Endoparazitoid eşek arısı Asobara japonica ve konak Drosophila melanogaster'in Verimli Yetiştirilmesi ve Fonksiyonel Analizi Protokolleri

Summary

Bu protokolün amacı, Asobara japonica ve Drosophila melanogaster'de parazitoid–konak etkileşimlerinin fonksiyonel analizini kolaylaştırmaktır. optimize edilmiş yetiştirme yöntemleri, tek yumurtlama enfeksiyonu testi ve RNAi aracılı gen etkisi aralı.

Abstract

Parazitizm, bir organizmanın diğerinin (konakçı) vücudunu veya kaynaklarını sömürdüğü biyolojik bir etkileşimdir ve bu da konakta ciddi hasar veya ölüme yol açar. Parazit hayvanlar arasında, parazitoid eşek arıları en tür açısından zengin soylardan biridir ve tüm böcek türlerinin neredeyse %20'sini oluşturur. Özellikle, endoparazitoid eşek arıları doğrudan konak vücutlarına yumurtlama yapar ve konak gelişimini, bağışıklığını ve fizyolojisini manipüle etmek için çeşitli zehir faktörleri kullanır. Eşek arısı saldırısına yanıt olarak, konakçılar parazitoid yumurtaları doğuştan gelen bağışıklık mekanizmalarıyla yok etmeye çalışır. Ancak, bireysel zehir bileşenlerinin konak biyolojisini modüle etme ve başarılı parazitizmi teşvik etme moleküler ve hücresel mekanizmaları hâlâ yeterince anlaşılmamaktadır. Burada, endoparazitoid eşek arısı Asobara japonica ve konakçısı Drosophila melanogaster'in yetiştirilmesi için standart bir laboratuvar protokolünü tanımlıyoruz. A. japonica'nın hem partenogenetik hem de cinsel suşları mevcuttur ve partenogenetik suş yüksek bir parazitizm başarı oranı sergiler; bu da genom analizi ve parazitizm testleri için laboratuvar stoklarının istikrarlı şekilde korunmasını sağlar. Zehir genlerinin fonksiyonel analizi için tek yumurtlama enfeksiyonu testi ve çift zincirli RNA tabanlı gen yok etme yöntemi optimize edildi. Bu protokoller birlikte, parazitoid-konak etkileşimlerinin altında yatan moleküler mekanizmaların incelenmesi için pratik bir deneysel çerçeve sağlar ve gelişimsel biyolojiy, immünoloji ve fizyoloji alanlarında gelecekteki araştırmaları kolaylaştıracaktır.

Introduction

Parazitizm, bir organizmanın diğerinin besin kaynaklarını kullandığı ve taksonlar arasında yaygın olduğu bir yaşam tarzıdır. Bilinen tüm organizmaların yarısına kadar yaşam döngülerinde parazitizm sergilediği^{tahmin edilmektedir 1}. Parazitler arasında, parazitoid eşek arıları özellikle çeşitli bir gruptur ve tüm böceklerin yaklaşık %20'sini^{oluşturur 2}. Böcekler, örümcekler ve akarlar gibi çok çeşitli artropod konakçılarını kullanır ve yaşam öyküleri ile parazitik stratejilerde olağanüstü çeşitlilik^{sergilerler 3}. Bu özellikler, parazitoid eşek arılarını evrimsel ve ekolojik olarak en başarılı böcek gruplarından biri yapar.

Parazitoidler ile konakçıları arasındaki etkileşimler, evrimsel "silahlanma yarışları" model sistemleri olarak kapsamlı şekilde incelenmiştir. Özellikle endoparazitoid eşek arıları, zehirler, simbiyotik virüsler ve teratositler dahil olmak üzere çeşitli faktörler yelpazesi^{kullanır 4,5}. Bu faktörler, konak fizyolojisini ve gelişimini manipüle eder ve böylece konak içinde başarılı gelişimi sağlar. Bu ilerlemelere rağmen, parazitizmin altında yatan moleküler mekanizmalar çoğu parazitoid türde yeterince anlaşılmamaktadır. Büyük bir sınırlama, küçük vücut boyutlarıdır ve bu da zehir bileşenlerinin biyokimyasal tanımlanmasını engellemiştir. Ayrıca, parazitoidleri ve konaklarını laboratuvar koşullarında senkronize gelişim aşamalarıyla korumak teknik olarak zordur.

