Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Oligonukleotid teslimatını değerlendirmek için insan tarafından indüklenen pluripotent kök hücre türevli kardioidleri model olarak kullandı

195 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/72013

⸱

11 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  , 
1Gulbenkian Institute for Molecular Medicine, 2Novo Nordisk Center for Optimized Oligo Escape, University of Copenhagen, 3Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, insan tarafından indüklenen pluripotent kök hücrelerden kendi kendini organize eden kardiyomiyosit bazlı kardiyoidlerin üretilmesini mümkün kılar ve floresan etiketli oligonukleotit alımının mikroskobik değerlendirmesini sağlar.

Özet

Oligonukleotid bazlı tedaviler, kardiyovasküler hastalıkların tedavisinde önemli potansiyele sahip hızla gelişen bir ilaç sınıfını temsil eder; Ancak, kalp dokusuna verimli teslimat sağlamak kritik ve çözülmemiş bir zorluk olarak kalmaktadır. Önemli bir engel, oligonukleotid hücre alımı ve hücre içi dağılımın nicel olarak değerlendirilmesini destekleyebilen, sağlam, fizyolojik olarak ilgili insan in vitro modellerinin sınırlı bulunabilirliğidir. İnsan tarafından indüklenen pluripotent kök hücrelerden (iPSC) kendi kendini organize eden 3D kardioidler oluşturmak ve bunları floresan etiketli oligonukleotitlerin alımını değerlendirmek için bir platform olarak uygulamak için ayrıntılı ve adım adım bir protokol sunulmaktadır. Protokol, Wnt/β-katenin sinyalini zamansal olarak modüle ederek süspansiyon kültüründe yönlendirilmiş kalp farklılaşmasını sağlar; böylece mezoderm, kardiyak mezoderm ve kardiyosiit progenitor evreleri boyunca iPSC'lerin ardışık olarak tanımlanmasını sağlar. Bu koşullar altında, hücreler kendiliğinden kendiliğinden kendiliğinden oluşarak kanonik kardiyomiyosit belirteçlerini ifade eden atan, çüklü üç boyutlu yapılara dönüşür. Ortaya çıkan kardioidler, oligonukleotid alım verimliliğinin görüntüleme tabanlı değerlendirmesi için ölçeklenebilir, deneysel olarak yönetilebilir bir platform sağlar ve kardiyak uygulamalar için teslimat stratejilerinin geliştirilmesi ve optimizasyonunu destekler.

Giriş

Oligonukleotid bazlı tedaviler, öncelikle antisens oligonükleotidler (ASO) ve küçük interferensif RNA'lar (siRNA'lar), hem kalıtsal hem de edinilmiş hastalıklar dahil olmak üzere geniş hastalıkların tedavisinde dönüştürücü ve son derece spesifik bir yaklaşımolarak hızla ortaya çıkmaktadır 1,2,3. Bu yöntemler, hedef transkriptlere dizi-spesifik bağlanma yoluyla mRNA seviyesinde gen ifadesinin doğrudan modülasyonunu sağlar; bu da genellikle geleneksel küçük molekül tedavilerinde erişilemeyen hastalıkla ilişkili genlerin gen susturulmasına veya birleştirilmesine olanaktanır 4,5. Bu nedenle, oligonukleotid bazlı gen tedavileri, kardiyovasküler hastalıklar da dahil olmak üzere birçok hastalık alanında çeşitli patojenik mekanizmaları hedeflemek için çok yönlü bir platform sağlar6. Bugüne kadar, ASO'lar, siRNA'lar ve splice değiştirme ajanları dahil olmak üzere birkaç oligonukleotid bazlı tedavi yöntemi klinik kullanım içinonaylanmış 7. Bu ilerlemeye rağmen, hem preklinik hem de klinik ortamlarda terapötik etkinlikleri verimsiz hücre içidoğumla sınırlı kalmaktadır 8. Mevcut tahminler, içselleştirilmiş oligonukleotidlerin %1'inden azının endozomal bölmelerden kaçarak sitozole ulaştığını ve hedef RNA'ya girdiğini ve böylece fonksiyonel aktiviteyisınırladığını göstermektedir 9,10. Bu sınırlama özellikle kalp dokusunda belirgindir; burada alım ve hücre içi taşım yeterince anlaşılmamaktadır.

