Glukokortikoid Reseptörü Aracılığıyla Kronik Obstruktif Akciğer Hastalığının Tedavisinde β-Sitosterol'ün Ağ Farmakolojisi ve Deneysel Araştırmaları

Özet

β-sitosterol, KOAH'yı hafifletmiş ve deksametazonun etkinliğini güçlendirmiştir; glukokortikoid reseptörü bu etkiyi aralemiştir. Ayrıca, β-sitosterol, hem CSE ile uyarlanan bronşiyal epitel hücrelerinde hem de sigara dumanı kaynaklı KOAH farelerinde iltihabı, oksidatif stresi ve hücresel yaşlanmayı azaltmıştır.

Özet

Kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), kalıcı iltihaplanma, oksidatif stres ve ilerleyici akciğer fonksiyon düşüşü ile karakterize edilen yaygın bir solunum bozukluğudur. KOAH'ta β-sitosterolün terapötik potansiyeli hâlâ belirsizdir. Bu çalışma, β-sitosterolün KOAH'ya karşı koruyucu etkilerini araştırmayı ve altta yatan mekanizmasını netleştirmeyi amaçladı. Veritabanı taraması, glukokortikoid reseptörünü (GR) β-sitosterolün potansiyel hedefi olarak belirledi. Sigara dumanı kaynaklı bir KOAH fare modeli ve sigara dumanı ekstraktı (CSE) ile uyarlanan BEAS-2B hücre modeli oluşturuldu. Akciğer fonksiyonu, akciğer hasarı ile ilgili belirteçler, iltihaplanma, oksidatif stres ve hücresel yaşlanma, (RT-qPCR), DCFH-DA floresan prob testleri ve yaşlanma tespit kitleri kullanılarak değerlendirildi. β-sitosterolün tek başına veya deksametazon (DEX) ile kombinasyonunun etkileri de değerlendirildi. β-sitosterol, hem CSE ile uyarlanan BEAS-2B hücrelerinde hem de sigara dumanına maruz kalan farelerde akciğer fonksiyonunu önemli ölçüde iyileştirdi, akciğer hasarı ile ilgili belirteçleri normalleştirdi ve iltihabı, oksidatif stresi ve hücresel yaşlanmayı azalttı. Bu koruyucu etkiler, GR ifadesinin artmasıyla birlikte gerçekleşti. Ayrıca, β-sitosterol DEX'e yanıt vermeyi artırdı ve β-sitosterol ile DEX ile kombinasyon tedavisi, sadece DEX tedavisine kıyasla akciğer fonksiyonu, akciğer hasarı belirteçleri, iltihaplanma, reaktif oksijen türleri seviyeleri ve hücresel yaşlanmada daha fazla iyileşme sağladı. Bu bulgular toplamda, β-sitosterol'ün GR ifadesini artırarak ve DEX'in terapötik etkinliğini artırarak KOAH ile ilişkili patolojik değişiklikleri en azından kısmen hafiflettiğini ve DEX'in tedavi için yardımcı strateji potansiyelini ortaya koyduğunu öne sürmektedir.

Giriş

Kronik obstruktif akciğer hastalığı (KOAH), kalıcı hava yolu iltihabı, alveolar hasar ve geri dönüşü olmayan hava akışı tıkanıklığı ile karakterize edilen ilerleyici bir solunum yolu hastalığıdır ve solunum fonksiyonunu bozur ve yaşam kalitesini^düşürür. Yaşla birlikte yaygınlığı önemli ölçüde artar ve altmış beş yaş ve üzeri kişiler için risk, kırk² yaş altındakilerin yaklaşık beş katıdır. Bu demografik eğilim, artan hastalık sisidanlığı, ölüm oranı ve engellilikle^{ilişkilidir 3}. Epidemiyolojik projeksiyonlar, 2030 yılına kadar KOAH'nin dünya çapında dördüncü en çok ölüm nedeni olabileceğini ve tüm ölümlerin yaklaşık %5'ini^{oluşturabileceğini (4,5,6}) göstermektedir. Şu anda belirlenen risk faktörleri arasında genetik yatkınlık, akciğer displazi, partikül madde maruziyeti, kronik bronşit ve solunum yolu^{enfeksiyonu yer almaktadır 7}.

Risk faktörleri arasında, sigara dumanı KOAH^8'in en önemli patojenik faktörüdür. Bronş epitel hasarına yol açabilen, inflamatuar hücrelerin sızmasını teşvik edebilen ve akciğer dokusunun yeniden şekillenmesine yol açabilen binlerce kimyasal^{içerir 9}. Uzun vadeli maruziyet, kalıcı ve geri dönüşü olmayan epitel hasarına neden olabilir, çok sayıda pro-inflamatuar kemokinin salınımını teşvik edebilir, (ROS) üretimini önemli ölçüde artırabilir ve hücre^{apoptozunu tetikleyebilir 10}. Birçok çalışma, interleukin-8 (IL-8) ve tümör nekroz faktörü-α (TNF-α gibi pro-inflamatuar kemokinin artan seviyelerinin, aşırı ROS üretimi ve hücresel yaşlanma ile birlikte KOAH ^11,12'nin şiddetiyle yakından ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu durum, KOAH'ta koruyucu ve terapötik etkiler yaratmak için bu temel patojenik faktörleri etkili ve güvenli şekilde modüle edebilen ajanlara olan ihtiyacı vurgulamaktadır.

Fitosteroller, bitki hücre zarlarında yaygın bulunan doğal biyoaktif bileşiklerdir. Bunlar arasında β-sitosterol en bol olanıdır ve sebzeler, kuruyemişler, tohumlar ve zeytinyağı gibi lipid açısından zengin bitki kaynaklı gıdalarda^{yaygın olarak dağılır} 13,14,15,16. Çalışmalar, fare ve farelerde 1000 mg/kg'ya kadar dozlarda β-sitosterol uygulanmasının sitotoksisite veya genotoksisite ile ilişkili^{olmadığını doğrulamıştır 17}. Ayrıca, araştırmalar β-sitosterolün antioksidan enzimler ve insan östrojen reseptörleri üzerindeki etkileri sayesinde antioksidan özellikler sergilediğini^{göstermiştir 18}.