Yeni nesil dizileme ve diğer omik teknolojilerindeki son gelişmeler, çok küçük parazitoid türlerde bile genom çapında analizler yapılmasını mümkün kılmaktadır. Bu yaklaşımlar, daha önce erişilemeyen moleküler mekanizmaların araştırılması için yeni yollar açmış ve parazitoid-konak etkileşimlerinin eşi benzeri görülmemiş bir çözünürlükle incelenmesini sağlamıştır. Bu bağlamda, laboratuvarımız Japonya'da ilk olarak tanımlanan Asobara japonica Belokobylskij  (Hymenoptera: Braconidae^{) üzerine odaklanmaktadır 6,7,8}. A. japonica, dişilerin çiftleşmeden yavrular ürettiği thelytokous partenogenetik bir suş içerir. Bu özellik, tüm genom dizileme için önemli miktarda genetik olarak uniform genomik DNA^{toplamamıza olanak tanır 9}. Ayrıca, bu tür, iyi kurulmuş yetiştirme koşulları ve kesin tanımlanmış gelişim evreleri sayesinde büyük deneysel avantajlar sunan, tekrarlanabilir enfeksiyon testleri ve parazitoid gelişiminin doğru kontrolünü sağlayan model organizma D. melanogaster  dahil olmak üzere geniş bir Drosophila türlerini parazite etmektedir^.

A. japonica parazitizmi sırasında, dişi eşek arısı zehri tek bir yumurta ile birlikte sinek larvasına enjekte eder; larvanın içinde bir eşek arısı larvası da konakçısının yanında büyür. Özellikle, A. japonica, konak D. melanogaster üzerinde yüksek bir parazitizm başarı oranı sergiler; bu da bu parazitoid-konak çiftini güçlü bir deneysel model yapar. Burada, A. japonica'da stabil yetiştirme protokollerini, tek yumurtlama enfeksiyon testi ve çift zincirli RNA (dsRNA) tabanlı gen knockdown yöntemini açıklıyoruz. Bu protokoller, parazitoid-konak etkileşimlerinin altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için güvenilir bir çerçeve sağlar.

Protocol

D. melanogaster ve A. japonica için senkronize yetiştirme yönteminin şematik bir özeti Şekil 1'de sunulmaktadır.

1. Konak meyve sineği Drosophila melanogaster'ın laboratuvarda yetiştirilmesi

1. Tüm deneysel hayvanları 12:12 saat ışık/karanlık döngüde 25 °C ve %50-60 göreli nemde tutun. A. japonica için konak olarak vahşi tip Oregon-R (OR) sürünü kullanın (Şekil 2A).
2. Yetişkin sinekleri, standart mısır unu-maya-agar ortamı (%0,55 agar, Tablo 1) içeren yeni bir gıda şişesine aktarın. Şişe, transfer tarihi ve sürün adı "OR" ile etiketleyin.
3. Bu yetişkin sinekleri transferden bir gün sonra temizleyin, böylece mamalarda aşırı sayıda yumurta oluşmasını önleyin. Yavru larvaların yiyeceğin yüzeyinde beslendiğinden emin olun.
   NOT: Bir rehber olarak, her gıda şişesi (φ30×100 mm) yaklaşık 200-250 yumurta bulundurun. Daha yüksek yumurta yoğunluğu, parazitizm başarısını azaltabilir ve konak ile eşek arı gelişimindeki çeşitliliği artırabilir.
4. Step 1.2'den dört gün sonra, bir kaşığı sinek larvasını (yumurta bıraktıktan 4 gün sonra, dAEL) yeni bir gıda şişesine aktarın. Bu larvaları bir sonraki nesil için parazitoidlere maruz bırakmasın. Bu prosedür ayrıca bir şişedeki konak larva yoğunluğunu kontrol etmeye yardımcı olur.