Tarihsel olarak, kardiyovasküler tedavilerin preklinik değerlendirmesi, farmakokonetik, biyodağılım, etkinlik ve in vivo güvenliği değerlendirmek için vazgeçilmez olan hayvan modellerine büyük ölçüde dayanmıştır. Ancak, kalp fizyolojisi, gen düzenlemesi ve hücresel yanıtlardaki önemli türler arası farklılıklar, insanların terapötik etkinliğini ve toksisitesini doğru şekilde tahmin etme yeteneklerini sıklıkla sınırlar. Bu sınırlamalar, insan temelli in vitro modellerin geliştirilmiş fizyolojik önemi artmasına yol açmıştır. Bunlar arasında, insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisi, kardiyovasküler hastalık modellemesinde neredeyse sınırsız bir hücre kaynağı sağlayarak kardiyovasküler hastalık modellemesinde devrim niteliğinde bir boyut yaratmıştır. İnsan iPSC'den türetilen kardiomiyositler (iPSC-CM'ler), insan miyokardının moleküler, yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin çoğunu özetler ve hastalık mekanizmalarının, ilaç yanıtlarının ve ortaya çıkan tedavi yöntemlerinin araştırılması için yaygın bir platform halinegelmiştir 11. Ancak, insan iPSC-CM'lerinin geleneksel iki boyutlu kültürlerinin önemli sınırlamaları vardır. Çoğu farklılaşma protokolü, yetişkin hücrelerden ziyade fetal hücrelere benzeyen kardiyomiyositler üretir ve olgunlaşmamış yapısal, elektrofizyolojik, metabolik ve kasılma özellikleri gösterir12.

Ayrıca, tek katmanlı kültürler, kardiyomiyosit fonksiyonunu in vivo etkileyen üç boyutlu (3D) doku yapısı, çok hücreli etkileşimler ve hücre dışı matris bileşiminden yoksundur. Bu zorlukları ele almak için giderek daha gelişmiş 3B kardiyak modellergeliştirilmiştir 13. Bunlar arasında, biyomateryal iskelelere iPSC-CM'lerin gömülüp mekanik ve elektriksel uyarım uygulanarak üretilen mühendislik ürünü kalp dokuları (EHT'ler), yapısal ve fonksiyonel olgunlaşmayı desteklerken, doğal miyokard13'ün biyomekanik ortamını daha yakından yeniden üretir. EHT'ler hastalık modellemesi ve ilaç testi için fizyolojik olarak son derece önemli platformlar sağlasa da, üretimleri genellikle özel biyomühendislik uzmanlığı ve özel ekipman gerektirir. Spektrumun diğer ucunda, ex vivo kalp dokusu dilimleri en sadık şekilde doğal doku mimarisini ve hücresel bileşimini korur ancak birincil kalp dokusuna erişime bağlıdır, kültürde sınırlı yaşama sahiptir ve kolayca ölçeklenebilir değildir.

Daha yakın zamanda, kardiyak organoidler, kalp dokusu organizasyonu ve işlevinin temel yönlerini özetleyen erişilebilir 3D modelsistemleri olarak ortaya çıkmıştır. Kardioidler, ağırlıklı olarak içsel spesifikasyon, mekânsal desenleme ve morfogenez geçirerek oda benzeri, çürük içeren yapılar oluşturan kardiyomiyositlerden oluşan kendi kendine oluşan kardiyakorganoidlerdir 15,16. Kardioidleri oluşturma yöntemleri genellikle mezoderm spetsifikasyonunu indüklemek için Wnt sinyalinin başlangıçta aktivasyonuna dayanır, ardından kalp soyu bağlanmasını teşvik etmek için inhibisyona dayanır. Kardioidler, ölçeklenebilir üretimi destekler ve doku öz-organizasyonunu artıran statik veya karıştırılmış süspansiyon kültürlerindeüretilebilir; 15,16,17,18,19. Endotelyal, epikardiyal veya diğer hücre tiplerini içeren daha karmaşık çok hatlı kardiyak organoidler, fizyolojik önemi artırır ancak daha ayrıntılı farklılaşma protokolleri, daha uzun kültür dönemleri ve kapsamlı optimizasyon gerektirir13,14.

İnsan iPSC'lerinden kendi kendini organize eden kardiyomiyosit bazlı kardiyositler üretmek ve floresan etiketli oligonukleotitlerin alımını değerlendirmek için uygulanan basit, tekrarlanabilir ve verimli bir protokol sunulmaktadır. Protokol, kardiyovasküler uygulamalar için oligonukleotid kimyasını ve dağıtım stratejilerini optimize etmek isteyen araştırmacılar için değerli olacaktır. Bu çalışmada kullanılan tüm materyaller Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Farklılaştırma için iPSC'lerin kültürü ve hazırlanması

DIKKAT: Hücrelerin ve ortamların tüm açık taşınmasını sertifikalı Sınıf II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin. Laboratuvar önlüğü ve eldiven giy. İş yüzeylerini ve sıvı atıkları uygun bir dezenfektan ile dezenfekte edin.

