç boşlukların gelişmesiyle ve genellikle 10. günden itibaren kendiliğinden vurulmanın başlamasıyla karakterize edilir. Bu morfolojik özellikler birlikte, kardioid üretiminin verimliliği ve tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için pratik kalite kontrol noktaları sağlar.

Kardioid mimarisi ve doku organizasyonu, kriyoseksiyonların histolojik analiziyle değerlendirilebilir. Şekil 2'de gösterildiği gibi, başarıyla farklılaşan kardioidlerin hematoksilin ve eozin (H&E) boyaması, bir veya daha fazla iç boşluk içeren, kompakt hücresel katmanlarla çevrili iyi organize edilmiş üç boyutlu dokuları ortaya koymaktadır; bu, odaya benzer organizasyonla uyumludur. Başarılı kardioidlerde genellikle nekrotik bölgeler olmaz ve yapısal parçalanma çok az olur. Buna karşılık, optimal olmayan farklılaşmalar sıklıkla belirgin çürüklerden yoksun düzensiz veya çökmüş yapılar oluşturur; bu da doku öz-organizasyonunun bozulduğunu gösterir.

Kardiyomiyosit farklılaşması, kriyoseksiyonların immünoflüoresans boyaması ile daha fazla değerlendirilebilir. Şekil 3A–B'de gösterildiği gibi, başarılı kardioidler, sarkomer işaretleyicisi cMYBP-C'nin yaygın bir şekilde ifade edilmesini, sarkomerlere özgü yüksek düzenli, periyodik çizgiler halinde organize edilmesini gösterir. Bu çizgili yapılar doku boyunca geniş yayılmış halde bulunur ve genellikle kardiyomiyositlerin uzunlamasına ekseni boyunca hizalanmıştır; bu da etkili kardiyak farklılaşmayı yansıtır. Buna karşılık, suboptimal kardioidler zayıf, yamalı veya bölgesel olarak sınırlı sarkomik boyama gösterir; genellikle periferik bölgelerle sınırlıdır ve geniş alanlarda tespit edilebilir sinyal yoktur; bu da kardiyomiyositlerin verimsiz ayrılmasını gösterir.

Flüoresans olarak işaretlenmiş oligonukleotidlerin alımı, sabit kardioidlerin canlı hücre görüntülemesi veya konfokal mikroskopisi ile değerlendirilebilir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, başarılı alım, endozomal lokalizasyonla uyumlu olarak ayrık nokta olarak dağıtılan kolayca tespit edilebilir hücre içi oligonukleotidle ilişkili floresans ile karakterize edilir. WGA, hücre zarlarını ve DAPI karşı boyalarının çekirdeklerini ayırarak hücre içi oligonukleotid lokalizasyonunun doğrulanmasını sağlar. Oligonukleotit alımının niteliksel görselleştirmesinin yanı sıra, elde edilen görüntü yığınları noktam başına floresans yoğunluğu, hücre başına nokta sayısı ve oligonukleotid pozitif hücrelerin yüzdesi gibi nicel analizler için de kullanılabilir. Şekil 5A–C'de gösterildiği gibi, Z-stack görüntüleme, üç boyutlu doku boyunca oligonukleotid dağılımının değerlendirilmesini daha da mümkün kılar; yüzeyden kardioidin iç kısmına uzanan birden fazla optik kesitte floresans tespit edilir ve etkili doku nüfuzunu gösterir.