2. Endoparazitoid eşek arısı Asobara japonica'nın laboratuvarda yetiştirilmesi

1. Partenogenetik Tokyo (TK) ve cinsel bir Iriomote-jima (IR) suşunu kullanın (Şekil 2B). İlki dişilerden oluşurken, ikincisi dişiler ve erkeklerden oluşur. Erkekler dişilerden iki-dört gün erken ayrılır. Bu nedenle, nakildən önce dişi varlığını yumurta üreticileriyle doğrulayın.
2. 10-20 yetişkin eşek arısını stok şişeden doğrudan sinek larvaları içeren şişeye 4 dAEL ile aktarın. Şişeye transfer tarihi ve suş adı "TK" veya "IR" yazılı olarak etiketleyin. Eşek arılarını Step 1.1'deki koşullarda tutun.
3. Yetişkin eşek arılarının sinek larvalarında yumurtlama yapmasına izin verin. Bu eşek arılarını bir ila iki gün sonra temizleyin, böylece süperparazitizmi önleyin; çünkü bu konak ölümüne yol açabilir. Parazitizmden kaçan kapalı yetişkin sinekler 2.2. adımdan 10 veya daha fazla gün sonra alın.
4. Step 2.2'den iki hafta sonra, yetişkin eşek arıları konak sinek pupa kılıfından ayrılmaya başlar. Bu yeni kapatılmış yetişkin eşek arılarını %25 glikoz ve 50 mM C vitamini çözeltisi içeren filtre kağıdına sahip yeni bir gıda şişesine aktarın. Filtre kağıdı parçaları 130 °C'de 2 saat sterilize edilmelidir. Çözeltiyi filtre kağıdına sunmak, yumurtlama davranışlarını teşvik eder ve yetişkin eşek arılarının ömrünü uzatır. Yumurtalığı artırmak için C vitamini kullanma yaklaşımımız, Drosophila ^{çalışmaları 11'deki} gözlemlerden ilham aldı.