β-sitosterol, anti-inflamatuar¹⁹, antipiretik²⁰, analjezik²¹ ve antidiyabetik etkiler dahil olmak üzere geniş bir farmakolojik aktivite yelpazesi^{gösterir 13}. Ayrıca kolit ve bağırsak^{iltihabı 22} gibi çeşitli hastalık modellerinde terapötik potansiyel göstermiştir ve anti-aterosklerotik²³ ile immünomodülatör^{özelliklere sahiptir 24}. Ayrıca, avantajlı bir güvenlik profili vardır. Bu özellikler göz önüne alındığında, β-sitosterol potansiyel bir ilaç adayı olarak büyük ilgi çekmiştir. Ancak, KOAH'taki kesin rolü ve altta yatan mekanizmaları büyük ölçüde belirsizdir.

Bu nedenle, bu çalışma KOAH'ta β-sitosterolün potansiyel terapötik etkilerini ve altta yatan mekanizmalarını incelemeyi amaçlamıştır. Özellikle, β-sitosterolün CSE aracılı hücresel hasarı etkili bir şekilde hafifledip hafifletemeyeceğini değerlendirmek için bir sigara dumanı ekstraktı (CSE) kaynaklı BEAS-2B hücre hasarı modeli kullanıldı ve böylece KOAH tedavi stratejileri için yeni bir aday molekül belirlendi.

Protokol

Çalışma, deneysel ve klinik çalışmalar için Temel ve Klinik Farmakoloji ve Toksikoloji rehberlerine^{uygun olarak yürütülmüştür.} Tüm hayvan deney protokolleri, Zhejiang Üniversitesi Tıp Fakültesi'nin İkinci Bağlı Hastanesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmış (Onay No. 20230102) ve tüm deneyler Hayvan Etik Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Çalışma, ARRIVE yönergeleriyle uyumlu şekilde yürütülmüştür.

Ana bileşenlerin ve hedeflerin ağ farmakolojisi yoluyla taraması

Fritillaria cirrhosa D. Don, Lonicera japonica Thunb., Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq. ve Adenophora stricta Miq. aktif bileşenleri. Geleneksel Çin Tıbbı Sistemleri Farmakoloji Veritabanı'ndan (TCMSP; erişim tarihi: 12 Mart 2024) alınmıştır. Aday bileşikler şu ADME kriterlerine göre tarandı: ağızdan biyoyararlanılım (OB) ≥ %30, ilaç benzerliği (DL) ≥ 0,18 ve Caco-2 geçirgenliği ≥ −0,4,4^%25. Üç kriterin tamamını karşılayan bileşikler, sonraki analizler için aday aktif bileşen olarak korundu.

β-sitosterol'ün kanonik Basitleştirilmiş Moleküler Giriş Hattı Giriş Sistemi (SMILES) yapısı, PubChem'den (erişim tarihi: 18 Mart 2024) alınmış ve hedef tahmini için SwissTargetPrediction'a (erişim tarihi: 21 Mart 2024) aktarılmıştır. Homo sapiens hedef tür olarak seçildi. Potansiyel hedefler, β-sitosterol ile veritabanındaki bilinen ligandlar arasındaki 2D ve 3D yapısal benzerliğe dayanarak tahmin edildi. 0'dan büyük olasılıkla tahmin edilen hedefler korundu ve tekrarlı girişler kaldırıldı.

KOAH ile ilişkili genler, Terapötik Hedef Veritabanı (TTD; erişim tarihi: 25 Mart 2024) ve Karşılaştırmalı Toksikogenomik Veritabanı (CTD; erişim tarihi: 28 Mart 2024) üzerinden "kronik obstrüktif akciğer hastalığı" anahtar kelimesi kullanılarak alındı. Kopya genler çıkarıldıktan sonra, KOAH ile ilişkili genler, tahmin edilen β-sitosterol hedefleriyle kesiştirilerek β-sitosterolün KOAH'ya karşı terapötik etkilerinde potansiyel olarak rol oynayan aday hedefler belirlendi.

β-sitosterol ve GR'nin moleküler kenetlenmesi

SDF formatındaki β-sitosterolün üç boyutlu yapısı PubChem veritabanından (erişim tarihi: 2 Haziran 2026) alındı; glukokortikoid reseptörünün (GR) kristal yapısı ise Yapısal Biyoinformatik Protein Veri Bankası Araştırma Laboratuvarı'ndan (RCSB PDB; erişim tarihi: 3 Haziran 2026) alındı. Ligand ve reseptör yapılarının standart hazırlanmasından sonra, moleküler kenetlenme CB-Dock2 çevrimiçi platformu kullanılarak gerçekleştirildi (erişim tarihi: 3 Haziran 2026). Hazırlanan ligand ve reseptör dosyaları platforma yüklendi ve kenetlenme hesaplamaları varsayılan parametrelerle yapıldı.

Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) fonksiyonel zenginleştirme analizi

β-sitosterolün tahmin edilen tüm hedef genleri GO fonksiyonel zenginleştirme ve KEGG yol zenginleştirme analizlerine tabi tutuldu. Zenginleştirme sonuçları, önemli ölçüde zenginleşmiş biyolojik süreçler, hücresel bileşenler, moleküler fonksiyonlar ve sinyal yolları dahil olup, sonraki biyoinformatik analiz için Ek Dosya 1'de sıralandı ve saklandı.

Hayvan modelleme ve gruplama

Örneklem büyüklüğü, G*Power yazılımı kullanılarak önceden güç analizi yapılan (α = 0.05, güç = 0.80) ve n = 6'nın karşılaştırılabilir deneysel koşullarda biyolojik olarak ilgili farklılıkları tespit etmek için yeterli olduğunu gösteren bir çalışmaya dayanarak grup başına altı hayvan olarak^{belirlendi 26}. 6–8 haftalık (20 ± 2 g) erkek C57BL/6 fareleri rastgele beş gruba ayrıldı: kontrol grubu, KOAH model grubu, KOAH + deksametazon (DEX) grubu, KOAH + β-sitosterol grubu ve KOAH + DEX + β-sitosterol grubu. Fareler standart laboratuvar koşullarında (25 °C, 12 saat ışık/karanlık döngü) tutuldu ve standart yemek ve suya serbest erişim sağlandı ve deneylerden önce 1 hafta boyunca uyum sağlamalarına izin verildi.

KOAH modelinin oluşturulması için, fareler tüm vücut sigara dumanına maruz kalma odasına (63 cm × 55 cm × 45 cm) yerleştirildi ve 12 hafta boyunca ana akım sigara dumanına maruz bırakıldı. Her sigara 10 mg katran, 0,9 mg nikotin ve 10 mg karbon monoksit içeriyordu. Dumana maruz kalma, günde iki kez (haftada 5 gün) sabah 09:30 ve 15:00'te gerçekleştirildi; 18 sigaradan oluşan duman her seans²⁷ 90 dakika boyunca odaya getirildi.

