Caenorhabditis elegans'ta Basit ve Erişilebilir Yumurta Çatlama Testleri: Uyuşturucu Taraması İçin Uyarlanabilir Formatlar

Özet

Bu çalışma, Caenorhabditis elegans'ta birden fazla deneysel formatı entegre eden esnek ve standart bir yumurta çatlama testi platformu sunmaktadır. Bu yaklaşım, tekrarlanabilirlik, ölçeklenebilirlik ve erişilebilirliği artırır; ilaç etkilerinin ve gelişim süreçlerinin sağlam bir şekilde değerlendirilmesini sağlarken, hem araştırma uygulamaları hem de eğitim ortamları için maliyet etkin ve kolayca uyarlanabilir kalır.

Özet

Yumurta çatlama testleri (EHA), özellikle antelmintik araştırmalarda, nematodların erken gelişim evreleri üzerindeki kimyasal bileşiklerin etkilerini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Ancak, mevcut metodolojiler format, karmaşıklık ve tekrarlanabilirlik açısından önemli ölçüde farklılık gösterir ve genellikle uyarlanabilir deneysel çerçeveler yerine sabit protokoller olarak sunulur. Bu çalışmada, Caenorhabditis elegans'ta yumurta çatlama testleri için basit, erişilebilir ve esnek bir platform oluşturuyoruz; üç deneysel konfigürasyonu entegre edip doğrudan karşılaştırıyoruz: (i) mikrosantrifüj tüplerinde kontrollü kuluçka, ardından agar plakalarında tohumlama, (ii) ilaç içeren agar plakalarına doğrudan maruz kalma ve (iii) çok amaçlı sıvı testler. Testi göstermek için iki temsilci bileşik kullanıldı: biri yumurta çatlamasını engelleyen, diğeri ise tespit edilebilir etkisi olmayan biri. Her konfigürasyon, deneysel kontrol, veri verimliliği ve erişilebilirlik açısından belirgin avantajlar sağlar. Mikrosantrifüj tüplü yaklaşım, ilaç maruziyetinin hassas kontrolünü sağlar ve nicel farmakolojik analizleri destekler. Agar tabanlı testler, sürekli maruz kalma ve eğitim ortamları için uygun basitleştirilmiş ve düşük maliyetli bir alternatif sunar. Çok kuyu formatları, modern ilaç keşif boru hatlarıyla uyumlu ölçeklenebilir, standartlaştırılmış tarama imkanı sağlar. Bu formatları doğrudan karşılaştırarak, metodolojik seçimlerin analiz tekrarlanabilirliğini, ilaç maruziyeti dinamiklerini ve biyolojik yorumu nasıl etkilediğini gösteriyoruz; özellikle yumurta kabuğunun koruyucu rolü ve moleküler hedef ifadedeki gelişimsel varyasyon gibi aşamaya özgü faktörlerle ilgili. Genel olarak, bu çalışma C. elegans'ta yumurta çatlama testlerini, antelmintik tarama, toksikolojik değerlendirme, gelişim çalışmaları ve öğretim laboratuvarları gibi çeşitli uygulamalara uyarlanabilir çok yönlü ve ölçeklenebilir bir platform olarak kurarak bu metodolojinin daha geniş ve mantıklı kullanımını kolaylaştırmaktadır.

Giriş

Yumurta çatlama testleri (EHA), uzun süredir nematolojide kimyasal bileşiklerin ovicidal aktivite ve erken gelişimsel etkilerini değerlendirmek için temel bir metodoloji olarak kabul edilmiştir. Başlangıçta parazitik nematodlar için geliştirilen bu testler, kontrollü in vitro koşullar altında embriyonasyonun veya larva çıkışının inhibisyonunu nicelikle ölçer; yumurta çıkma yüzdesi veya konsantrasyon-yanıt analizi (örneğin, EC₅₀ veya IC₅₀^{) gibi} sağlam ve biyolojik olarak önemli son noktalar sağlar.

Haemonchus contortus ve Trichostrongylus colubriformis gibi parazitik nematodlarda klasik yumurta bazlı yaklaşımlar, sentetik ilaçların ve doğal ürünlerin etkinliğini değerlendirmek ve antelmintik direncin^{izlenmesinde yaygın olarak kullanılmıştır} 1,2,6,8,9,10 . Bu metodolojiler, yumurta yaşamı ve çatlama doğrudan değerlendirildiğinden, dışkı kültürü sonrası larva gelişiminin değerlendirilmesine kadar çeşitli okumaları kapsar. Birlikte, ilaç maruziyetinin parazit üreme çıktısı ve iletim potansiyeliyle bağlantılı bir rol oynamasında merkezi bir rol oynadılar. Ancak, bu yaklaşımlar genellikle enfekte konaklardan karmaşık örnek hazırlama, uzun kuluçka dönemleri ve özel altyapı gerektirir; bu da erişilebilirliklerini, ölçeklenebilirliklerini ve laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliklerini sınırlayabilir.

Caenorhabditis elegans'ın model organizma olarak kullanımı, parazitik nematodlarla ilişkili çeşitli sınırlamaları aşmak için güçlü bir strateji olarak ortaya çıkmıştır. Kısa yaşam döngüsü, genetik olarak yönetilebilirliği, kültür kolaylığı ve parazitik türlerle paylaşılan önemli moleküler hedeflerin korunması, onu özellikle farmakolojik, toksikolojik ve gelişimsel çalışmalar için uygun kılar. Önemli olarak, C. elegans'ta embriyogenez, hızlı ve yüksek derecede tekrarlanabilir bir yapıya sahiptir; bu da yumurta canlılığı ve yumurta çıkarma testlerinin, erken gelişim süreçlerinin ve bunların xenobiyotikler tarafından bozulmasının nicel ve güvenilir okumaları olarak^{kullanılmasına olanak tanır 11,12,13,14,15,16,17}.

Ayrıca, iyi karakterize edilmiş mutant suşların varlığı, ilaç etkisi ve direnci hakkında mekanik içgörü sağlamıştır. Önceki çalışmalar, biyoaktif bileşiklere karşı direncin evre bağlı olarak ortaya çıkabileceğini, embriyon ve larva evrelerinin farklı hassasiyetler gösterebileceğini göstermiştir. Örneğin, glutamaterjik sinyal değişimleri larvalarda dirençli fenotiplerle ilişkilendirilmiş, yumurta çatlaması ise etkilenmemiştir 14,18,19,20. Bu, ilaç hassasiyetinin evreye özgü doğasını vurgular ve embriyonik evrelerin sonraki gelişim evrelerine kıyasla farklı hedefler veya farklı erişilebilirlik içerebileceğini göstermektedir.