Şekil 1: İnsan iPSC kaynaklı kardioidlerin üretimi için iş akışı. İnsan tarafından indüklenen pluripotent kök hücreler (iPSC'ler), mikro kuyulu plakalarda (Day−2) toplanır ve Wnt sinyalinin zamansal modülasyonu yoluyla yönlendirilmiş kalp farklılaşmasına maruz kalır. Mezoderm indüksiyonu, 0. Günde, bazal ortamda B27 eksi insülin takviyesinde Wnt yol aktivatörü CHIR99021 ile tedavi ile başlatılır ve 1. günde aktivatörün çıkarılması sağlanır. Kardiyak spesifikasyon, 3. günde Wnt yol inhibitörü IWP4 ile tedavi edilerek indüklenir, bu işlem 5. günde çıkarılır. 7. günde, agregalar 6 kuyu plakalarına aktarılır ve B27 içeren insülin takviyesi içeren bazal ortamda tutulur. 14. güne gelindiğinde, kendi kendini organize eden kardioidler yerleşir ve oligonukleotid alım testleri dahil olmak üzere sonraki uygulamalar için uygundur. Bu görüntü, yazarlar tarafından Biorender kullanılarak oluşturulmuş ve gerekli telif hakkı lisansı eklenmiştir. Belirtilen zaman noktalarında elde edilen temsili parlak alan görüntüleri, eşit boyutlu iPSC agregalarından kavitasyonlu, kendi kendini organize eden kardiyoidlere beklenen morfolojik ilerlemeyi göstermektedir. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: İnsan iPSC kaynaklı kardioidlerin histolojik karakterizasyonu. 14. Gün kardioidlerinin temsili hematoksilin ve eozin (H&E) boyalı kriyoseksiyonları, iç boşlukları kompakt hücresel katmanlarla çevrili ve odavari doku organizasyonuyla uyumludur. Görüntüler görüntüleme mikroskobu kullanılarak alındı. Farklılaşma sonuçlarının nicelendirilmesi, kardioidlerin %94,0± %2,6'sının spontan atma gösterdiğini, %60,3 ± %20,6'sında ise bir veya daha fazla görünür iç çürüğün bulunduğunu göstermiştir. Veriler, üç bağımsız farklılaşmadan ortalama ± SD olarak sunulmakta olup, her farklılaşmada yaklaşık 115 kardioid analiz edilmiştir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kardiyomiyosit farklılaşmasının immünoflüoresans karakterizasyonu. 14. Gün kardioidlerinin temsil eden kriyoseksiyonları. (A) DAPI boyama, hücre çekirdeklerinin dağılımını gösterir. (B) DAPI (mavi) ile işaretlenmiş çekirdekler ve kardiyak miyosin-bağlanan protein C (cMYBP-C, yeşil) karşısında antikor ile işaretlenmiş sarkomerleri gösteren immünoflüoresans görüntüsü; bu görüntü, farklılaşmış kardiyomiyositlerde organize sarkomik yapıları gösteriyor. Görüntüler, 10×/0.30 kuru objektif (solda) ve 63×/1.40 yağ batdırma nesnesi (sağda) kullanılarak lazerle taramalı konfokal floresans mikroskopisi ile alındı. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Kardioidler tarafından oligonukleotid alımının görüntülemesi. 14. gün kardioidlerinde floresan etiketli antisens oligonukleotidlerin (ASO, sarı) hücre içi lokalizasyonunu gösteren konfokal görüntüler. Hücre zarları floresan buğday tohumu agglutinin (WGA, magenta) ile etiketlenir ve çekirdekler DAPI (mavi) ile boyanmıştır. ASO ile ilişkili floresans, ayrı hücre içi noktalar (oklar) olarak tespit edilir. Alt panellerde, floresan ASO'larla inkubasyon edilmemiş negatif kontrol kardioidleri görülüyor. Sağ panellerdeki görüntüler, sol panellerdeki kutulu bölgelerin daha yüksek büyütme görünümlerine karşılık gelir. Temsil görüntüler, 40× suya daldırma objektif kullanılarak dizi dedektörü süper çözünürlüklü görüntüleme ile lazer-taramalı konfokal mikroskopi ile alındı. Ölçek çubukları = 10 μm (solda) ve 5 μm (sağda). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Kardioidler boyunca oligonukleotid penetrasyonunun değerlendirilmesi. (A) Kardiyoid içinde artan derinliklerde optik kesitlerin edinimini gösteren şematik. Bu görüntü, yazarlar tarafından Biorender kullanılarak oluşturulmuş ve gerekli telif hakkı lisansı eklenmiştir. (B) Floresan işaretli ASO'ların doku yüzeyine göre 0 μm, 6 μm ve 10 μm z-pozisyonlarında dağılımını gösteren temsilci konfokal görüntüler. Tüm z-pozisyonlarında görüntüleme ayarları sabit tutuldu. Ölçek çubuğu = 10 μm. (C) Her görüntüleme derinliğinde en az bir ASO ilişkili nokta sinyal içeren hücrelerin oranının nicelendirilmesi, doku genelinde benzer oligonukleotid alımını gösterdi; sırasıyla 0 μm, 6 μm ve 10 μm ± 83,1 ± %4,5, 84,0 ± %4,5 ASO-pozitif hücre. Veriler, üç kardioidden ortalama SD ±olarak sunulmakta, her kardioid başına üç optik kesit analiz edilmiş ve toplamda 1.305 hücre nicelendirilmiştir. Temsil görüntüler, 40× suya daldırma objektif kullanılarak dizi dedektörü süper çözünürlüklü görüntüleme ile lazer-taramalı konfokal mikroskopi ile alındı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: Zaman geçişi sekansı. Saniyede 40 kare hızında alınan bir video, kardioidlerde spontan kasılma aktivitesini gösterir. Görüntüleme, sCMOS kameralı geniş alan mikroskopu kullanılarak gerçekleştirildi. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Oligonukleotid bazlı tedaviler, onlarca yıllık oligonukleotid kimyasında ilerleyen ve hedef özgüllüğünü, metabolik stabiliteyi ve immünojenik tolere yeteneğini artıran güçlü bir gen hedefleme modaliteleri sınıfı olarak ortaya^{çıkmıştır 7,8}. Klinik olarak onaylanmış RNA tedavilerinin sayısı artsa da, daha geniş uygulamaları verimsiz hücre içi teslimat^{nedeniyle sınırlı kalmaktadır 7,8}. Büyüklükleri, yükü ve hidrofilikleri nedeniyle oligonukleotidler plazma zarı boyunca pasif olarak difüzyon olamaz ve bunun yerine endositik^{yollar 9,10} üzerinden içselleştirilir. Alımdan sonra, içselleştirilmiş oligonukleotidlerin büyük çoğunluğu (~%99) endozomal^{bölmelerde (9,10}) saklanmıştır. Endozomal taşıma, erken ve geç endozomlardan ve nihayetinde lizozomlardan oluşan bir olgunlaşma sürecinden geçer; Ancak, oligonukleotidlerin sitozole kaçtığı kesin bölümler tam olarak anlaşılmamaktadır ve birden fazla endozomal popülasyonu içerebilir⁹. Bu sınırlı sitozolik salınım, kritik bir oran sınırlayıcı engeli oluşturur ve oligonukleotid alımı, hücre içi taşıma ve endozomal kaçışların nicel olarak değerlendirilmesini mümkün kılan fizyolojik olarak ilgili deneysel^{sistemlere olan ihtiyacı vurgulamaktadır 20}.