3. Tek Ovipozisyon Enfeksiyonu Testi

1. Enfeksiyon deneyi için kullanılan sinek larvalarının gelişim aşamasını senkronize edin.
   1. Yetişkin sinekleri, taze maya macunu ile serilmiş bir üzüm suyu agar tabağı (%3 agar) içeren 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve 24 saat boyunca yumurta bırakmalarına izin verin.
   2. Yeni çıkmış birinci dönem larvaları üzüm suyu agar tabağında toplayın ve bunları 2-3 g sinek maması macunu (uygun miktarda suyla karıştırılmış sinek maması) içeren küçük bir şişeye (12 mL) aktarın. 20-30 larva şişeye yerleştirilir. Sinek larvalarının 25 °C'de büyümesine izin verilir.
2. Uygun zamanda, yaklaşık 1,5-2,0 cm çapında bir alanı kaplayan ince, eşit yayılmış sinek maması tabakası içeren 4 cm uzunluğunda bir Petri kabı hazırlayın (bundan sonra enfeksiyon analiz alanı olarak adlandırılacaktır). Enfeksiyon test alanına ek olarak, uygun miktarda sinek maması macunu içeren yeni küçük bir şişe (12 mL) hazırlayın. Bu şişe, enfeksiyon testinden sonra konak larvaların yetiştirilmesi için kullanılır.
3. Aşamalı larvaları toplayıp deiyonize su içeren bir kaba aktarın (direnç = 15 MΩ·cm, 25 °C). Larvaları tabaktaki hafif bir çaltıyla durulayarak vücutlarındaki kalıntı yiyecekleri çıkarın.
4. Durulama işleminden sonra, fazla su enfeksiyon analiz alanında eşek arısının yumurtlama davranışını engelleyeceği için, tüy içermeyen kağıt mendillerle larvalardan fazla nemi nazikçe uzaklaştırın. Sonra larvaları arenaya transfer edin. Bu adım, enfeksiyon deneyi sırasında larva aktivitesini artırır.
5. Yetişkin eşek arılarını_CO2 gazı ile 5 L·^min-1 akış hızı ve 0.2 MPa basınçla anestezi edin. Sonra, enfeksiyon testi alanına yaklaşık üç dişi eşek arısı nazikçe yerleştirin. Kabın kapağını kapatın ve sinek yiyecek macununda geri kazanmalarını bırakın.
6. Bu eşek arılarının yumurtlama davranışını stereomikroskop altında (zoom ayarı: 10× ila 15×) gözlemleyin.
   NOT: Bir eşek arısı hareket eden bir sinek larva gövdesine dokunduğunda, yumurtlama cihazını hızla sinek gövdesine yerleştirir ve zehir bileşenleri enjekte eder. Sinek larvası vücudunu kıvranıp savrulsa da, hemen felç olur. Daha sonra, eşek arısı karnını titreştirir ve bir yumurtayı konak larva gövdesine bırakır, ardından yumurta çıkarılır. Bu yumurtlama davranışına enfeksiyon denir.
7. Enfeksiyondan sonra kapağı açın ve enfekte sinek larvasını Step 3.2'de hazırlanan sinek maması macunu içeren yeni küçük şişeye aktarın. Enfeksiyon zamanlamasını standartlaştırmak için enfeksiyon deneyini 15 dakika içinde gerçekleştirin.
8. Küçük şişe, tarih, örnek adı, enfeksiyon zamanı ve kişi sayısı gibi deneysel bilgilerle etiketleyin. Bu şişeler tıkanıp nemli bir kaba konur ve 25 °C'de tutulur.