Parazitolojinin ötesinde, C. elegans'taki yumurta canlılığı testleri toksikoloji ve erken ilaç keşfinde giderek daha önemli hale gelmiştir. Bu testler sadece antelmintik aktiviteyi değerlendirmek için değil, aynı zamanda gelişimsel toksisite ve ilaç kaynaklı embriyonik kusurları da değerlendirmek için uygulanmıştır; sonuçlar daha yüksek organizma toksisitesi profilleriyle^{korelasyon gösterebilir 15,16}. Aynı zamanda, yumurta kabuğunun varlığı önemli biyolojik kısıtlamalar getirir; çünkü embriyo^21,22 etrafında koruyucu ve seçici bir geçirgenlik bariyeri görevi görür. Sonuç olarak, bazı biyoaktif moleküller, ilerleyen gelişim aşamalarında aktivite göstermelerine^{rağmen embriyoya ulaşamayabilir (}14,19,23,24). Bu nedenle embriyoya erişim, moleküler boyut ve polarite dahil olmak üzere her bileşiğin fizikokimyasal özelliklerine bağlı olabilir. Bu, yumurta çatlama testlerinde gözlemlenen aktivite ile sonraki gelişim evrelerinde gözlemlenen aktivite arasındaki farklılıklara katkıda bulunabilir. Bu ayrım, hem deneysel bağlamın hem de ölçülen biyolojik son noktanın net tanımlanmasının önemini vurgular.

Metodolojik olarak, Caenorhabditis elegans'ta yumurta çatlama testleri, senkronize yumurtaların sıvı kuluçkası, ilaç içeren agar plakalarına doğrudan maruz kalma ve orta ile yüksek verimlilikte tarama için uyarlanmış çoklu kuyu tabanlı testler gibi geniş deneysel formatlar yelpazesi kullanılarak^{uygulanmıştır 11,13,14,16,19,23,24}.

Sıvı bazlı ve mikroplaka formatları, homojen maruziyet koşulları sağladıkları, ilaç konsantrasyonlarının hassas kontrolünü kolaylaştırdıkları ve konsantrasyon-yanıt ilişkilerinin nicel analizini mümkün kıldıkları için farmakolojik tarama çalışmalarında yaygın olarak benimsenmiştir. Paralel olarak, parazitik nematodlar için karşılaştırılabilir çoklu kuyu tabanlı stratejiler yaygın şekilde geliştirilmiştir; geleneksel 96 kuyu plaka testlerinden, 384 kuyu formatları ^4,5 kullanan ultra yüksek verimli platformlara kadar uzanır. Bu yaklaşımlar birlikte, farklı nematod türleri arasında yumurta çatlama testlerinin çok yönlülüğünü ve ölçeklenebilirliğini ve küçük ölçekli mekanik çalışmalardan büyük ölçekli bileşik taramaya kadar çeşitli deneysel ortamlara uyum sağlayabilmesini vurgular.

Her format, deneysel kontrol, tekrarlanabilirlik, veri verimliliği ve erişilebilirlik açısından kendine özgü avantajlar ve sınırlamalar sunar. Sıvı bazlı testler homojen maruziyet koşulları sağlar ve nicel farmakolojik analizler için uygundur; agar tabanlı testler ise geliştirme boyunca sürekli maruziyete izin verir ancak ilaç difüzyonu ve biyoyararlanımla ilgili değişkenlik getirir. Çok kuyu formatları ise, modern tarama stratejileriyle uyumlu olarak paralelleştirme ve azaltılmış reaktif tüketimi sağlar.

Yaygın kullanıma rağmen, yumurta çatlama testleri genellikle esnek bir metodolojik çerçeve olarak değil, sabit protokoller olarak sunulur. Formatlar arasında doğrudan karşılaştırmalar nadir ve mekanik çalışmalardan yüksek verimli tarama veya öğretim ortamlarına kadar belirli uygulamalar için en uygun konfigürasyonun seçilmesine dair rehberlik sınırlı kalır.

Bu çalışmada, C. elegans'ta yumurta çatlama testleri için basit, erişilebilir ve uyarlanabilir bir platform öneriyoruz; üç deneysel konfigürasyonu entegre edip karşılaştırıyoruz: (i) mikrosantrifüj tüplerinde kontrollü kuluçka ve ardından agar plakalarında tohumlama, (ii) ilaç içeren agar plakalarına doğrudan maruz kalma ve (iii) çok tabanlı sıvı testler.

Bu yapılandırmaları sistematik olarak değerlendirerek, deneysel kontrol, sadelik ve ölçeklenebilirlik arasındaki dengeleri ortaya koyan pratik bir çerçeve oluşturmayı hedefliyoruz. Bu entegre bakış açısı, klasik parazitolojik metodolojileri modern model tabanlı tarama yaklaşımlarıyla birleştirerek, yumurta çatlama testlerini tek bir standart teknik olarak değil, antelmintik keşif, toksikolojik değerlendirme, gelişim biyolojisi ve eğitim uygulamaları dahil olmak üzere çeşitli araştırma bağlamlarına uyarlanabilir çok yönlü bir platform olarak konumlandırır.