Müdahalelerin terapötik etkilerini değerlendirmek için, 8 haftalık sigara dumanına maruz kaldıktan sonra ilaç uygulaması başlatıldı ve kalan 4 hafta boyunca devam etti. 9. haftadan itibaren, ilgili tedavi gruplarındaki farelere sigara dumanına maruz kalmadan 1 saat önce günlük intragastrik DEX (1 mg/kg⁾²⁸ veya β-sitosterol (50 mg/kg)^29,30 verildi. Önceki farmakokinetik çalışmalar, kemirgenlerde β-sitosterol için yaklaşık %4 ağızdan biyoyararlanılım bildirmiştir³¹. Ayrıca, birkaç fare çalışmasında 20 ila 50 mg/kg³² arasında dozlar kullanılmıştır. Bu nedenle, yeterli sistemik maruziyeti sağlamak ve preklinik çalışmalarda yaygın kullanılan aralık içinde kalmak için 50 mg/kg doz seçildi.

Kontrol grubundaki fareler filtrelenmiş oda havasına maruz kalırken, model ve tedavi gruplarındaki fareler araç olarak eşdeğer miktarda normal tuzlu su aldı. Deneysel dönemin sonunda, fareler izofluran ile derin anestezi altına alınarak pedal refleksini kaybetti ve karın aortası kan toplama yoluyla exkanguinasyonla ötanize edildi. Toraks boşluğu hemen açıldı ve sağlam iki taraflı akciğer dokuları dikkatlice kesildi, buz soğukluğu fosfatlı tuzlu su (PBS) ile duruldu ve buz üzerine kondu. Bronkoalveolyar lavaj sıvısı (BALF) toplamak için, trakea kanülasyon edilip soğuk steril PBS ile yıkandı; PBS nazikçe aşılanıp tekrar tekrar çekilerek lavaj sıvısı toplandı. Akciğer dokuları ve BALF örnekleri buz üzerinde tutuldu ve ardından aşağı akış analizleri için işlendi.

BEAS-2B hücre kültürü

BEAS-2B insan bronşial epitel hücreleri, Dulbecco'nun Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F12) içinde tutuldu; bu hücreler %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin içeren, %5 CO₂ altında 37 °C'de tutuldu.

CSE hazırlığı ve BEAS-2B hücre maruziyeti

BEAS-2B hücreleri, fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla yıkanıp 24 kuyu tabaklarına üçlü olarak tohumlanmış, her kuyu başına 5 ×^{10 4} hücre yoğunluğunda tohumlanmıştır. 12 saatlik kültür sonrası hücreler yaklaşık %60 birleşmeye ulaştı ve ardından CSE'ye maruz kaldılar. CSE, daha önce tarif edildiği gibi taze hazırlanmış, küçük^{değişikliklerle 33}. Kısa bir süreliğine, filtrelenmemiş bir ticari sigara sürekli yakıldı ve ana akım duman yaklaşık 5 dakika boyunca 1,05 L/dakika sabit akış hızında (yaklaşık −11 kPa negatif basınç) vakum pompası ile 10 mL serumsuz ortama kabarcıklandı, ta ki sigara tamamen yanana kadar. Elde edilen çözelti önce büyük partikül safsızlıkları çıkarmak için ön filtreleme geçirildi, ardından kalıntı partikülleri ortadan kaldırmak için 0,22 μm steril mikrogözenekli filtre ile sterilize edildi; ortaya çıkan stok çözümü %100 CSE olarak tanımlandı. Tüm taze hazırlanmış KS, filtreleme sonrası hücre tedavisinde depolanmadan hemen sonra kullanıldı. Hücreler, %2,5 CSE içeren ortamla uyarıldı. 24 saatlik CSE tedavisinden sonra, kültür süpernatantları toplanıp -40 °C'de depolanarak sonraki analiz^{için 34}.

Nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR)

Toplam RNA, BEAS-2B hücrelerinden toplam RNA çıkarma kiti kullanılarak çıkarıldı ve üreticilerin talimatlarına göre ters transkripsiyon kiti kullanılarak cDNA'ya ters-transkribe edildi. RT-qPCR daha sonra gerçek zamanlı PCR tespit sistemi ve SYBR Yeşil tabanlı qPCR master karışımı kullanılarak gerçekleştirildi. Tüm RT-qPCR deneyleri, veri güvenilirliğini sağlamak için her örnek başına üç biyolojik ve üç teknik replika ile gerçekleştirildi.

Her qPCR reaksiyonu, toplam 20 μL hacimde gerçekleştirildi; 10 μL SYBR Green qPCR master karışımı, 0,4 μL ön astar, 0,4 μL ters primer, 2 μL seyreltilmiş cDNA şablonu ve 7,2 μL RNase içermeyen su içeriyordu. Amplifikasyon koşulları şöyleydi: başlangıçta 95 °C'de 3 dakika denatürasyon, ardından 95 °C'de 10 saniye boyunca 40 döngü denatürasyon ve 30 saniye boyunca 60 °C'de tavlama/uzatma. Göreceli gen ifade seviyeleri 2^−ΔΔCt yöntemiyle hesaplandı ve GAPDH dahili referans gen olarak hizmet verdi. Bu çalışmada kullanılan primer dizileri, Ek Tablo 1'de belirtilmiştir.

Hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) analizi

BEAS-2B hücrelerinde hücre içi ROS üretimi, florojenik prob 2′,7′-diklorodihidroflorescein diacetate (DCFH-DA) kullanılarak değerlendirildi ve akış sitometrisiyle analiz edildi. Akış sitometrik alım sırasında, hücresel döküntüleri dışlamak ve sağlam tek hücreleri seçmek için standart bir ileri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) kapı stratejisi uygulandı. Her örnek için toplam 10.000 geçerli hücresel olay elde edildi. Uyarılma ve emisyon dalga boyları sırasıyla 488 nm ve 525 nm olarak ayarlandı. Akış sitometrik verileri daha sonra hücre içi ROS floresans yoğunluğu nicelendirilmek için analiz edildi.

Malondialdehit (MDA) seviyesi belirleme

Hücre içi MDA içeriği, üreticinin talimatlarına göre lipid peroksidasyon test kiti kullanılarak ölçüldü. Kısa süreliğine, işlenmiş BEAS-2B hücreleri toplanıp lizlendi, ardından düşük sıcaklıkta santrifüjlenerek süpernatan toplandı. Daha sonra tiyobarbiturik asit (TBA) kolorimetrik reaksiyonu gerçekleştirildi ve mikroplaka okuyucu kullanılarak 532 nm soğurma oranı ölçüldü. Göreceli MDA seviyeleri standart eğriye göre hesaplandı.