  1. iPSC'leri koruyun.
    1. Üreticinin talimatlarına göre uygun bazal zar matrisi ile katman kültür plakaları.
    2. iPSC'leri tanımlanmış, besleyicisiz pluripotent kök hücre ortamıyla besleyin ve her 24 saatte bir ortamı değiştirin.
    3. Kültürleri aşırı birleşme altında tutun ve hücreler %70–80 birleşmeye ulaştığında geçiş hücrelerini gerçekleştirin.
      NOT: iPSC'lerin yüksek kaliteli, farklılaşmamış bir morfolojiye sahip olduğundan ve farklılaşmadan önce mycoplasmasız olduklarının doğrulandığından emin olun.
  2. Farklılaşma öncesi geçiş.
    1. iPSC'leri eritin ve hücreleri en az iki geçiş boyunca genişletin, ardından kalp farklılaşması başlatılır.
    2. Enzimsiz ayrıştırma yöntemi olan PBS-EDTA ile geçiş hücreleri, iPSC bakımıyla uyumlu.
      DURAKLAMA NOKTASI: iPSC'ler kültürde %70–80 birleşimlerine ulaşana kadar ve tipik morfolojiyi kendiliğinden farklılaşma belirtisi olmadan koruyana kadar devam edin.

2. Mikro kuyu plakalarında iPSC agregalarının hazırlanması

  1. iPSC'leri tek hücreli bir askıya ayırın.
    1. Ortamı aspire edin ve hücreleri 1 mL 1× PBS ile bir kez yıkayın.
    2. 6 kuyu bir plakanın her kuyusunda 500 μL hücre ayırma çözeltisi (Accutase) ekleyin ve 37 °C'de 5–7 dakika kuluçka yapın.
    3. Her kuyuya 1,5 mL yıkama ortamı ekleyin ve nazikçe tekrar süspansiyon ile tek hücreli süspansiyon elde edin.
    4. Süspansiyonu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 200 × g sıcaklığında 3 dakika boyunca santrifüj yapın.
    5. Süpernatantı aspire edin ve hücre pelletini ROCK inhibitörü ile takviye edilmiş besleyicisiz iPSC ortamında yeniden süzülür (son 10 μM).
      NOT: Her iPSC hattı için ayrılmayı kontrol ederek 5 dakika sonra ayrılma süresini ayarlayın ve gerekirse kısa aralıklarla uzatın.
  2. Hücreleri sayın ve kaplama yoğunluğunu hazırlayın.
    1. Canlı hücreleri standart bir hücre sayma yöntemiyle sayın.
    2. 800 μm mikrokuyu toplama plakasının her kuyusu için 0.9 ×10 6 hücre/mL ile tek hücreli süspansiyon hazırlayın (24 kuyu formatı, ~300 mikrokuyruk/kuyu).
      NOT: Hücre sayısını kuyu başına optimize edin, çünkü toplam boyut veya farklılaşma verimliliği iPSC hatları arasında değişir.
  3. Mikro kuyu plakasını astar ve baloncukları çıkar.
    1. Her kuyuya 500 μL ROCK inhibitörü içeren besleyicisiz iPSC ortamı (son 10 μM) ekleyin.
    2. Mikro kuyu plakasını oda sıcaklığında 300 × g boyunca 3 dakika boyunca santrifüjle ederek mikro kuyulardan hava kabarcıklarını çıkarın.
      KRITİK: Tüm baloncukları tamamen kaldırın, böylece her mikro kuyunun dibinde eşit hücre birikintisi sağlanır ve verimli agregat oluşumunu destekler.
  4. iPSC'leri mikro kuyruklara tohumlayın.
    1. Her kuyuyuya hazırlanan tek hücreli süspansiyondan 1,0 ml (0,9 ×10 6 hücre/mL) ekleyin; bu, her kuyu başına 0,9 × 106 hücreye karşılık gelir.
    2. Kuyu içinde P1000 kullanarak 3–5 kez nazikçe tekrar süzülün ve hava kabarcıklarının oluşmasından kaçının.
    3. Plakayı 200 × g sıcaklığında oda sıcaklığında 3 dakika boyunca santrifüjle ederek hücreleri mikro kuyruklara pellet edin.
    4. Mikroskop altında hücrelerin mikro kuyruklara yerleştiğini doğrulayın ve plakayı %5 CO₂ ile 37 °C'ye 24 saat boyunca yerleştirin.
      KRITİK: Santrifüjlemeden sonra plakayı dikkatlice tutun. Plakayı kışkırtmayın veya sallayın, çünkü bu hücrelerin mikro kuyulardan çıkmasına neden olabilir.