Protokol

1. Caenorhabditis elegans türleri ve kültürü

1. Metodolojiyi geliştirmek ve^doğrulamak için vahşi tip N2 (Bristol) suşunu ve/veya transjenik suş PD4251 (ccIs4251; dpy-20(e1282)) ^kullanın. PD4251, GFP'yi ifade eder, gerekirse görselleştirme ve potansiyel görüntüleme uygulamalarını kolaylaştırırken, bu çalışmada kullanılan deneysel koşullarda vahşi tip N2 suşunda gözlemlenenlerden ayırt edilemez yumurta çatlama ve gelişimsel tepkiler^{gösterir 27}.
2. Ulusal Sağlık Enstitüleri Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından desteklenen Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden (örneğin, vahşi tip N2 suşu) suşlar (örneğin, vahşi tip N2 suşu) edinin.
3. Solucanları, Escherichia coli OP50 ile besin kaynağı olarak tohumlanmış taze hazırlanmış Nematod Büyüme Ortamı (NGM) agar plakalarında standart laboratuvar koşullarında 18–25 °C sıcaklıkta tutun. NGM'yi 16 g agar, 3 g NaCl ve 2,5 g bactopeptone 975 mL damıtılmış veya ultra saf suda çözerek hazırlayın. Otoklavlama ile sterilize edin. Ortamı 55 °C'ye soğuttuktan sonra, potasyum fosfat tamponu (25 mL, 1 M, pH 6.0), CaCl₂ (1 mL, 1 M), MgSO₄ (1 mL, 1 M) ve kolesterol (1 mL, 5 mg/mL mutlak etanol) içeren steril çözeltiler ekleyin. İyice karıştırın ve tabakları steril koşullarda dökün.
4. WormBook ve ilgili^{çalışmalar} 24,26,28,29'da tanımlanan prosedürlere uygun olarak rutin işleme, çoğaltma ve bakım gerçekleştirin. Solucanları açlık olmayan koşullarda koruyun, sürekli bakteriyel gıda erişimini sağlayarak ve aşırı kalabalık tabaklardan kaçının. Kültürleri önerilen sıcaklık aralığında (18–25 °C) tutun ve aşırı kuru koşullardan kaçının, çünkü bunlar agar dehidratasyonunu hızlandırabilir.
5. Teste başlamadan önce genel hususlar
   1. Tüm deneysel parametreleri önceden tanımlayın; sıcaklık (18–25 °C), kuluçka süresi (4–8 saat), nem (%50–70) ve kullanım prosedürleri dahil.
   2. Teste başlamadan önce tüm malzemeleri hazırlayın; böylece doğru zamanlama ve iş akışı koordinasyonu sağlanır.
   3. Tüm kopyalarda tutarlı deneysel koşullar korun, değişkenliği en aza indirmek için.

2. Test bileşiklerinin ve kontrollerinin hazırlanması

1. Deney günü tüm bileşikleri taze hazırlayın. Stoklar, bileşiğin uyumluluğu ve test koşullarına^{bağlı olarak} M9 tampon (22 mM KH₂PO₄, 42 mM Na₂HPO₄, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO₄) veya steril damıtılmış suda ^çözülür.
   NOT: Sulu ortam seçimi, C. elegans testlerinde bileşik aktiviteyi etkileyebilir. Örneğin, serotonin gibi bileşikler, steril damıtılmış suda M9 tampon ile farklı etkili konsantrasyonlar gösterebilir. Bu nedenle, hem araç uyumluluğu hem de biyolojik yanıt, analiz optimizasyonu sırasında ampirik olarak değerlendirilmelidir. Ayrıca, düşük sulu çözünürlüğüne sahip bileşikler için, dimetil sülfoksit (DMSO) veya etanol gibi uygun araçlar kullanılabilir. Toksisiteyi önlemek için nihai çözücü konsantrasyonları düşük kalmalıdır (genellikle %0,2 v/v'nin altında). C. elegans'ta yapılan önceki çalışmalar, DMSO konsantrasyonlarının standart laboratuvar koşullarında %0,5'e kadar minimal etkiler yarattığını^{bildirmiştir 17}.
2. Her bileşik başına en az beş konsantrasyon hazırlayın; böylece konsantrasyon-yanıt eğrileri oluşturulabilir ve IC₅₀ veya IC₉₀ değerlerinin tahmini yapılabilir. Başlangıç noktası olarak 2 ila 3 katlık konsantrasyon adımlarıyla seri seyreltme kullanın ve her bileşiğin beklenen gücü, çözünürlüğü ve deneysel yanıtına göre nihai konsantrasyon aralığını ayarlayın.
   NOT: Test bileşikleri ışığa duyarlıysa, bozulmayı önlemek için tüm hazırlık adımları loş ışıkta yapılmalıdır. Bu, stok çözeltilerinin, seyreltmelerin ve ilaç içeren agar plakalarının hazırlanmasını içerir. Mümkün olduğunda, plakalar alüminyum folyo ile kaplı ve karanlıkta saklanmalıdır. Benzer şekilde, çoklu kuyu plakaları kuluçka sırasında (örneğin, folyo veya opak kapaklarla) örtülü tutulmalıdır. Deney boyunca bileşik stabilitesini korumak için ışık maruziyetini sınırlayan kapalı kaplar veya nemli odalar kullanılması önerilir.
3. Her deneyde şu kontrolleri ekleyin: sadece tampon kontrolü (M9 veya su) ve araç kontrolü (örneğin, tedavilerde kullanılan aynı konsantrasyonda DMSO veya etanol).
   NOT: Çözücü seçimi kritik öneme sahiptir. DMSO ve etanol yaygın olarak kullanılır çünkü hidrofobik bileşikleri çözünürken düşük konsantrasyonlarda biyouyumlu kalırlar. Çözümlülüğü artırmak için Tween 20 veya siklodekstrin gibi alternatif yaklaşımlar düşünülebilir. İlaç çözeltileri hazırlandıktan hemen sonra kullanılmalıdır, çünkü zamanla stabilite değişebilir ve tekrarlanabilirliği etkileyebilir.

3. Senkronize C. elegans yumurtalarının elde edilmesi

NOT: C. elegans yumurtalarının izolasyonu önceki çalışmalarda^{kapsamlı şekilde tanımlanmıştır 29,32}. Burada, ana adımlar özetlenerek, yumurta çatlama testleri için uygun temiz, kalıntısız yumurtaların geri kazanılmasını optimize etmek için küçük değişiklikler içeriyor.