Hücre yaşlanması değerlendirmesi

Hücresel yaşlanma, yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-gal) aktivitesine dayalı bir yaşlanma tespit testi kullanılarak değerlendirildi. SA-β-gal-pozitif hücreler akış sitometrisiyle nicelendirildi. Paralel olarak, yaşlanma ile ilişkili belirteçler p53 ve p21'in mRNA ekspresyon seviyeleri RT-qPCR ile belirlendi.

Hücre proliferasyon testi

Hücre çoğalması, kolorimetrik hücre canlılık testi kiti kullanılarak değerlendirildi. Absorbans 450 nm olarak mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçüldü.

GR çökme testi

Hücre transfeksiyonu lipid bazlı bir transfeksiyon reaktifi kullanılarak gerçekleştirildi. Aşağıdaki oligonukleotidler transfekte edildi: glukokortikoid reseptör-hedefleyen küçük interferens RNA (si-GR) ve negatif kontrol küçük interferenif RNA (si-NC). GR hedefleyen aday siRNA dizileri, çevrimiçi biyoinformatik platformu siDirect 2.0 kullanılarak tasarlanmıştır. Transfeksiyondan sonra hücreler 48 saat kültürlendi ve tüm siRNA'lar son konsantrasyon 50 nM'de kullanıldı. Knockdown verimliliği, RT-qPCR kullanılarak GR mRNA ekspresyonunun ölçülmesiyle doğrulandı.

Araç kontrol grupları hem β-sitosterol tedavisi hem de transfeksiyon deneylerine dahil edildi. β-sitosterol müdahalesinde, sadece araç çözücüsiyle işlenmiş hücreler araç kontrol grubu olarak kullanıldı (CSE+0 olarak gösterilir). İstatistiksel analiz, araç kontrol ve boş kontrol grupları arasında anlamlı bir fark gözlemlenmediğini doğruladı.

İstatistiksel analiz

Tüm nicel sonuçlar, üç biyolojik olarak bağımsız in vitro deneyden ortalama ± standart sapma olarak ifade edildi. İstatistiksel analizler istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. Shapiro–Wilk testi, istatistiksel testlerden önce veri seti dağılımının normalliğini incelemek için kullanıldı; Bonferroni post-hoc düzeltmesi, varyans analizinden (ANOVA) sonra çoklu karşılaştırmalar için P değerlerini ayarlamak amacıyla benimsenmiştir. İki grup arasındaki karşılaştırmalar, eşleşmemiş bir öğrencinin t-testi ile değerlendirilirken, çoklu grup karşılaştırmaları için tek veya iki yönlü ANOVA kullanıldı. P ≤ değeri 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Sonuçlar

β-sitosterol, KOAH tedavisinde potansiyel bir doğal üründü

Fritillaria cirrhosa D. Don'un rapor edilen iyileştirici etkileri nedeniyle, Lonicera japonica Thunb.'un kuru çiçeği, Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq.'nin kuru kökü ve Adenophora stricta Miq. Akciğer hastalıklarının^tedavisinde 35,36,37,38, bu çalışma TCMSP veritabanını kullanarak bu Geleneksel Çin Tıbbı (TCM) bitkilerinin aktif bileşenlerini sistematik olarak tanımladı β-sitosterol, bu TCM bitkileri tarafından paylaşılan önemli bir aktif bileşen olarak tanımlandı (Şekil 1A). β-sitosterolün temel moleküler mekanizmasını sistematik olarak incelemek için, SMILES yapısal bilgileri PubChem veritabanından alındı ve hedef tahmini için SwissTargetPrediction veritabanına aktarıldı; 0'ın üzerinde öngörü olasılığı olan tüm öngörülen hedefler sonraki analizler için tutuldu. β-sitosterol ile aday hedefleri arasındaki ortaya çıkan bileşen-hedef etkileşim ağı görselleştirilmiş ve Şekil 1B'de sunulmuştur. SwissTargetPrediction veritabanı kullanılarak toplam 43 varsayılan hedef geni β-sitosterol tahmin edilmiştir. Sonrasında, β-sitosterolün hedef genleri üzerinde GO fonksiyonel zenginleştirme ve KEGG yol zenginleştirme analizleri yapıldı ve tüm tam zenginleştirme veri setleri Ek Dosya 1'de arşivlendi. Özellikle, steroid metabolik süreçleri en önemli şekilde zenginleşen yollardan biri olarak tanımlanmıştır. Birikmiş literatür, KOAH^39'da anormal steroid metabolizması ile glukokortikoid direnci arasındaki sıkı ilişkiyi göstermiştir. Ayrıca, GR steroid metabolizmasına bağlı fonksiyonel kümelerde belirgin şekilde zenginleşmiştir. Bu bulgu, β-sitosterolün DEX hassasiyetini artırdığı ve GR ifade seviyelerini nasıl değiştirdiği mekanizmasını inceleyen sonraki hücresel deneylerimiz için kritik biyoinformatik destek sağlar.

KOAH ile ilgili genler TTD ve CTD veritabanlarından alındı. Sonraki Venn kesişim analizi (Şekil 1C), β-sitosterol hedefleri ile TTD kaynaklı KOAH genleri arasında iki örtüşen gen, β-sitosterol hedefleri ile CTD kaynaklı KOAH genleri arasında iki üst üste binen gen ve TTD ile CTD veri setleri arasında beş ortak KOAH genini ortaya koydu. Sonuç olarak, GR, üç veri setinin ortak tek geniydi ve KOAH'ya karşı β-sitosterolün temel hedefi olarak tanımlandı. Venn analizinin ayrıntılı sayısal verileri Ek Dosya 2'de listelenmiştir. Bağlanma afinitesinin daha fazla doğrulanması için β-sitosterolün GR ile moleküler kesilmesi gerçekleştirildi (Şekil 1D). −7.0 kcal/mol'dan düşük Vina puanına sahip bağlanma cepleri olumlu bağlanma eğilimi gösterdiği düşünülmüştür. C1 ve C5 ceplerinin Vina skorları sırasıyla −8.8 ve −7.2 kcal/mol olup, β-sitosterol ile GR arasında güçlü bir öngörülen etkileşimi göstermektedir.