4. DsRNA enjeksiyonu ile RNA girişimi (RNAi) eşek arılarının üretimi

1. 400 bp veya daha uzun dsRNA'ları in vitro transkripsiyon tabanlı dsRNA sentezi sistemi kullanarak dsRNA aracılı gen knockdown (RNA girişimi, RNAi) için sentezleyin. dsRNA örnekleri kullanıma kadar -20 ila -80 °C arasında tutulmalıdır. Ayrıntılı protokoller daha önce^{açıklandığı gibi 9}.
2. Eşek arısı bedenlerini yerleştirmek için %2 agar içeren 5,5 cm uzunluğunda bir petri kabı hazırlayın. Her kabın üçte ikisini agar ile doldurarak enjeksiyon için kalın bir agar tabakası oluşturulur.
3. Plastik bir kabın kapağına su ile nemlendirilmiş, tüy içermeyen kağıt mendil yerleştirin.
4. Enfeksiyondan 7 gün sonra (dpi) konak sinek pupalarını şişeden topla ve Step 4.3'te hazırlanan tüy içermeyen kağıt mendillere yerleştir. Şişe duvarına bir damla su eklemek, konak sinek pupa kasalarını şişeden ayırmaya yardımcı olur.
5. Stereomikroskop altında (zoom ayarı: 20×), ana sinek pupa kılıfını çıkarın ve penss ile bir eşek arısı bedenini ortaya çıkarın. 7 dpi ile çoğu eşek arısı pupa evresinde olur; bu evrede baş, göğüs ve karın kısımları ayırt edilir. Eşek arısı bedeni hareketsizdir.
6. Alınan eşek arısı bedenlerini Adım 4.2'de hazırlanmış agar plakasına yerleştirin, vücut eksenlerini aynı yönde hizalasın. 20-30 eşek arısı gövdesini sırt tarafı yukarıda bir ila iki sıra halinde düzenleyin. Eşek arılarının kaymasını önlemek için agar plakasındaki fazla nemi tüy içermeyen kağıt mendil kullanarak temizleyin.
7. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, enjeksiyon cihazını ve stereomikroskobu kurun (Şekil 3A). Enjeksiyon hacmi ve enjeksiyon hızının hassas kontrolünü sağlayan cam kapiler iğneyle donatılmış mikroenjeksiyon sistemi kullanın. Eşek arısı başlarının enjeksiyon iğnesinin ucuna doğru konumlandırıldığı agar plakasını yerleştirin. Enjeksiyon hacmi 50 nL·^wasp-1 ve enjeksiyon hızı enjektörde 50 nL·^{sek 1'dir} .
8. Cam kapiler iğneleri iğne çekicisi kullanarak hazırlayın. Cam kapiller şekli ısıtıcı sıcaklığıyla ayarlanabilir.
9. Cam kahiller iğneyi iğne öğütücüye 30-35° açıyla yerleştirin. İğneyi uç uzunluğu 0,04 mm'ye kadar öğütün (okulluk nişangahında dört bölme, Şekil 3B).
10. Enjeksiyondan hemen önce, dsRNA'yı çöz. dsRNA konsantrasyonu 0.25-1 μg·^μL-1'dir. Görselleştirme için, dsRNA çözeltisi mavi bir boya (Erioglaucine disodyum tuzu, %2 ağırlık·^hacim-1) ile boyanmıştır. Mikroloader pipet ucu kullanarak, cam kapilleri mavi boyalı dsRNA çözeltisiyle doldurun. 4 μL 30 eşek arısı bedeni enjekte etmek için yeterlidir. Çözeltinin içinde hava kabarcıkları olmadığından emin olun.
    NOT: dsRNA çözeltisini doldurduktan sonra, iğnenin yanına tırnağınızla nazikçe vurarak hapsolmuş hava kabarcıklarını çıkarın. Kalıntı hava kabarcıkları, çözeltinin akışını engelleyebilir ve başarılı enjeksiyonu engelleyebilir.
11. 1 mL şırınga ve iğne kullanarak, cam kapillerin boş kısmını mineral yağla doldurun, böylece kapiller içinde hava kabarcıkları kalmadığından emin olun.
12. DsRNA çözeltisi ve mineral yağı içeren cam kapiler iğneyi iğne tutucuya takın ve ardından enjeksiyon cihazına monte edin.
13. Agar plakası ve cam kahiller iğnesinin enjektör üzerindeki konumunu ayarlayın; böylece cam iğne eşek arısı gövdelerine göre 30-45° açı içinde konumlandırılır (Şekil 3A).
14. Cam kapiller iğneyi eşek arısı gövdesinin dorsal tarafına yerleştirin, hafifçe yan tarafı dorsal orta hatta olsun. Vücut içinde dsRNA çözeltisini mikroenjekte edin. Enjekte edilen dsRNA çözeltisi mavi boya  ile görülebilir (Şekil 3C).
15. Enjeksiyondan sonra, agar plakalarını nemli bir kaba (%70-80 göreli nem) yerleştirin ve yetişkin eşek arıları yaklaşana kadar bir hafta boyunca 25 °C inkübatörde tutun. Yaralı eşek arısı bedenleri, bakteriyel kontaminasyonu önlemek için agar plakasından çıkarılmalıdır.
    DURAKLAMA NOKTASI: Adım 4.6'da, eşek arısı pupaları enjeksiyondan önce birkaç saat boyunca agar plakasında tutulabilir. İğneler önceden hazırlanabilir (Adım 4.8 ve 4.9); ancak zamanla tıkanmaya yatkındırlar. Taze hazırlanmış iğneler genellikle daha güvenilir enjeksiyon performansı sağlar.