1. Gravid solucanlarının koleksiyonu
   1. Gravid yetişkinlerin birleşik kültürleri içeren 3–5 NGM^{plakalarıyla başlayın 25,26}. Çok sayıda gravid solucanı ve görünür yumurta içeren plakaları tercih edin; bu da aktif üremeyi gösterir, ancak aşırı kalabalık veya aç kültürlerden kaçının. Kesin solucan sayıları genellikle bu aşamada belirlenmez, çünkü C. elegans'taki yumurta izolasyon protokolleri genellikle kesin hayvan sayımları yerine birleşik üreme kültürlerine dayanır. Genel bir referans olarak, her 60 mm plakada birkaç yüz gravid yetişkin bulunmalıdır.
   2. Her plakaya damıtılmış su ekleyin ve solucanları 15 mL'lik konik bir tüpte nazikçe yıkayın. Eğer yüzeyini kazımaktan kaçının, kalıntıyı en aza indirin.
   3. 266 × g ile 3 dakika (18–25 °C) arasında santrifüj yapın ve solucanlar pellet edilir. Bakteri içeren süpernatantı çıkarın.
   4. Üst yüzeyi çıkarın ve yıkama adımını üç kez tekrarlayın. Her seferinde kalıntı bakterilerin uzaklaştırılmasını artırmak için peleti nazikçe tekrar askıya alın.
2. Ağartma ile yumurta izolasyonu
   1. Solucan peletini taze hazırlanmış bir ağartma çözeltisine (%1,2 NaOCl ve 0,5 M NaOH; son hacim 5 mL) yeniden süzülün. Çözümü hemen kullanmadan önce hazırlayarak aktivite sağlanmasını sağlayın.
      NOT: Doğru şekilde ağartılmış örnekler, yetişkin karkasların bozulması/sindirildiği, sağlam yumurtaların morfolojik olarak normal ve canlı kaldığı preparatlar olarak tanımlanmıştır. Aşırı ağartılmış örnekler, hasarlı veya lizlenmiş yumurtalar, anormal yumurta morfolojisi, azalmış çatlama oranları veya kuluçka sonrası canlı larvaların yokluğu nedeniyle^{tespit edildi 25}.
   2. Tüpü güçlü şekilde kışkırtarak yetişkin vücutların çözünmesini ve yumurtaların salınmasını teşvik etmelidir. Kuluçka sırasında sürekli karıştırarak eşit bir maruziyet sağlanır.
   3. Reaksiyonu yakından izleyin ve 5 dakikayı geçmeyin. Görsel olarak kontrol edin: yetişkin bedenler çoğunlukla çözünmüş, yumurtalar sağlam kalmalıdır.
   4. Reaksiyonu yakından izleyin ve 5 dakikada soğuk steril damıtılmış su (tercihen 10 °C) ekleyerek son hacmi 14 mL'ye kadar durdurun. Yumurta hasarını önlemek için kuluçka süresinin bu süreyi aşmasına izin vermeyin.
   5. Tüpü kapalı kapatın ve ağartma çözeltisini hızlıca seyreltmek için birkaç kez nazikçe ters çevirin. Yumurtanın canlılığını korumak için bu adımı gecikmeden yapın.
   6. 266 × g'de 3 dakika (18–25 °C) santrifüj yapın ve süpernatantı dikkatlice atın.
   7. Yumurta peletini steril damıtılmış suyla üç kez yıkayarak kalan çamaşır suyunu tamamen temizleyin. Yıkamalar arasında kapsamlı bir süspansiyon yapın. Yumurtaları 5 mL M9 tampon veya steril suya yeniden süsle bırakın.
      NOT: Gravid hermafroditlerin ağartılması, senkronize testler için uygun steril bir yumurta hazırlama sağlar. Yiyecek yokluğunda, yumurtadan çıkan larvalar L1 gelişimsel durgunluğa girer ve beslenmeye başladıktan sonra aynı anda gelişime devam ederler.
3. Arındırma aşaması (sukroz flotasyonu)
   1. Bu adımı ağartmadan sonra solucan kalıntısı görünüyorsa yapın.
   2. %60 steril bir sakaroz suyru çözeltisi seyreltilerek %30 sakaroz çözeltisi hazırlayın (örneğin, eşit hacimlerde karıştırın: 5 mL %60 sakroz ile 5 mL damıtılmış su).
   3. Pellete sukroz çözeltisini ekleyin ve nazikçe ters çevirerek karıştırın. Girdabdan kaçının.
      NOT: Bu arıtma adımı kısa olduğu ve ardından hemen kalıntı sakrozu almak için yıkama adımları yapıldığı için, bu çalışmada kullanılan koşullarda yumurta yaşamılığı üzerinde tespit edilebilir bir etki gözlemlenmemiştir. Buna karşılık, solucan kalıntılarının çıkarılması yumurta görselleştirmesini, sayma doğruluğunu ve örnekler arasında ilaç maruziyetinin eşitliğini önemli ölçüde artırır.
   4. Santrifüj 266 × g ile 5 dakika (18–25 °C) kullanıldı.
   5. Yumurta tabakasını, çözeltinin üstünde ince beyaz bir halka olarak tanımlayın. Pipet ucunu halka boyunca dikkatlice hareket ettirerek yumurta içeren süpernatanttan hemen 4 mL toplayın.
   6. Bu adımı hızlıca yapın, çünkü yumurtalar yerçekimi nedeniyle santrifüjden kısa süre sonra batmaya başlar.
   7. Toplanan süpernatantı steril damıtılmış su içeren temiz bir tüpe aktarın. Yumurtaları soğuk steril suyla iki kez yıkayarak kalan sukrozu çıkarın.
      NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ancak şiddetle tavsiye edilir. Döküntülerin çıkarılması, yumurta görselleştirmesini ve sayma doğruluğunu artırır ve yumurtaların kalıntı solucan materyalinde hapsolmasını önleyerek test bileşiklerine daha eşit maruziyeti sağlar.
4. Yumurta suyu çözeltisi hazırlanır
   1. Yumurta süspansiyonunu örneklemeden önce hafifçe karıştırın, yumurtalar hızla tortulur.
   2. Bir slayta üç adet 20 μL damla yerleştirin ve stereomikroskop altında yumurtaları sayın.
   3. Ortalamayı hesaplayın ve konsantrasyonu M9 tamponu kullanarak 100 μL'de 50–100 yumurtaya ayarlayın. Aliquote yapmadan önce tekrar karıştırın, böylece eşit dağılımı koruyun.
   4. Seçilmiş protokole göre her deneysel koşul için gerekli yumurta süspansiyon hacmini Aliquot olarak belirtir.