β-sitosterol, BEAS-2B hücrelerini yüksek GR ifadesiyle ilişkili olabilecek CSE hasarından korur

β-sitosterol, CSE tarafından indüklenen BEAS-2B hücre hasarı modelinde önemli bir koruyucu etki göstermiştir. CSE + 0 grubu, β-sitosterol olmadan eşit miktarda ilaç çözücü içeren bir araç kontrol olarak tasarlandı. Beklendiği gibi, CSE ile CSE + 0 grupları arasında anlamlı bir fark bulunmadı. Bu bileşik, konsantrasyona bağlı olarak CSE kaynaklı TNF-α ve IL-6 üretimini inhibe etmiş (Şekil 2A). Ayrıca hücre içi ROS seviyelerini azalttı (Şekil 2B). β-sitosterol ayrıca MDA içeriğini anlamlı şekilde azalttı (Şekil 2C), CSE kaynaklı hücresel yaşlanmayı baskıladı (Şekil 2D) ve yaşlanmaya bağlı belirteçler p53 ve p21'i aşağı regule etti (Şekil 2E). Bu etkiler, GR mRNA ekspresyonunun yukarı regülasyonla birlikte gerçekleşti (Şekil 2F), koruyucu fonksiyonunun GR'nin transkripsiyonel yukarı regülasyonuyla yakından bağlantılı olabileceğini göstermektedir. Test edilen konsantrasyon aralığında, β-sitosterol BEAS-2B hücre canlılığına belirgin bir sitotoksisite uygulamadı (Şekil 2G), bu da bu bileşiğe karşı olumlu hücresel toleransı göstermektedir. 20 μg/mL (yaklaşık 48,2 μM) en güçlü inhibitör etkileri gösterdiği için, bu doz sonraki deneyler için seçildi. 10 μg/mL ile 20 μg/mL grupları arasında pro-inflamatuar sitokinlerin baskılanması konusunda istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlemlenmemiş olsa da, 20 μg/mL β-sitosterol inflamatuar faktör seviyelerinde hafif bir düşüş eğilimi gösterdi. Ayrıca, 10 μg/mL ile karşılaştırıldığında, 20 μg/mL CSE kaynaklı ROS ve MDA birikimini inhibe etmede, hücresel yaşlanmanı azaltmada ve GR mRNA ifadesini artırmada üstün etkililik sağlamıştır. Bu, takip kurtarma testleri için optimal çalışma konsantrasyonu olarak 20 μg/mL seçilmesini destekledi.

RT-qPCR sonuçları (Şekil 2H) başarılı GR knockdown'u doğruladı. Si-GR grubundaki GR mRNA seviyeleri, si-NC kontrolüne kıyasla yaklaşık %78 azalmış, bu da sonraki kurtarma testleri için GR susturmanın verimliliğini doğrulamıştır. GR etkisinden sonra, β-sitosterolün inflamatuar faktörler ve ROS üzerindeki inhibitör etkileri anlamlı şekilde tersine döndü (Şekil 2I, J). Benzer şekilde, hücresel yaşlanmanın β-sitosterol ile zayıflatılması da kaldırıldı (Şekil 2K). Bu sonuçlar bir arada ele alındığında, β-sitosterol'ün GR aracılı anti-inflamatuar, antioksidasyon ve yaşlanma karşıtı mekanizmalar aracılığıyla bronşiyal epitel hücrelerine yönelik CSE kaynaklı hasara karşı koruyucu bir rol oynadığını gösterdi.

β-sitosterol, DEX'in akciğer fonksiyonu ve iltihabı üzerindeki terapötik etkilerini bir fare modelinde KOAH olarak artırdı

Sigara dumanı maruziyetiyle belirlenen bir fare modelinde KOAH, β-sitosterol, DEX veya bunların kombinasyonuyla yapılan tedavinin hepsi belirgin koruyucu etkiler yaratmıştır. Birden fazla grup arasındaki istatistiksel karşılaştırmalar tek yönlü ANOVA kullanılarak analiz edildi ve ardından Tukey'nin post-hok testi yapıldı. Deneysel kohortları ayırt etmek için beş farklı sembol stili uygulandı: Kontrol grubu için daireler, Model grubu için üçgenler, Model + DEX grubu için yıldızlar, Model + β-sitosterol grubu için kareler ve Model + DEX + β-sitosterol grubu için elmaslar. Her yatay parantez, iki bağlantılı deneysel grup arasındaki istatistiksel bir karşılaştırmayı temsil eder.

Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, KOAH model grubundaki fareler zorla ekspirasyon hacminde 0.1 saniye (FEV₀.₁), zorunlu yaşam kapasitesi (FVC), zirve ekspirasyon akışı (PEF) ve FEV₀.₁/FVC oranında belirgin azalmalar göstermiştir. Şekil 3A–D'de gösterildiği gibi, %70'in altında olan FEV₀.₁/FVC oranı KOAH modelinin başarılı kurulduğunu doğrulamıştır. Sadece DEX veya β-sitosterol uygulanması, model farelere kıyasla bu pulmoner fonksiyon bozukluklarını anlamlı şekilde tersine çevirdi ve kombinasyon tedavisi, tek ajanla uygulanmaya kıyasla daha fazla iyileşme sağladı. Ayrıca, değişmiş MMP-9/TIMP-1 oranı hava yolu yeniden modellenmesinin karakteristik moleküler belirtejisidir ve yüksek MUC5AC ekspresyonu aşırı mukus aşırı^{salgılanmasını temsil eder 40,41}. MMP-9, TIMP-1 ve mukus belirteci MUC5AC'nin mRNA seviyelerini de tespit ettik ve MMP-9/TIMP-1 oranını hesapladık (Şekil 3E, F). Model grubu, MMP-9/TIMP-1 oranının belirgin şekilde arttığını ve MUC5AC ekspresyonu yükseldiğini gösterdi. DEX veya β-sitosterol tek başına her iki parametri de etkili şekilde azalttı ve kombinasyon tedavi, monoterapiye kıyasla daha iyi inhibitör etkinlik sağladı.

KOAH model farelerinde, TNF-α ve IL-6 BALF seviyelerinde belirgin yükselmeler ve kontrol farelerine göre akciğer ROS içeriğinin arttığı görüldü. Tek başına DEX veya β-sitosterol hem inflamatuar sitokin seviyelerini hem de oksidatif stresi belirgin şekilde azaltmış ve kombinasyon tedavisi daha güçlü inhibitör etkiler yaratmıştır (Şekil 3G, H). Ayrıca, KOAH model farelerde pulmoner GR mRNA ekspresyonu belirgin şekilde aşağı regülasyonludur. Tek başına DEX veya β-sitosterol GR ifadesini önemli ölçüde artırmış ve kombinasyon tedavisi GR seviyelerini daha da yükseltmiştir (Şekil 3I).