Results

Asobara japonica'nın aseksüel ve cinsel türleri
A. japonica, Japonya genelinde yaygın olarak yayılmıştır. Ana adalarda thelytokous partenogenetik suşlar baskınken, arhenotokous cinsiyetli suşlar subtropikal adalarda, Amami-Oshima ve Iriomote-jima^{adaları 8,12} dahil olmak üzere bulunur. Cinsel suşlarda, erkekler dişilerden birkaç gün erken çıkar, bu yüzden yetişkin transfer zamanlaması bu suşlar arasında farklıdır. A. japonica'da thelytoköz partenogenez, anne yoluyla bulaşan endosimbiyotik bakteri olan Wolbachia ile enfeksiyon^{sonucu oluşur 13}. Wolbachia'nın antibiyotik tedavisiyle eliminasyonu erkek^{üretimine yol açar 9,14} ve Wolbachia'nın cinsel suşlara nakli partenogenezi^{indükler 15}. A. japonica'nın hem eşeysüz hem de cinsel türleri, birden fazla Drosophila türünde yüksek parazitizm başarısı sergiler. Örneğin, ekonomik açıdan önemli bir meyve zararlısı olan D. suzukii'yi parazitleyebilirler ve tarımda potansiyel biyolojik kontrol ajanı olarak kabul^{edilirler 16}. Mevcut suşlar arasında, deneylerimizde öncelikle Wolbachia enfekte TK suşunu kullandık. TK suşu, IR^{suş 14'e} kıyasla konak larvalara karşı daha yüksek parazitizm aktivitesi sergiler, bu da analiz için uygun hale gelir.

Parazitizmin başarısı yetiştirme koşullarına bağlıdır
A. japonica'nın parazitizm başarı oranı genellikle yüksektir, ancak konak sineklerin yetişme koşullarından güçlü şekilde etkilenir. Besin açısından zayıf koşullarda, sinek larvalarının büyüme süresi uzamış ve puparasyon zamanlaması^{gecikmiştir 17}. Bu koşullarda, eşek arıları konak kaynaklarını doğru şekilde kullanamaz ve gelişimlerini konaklarınkiyle senkronize edemeyebilir. Bu olasılığı incelemek için, normal maya (1×) ve maya fakir (0.1×) koşullarında sinek ve eşek arıları yetiştirdik. Daha sonra parazitizm başarısını ve gelişimsel zamanlamayı değerlendirdik (Şekiller 2C, 2D). Parazitizm başarısı, çıkmış yetişkin eşek arılarının konak larvalara oranı olarak hesaplandı.

Normal maya koşullarında, tek yumurtlama enfeksiyon testinde parazitizm başarı oranı %81,7'dir (Şekil 2C, solda; Tablo 2). Maya içeriği %10'a indirildiğinde (maya açısından kötü durum), parazitizm başarı oranı %35,0'a düştü (Şekil 2C, sağda; Tablo 2). Bu azalma, konak larvaların yaklaşık %50'sinin enfeksiyon sonrası ölmesiyle açıklanabilir. Bu sonuçlar, besin açısından yoksunluk koşullarında konak ve parazitoid arasındaki kaynak dağılışının bozulduğunu göstermektedir.

Özellikle, eşek arısı eklonsiyonunun zamanlaması, maya açısından kötü koşullarda normal maya koşullarında olduğu kadar gecikmedi. Sinek eklozyon zamanlaması 9 güne kadar gecikirken, eşek arısı eklozyon zamanlaması sadece 4-5 gün gecikti. Bu sonuç, besin bulunabilirliğinin öncelikle konak gelişimini etkilediğini göstermektedir. Eklonsiyon zamanlaması, normal maya koşullarında hem sinekler hem de eşek arılarında tutarlıdır, ancak maya açısından kötü koşullarda değildir; bu da parazitoidler ile konakçılar arasındaki senkronize gelişimin besin bulunabilirliğine bağlı olduğunu gösterir.