4. Yumurta çatlama testi formatları

1. Mikrosantrifüj tüplerinde kısa süreli yumurta maruziyeti (yüksek kontrol formatı)
   NOT: Bu deneysel yapılandırma, daha önce tanımlanan^{prosedürler 25'e} dayanır ve maruz kalma koşulları üzerindeki kontrolü ve tekrarlanabilirliği artırmak için uyarlamalar yapılmıştır.
   1. Yumurta çatlama testleri için agar plakalarının hazırlanması
      1. Sadece agar ve damıtılmış su kullanarak (100 mL suda 1,7 g agar) ilaçsız agar plakaları hazırlayın. Besin veya bakteri eklemeyin, çünkü amaç yumurta çatlamasını gıda kaynaklarından müdahale olmadan değerlendirmektir. Deneyler boyunca tutarlı bir agar derinliğini korumak için 35 mm Petri kabına yaklaşık 3 mL agar dökün.
      2. Plakaları kullanımdan 12–24 saat önce hazırlayın. Bu zaman aralığını aşmaktan kaçının, çünkü aşırı kurutma yumurta yaşamını azaltır ve larva hareketini etkiler.
      3. Sayımayı kolaylaştırmak için her plakayı katılaktan sonra dört dörtlüğe ayırın.
      4. Tabakları 8–10 °C sıcaklıkta, kapalı koşullarda saklayarak dehidrasyonu önleyin. Plakaların oda sıcaklığında dengelenmesine izin verin.
   2. Her koşul için 500 μL yumurta süspansiyonunu 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Yumurtaların yerçekimiyle hızla çökmesini önlemek için pipetleme adımlarını nazikçe karıştırın. Homojen bir süspansiyon sağlamak, koşullar arasında karşılaştırılabilir yumurta sayısını sağlamak için kritiktir.
   3. 500 μL yumurta süspansiyonuna 500 μL tedavi çözeltisi veya ona karşılık gelen kontrol eklenir. 22 °C'de 4–8 saat kuluçka yapın. İnkubasyon süresini önceden belirleyin ve deneyler boyunca sabit tutun (örneğin, 6 saat), çünkü bu süredeki değişiklikler doğrudan ilaç maruziyetini etkiler.
      NOT: Yumurta süspansiyonuyla karıştırdıktan sonra seyreltme, istenen nihai konsantrasyonun 2 katında işlem çözeltilerini hazırlayın.
   4. Kuluçka sırasında tüp rotatörü (örneğin, 5–20 rpm'de dikey dönüş) veya sallama platformu kullanılarak sürekli hafif çaltma sağlansın. Yumurta tortulmasını önlemek ve eşit maruziyeti teşvik etmek için tüplerin sürekli hareket halinde kalmasını sağla. Bu adım kritiktir, çünkü statik koşullar yumurta birikmesine ve heterojen ilaç maruziyetine yol açar.
   5. Tüpleri kuluçkadan sonra 3 dakika (18–25 °C) boyunca 3.420 × g sıcaklıkta santrifüjlenin. Tüp duvarında küçük beyaz bir birikinti olarak görünen peleti tanımlayın. Santrifüjden önce tüpleri düzenli olarak yönlendirin (örneğin, bir tarafı işaretleyin) böylece hızlı pellet lokalizasyonunu kolaylaştırın ve süpernatantın çıkarılması sırasında kazara kaybı önler.
   6. Süpernatantı peleti rahatsız etmeden dikkatlice çıkarın. Yumurtaları M9 tamponu ile üç kez yıkayarak kalan bileşiği çıkarın. Son peleti 240 μL M9 tamponunda yeniden askıya alın.
   7. Süspansiyonu agar plakalarına 20 μL vererek dört dörtlü başına dağılın. Her koşulda üç plaka kullanın. Damlaların tamamen kurumasına izin verin, sonra taşı hareket ettirin veya plakaları ters çevirin, böylece yumurtaların yüzeye kaymasını önleyin.
      NOT: Yıkama aşamalarında yumurta kaybını telafi etmek ve kaplama ile sayma için yeterli nihai örnek boyutunu sağlamak için zorunlu olandan daha fazla toplam yumurta süspansiyonu hacmiyle başlayın. Prosedürü basitleştirmek ve özellikle eğitim ortamlarında agar plakası kullanımını azaltmak için, yeniden askılanan yumurtaları agar plakalarına değil, doğrudan çoklu kuyu tabakasına aktarın. Kuyu başına son hacmi 200 μL olarak ayarlayın ve kullanılmayan kuyuları buharlaşmayı en aza indirmek için steril suyla doldurun.
2. İlaç içeren agar plakalarında doğrudan yumurta maruziyeti
   1. Sadece agar ve steril damıtılmış su içeren bir agar çözeltisi hazırlayın (100 mL'de 1.7 g agar). Tamamen çözünene kadar ısıtın ve çözeltiyi sıvı halde tutun. Herhangi bir bileşik eklemeden önce agarın 50–55 °C'ye kadar soğumasına izin verin ve laboratuvar termometresi ile sıcaklığı izleyin. Bu adım, bileşik stabilitesini korumak ve daha önce belirtildiği gibi homojen bir şekilde dahil edilmesini sağlamak için^{kritiktir. 28}. Her bileşik başına en az beş konsantrasyon hazırlayın; böylece konsantrasyon-yanıt analizi ve IC₅₀ tahmini yapılabilir.
      NOT: Bakteriyel gıda kaynakları eklemeyin. Yiyecek yokluğunda, yumurtadan çıkan larvalar senkronize L1 gelişimsel durgunluğuna girer ve analiz^{dönemi 26,33} sırasında ilerlemeyi daha sonraki larva evrelerine engeller.
   2. Soğutulmuş agara uygun miktarda ilaç çözeltisi veya araç kontrolü ekleyin. Homojen dağılımın sağlanması için yavaş ters çevirerek nazikçe karıştırın. Baloncuk oluşumunu önlemek için girdap veya şiddetli sallamadan kaçının.
   3. Hemen yaklaşık 3 mL agar 35 mm Petri kabına dökün. Sabit sıcaklık ve plaka kalınlığını korumak için düzenli bir şekilde çalışın. Her koşul için en az 3–5 tabaktan hazırlanın.
   4. Plakaların saklanması ve işlenmesi aşağıdaki şekilde: Plakaların oda sıcaklığında düz bir yüzeyde katılaşmasına izin verin. Depo plakaları ters olarak saklayarak yoğuşmanın agar yüzeyine ulaşmasını önleyin.
   5. Deneyi kurun: 50–100 yumurtayı doğrudan agar plakalarına tohumlayın. Sıcaklık, kuluçka süresi, nem ve plaka hazırlanma zamanlaması gibi deneysel parametreleri sabit tutun. Konsantrasyon-yanıt analizi için en az beş konsantrasyon kullanın.
      NOT: Plakaları kullanımdan 12–24 saat önce hazırlayın. Aşırı kurutmaktan kaçının, çünkü yumurtanın canlılığını ve larva hareketini etkileyebilir. Işığa duyarlı bileşiklerle çalışırken susuzluğu azaltmak ve ışıktan korumak için plakaları sarın. Tabakları temiz, tercihen nemli bir ortamda (örneğin, nemli kağıtla kapalı bir kap) saklayarak değişkenliği en aza indirin.
3. Çok kuyu plakalarında yumurta çatlama testi (orta ve yüksek verimlilik formatı)
   NOT: Bu format, hem C. elegans hem de parazitik nematod çalışmalarında orta ve yüksek verimli tarama için yaygın olarak kullanılır ve standart koşullar altında birden fazla bileşik ve konsantrasyonun paralel değerlendirilmesini sağlar.
   1. Kuyu plaka hazırlama ve deneysel tasarım: 96 kuyu plakaları (veya veri taşıma ihtiyacına bağlı olarak alternatif bir format) kullanın. Plaka düzenini önceden hazırlayın ve ilaç konsantrasyonlarını (sütunlar boyunca düzenlenmiş), replikaları (sıralar boyunca) ve kontrolleri, yalnızca tamponlu (M9 veya su) ve araç kontrollerini (örneğin, tedavilerde kullanılan aynı nihai konsantrasyonda DMSO veya etanol) tanımlayın.
      NOT: Her kuyrukta doğrudan görselleştirme ve sayma sağlamak için şeffaf, düz tabanlı çok kuyu plakaları kullanın; bu da stereomikroskopla iletim LED aydınlatması altında doğrudan görselleştirme ve sayma yapılmasına olanak tanır. Yumurtalar ve çatlamış L1 larvaları, transfer adımları olmadan doğrudan kuyularda nicelendirilir, böylece örnek kaybı en aza indirilir ve artefaktlar ele alınır.
   2. Her kuyuyu, uygun miktarda ilaç çözeltisi veya kontrol ile önceden yükleyin. Tüm kuyular için eşit hacimler kullanın.
   3. Yumurta süspansiyonunun eklenmesi
      1. Tanımlanmış bir konsantrasyona sahip iyi homojenize edilmiş bir yumurta süspansiyonu hazırlayın (bkz. Bölüm 2).
      2. İlaç çözeltisi içeren her kuyuya eşit miktarda yumurta süspansiyonu ekleyin. Kuyu başına son hacim olarak 200 μL kullanın.
      3. Yumurta yoğunluğunu her kuyuda en az 30 yumurtaya ayarlayın (ideal olarak 30–100). Kuyu başına 100 yumurtayı aşmayın, çünkü aşırı kalabalıklık manuel ölçümünü önemli ölçüde zorlaştırır. Bireysel yumurtaları ayırt etmek zorlaşırken, hareketli L1 larvalar kuyu boyunca aktif olarak yüzer, sayma doğruluğunu azaltır ve deneysel değişkenliği artırır.
      4. Dağıtmadan önce yumurta süspansiyonunu nazikçe karıştırarak eşit dağılımı sağlar.
   4. Plakayı dikkatlice yükleyin. Hava kabarcıklarını sokmaktan kaçının. Çapraz kontaminasyonu önlemek için düzenli olarak pipet yapın ve koşullar arasında uç değiştirin. Tüm içeriğin kuyrukların dibine yerleştiğinden emin olmak için plakaya hafifçe dokunun.
   5. Kuluçka koşulları: Yumurta izolasyonundan sonra toplam 24 saat boyunca kontrollü ve nemli koşullarda 20–22 °C sıcaklıkta kuluçka yapın.
      NOT: Dış kuyulardan kaçınarak veya buharlaşmayı azaltmak için tampon doldurarak değişkenliği en aza indirin. Plakaları nemli bir odada (örneğin, nemli kağıtla kapalı bir kap) kuluçka yapın ve ışığa duyarlı bileşiklerle çalışırken ışıktan korunun. İnkubasyon sırasında gereksiz hareketlerden kaçının. Tüm replikasyonlarda yumurta hazırlığı ve ilaç maruziyetinin tutarlı zamanlamasını koruyun; çünkü farklılıklar gelişim aşamasını ve veri yorumunu etkileyebilir.