Bu bulgular toplamda, β-sitosterolün farelerde KOAH ile ilişkili patolojik değişikliklere karşı akciğer fonksiyonunu koruyarak, iltihabı inhibe ettiğini, oksidatif stresi azalttığını ve GR ifadesini yükselttiğini gösterdi. Ayrıca, β-sitosterolün birleşik uygulanması, bu modelde DEX'in koruyucu etkinliğini güçlendirmiştir.

β-sitosterol, CSE kaynaklı BEAS-2B hücre modelinde GR yolunun düzenlenmesi yoluyla DEX terapötik etkinliğini artırdı

CSE kaynaklı BEAS-2B hücre modelinde, DEX monoterapisi pro-inflamatuar sitokinlerin mRNA ekspresyonunu önemli ölçüde azalttı, hücre içi ROS ve MDA seviyelerini düşürdü ve yaşlanma belirteçleri p53 ile p21'in ifadesini ve yaşlanma oranını azalttı. Bu sonuçlar, DEX'in anti-inflamatuar, antioksidan ve anti-yaşlanma etkilerini doğrulamaktadır. Özellikle, β-sitosterolün birlikte uygulanması, DEX'in koruyucu etkilerini daha da artırmış ve DEX monoterapisine kıyasla iltihaplanma, oksidatif stres ve hücresel yaşlanmanın daha güçlü bastırılmasına yol açmıştır. DEX + β-sitosterol ortak tedavi grubunda GR knockdown (si-GR) olduğunda, kombine verilen tedaviye hücresel yanıt belirgin şekilde azaldı. Şekil 4A–E'de gösterildiği gibi, DEX ve β-sitosterol arasında iltihaplanma, oksidatif stres ve yaşlanmanın birlikte inhibisyonu anlamlı şekilde tersine çevrilmiştir; bu da GR eksikliğinin β-sitosterolün DEX etkinliği üzerindeki faydalı etkilerini zayıflattığını göstermektedir.

Bu bulgular toplamda, β-sitosterolün GR ile ilgili süreçleri düzenleyerek DEX etkinliğini artırdığını ve böylece DEX'in CSE kaynaklı bronşiyal epitel hücre hasarına karşı koruyucu etkilerini artırdığını göstermiştir.

VERİ ERIŞILEBILIRLIĞI:

Bu çalışmanın bulgularını destekleyen tüm ham veriler, ek materyallerde (Ek Dosya 1, Ek Dosya 2) sunulmaktadır.

Şekil 1: KOAH tedavisinde β-sitosterolün önemli rolü. (A) Fritillaria cirrhosa D. Don'da aktif bileşenler, Lonicera japonica Thunb.'un kurutulmuş çiçeği ve Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq. ve Adenophora stricta Miq. TCMSP veritabanı üzerinden incelendi. (B) β-sitosterolün potansiyel hedefleri. (C) β-sitosterol aşağı akış hedefleri ile KOAH ile ilgili genlerin kesişim analizi. (D) β-sitosterol ile GR proteini arasında moleküler kenetlenme analizi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: CSE kaynaklı hücre hasarına karşı β-sitosterol ile ilişkili korumada GR'nin katılımı. (A) β-sitosterol ile CSE kaynaklı inflamatuar mediatörlerin (TNF-α, IL-6) konsantrasyona bağlı modülasyonu. (B) β-sitosterol dozunun CSE'ye maruz kalmış hücrelerde ROS seviyesi üzerindeki etkileri. (C) β-sitosterol'ün CSE tarafından artırılmış MDA içeriği üzerindeki etkileri. (D) β-sitosterolün CSE tarafından desteklenen hücresel yaşlanma üzerindeki etkisi. (E) Yaşlanmaya bağlı p53 ve p21'in CSE uyarısı altında β-sitosterol ile modülasyonu. (F) CSE uyarısı altında GR ekspresyonunun β-sitosterol konsantrasyonuna bağlı regülasyonu. (G) BEAS-2B hücrelerinde test edilen konsantrasyonlar arasında β-sitosterolün hücre canlılığı. (H)GR hedefli siRNA transfeksiyonundan sonra etkisini doğrulamak için GR mRNA ekspresyonunun RT-qPCR tespiti. (I) GR ile β-sitosterol ile CSE kaynaklı inflamatuar faktörler arasındaki düzenleyici ilişki. (J) GR ile β-sitosterol arasındaki düzenleyici ilişki ile CSE kaynaklı ROS birikimi. (K) GR ile β-sitosterol ile CSE kaynaklı hücresel yaşlanma arasındaki düzenleyici ilişki. *p < 0.05; **p < 0.01; p < 0.001; NS, önemli değil. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: KOAH model farelerde β-sitosterolün DEX ile birleşen akciğer fonksiyonu, iltihap, oksidatif stres ve GR ifadesi üzerindeki etkileri. (A) KOAH farelerinde 0.1 saniye (FEV₀.₁) içinde zorla ekspirasyon hacmindeki değişiklikler. (B)KOAH farelerinde zorunlu hayati kapasite (FVC) değişiklikleri. (C) KOAH farelerinde zirve ekspirasyon akışı (PEF) üzerindeki etkiler. (D)KOAH model farelerde FEV₀.₁/FVC oranı. (E) MMP-9/TIMP-1'in hava yolu yeniden modelini yansıtan göreli mRNA oranı. (F) MUC5AC'nin göreli mRNA ekspresyonu fare akciğer dokularında mukus aşırı salgılanmasını gösterir. (G) Bronkoalveolar lavaj sıvısında (BALF) TNF-α ve IL-6 seviyeleri. (H)KOAH farelerinin akciğer dokusunda ROS üretimi. (Ben) Fare akciğer dokusunda GR'nin göreli mRNA ekspresyonu. *p < 0.05; **p < 0.01; p < 0.001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: CSE kaynaklı BEAS-2B hücrelerinde β-sitosterolün GR aracılı DEX direnci üzerindeki etkisi. (A) Her grupta inflamatuar faktörlerin (TNF-α, IL-6) göreli mRNA ekspresyonu. (B)Her grupta ROS seviyesi. (C)Her deneysel grupta MDA içeriği. (D) Her grupta yaşlanan BEAS-2B hücrelerinin yüzdesi. (E) Yaşlanma ile ilişkili belirteçler p53 ve p21'in göreli mRNA seviyeleri. **p < 0.01; p < 0.001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: RT-qPCR analizi için kullanılan primer dizileri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: β-sitosterol hedef genleri için tam GO ve KEGG zenginleştirme analiz veri setleri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: β-sitosterol ile KOAH arasındaki örtüşen hedefleri belirleyen Venn analizinin ayrıntılı sayısal sonuçları. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