3. Mikro kuyular içindeki iPSC agregalarının genişletilmesi

  1. Agregaları rahatsız etmeden veya yerinden çıkarmadan ortamı dikkatlice aspire edin ve değiştirin.
    1. Plakayı eğip her kuyidan yaklaşık 1.0 mL ortamı yavaşça P1000 pipeti kullanarak aspirasyon yapın; böylece agregalar mikro kuyruklarda sabit kalmasını sağlar.
    2. Kalan ~500 μL ortamı P1000 pipeti ile yavaşça aspire edin.
    3. Her kuyuya, serolojik pipet kullanarak kuyunun kenarından yavaşça dağıtarak 1,5 mL besleyicisiz iPSC ortamı ekleyin.
    4. 37 °C, %5 CO₂ sıcaklıkta kuluçka yapın ve ortam değişimini günlük olarak tekrarlayın.
      KRITİK: Malzemeyi kuyunun duvarına dağıtın ve agregalara doğrudan akışı önleyin.

4. iPSC agregalarının kardiyak farklılaşması (0. günden 12. güne kadar)

  1. Mezoderm indüksiyonu (0. Gün).
    1. 3.1.1–3.1.2. Adımlarda tanımlanan hafif aspirasyon yöntemiyle ortamı çıkarın.
    2. Her kuyuyla 1,5 mL bazal ortam ekleyin, %2 B27 insülin çıkar ve Wnt/β-katenin yol aktivatörü (CHIR99021, nihai konsantrasyon: 11 μM) eklenin.
      NOT: Glikojen sitsez kinaz-3 (GSK-3) küçük moleküllü inhibitörü CHIR99021'in 10 mM stok çözeltisi hazırlanın. 11 μM nihai konsantrasyon elde etmek için, 1,5 mL ortama stok çözeltisinden 1,65 μL eklenin.
  2. İndüksiyondan sonra orta değişim (1. gün).
    1. CHIR99021 eklendikten sonra 24 saat sonra, her kuyunun ortamını nazikçe aspire edin.
    2. Her kuyu başına 1,5 mL taze bazal ortam ekleyin, %2 B27 çıkar insülin ile takviye olun, ardından 48 saat kuluçka yapın.
      KRITİK: Wnt modülasyon adımlarının zamanlamasına sıkı sıkıya uyun, çünkü sapmalar farklılaşma verimliliğini zayıflatabilir.
      NOT: Wnt/β-katenin yol aktivatörüne maruz kaldıktan sonra bazı hücre ölümleri beklenmektedir. Yaygın toplam kaybı gözlemlenirse, gelecekteki deneylerde aktivatör konsantrasyonunu azaltmayı düşünebilirsiniz.
  3. WNT inhibisyonu yoluyla kardiyak bağlılık (3. gün).
    1. Her kuyudan 760 μL harcanmış ortamı steril 50 mL konik bir tüpe aktararak koşullanmış ortam hazırlayın.
    2. Her kuyu için, havuzlanmış koşullanmış ortamı içeren tüpe %2 B27 çıkarılmış insülin takviyesi olan 760 μL taze bazal ortam ekleyin ve nazikçe karıştırın.
    3. Wnt yol inhibitörü IWP4'ü karışık ortama 5 μM nihai konsantrasyona kadar ekleyin ve tüpü birkaç kez nazikçe ters çevirerek karıştırın.
    4. Her kuyunun kalan ortamını dikkatlice aspire edin, ardından IWP4 ile takviye edilmiş her iyi koşullu ortam başına 1,5 mL ekleyin.
    5. %5 CO₂ ile 37 °C'de 48 saat kuluçka yapın.
      NOT: Wnt yol inhibitörü IWP4'ün 1 mM stok çözeltisi hazırla. 5 μM nihai konsantrasyon elde etmek için, her kuyu için toplam ortamın 1.52 mL'sine (760 μL koşullu ortam + 760 μL taze bazal ortam) 7,6 μL stok çözeltisi ekleyin.
  4. Mikro kuyruklarda orta değişim (5. Gün).
    1. Maddeyi 3.1.1–3.1.2. Adımlarda tanımlanan hafif aspirasyon yöntemiyle değiştirin.
    2. Her kuyuya %2 B27 ile insülin takviyesi olan 1,5 ml bazal ortam ekleyin, ardından %5 CO₂ ile 37 °C'de 48 saat kuluçka yapın.
  5. Agregaları mikro kuyulardan 6 kuyruklu plakalara aktarın (7. Gün).
    1. Her kuyunun ortamını dikkatlice aşerin, Adımlar 3.1.1–3.1.2'de açıklanan nazik aspirasyon yöntemiyle kullanın.
    2. Mikrokuyunun her bir kuyusuna %2 B27 ile takviye edilmiş 1.0 ml bazal ortam ekleyin. P1000 pipeti kullanarak, mikro kuyruklardaki agregaları yerinden çıkarıp süspansiyona aktarmak için pipet ucunu dairesel bir hareketle kuyu yüzeyinde harekete geçirerek ortamı beş kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin.
    3. Agrega süspansiyonu, işlenmemiş 6 kuyuyla kültür plakasının tek bir kuyusuna aktarın.
    4. Mikro kuyu plakasının her kuyusunu ek olarak 1.0 mL taze medyumla iki-üç kez durulayın, kalan agregaları geri kazanmak için her durulamayı 6 kuyu tabağının aynı kuyusuna aktarın.
    5. %5 CO₂ ile 37 °C'de 72 saat kuluçka yapın.
      NOT: Agregat transferinden sonra ölü hücreler ve hücresel kalıntıların varlığı beklenmektedir. Çoğu enkaz sonraki ortam değişimi sırasında temizlenir.
  6. Askı kültüründe orta değişim (10. gün).
    1. Plakayı hafifçe karıştırarak gevşek bağlı agregaları çıkarın.
    2. Agregaların kurşunun dibine yerçekimiyle yerleşmesini sağlamak için plakayı eğin.
    3. Kullanılmış ortamı agregaları rahatsız etmeden veya aspire etmeden dikkatlice aspire edin.
    4. Her kuyuya 2,0 ml taze bazal ortam ve %2 B27 insülin takviyesi ekleyin ve %5 CO₂ ile 37 °C'de 48–72 saat boyunca inkübe yapın.
      NOT: Kendiliğinden dayak genellikle yaklaşık 10. günden itibaren gözlemlenir.
      DURAKLAMA NOKTASI: Vuran kardioidler, ortamı her 2–3 günde bir değiştirerek uzun olgunlaşma için süspansiyon kültüründe tutulabilir.