5. Değerlendirme ve sayım

1. Yumurta izolasyonundan 24 saat sonra yumurta çıkışını değerlendirin, böylece kontrol koşullarının belirlenen sıcaklıkta tam çatlamasına ulaştığından emin olun. Bu zaman noktasını yumurta toplanma anından itibaren hesaplayın, böylece yeterli embriyonik gelişim sağlanır. Bu aşamada yumurtadan çıkmamış kalan yumurtaları tedaviden etkilenmiş olarak değerlendirin.
2. Örnekleri stereomikroskop altında inceleyin. Her koşul için (agar plakaları veya çoklu kuyulu plakalar), yumurtadan çıkmamış yumurta sayısını ve çatlamış L1 larva sayısını nicelikle hesaplayın.
3. Tüm gözlem alanını, plaka kenarları ve kuyu sınırları dahil olmak üzere, hareketli L1 larvaları bu bölgelerde eşit olmayan şekilde dağılıp birikebilir.
   NOT: Ek ekipman olmadan hızlı değerlendirme için doğrudan sayımı stereomikroskop altında gerçekleştirin. Koşullar arasında tutarlı yumurta yoğunluğunu koruyun, her koşul başına en az 3–5 teknik kopya kullanın ve güvenilir karşılaştırmalar için farklı yumurta hazırlıklarıyla en az üç bağımsız deney yapın.