KOAH, küresel düzeyde ciddi bir hastalık yükü oluşturur ve dünya çapında sağlık için büyük bir zorluk^{olmaya devam eder 1}. KOAH'nin mevcut yönetimi hem farmakolojik hem de farmakolojik olmayan müdahaleleri^{kapsar 42}. Farmakolojik tedaviler arasında, glukokortikosteroidler (GC) kronik inflamatuar bozukluklarda yaygın olarak kullanılır. GR'ye bağlanarak histon deasetilaz 2'yi transkripsiyonel komplekslere akılayarak histon^{asetilasyonunu 43 tersine çevirirler}. Ancak, birçok çalışma KOAH hastalarında GC hassasiyetinin azaldığını^{göstermiştir 44,45} ve araştırmalar bu hastalıkta GC direncinin kanıtlarını^{sağlamıştır 46}. Bu bulgular, GC direncini aşmanın önemli bir klinik zorluk olduğunu ve yeni tedavi etkenlere olan ihtiyacı vurguladığını göstermektedir. Bu nedenle, KOAH için daha etkili terapötik seçenekler belirlemek büyük öneme sahiptir.

Önceki çalışmalar, γ-sitosterolün KOAH^47'de bronşial epitel hücreleri üzerinde antiproliferatif bir etki yarattığını göstermiştir. γ-sitosterol ve β-sitosterol hem de fitosterollerin yaygın biyoaktif bileşenleri olduğundan, mevcut çalışma KOAH'ta fitosterol etkilerinin mevcut anlayışını genişletmekte ve hastalık patogenezinde β-sitosterolün potansiyel koruyucu değerini vurgulamaktadır. Bulgularımız, β-sitosterolün inflamatuar faktörlerin salınımını anlamlı şekilde inhibe ettiğini, oksidatif stresi azalttığını ve hücresel yaşlanmayı bastırdığını ortaya koydu. Bu, β-sitosterol'ün IL-6, indüklenebilir nitrik oksit sentazı ve TNF-α⁴⁸ gibi lipopolisakkaridle indüklenen inflamatuar aracıların yukarı regulasyonunu etkili bir şekilde bastırdığını gösteren önceki raporlarla tutarlıdır. Bu bulgular, anti-enflamatuar etkinliğini doğrulamaktadır ve farklı inflamatuar modellerde tutarlılığını desteklemektedir.

Soluma GC'ler, hava yolu iltihabını kontrol etmek için etkili anti-inflamatuar ajanlardır. Öncelikle GR^49'a bağlanarak ve etkinleştirerek hareket ederler. Ancak, KOAH'nin temel patolojik özelliği, hücrelerin GC'nin anti-inflamatuar etkilerine karşı hassasiyetinin^{azalmasıdır 44}. KR'nin aşağı regulasyonu veya fonksiyonel bozulması, KOAH hastalarında GC direncinin gelişiminin temel bir mekanizması olarak kabul^{edilir 50}. Önceki çalışmalar, bazı ilaçların GC hassasiyetini artırabileceğini göstermiştir. Örneğin, azitromisin ve budesonidin birleşimi, IL-4 ve CXCL8 üretimi üzerinde her iki ajanın tek başına⁵¹ kadar inhibitör etki yaratır.

Özellikle, mevcut çalışma, hem sigara dumanına maruz kalan KOAH fare modellerinde hem de CSE kaynaklı BEAS-2B hücre modellerinde, β-sitosterol ile DEX'in birleşiminin, yalnızca DEX'e kıyasla inflamatuar faktörler, oksidatif stres ve hücresel yaşlanma üzerinde anlamlı derecede güçlü inhibitör etkiler yarattığını bulmuştur. Bu kombinasyon, farelerde DEX'in KOAH ile ilişkili patolojik değişikliklere ve bronşiyal epitel hücre hasarına karşı koruyucu etkinliğini önemli ölçüde artırmıştır. Bu sonuç, β-sitosterolün bronşiyal epitel hücrelerinin DEX'e duyarlılığını artırabileceğini ve bazı KOAH hastalarında GC hassasiyetsizliği veya direncini ele almak için yeni bir yaklaşım sağlayabileceğini göstermektedir. In vitro nicel PCR sonuçlarıyla uyumlu olarak, β-sitosterol, GR mRNA seviyelerini konsantrasyona bağlı olarak yükseltir; doğrudan GR agonisti veya antagonisti olarak hizmet etmez. Doğrulanmış si-GR etkisi ve ardından yapılan fonksiyonel kurtarma testleri, β-sitosterol, GR'yi doğrudan aktive etmek yerine toplam hücre içi GR seviyelerini artırarak hücresel GC yanıtını artırdığını ve böylece kanonik bir GR agonisti olan DEX ile birleştiğinde gelişmiş terapötik etkiler yarattığını daha da doğrulamaktadır. Buna göre, GR ifadesindeki değişiklikler, β-sitosterolün etkisiyle ilişkilendirilebilir; bu, KOAH hastalarından alınan hava yolu düz kas hücrelerinde GR'nin ve aktif izoformunun GRα'nin belirgin şekilde azaldığı gözlemleriyle tutarlıdır⁵². Önemli olarak, GR etkisi deneyleri, bu reseptörün β-sitosterol aracılı sitokorumadaki merkezi rolünü daha da ortaya koydu ve β-sitosterolün bazı biyolojik işlevlerinin GR yolunun bütünlüğüne bağlı olduğunu gösterdi.

Bir arada ele alındığında, mevcut çalışma sadece GR'nin KOAH müdahalesinde β-sitosterolün önemli bir aracısı olabileceğini değil, aynı zamanda DEX direncinin klinik zorluğunu aşmak için potansiyel yeni bir yaklaşım sunmakta ve GR yolunu hedefleyen doğal yardımcı tedavilerin geliştirilmesi için deneysel bir temel oluşturmaktadır.