5. Kardioidlerin mikroskobik karakterizasyonu

NOT: Bu yöntem, kriyoseksiyonlar kullanılarak kardioidlerin histolojik karakterizasyonu için bir iş akışı sağlar. Ortaya çıkan bölümler, genel doku mimarisini değerlendirmek için hematoksilin ve eozin (H&E) boyama ve kardiyomiyosit kimliğini değerlendirmek için immünoflüoresans etiketleme gibi çeşitli histolojik analizler için kullanılabilir.

  1. Fiksasyon ve kriyoseksiyon.
    1. Kardioidleri %4 paraformaldehit ile gece boyunca 4 °C'de sabitleyin.
      DIKKAT: Paraformaldehit toksiktir ve muhtemel bir kanserojendir; Uygun kişisel koruyucu ekipman takarak kimyasal bir buhar kaputu içinde kullanın. Tüm paraformaldehit içeren atıkları (fiksator ve yıkama ürünleri) aldehit/kimyasal tehlikeli atıklar için açıkça etiketlenmiş bir kapta toplayın ve kurumsal tehlikeli atık prosedürlerine uygun olarak bertaraf edin.
      GÜVENLİK: Tüm paraformaldehit fiksasyonu ve kullanımı kimyasal bir buhar kaputu ile uygun kişisel koruyucu ekipman takarak gerçekleştirin.
    2. PBS ile üç kez yıkayın ve sabit kardioidleri %30 (w/v) sukrozda gece boyunca 4 °C'de kriyoprotektive yapın.
    3. Kardioidleri jelatine göm, dondur ve 10 μm kalınlığında kriyoseksiyonları mikroskop slaytlarına kes. Bölümleri kullanana kadar −20 °C sıcaklıkta sakla.
  2. İmmünoetiketleme.
    1. Bölümleri oda sıcaklığında 15 dakika erit.
    2. Bölümleri PBS'de 37 °C'de 10 dakika boyunca, iki kez yıkayın.
    3. Her slayttaki ilgi alanını hidrofobik bir kalemle daire altına alarak bloklama ve antikor çözeltilerini tutan bir kuyu oluşturun.
    4. Kesitleri 2–3 dakika boyunca permeabilizasyon tamponunda (PB; PBS, %0,1 Tween-20 içerir) içerir ve Coplin kavanozunda bulunur.
    5. PB'den slaytları çıkarın, fazla çözeltiyi boşaltın ve kaydırakları nemli bir kamyaya yerleştirin.
      KRITİKLİK: Bu noktadan itibaren bölümlerin kurumasına izin vermemek çok önemli.
    6. Bölümleri, %5 fetal sığır serumu (FBS) içeren 200–300 μL PB ile nemli bir odada 90 dakika boyunca oda sıcaklığında bloklayın.
    7. Bloklayıcı çözeltiyi çıkarın ve bölümleri 4 °C'de gece boyunca 100 μL primer antikor (anti-cMYBP-C; 1:50) bloklayıcı çözeltide (%1 FBS içeren PB) sulandırılmış şekilde inkübe yapın.
    8. Slaytları PB ile üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında yeşil floresan anti-fare ikincil antikor (1:200), uzak kırmızı floresan falloidin (1:400) ve DAPI (1 μg/mL) ile 2 saat kuluçka yapın.
    9. PB'de üç kez yıkayın ve antiifade montaj ortamıyla monte edin.
      DIKKAT: Tüm floresan boya içeren çözeltiler (ikincil antikor, falloidin ve DAPI boyama çözeltileri ile ilgili yıkamalar) bir kapta toplan ve kurumsal yönergelere uygun olarak kimyasal atık olarak bertaraf edilsin.
  3. Görüntü alımı.
    1. 10× ve 63×/1.40 yağ batdırma objektif kullanarak süper çözünürlüklü görüntüleme dedektörüyle donatılmış lazer taramalı konfokal mikroskop kullanarak konfokal görüntüler alın.
    2. Uzak kırmızı florofor, yeşil florofor ve nükleer boyayı, sırasıyla %4,0, %4,0 ve %1,0 lazer geçirimiyle 639 nm, 488 nm ve 405 nm lazer hatlarıyla uyarın.
    3. 0.0353 piksel boyutu × 0.0353μm 2 piksel boyutuna sahip tek optik kesitler elde edinin; tek yönlü tarama, tarama hızı 6, zoom 1,7, satır ortalaması 1 ve piksel başına 0,935 μs piksel bakışı süresi.
    4. Otomatik Wiener filtreleme kullanarak dizi dedektörlü süper çözünürlüklü görüntü işleme uygulanır.