6. Görüntü edinimi ve dokümantasyonu

1. Dijital kamerayla donatılmış bir stereomikroskop kullanarak görüntü alın. Agar plakaları için her dörtgenti kaydedin; Multiwell plakalar için her bir kiyi tek kaydedin. Tüm alanların yakalandığından emin olun; plaka kenarları ve larvaların birikebileceği kuyu sınırları dahil.
   NOT: Standart 10x okulluk ve objektifler, 0,6x'den 5x'e kadar değişen (toplam büyütme 6x ile 50x) arasında değişir ve sayma alanında hem yumurtaların hem de L1 larvaların net görselleştirilmesini sağlar. Iletim LED aydınlatma kullanın. Tüm deneysel koşullarda sürekli kamera alım ayarlarını (parlaklık, pozlama ve kontrast) koruyarak tutarlı görüntü kalitesi ve örnekler arasında güvenilir karşılaştırma sağlanır.
2. Görüntüleri yakalamak için uygun satın alma yazılımı kullanın. Görüntüleri görüntü analiz yazılımı kullanarak işleyin ve analiz edin. Tüm deneysel koşullarda aynı analiz parametrelerini koruyun; parlaklık, kontrast, büyütme, aynı alım alanı/alanı ve sayma kriterleri dahil.
3. Alınan görüntülerden yumurta çıkmamış yumurta ve L1 larva sayısını nicelikle ölçerin. Larvaların ancak yumurta kabuğundan tamamen çıktıklarında çatladığını düşünebilirsiniz. Kısmen çıkmış larvalar içeren yumurtalar ise yumurtadan çıkmamış olarak sınıflandırılmalıdır. Tüm deneysel koşullar için aynı sınıflandırma kriterleri uygulanır.
4. Yumurta çatlama inhibisyonunun geri dönüp dönmediğini değerlendirmek için 16–18 °C sıcaklıkta plakalar veya çoklu kuyu plakaları 12–24 saat ek kuluçka yapın. Tanımlanmış deneysel koşullar altında, bu aşamada yumurtadan çıkmamış kalan yumurtalar tedaviden etkilenmiş sayılır.

7. Veri analizi

1. Yumurta çatlama inhibisyonunu şu şekilde hesaplayın:
   Yumurtadan çıkmamış yumurtaların oranı = (Yumurtadan çıkmamış yumurta sayısı) / (toplam yumurta sayısı + larva)
2. Farklı yumurta partileriyle en az 3–5 bağımsız deney yapın. Veri ortalama ± standart sapma (ortalama SD ±) olarak ifade edilir.
3. Doğrusal olmayan regresyon kullanarak konsantrasyon-yanıt eğrileri oluşturun ve IC₅₀ değerlerini belirleyin.
4. Öğrencilerin t-testini kullanarak koşullar arasında istatistiksel karşılaştırmalar yapmak ve p < 0.05'te istatistiksel anlamlılığı tanımlamak.
5. Uygun istatistiksel yazılım kullanarak verileri analiz edin.

8. Trans-sinnamaldehit ve linalyl asetat kullanarak yumurta çatlama testlerinin uygulanması

NOT: Bu çalışma belirli bir bileşik üzerine odaklanmamaktadır; bunun yerine, her deneysel formatın benzer koşullarda nasıl uygulanabileceğini, kontrol edilebileceğini ve yorumlanabileceğini göstermek için temsilci ajanlar kullanır. Trans-sinnamaldehit (TCA), daha önce karakterize edilmiş ve burada sunulan üç test konfigürasyonu boyunca yumurta çatlamasını sağlam, tekrarlanabilir inhibisyon ürettiği için örnekleyici bir bileşik olarak seçilmiştir. Önemli olarak, TCA'nın dahil edilmesinin amacı, formatlar arasında göreceli potansiyel veya karşılaştırmalı performans belirlemek değil, protokol uygulamasını ve temsilci konsantrasyon-yanıt davranışını göstermekti.