Zehir genlerinin fonksiyonel analizi için RNAi tabanlı yaklaşım
Zehir bezinin transkriptomik ve proteomik analizleri birçok aday molekülü tespit etse de, bunların hangisinin başarılı parazitizm için gerekli olduğu belirsizdir. Bu aday moleküllerin fizyolojik rollerini belirlemek için, gen etkisi yaklaşımlarıyla in vivo fonksiyonel analizler gereklidir.

Yakın zamanda A. japonica parazitizminin D. melanogaster larvalarının imaginal disklerinde apoptoz, otofaji ve mitotik durmaya neden olduğunu, bunun da ciddi doku bozulmasına yol açtığını bildirdik; bu olguya imaginal disk bozulması (IDD)¹⁰ denir. IDD'den sorumlu molekülleri belirlemek için, transkriptomik, proteomik ve karşılaştırmalı genomik analizlerden tanımlanan aday genlerin RNAi taramasını yaptık. Sonuç olarak, imaginal disk bozunma faktörü (IDDF)-1 ve IDDF-2 olmak üzere iki gen tanımlandı. Hem IDDF-1 hem de IDDF-2, Bilinmeyen Fonksiyon Alanı 4803 (DUF4803) içerir. Özellikle, ilk raporumuzun ardından, bağımsız bir çalışma IDD ile ilişkili birden fazla A. japonica zehir proteini (Venom-Induced Degradation, VID) tespit etti ve bunların hepsi aynı zamanda DUF4803 domain^18'e sahiptir.

Bu sonuçlara dayanarak, tekrarlanabilirliği ve verimliliği artırmak için RNAi protokolünü daha da optimize ettik. Özellikle, Nanoject III kullanımı, enjeksiyon hacmi ve hızının hassas kontrolünü sağladı ve bu da daha tutarlı devre dışı sonuçlar elde etti.

Optimize edilmiş RNAi protokolünün verimliliğini değerlendirmek için IDDF-1'in etkisini ölçtük. Kapalı yetişkin eşek arılarında IDDF-1'in ifade seviyesi kontrol arısına göre anlamlı şekilde azaldı (Şekil 3D). Fonksiyonel doğrulama için, kanat kesesi bölgesi^19'da apoptoz raporlayıcısı GC3Ai'yi ifade eden RNAi eşek arıları ve konak sinek larvaları kullanılarak tek yumurtalama enfeksiyonu testleri yaptık. Kontrol (GFP RNAi) eşek arılarıyla enfeksiyonun ardından kanat kesesinde bir GC3Ai sinyali tespit edildi. Buna karşılık, IDDF-1 RNAi eşek arıları enfeksiyonundan sonra GC3Ai sinyali anlamlı şekilde azaldı (Şekil 3E, 3F). Bu sonuçlar, önceki bulgularla tutarlıdır ve IDDF-1 fonksiyonunun RNAi tarafından etkili şekilde bastırıldığını doğrular.