Ancak, mevcut çalışmanın birkaç sınırlaması vardı. İlk olarak, pulmoner fonksiyon yalnızca KOAH fare modelinin başarılı şekilde kurulmasını doğrulamak için değerlendirildi ve hematoksilin-eozin (HE) ile Masson boyama işlemi amfizem, hava yolu yeniden modellenmesi ve mukus aşırı sekreyonu gibi tipik patolojik özellikleri daha fazla doğrulamak için yapılmadı. Tüm sabit akciğer örnekleri önceki deneylerde tüketildiğinden, 12 haftalık sigara dumanı kaynaklı KOAH fare modelinin mevcut çalışma süresi içinde yeniden yapılması mümkün değildi. Bu sınırlamayı kısmen ele almak için, MMP-9/TIMP-1 oranı ve MUC5AC mRNA ifade seviyeleri korunan akciğer RNA örnekleri kullanılarak nicelendirilmiştir. İkinci olarak, in vivo yalnızca tek bir kombinasyon dozu β-sitosterol ve DEX değerlendirildi ve doz-yanıt veya sinerjik etkiler sistematik olarak araştırılmadı. Potansiyel sinergistik etkileşimleri karakterize etmek için çoklu doz kombinasyonlarını içeren ek çalışmalar gerekmektedir. Üçüncü olarak, deneysel kısıtlamalar ve araştırma maliyetleri nedeniyle, her gruba sadece altı fare dahil edildi. Görece küçük örneklem büyüklüğü, hayvanlar arası değişkenliğe karşı hassasiyeti artırmış ve bulguların istatistiksel sağlamlığını sınırlamış olabilir. Mevcut sonuçları daha da doğrulamak için daha büyük örneklem büyüklükleriyle gelecekteki çalışmalara ihtiyaç vardır. Dördüncüsü, stabil DEX'e dirençli hücre hatları belirlenemedi; Bu nedenle, β-sitosterolün yerleşik glukokortikoid direnci tersine çevirme yeteneği doğrudan değerlendirilemezdi. Bu potansiyel mekanizmayı daha da incelemek için doğrulanmış glukokortikoid-dirençli modeller kullanılarak ek çalışmalar yapılmalıdır.

Sonuç olarak, bu bulgular GR sinyalinin BEAS-2B hücrelerinde CSE kaynaklı hasara karşı β-sitosterolün koruyucu etkilerinde rol oynayabileceğini göstermektedir; bunlar arasında inflamatuar faktör salınımının inhibisyonu, oksidatif stres ve hücresel yaşlanma ile akciğer fonksiyonu ve akciğer hasarı biyobelirteçlerinde iyileşmeler de bulunmaktadır. Ayrıca, β-sitosterol bu hücrelerin DEX'e karşı terapötik duyarlılığını artırmıştır. Bu bulgular birlikte, β-sitosterol'ü KOAH için yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesine katkıda bulunabilecek potansiyel bir doğal aday molekül olarak tanımlıyor.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BEAS-2B human bronchial epithelial cells	SunnCell, Çin	SC-0218	In vitro çalışma için insan bronşiyal epitel hücre hattı
C57BL/6 fareler	Vital River Laboratories, Çin	213	Canlı deneyde KOAH için hayvan modeli
CB-DOCK2	Çin	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php	Ligand ve reseptör proteini arasındaki moleküler yerleştirme simülasyonu için
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	Beyotime Biotechnology, Çin	C0038	Hücre canlılığı ve proliferasyonunun tespiti
CellEvent™ Senescence Green Detection Kit	Thermo Fisher, ABD	C10851	Hücresel yaşlanmanın tespiti
Sigara	Hongta, Çin	Verilmedi	Duman maruziyeti ve CSE hazırlığı için kullanılan sigara
CTD	ABD	https://ctdbase.org/	KOAH ile ilgili genleri almak için
DCFH-DA floresan probu	Sigma-Aldrich, ABD	D6883-50MG	İntrasellüler ROS seviyesinin tespiti
Deksametazon (DEX)	Yeasen, Çin	40323ES03	Kombine müdahale için glukokortikoid
DMEM/F12 ortamı	Gibco, ABD	11330032	BEAS-2B hücre kültürü için bazal ortam
Fetal boğa serumu (FBS)	Gibco, ABD	10270106	Hücre kültür ortamı için takviye
GraphPad Prism	GraphPad Software, ABD	9.3.1	Veri istatistiksel analizi ve grafik çizimi
Izofluran	RWD Life Science, Çin	R510-22-10	Hayvan ötanazi için inhalasyon anestezisi
Lipid Peroksidasyon MDA Assay Kit	Beyotime Biotechnology, Çin	S0131S	İntrasellüler malondialdehit (MDA) içeriğinin tespiti
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher, ABD	11668030	siRNA teslimi için transfeksiyon reaktifi
Multimodlu mikroplaka okuyucu	Thermo Fisher, ABD	VL0000D0	Absorbans ve floresan değerinin tespiti
Navios EX Akış Sitometrisi	Beckman Coulter, ABD	B80912	ROS ve yaşlı hücrelerin analizi
Penisilin/streptomisin	HyClone, ABD	SV30010	Bakteryel kontaminasyonu önlemek için antibiyotik
Power SYBR™ Green Master Mix	Thermo Fisher, ABD	4367659	Floresan kuantitatif PCR amplifikasyonu
PrimeScript™ RT reaktifi Kiti	Takara, Japonya	RR037Q	cDNA sentezi için ters transkripsiyon
PubChem veritabanı	ABD	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/	Beta-sitosterolün kanonik SMILES dizisi ve 3D SDF yapı bilgisinin alınması için
QuantStudio Dx PCR Cihazı	Thermo Fisher, ABD	4479889	Gerçek zamanlı RT-qPCR tespiti
RCSB PDB	ABD	https://www.rcsb.org/	GR kristal 3D yapı dosyasının alınması için
RNA/Protein İzolasyon Kiti	Beyotime Biotechnology, Çin	R0018S	Hücre ve akciğer dokusundan toplam RNA ekstraksiyonu
si-GR	siDirect 2.1 üzerinden silico olarak tasarlanmış	Özel sentez	Rehber: 5′-UUUUGAAUGGGUGUAGCAA-3′; Yolcu: 5′-GCUUUCACCCAUUCAAAAGG-3′, GR için knockdown
si-NC	Thermo Fisher, ABD	4390843	Hücresel ve in vivo deneyler için negatif transfeksiyon kontrolü olarak kullanılır
SwissTargetPrediction veritabanı	İsviçre	http://swisstargetprediction.ch/	Potansiyel ilaçla ilgili protein hedeflerinin silico tahmini için
TCMSP veritabanı	Çin	https://www.tcmsp-e.com/	Bitkisel içerik taraması ve hedef tahmini için
TTD	Singapur	https://db.idrblab.net/ttd/	Onaylanmış KOAH ile ilişkili hastalık genlerinin toplanması için
Tüm vücut duman maruziyeti odası	Teague Enterprise, ABD	TE-2	Sigara dumanı kaynaklı KOAH modelinin kurulması
β-sitosterol	ChemicalBook, Çin	83-46-5	İlaç tedavisi için aktif fitosterol