6. Floresan oligonukleotid alım testi

  1. Lipofilisiteyi artırmak için floresan etiketli oligonukleotidin palmitik asite ile konjuge edilmiş stok çözeltisi hazırlanır.
    1. Liyofilize, floresan olarak etiketlenmiş oligonukleotidi nükleazsız suda 1 mM nihai konsantrasyona yeniden yapılandırın. Girdap kısa süreliğine ve 3.000 × g sıcaklığında 30 saniye boyunca santrifüj yapın, böylece tüpün altındaki çözelti toplandı.
    2. 1 mM stok çözeltisinden tek kullanımlık aliquotlar hazırlayın ve ışıktan korunaklı −20 °C'de saklayın.
    3. Deney günü, 1 mM stoktan 1 μL kardioid kültür ortamına eklenerek nihai oligonukleotid konsantrasyonu 1 μM. Nazik plaka çaltımı ile karıştırın.
  2. Floresan etiketli oligonukleotid (1 μM nihai konsantrasyon) ile serumsuz ortamda, %5 CO₂ ile 37 °C'de, 24 saat boyunca inkübe edilir.
  3. Kardioidleri fosfatla tamponlanmış salin (PBS) ile üç kez yıkayarak ekstraselulyar oligonukleotidi çıkarabilirsiniz.
  4. Kardioidleri %4 paraformaldehit ile oda sıcaklığında 20 dakika sabitleyin, PBS ile üç kez yıkayın ve görüntülemeden önce floresan etiketleme ile devam edin.
  5. Sağlam sabit kardioidleri gece boyunca 4 °C'de, ışıktan korunarak, yeşil florofor ile konjuge edilmiş 5 μg/mL buğday tohumu agglutinin (WGA) içeren PBS içinde kuluçka edin. PBS'de üç kez yıkayın ve antiifade montaj ortamı ile monte edin.
    DIKKAT: Tüm oligonukleotid ve floresan boya içeren ortam ve yıkamalar, 6.2. adımdan etiketlenmiş oligonukleotid kuluçka ortamı ve WGA/DAPI boyama çözeltisi dahil, ayrı bir kapta toplan ve bunları kurumsal yönergelere uygun olarak kimyasal/biyotehlike atıkları olarak bertaraf etmelidir.
  6. Oligonukleotit alımı ve dağılımının konfokal görüntülerini alın.
    1. Süper çözünürlüklü görüntüleme için bir dizi dedektörü ve 40× suya batma hedefiyle donatılmış lazer taramalı konfokal mikroskop kullanarak konfokal görüntüler alın. Görüntüleri, 2 μm z-adım boyutuna sahip 8 bölümlü z-yığınları olarak alın, toplam 16 μm derinliği kaplar.
    2. Nükleer boya, membran işaretleyicisi ve uzak kırmızı floresan etiketli oligonukleotidi sırasıyla 405 nm, 488 nm ve 639 nm lazer hatları ile 0,9%, %0,2 ve %3,0 lazer geçirimiyle uyarın.
    3. 0.0449 × 0.0449 × 2μm 3 voxel boyutuna sahip görüntüler, çift yönlü tarama, tarama hızı 5, satır ortalaması 1 ve piksel başına 1.51 μs piksel bulaşma süresi elde edin. Otomatik Wiener filtreleme kullanarak Airyscan/süper çözünürlüklü görüntü işleme uygulayın.
    4. Tüm alım ayarlarını (lazer gücü, dedektör kazancı, z-adım ve voxel boyutu) tüm z-pozisyonlarında ve tüm örneklerde sabit tutun, böylece koşullar arasında geçerli oligonukleotid sinyal karşılaştırılması sağlanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1 , farklılaşma iş akışını özetler ve protokolün her aşamasında beklenen karakteristik morfolojik değişiklikleri gösterir; iPSC toplamasından kendini organize eden kardioidlerin oluşumuna kadar. Süspansiyon tabanlı mikro kuyu toplama, büyük sayıda boyut kontrollü kardiyoidin paralel üretimi için basit ve standart bir yaklaşım sunar. Başarılı farklılaşma, eşit boyutlarda agregaların oluşması, ardından iç boşlukların gelişmesiyle ve genellikle 10. günden...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Oligonukleotid bazlı tedaviler, onlarca yıllık oligonukleotid kimyasında ilerleyen ve hedef özgüllüğünü, metabolik stabiliteyi ve immünojenik tolere yeteneğini artıran güçlü bir gen hedefleme modaliteleri sınıfı olarak ortayaçıkmıştır 7,8. Klinik olarak onaylanmış RNA tedavilerinin sayısı artsa da, daha geniş uygulamaları verimsiz hücre içi teslimatnedeniyle sınırlı kalmaktadır 7,8