Burada açıklanan protokol, insan iPSC kaynaklı kardioidleri oligonukleotid alımının görüntüleme tabanlı okumalarıyla birleştirerek bu ihtiyacı karşılamak için geliştirilmiştir. Bu sistemin sağlamlığı, tekrarlanabilirliği ve deneysel sonuçları doğrudan etkileyen birkaç kritik adıma dayanır. Birincisi, başlangıç iPSC kültürlerinin kalitesi, başarılı kalp farklılaşmasının temel belirleyicisidir. Yazarlar, uzun vadeli genomik kararlılık ve koloni morfolojisi, bütünlüğü ile büyüme dinamiklerinin rutin değerlendirilmesini sağlamak için periyodik karyotip analizini önermektedir. Yüksek kaliteli kültürler, pürüzsüz sınırlara, minimal spontan farklılaşmaya ve tutarlı çoğalma ile kompakt, iyi tanımlanmış kolonilerle karakterizedir. Düzensiz koloni kenarları, heterojen hücre morfolojisi veya farklılaşma alanları gösteren kültürler, farklılaşma başlatılmadan önce atılmış ve düşük geçişli donmuş stoklarla değiştirilmelidir.

İkinci kritik adım ise, mikro kuyu plakaları kullanılarak iPSC agregalarının kontrollü oluşturulmasıdır; bu da tekrarlanabilir kalp farklılaşması için gerekli olan tekdüz, boyut tanımlı üç boyutlu yapıların oluşmasını^{teşvik eder 21}. Mikrokuyu tabanlı agregasyon, tanımlanmış çaplara (optimal olarak 200–230 μm) sahip embriyoid cisimler üretir; böylece hücre-hücre etkileşimleri ve Wnt sinyalinin zamansal modülasyonu sırasında morfogen gradyanlarına maruz kalma standartlaşır. Deneyimimize göre, bu boyut, bireysel mikro kuyu başına yaklaşık 3.000 hücre tohumlanarak (Step 2.2) tutarlı şekilde elde edilmektedir; bu durum, ticari olarak mevcut hatlar ve yeniden programlanmış hatlar dahil olmak üzere birden fazla insan iPSC hattında ampirik olarak optimize edilip doğrulanmıştır. Ancak, iPSC çoğalma oranları değişken olabildiğinden, optimal tohumlama yoğunluğu istenen agregat boyutunu korumak için ayarlama gerektirebilir. Bu parametrelerin kontrol edilmemesi heterojen yapılara, canlılık azalmasına ve farklılaşma verimliliğinin azalmasına yol açabilir.