1. Deneysel kurulum ve bileşik hazırlığı
   1. Agar tabaklarını (35 mm tabak başına 3 mL) 12–24 saat önce, sadece agar içeren ortamla (%1,7 damıtılmış suda) hazırlayın. Plakaları etiketleyin, saymayı kolaylaştırmak için dört dörtlüğe ayırın, susuzluğu önlemek için kapalı koşullarda saklayın ve kullanmadan önce oda sıcaklığında dengeleyin.
   2. DMSO'da taze trans-sinnamaldehit (TCA) stok çözeltileri hazırlayın ve bunları steril su veya agar'da seyreltirerek sekiz nihai konsantrasyon (0,05–0,7 mM) elde edinin. Tüm koşullarda nihai DMSO konsantrasyonunu %0,2'nin altında tutun. Su, agar ve/veya DMSO'yu sırasıyla negatif olarak ve araç kontrollerini ekleyin.
   3. Linalyl asetatı, 5 mM'de negatif bileşik kontrol olarak test edilerek testin aynı deneysel koşullarda aktif ve inaktif bileşikleri ayırt etme yeteneğini değerlendirir.
   4. Yukarıda açıklandığı gibi senkronize yumurta süspansiyonları hazırlayın ve yoğunluğu 100 μL'de 50–100 yumurta olarak ayarlayın. Tüm formatlarda eşit hacimler ve karşılaştırılabilir yumurta sayıları kullanın, böylece koşullar arasında tutarlılık sağlanır.
2. Referans bileşik kullanarak deneysel formatların uygulanması
   1. Mikrosantrifüj tüplerinde kısa süreli maruziyet (yüksek kontrol formatı)
      1. 500 μL yumurta süspansiyonu ile 0,05–0,7 mM TCA içeren 500 μL tedavi çözeltisi karıştırın. Tüpleri 18–20 °C sıcaklıkta 6 saat kuluçka yapın ve tüm deneylerde kuluçka süresini tutarlı şekilde koruyun.
      2. Tüpleri kuluçka sırasında rotator kullanarak sürekli nazik çaltlama altında tutun.
      3. Tüpleri 3.420 × g sıcaklığında 3 dakika (18–25 °C) santrifüjlenin ve süpernatantı dikkatlice çıkarın. Yumurtaları damıtılmış suyla üç kez yıkayarak kalan bileşikleri çıkarın ve belirlenen kuluçka döneminde maruziyeti sınırlayın.
      4. Son pelleti 240 μL damıtılmış suya yeniden askıda bırakın ve süspansiyon, her koşulda üç plaka kullanılarak dörtgen başına 20 μL oranında agar plakalarına örtülür. Yumurta izolasyonundan sonra plakaları 16–18 °C'de 24 saat boyunca kuluçka yapın.
   2. İlaç içeren agar plakalarına doğrudan maruz kalma
      1. İlaç içeren agar plakalarını, 50–55 °C soğutulanda agar'a TCA çözeltileri ekleyerek ve homojen dağılımın sağlanması için nazikçe karıştırarak hazırlayın. Her plaka başına yaklaşık 3 mL agar dökülür ve tabakları kullanımdan 12–24 saat önce hazırlayın.
      2. Tohum yumurtaları, diğer formatlarda kullanılanlara benzer yoğunluklarda (100 μL'de 50–100 yumurta) doğrudan plakaların yüzeyine bırakılır. Bu konfigürasyonda yıkama adımlarını yapmayın.
      3. Plakaları yumurta izolasyonundan 24 saat sonra 16–18 °C'de kuluçka altına alın.
   3. Çok kuyu plaka testi (orta ve yüksek verimli format)
      1. 96 kuyu plakalarını ilaç çözeltileri ve kontrollerle önceden yükleyin. Yumurta süspansiyonları eklenerek kuyu başına 200 μL nihai hacim ve 50–100 yumurta yoğunluğu elde edilir.
      2. Yükleme sırasında baloncuklardan kaçınarak ve kuyular arasında tutarlı hacim sağlayarak homojen dağılımı sağlayın. Yumurta izolasyonundan sonra 24 saat boyunca levhaları nemli koşullarda 20–22 °C sıcaklıkta kuluçka edin.
3. Görüntü edinimi ve niceliklendirme
   1. Yumurta izolasyonundan 24 saat sonra, yumurta çatlama tamamlandıktan sonra, kontrol koşullarında değerlendirin. Her durum için çıkmamış yumurta ve L1 larva sayısını stereomikroskop altında sayın. Plaka kenarlarını ve kuyu sınırlarını dikkatlice inceleyin, çünkü larvalar bu bölgelerde birikebilir.
   2. Belgeleme amacıyla dijital kamerayla donatılmış stereomikroskop kullanarak görüntü edinin. Her bir kadranı agar plakaları için kaydedin ve her kuyu çoklu kuyu plakaları için sistematik olarak görüntüleyin. Nicel belirlemeyi desteklemek için gerektiğinde görüntü analiz yazılımı kullanın.
   3. Görüntü alındıktan sonra plakaları ek 12–24 saat kuluçka altına alınarak gözlemlenen yumurta çıkışının inhibisyonunun geri dönüş olup olmadığını değerlendirin.
   4. Tüm deneyleri en az üç bağımsız biyolojik kopya kullanarak gerçekleştirin.

Sonuçlar

TCA, Şekil 1'de gösterildiği gibi, tüm deneysel formatlarda yumurta çatlama konusunda net konsantrasyona bağlı inhibisyon sağlamıştır. Her test konfigürasyonu için temsilci konsantrasyon–yanıt eğrileri sunulur: mikrosantrifüj tüpleri (Şekil 1A), agar plakalarında doğrudan maruz kalma (Şekil 1B) ve çoklu kuyu plakaları (Şekil 1C).

Tahmini IC₅₀...

Tartışma

Bu çalışma, Caenorhabditis elegans'ta yumurta çatlama testleri için basit ve uyarlanabilir bir platform sunar; kontrol, poz dinamikleri ve ölçeklenebilirlik açısından farklılık gösteren üç tamamlayıcı deneysel format etrafında yapılandırılmıştır. Tek bir optimal protokol tanımlamak yerine, sonuçlarımız yumurta çatlama testlerinin belirli deneysel hedeflere uyarlanabilir esnek bir metodolojik çerçeve olarak görülmesi gerektiği görüşünü destekler.

Mikro...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Bacteriological Agar	Britania	B0101406	taze hazırlanmalıdır (1.7 gr 100 mL H2O içinde)
Bleach solution	Yok	Yok	1.2 % (v/v) NaOH ve 0.5 M NaOH
Centrifuge	ThermoScientific.	Sorvall ST16R.
Centrifuge	BiofugePICO to eppendorf tube	Heraeus 75003235
Digital camera	ToupCam	TP605100A	Endüstriyel dijital kamera. Ayarlanabilir odak uzaklığı USB 2.0
DMSO	BioBasic	RAS#7-68-5	MW: 78,13
Linalil Acetate	SIGMA	No.CAS: 115-95-7	taze hazırlanmalıdır
Lysogeny broth (LB) medium	Yok	Yok	10 g Bakto-tripton, 5 g maya özü, 10 g NaCl 1 L destilasyon suyu içinde
M9 Buffer	Yok	Yok	3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g  NaCl, 0,25 g MgSO4 1 L destilasyon suyu içinde
Mini Rotator	BioSan	Bio RS-24
Nematode Growth Medium (NGM)	Yok	Yok	3 g NaCl, 17 g agar, 2,5 g  Bakto-Pepton 1 L destilasyon suyu içinde. Otoklavl ile sterilize edin. 1 mL kolesterol (5 mg/mL),  1 mL CaCl2 (1 M), 25 mL potasyum fosfat tamponu (1 M, pH 6.0) ve 1 mL  MgSO4 (1 M) ekleyin
Petri Dish (3 - 5 mm)	ThermoScientific. Nunclon DeltaSurface	153066
Petri Dish (90 mm x 15 mm)	ExtraGene	1026160305	Sadece laboratuvar kullanımı için, Polistiren.
Pipette	Fisherbrand	Yok
SigmaPlot 12.0	Systat Software	Yok	Versiyon 12.0
Stereomicroscope	ARCANO	ZTX-T 1:4 LED	Trinoküler stereomikroskop (10x–40x toplam büyütme; LED ışık geçiren ve yayan aydınlatma)
Sucrose	Laboratorio Cicarelli	Art 841	60 % (v/v) sukroz
Tissue culture plate 96 well	Biofil	TCP 012096	Polistiren, Düşük Buharlaşma Kapağı.
ToupView	ToupTek Photonics	Yok
Transcinnamaldehyde (TCA)	Santa Cruz Biotechnology	J1712	Taze hazırlanmalıdır