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.

Teşekkürler

Novo Nordisk Vakfı Optimize Oligo Escape Challenge Center üyelerine, özellikle oligonukleotid tasarımı ve sentezi için Knud Jensen'e, nicel görüntüleme ve hücre içi taşıma analizi konusunda değerli rehberlik için Nikos S. Hatzakis ve Tomas Kirchhausen'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, Novo Nordisk Vakfı Optimize Oligo Kaçış Mücadele Merkezi (NNF23OC0081287) tarafından finanse edilmiştir. M.F., Portekiz'deki Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)'den burs aldı (2020.04836.BD). GIMM Biyogörüntüleme ve GIMM Histopatoloji Platformlarına (Lizboa, Portekiz) teknik destek için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochlorideThermo Scientific62248DAPI
10× dry objectiveZeissEC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objectiveZeissLD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objectiveZeissPlan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27 
800-µm microwell aggregation plateSTEMCELL Technologies34815AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera AndorAndor Neo 5.5 
Antifade mounting mediumVector LaboratoriesH-1000-10VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×GibcoA18956-01B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×Gibco17504-044B27 Supplement 50×
Basal MediumGibco21875-034RPMI 1640
Basement-membrane matrixGibco / CorningA14132-02 / 354230Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope EVOSEVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solutionSTEMCELL Technologies07922ACCUTASE
confocal microscopeZEISSZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance mediumSTEMCELL Technologies100-0276mTeSR Plus
DMEM/F12Gibco31331-028DMEM/F12
Non-treated 6-well plateAvantor (VWR)734-2777Untreated 6-well Plate
PhalloidinThermo ScientificA22287Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)Gibco14190-144DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3Santa Cruzsc-137181MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitorSTEMCELL Technologies72304ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)Thermo ScientificA-11017F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplementGibco10828028KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugateInvitrogen W11261WGA
widefield microscopeNikonNikon Eclipse Ti 
WNT pathway inhibitorSTEMCELL Technologies72552IWP4
Wnt/β-catenin pathway activatorSigmaSML1046CHIR99021