Histolojik analiz, Şekil 2'de gösterildiği gibi, kardioid oluşumunun uygun bir kalite kontrol değerlendirmesi sağlar. Özellikle, iç boşlukların olmaması veya çökmüş ya da parçalanmış yapıların varlığı, farklılaşma aşamalarında Wnt sinyalinin optimal olmayan agregat oluşumunu veya yetersiz zamansal kontrolü gösterebilir (Adım 4.1–4.3). Bazı başarısız farklılaşmalarda, kardioidlerin içinde veya çevresinde kasılmayan hücre popülasyonları ortaya çıkar. Bu hücreler genellikle parlak alan mikroskopisinde sarımsı görünür ve düşük tutunma kültür plakalarına bağlanma eğilimindedir; kardiyomiyositten zengin kardioidler ise genellikle gri olur, kompakt üç boyutlu yapılar olarak kalır ve kolayca bağlanmazlar. Eğer agregaların önemli bir kısmı bu yapışkan, kasılmayan fenotipi sergiliyorsa, bu farklılaşma optimal olmayan olarak değerlendirilmelidir. Bu durumda, sorun giderme işlemi önce farklılaştırmadan önce iPSC koloni morfolojisini gözden geçirmek, −1 ile 0. gün arasındaki toplam boyutu doğrulamak ve gerekirse tohumlama yoğunluğunu ve CHIR99021 ile IWP4 konsantrasyonlarını belirli iPSC hattı için yeniden optimize etmektir.

10–12. günlerde düşük veya yok spontan atış genellikle verimsiz mezoderm indüksiyonu veya kardiyak spesifikasyonu gösterir; en yaygın olarak Wnt-modülatör konsantrasyonu veya zamanlaması veya CHIR99021 tedaviden sonra aşırı hücre ölümü nedeniyle (Adım 4.2). Deneyimimize göre, her iPSC hattı için 9–13 μM aralığında CHIR99021 titretmek ve stok çözeltilerinin yoğunluğunu ve aktivitesini doğrulamak, farklılaşma verimliliğini önemli ölçüde artırabilir. Sarkomik protein organizasyonunun immünoflüosans analizi, Şekil 3'te gösterildiği gibi, kardiyomiyosit farklılaşmasının uygun bir kalite kontrol değerlendirmesi sağlar. Zayıf veya yamalı sarkomerik protein boyama, özellikle kardioidin periferik bölgeleriyle sınırlı olduğunda, genellikle eksik veya heterojen kardiyosit farklılaşmasını gösterir. Bu durumlarda, fiksasyondan önce süspansiyon-kültür olgunlaşma süresinin (Step 4.6 ve Duraklama Noktası) uzatılması ve fiksasyon ile antikor boyama koşullarının doğrulanması önerilir.

Bu kardioid model, geleneksel iki boyutlu kardiyosit kültürlerini önemli ölçüde geliştiren üç boyutlu bir insan kalp mikro ortamı sağlasa da, yetişkin insan kalbinin karmaşıklığını tam olarak yansıtmaz. Kardiyoidler, insan kalp gelişiminin erken bir evresini temsil eder; kardiyomiyositler olgunlaşmamış, fetal benzeri fenotip^14'ü korur. Ayrıca, dokularda damar perfüzyon, innervasyon, yerleşik bağışıklık hücreleri ve olgun miyokardın tam oda-spesifik yapısı yoktur. Sonuç olarak, bu platform kontrollü deneysel koşullarda oligonukleotidlerin hücresel alımı ve hücre içi dağılımını araştırmak için oldukça uygun olsa da, alım kinetik ve ulaşım mekanizmalarını doğrudan in vivo ortama çıkarırken dikkatli olunmalıdır. Gelecekteki ek kardiyak hücre tiplerinin, damar ağlarının ve doku olgunlaşma stratejilerinin dahil edilmesi, bu platformun fizyolojik önemini daha da artırmalıdır.

Bu protokolte tanımlanan kardioidlerin oligonukleotid alımının güvenilir şekilde değerlendirilmesi, Şekil 4 ve Şekil 5'te gösterildiği gibi ASO konsantrasyonu, kuluçka süresi ve görüntüleme alım ayarlarının optimizasyonu ve standartlaştırılmasını gerektirir. Florofor seçimi özellikle önemlidir, çünkü boyalar parlaklık, fotostabilite ve çevresel etkilere duyarlılık açısından farklılık gösterir. Bu çalışmada, yüksek parlaklık ve fotostabiliteye sahip, üç boyutlu örneklerde doku otofloresansını en aza indirirken sağlam sinyal algılaması sağlayan uzak kırmızı silikon-rodamin floroforu Janelia Fluor 646 (JF646)²² kullandık. Bu özellikler, canlı veya sabit kardioidlerde oligonukleotid alımının görüntülenmesi için oldukça uygun hale getirir. Özellikle, florofor konjugasyonu oligonukleotid davranışını, alım ve kaçakçılık dahil olmak üzere etkileyebilir ve bu nedenle her deneysel sistem için doğrulanmalıdır.

Mevcut haliyle bu protokol, oligonukleotid alımının hem niteliksel hem de nicel değerlendirmesini sağlar. Hücre içi ASO ile ilişkili noktaların konfokal görüntülemesi, kardioidlerde oligonukleotid lokalizasyonunun görselleştirilmesini sağlarken, alım verimliliği Fiji/ImageJ'deki Cell Counter eklentisi kullanılarak ASO-pozitif hücrelerin yüzdesi manuel olarak belirlenerek ölçülür. Bu yaklaşım burada sunulan orta verimli analizler için oldukça uygun olsa da, manuel görüntü analizi emek yoğundur ve özellikle büyük veri setlerine uygulandığında gözlemci yanlılığına maruz kalabilir. Üç boyutlu mikroskopi için kendi denetimli derin öğrenmedeki son gelişmeler, bu sınırlamaların aşılması için umut verici fırsatlar sunmaktadır. Yapay zeka tabanlı görüntü analizi, karmaşık üç boyutlu ortamlarda heterojen alt hücre yapılarını doğru şekilde segmente edebilir, tanımlayabilir ve takip edebilir; bu da oligonukleotid alımının ve hücre içi trafikin, endozomal dinamikler dahil olmak üzere, otomatik nicelendirilmesini^{sağlar 23}. Bu yaklaşımların protokolün gelecekteki uygulamalarına dahil edilmesi, veri verimliliği, tekrarlanabilirliği ve analitik hassasiyeti artırmalıdır.

İleriye bakıldığında, insan iPSC kaynaklı kardioidlerin nicel görüntüleme, makine öğrenimi tabanlı görüntü analizi ve tek parçacık metodolojileriyle entegrasyonu, insan kalp dokusunda oligonukleotid teslimatını yöneten mekanizmaları araştırmak için güçlü bir çerçeve sunmaktadır. Fizyolojik olarak ilgili üç boyutlu kardiyak modellerin, alt hücresel organizasyon ve dinamikleri çözebilen gelişmiş analitik araçlarla birleştirilmesi, oligonukleotid alımı, hücre içi taşım ve uygun tamamlayıcı testlerle endozomal kaçışın kapsamlı nicel karakterizasyonunu mümkün kılacaktır. Bu tür entegre yaklaşımların, teslimat verimliliğini belirleyen faktörlerin sistematik olarak tanımlanmasını kolaylaştırması, oligonukleotid kimyalarının ve teslimat araçlarının rasyonel optimizasyonunu desteklemesi ve kardiyovasküler hastalıklar bağlamında ortaya çıkan oligonukleotid tedavilerinin değerlendirilmesi için ölçeklenebilir bir platform sağlaması beklenmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochloride	Thermo Scientific	62248	DAPI
10× dry objective	Zeiss		EC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objective	Zeiss		LD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objective	Zeiss		Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27
800-µm microwell aggregation plate	STEMCELL Technologies	34815	AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera	Andor		Andor Neo 5.5
Antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000-10	VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×	Gibco	A18956-01	B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×	Gibco	17504-044	B27 Supplement 50×
Basal Medium	Gibco	21875-034	RPMI 1640
Basement-membrane matrix	Gibco / Corning	A14132-02 / 354230	Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope	EVOS		EVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solution	STEMCELL Technologies	07922	ACCUTASE
confocal microscope	ZEISS		ZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance medium	STEMCELL Technologies	100-0276	mTeSR Plus
DMEM/F12	Gibco	31331-028	DMEM/F12
Non-treated 6-well plate	Avantor (VWR)	734-2777	Untreated 6-well Plate
Phalloidin	Thermo Scientific	A22287	Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)	Gibco	14190-144	DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3	Santa Cruz	sc-137181	MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72304	ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)	Thermo Scientific	A-11017	F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplement	Gibco	10828028	KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugate	Invitrogen	W11261	WGA
widefield microscope	Nikon		Nikon Eclipse Ti
WNT pathway inhibitor	STEMCELL Technologies	72552	IWP4
Wnt/β-catenin pathway activator	Sigma	SML1046	CHIR99021