Kaynaklar

  1. Kulkarni JA, Witzigmann D, Thomson SB, Chen S, Leavitt BR, Cullis PR, et al. The current landscape of nucleic acid therapeutics. Nat Nanotechnol. 2021;16(6):630-43.
  2. Lauffer MC, van Roon-Mom W, Aartsma-Rus A, Collaborative N. Possibilities and limitations of antisense oligonucleotide therapies for the treatment of monogenic disorders. Commun Med (Lond). 2024;4(1):6.
  3. Lee HG, Kim J, Jang CY, Shin M. Antisense Oligonucleotide Therapeutics Targeting Age-Related Diseases. BioDrugs. 2026;40(2):237-61.
  4. Roberts TC, Langer R, Wood MJA. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(10):673-94.
  5. Corey DR, Damha MJ, Manoharan M. Challenges and Opportunities for Nucleic Acid Therapeutics. Nucleic Acid Ther. 2022;32(1):8-13.
  6. Gotthardt M, Badillo-Lisakowski V, Parikh VN, Ashley E, Furtado M, Carmo-Fonseca M, et al. Cardiac splicing as a diagnostic and therapeutic target. Nat Rev Cardiol. 2023;20(8):517-30.
  7. Liu M, Wang Y, Zhang Y, Hu D, Tang L, Zhou B, et al. Landscape of small nucleic acid therapeutics: moving from the bench to the clinic as next-generation medicines. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):73.
  8. Sun X, Setrerrahmane S, Li C, Hu J, Xu H. Nucleic acid drugs: recent progress and future perspectives. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):316.
  9. Dowdy SF, Setten RL, Cui XS, Jadhav SG. Delivery of RNA Therapeutics: The Great Endosomal Escape! Nucleic Acid Ther. 2022;32(5):361-8.
  10. Patra C, Hussein Z, Ace VD, Misnik EV, Rybalko DS, Salimova AA, et al. The efficacy of oligonucleotide-based gene therapeutics in gene silencing. Theranostics. 2026;16(2):599-616.
  11. Lyra-Leite DM, Gutierrez-Gutierrez O, Wang M, Zhou Y, Cyganek L, Burridge PW. A review of protocols for human iPSC culture, cardiac differentiation, subtype-specification, maturation, and direct reprogramming. STAR Protoc. 2022;3(3):101560.
  12. Karbassi E, Fenix A, Marchiano S, Muraoka N, Nakamura K, Yang X, et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nat Rev Cardiol. 2020;17(6):341-59.
  13. Kim YH, Son YH, Choi Y, Kim MS, Park SJ, Lee KY. Advanced in vitro cardiac models for drug evaluation: integration of organoids, engineered tissues, and microphysiological systems. Microsyst Nanoeng. 2026;12(1).
  14. Mendjan S, Deyett A, Yelon D. Coordination of cardiogenesis in vivo and in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 2026;27(1):19-34.
  15. Lewis-Israeli YR, Wasserman AH, Gabalski MA, Volmert BD, Ming Y, Ball KA, et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 2021;12(1):5142.
  16. Hofbauer P, Jahnel SM, Papai N, Giesshammer M, Deyett A, Schmidt C, et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 2021;184(12):3299-317 e22.
  17. Silva AC, Matthys OB, Joy DA, Kauss MA, Natarajan V, Lai MH, et al. Co-emergence of cardiac and gut tissues promotes cardiomyocyte maturation within human iPSC-derived organoids. Cell Stem Cell. 2021;28(12):2137-52 e6.
  18. Drakhlis L, Biswanath S, Farr CM, Lupanow V, Teske J, Ritzenhoff K, et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nat Biotechnol. 2021;39(6):737-46.
  19. Prondzynski M, Berkson P, Trembley MA, Tharani Y, Shani K, Bortolin RH, et al. Efficient and reproducible generation of human iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac organoids in stirred suspension systems. Nat Commun. 2024;15(1):5929.
  20. Buntz A, Killian T, Schmid D, Seul H, Brinkmann U, Ravn J, et al. Quantitative fluorescence imaging determines the absolute number of locked nucleic acid oligonucleotides needed for suppression of target gene expression. Nucleic Acids Res. 2019;47(2):953-69.
  21. Branco MA, Cotovio JP, Rodrigues CAV, Vaz SH, Fernandes TG, Moreira LM, et al. Transcriptomic analysis of 3D Cardiac Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reveals Faster Cardiomyocyte Maturation Compared to 2D Culture. Sci Rep. 2019;9(1):9229.
  22. Grimm JB, English BP, Chen J, Slaughter JP, Zhang Z, Revyakin A, et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nat Methods. 2015;12(3):244-50, 3 p following 50.
  23. Lavaee A, Jain A, Scanavachi G, Costa-Filho JI, Ingemansson A, Kirchhausen T. SpatialDINO: A Self-Supervised 3D Vision Transformer that enables Segmentation and Tracking in Crowded Cellular Environments. bioRxiv. 2026.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

nd klenmi Pluripotent K k H crelerKardioid ModelKardiyak DiferansiyasyonWnt Sinyal YolaKardiyak MezodermKardiyomiyosit Progenit rleriFloresan Oligon kleotidlerH cresel Al mBoyutlu Kardioidler

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.