Şekil 1. D. melanogaster ve A. japonica için yetiştirme prosedürlerinin şematik özeti. 
D. melanogaster'ın gelişim aşamalarına göre adımlı prosedürler gösterilir.Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Asobara japonica tarafından parazitizm. (A) D. melanogaster ile parazitoidi A. japonica arasındaki gelişimsel ilişkinin şeması. Dişi bir eşek arısı, sinek larvasına zehir ve tek bir yumurta bırakır. Yumurtadan çıktıktan sonra, eşek arısı larvası konak larvayla paralel olarak gelişir ve larva daha sonra puparilaşır. Köpürasyondan sonra, eşek arısı tüm sinek vücudunu tüketir ve sonunda sinek pupa kılıfından ayrılır. (B) A. japonica'nın eşeysiz (solda) ve cinsel cinsiyette (sağda) yetişkin eşek arıları. Ölçeg çubuğu, 1 mm. (C) Normal (1×) ve maya yoksul (0.1×) koşullarda sinek veya eşek arılarının çıkış oranı. Tek yumurta yumurtlama enfeksiyonu testleri, yumurta bırakmadan 4 gün sonra konak sinek larvaları kullanılarak gerçekleştirildi (dAEL). n = sırasıyla 267 (1×, sinekler), 120 (0,1×, sinekler), 85 (1×, eşek arıları) ve 80 (0,1×, eşek arıları). (D) ( C)'de gösterilen iki beslenme koşulları altında sinek ve eşek arılarının eklozyon zamanı. Yetişkin ve pupa oranı gösterilir. n = sırasıyla 250, 107, 61 ve 41. Siyah ok, eşek arısı enfeksiyonunun zamanlamasını gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. Nanoject III kullanılarak optimize edilmiş RNAi prosedürü. (A) Mikroenjeksiyon cihazının stereomikroskop altında kurulumu. Cam kapiler iğne, agar plakasına göre 30-45° açı ile konumlandırıldı. (B) Cam kapiler iğnesinin ucu iğne öğütücüsü kullanılarak bilemezdi. (C) Mavi boyalı bir çözelti cam kapiler iğne kullanılarak eşek arısı vücuduna mikroenjekte edildi. Eşek arısının ön tarafı görselde A ile gösterilmiştir. P, posterior. Ölçek çubuğu, 1 mm. (D) GFP RNAi ve IDDF-1 RNAi eşek arılarındaki IDDF-1 ifade seviyeleri delta-delta C_t yöntemiyle nicelendirildi. İfade seviyeleri RpL32-Aj olarak normalize edildi. Veri, bireysel veri noktalarıyla (n = 5) SD ± ortalamasını temsil eder. P < 0.005 (Öğrencinin t-testi). (E ve F) GC3AI, enfekte olmamış larvaların ve konak larvaların kanat disklerinde, kontrol (GFP RNAi)  veya IDDF-1 RNAi eşek arılarıyla enfeksiyon sonrası 6 saat içinde (hpi) sinyal verir. Kanat diskleri, çekirdeklerin DAPI boyamasına dayalı beyaz noktalı çizgilerle hatlandırılmıştır (1:10000, 62247; Thermo Fisher Scientific). GC3Ai pozitif alan ile kanat kesesi alanının oranı nicelendirildi. P < 0.005 (Tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi). n = her grup için 11 biyolojik çoğaltma. Ölçek çubuğu, 100 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Bileşenler	Miktar
Su	1 L
Agar	5,5 g
Maya	40 g
Mısır unu	90 g
Glikoz	100 g
Propionik asit	3 mL
%70 EtOH içinde %10 butil p-Hidroksibenzoat	3.5 mL

Tablo 1: Standart mısır unu-maya-agar ortamının bileşenleri (Sinek maması).

Gıda türü	Durum	# toplam bireyler	# kapatılmış veya ölü bireyler				Sinekler veya eşek arılarının ortaya çıkma oranı (%)
			Fly	Eşek arısı	Pupal ölümcül	Larva ölümcül
1×	Enfekte Olmayan	267	248	0	2	17	92.88389513
	A. japonica enfekte	120	0	98	9	13	81.66666667
0.1×	Enfekte Olmayan	85	38	0	23	24	44.70588235
	A. japonica enfekte	80	0	28	13	39	35

Tablo 2: Normal (1x) ve maya açısından fakir (0,1 x) koşullarda birey sayısı ve ortaya çıkma oranları.

Giriş adı	Sahne (5'>3')	Amaç
AjRpL32_qPCR_Fwd	CCCGTCACATGCTTCCTACT	qRT-PCR
AjRpL32_qPCR_Rev	GAATTTGCGATTCTGCATCA	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Fwd	TGGGCAATGATTGTGTGAGT	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Rev	GCGTCCCTGTATCGAAGGTA	qRT-PCR
Aj_gene007424_ex1_Fwd	ATGAGCATCAAGCAAGCAGTGCTAG	CDS klonlama
Aj_gene007424_ex10_Rev	TCAGCACCTTCTACCCGGCAAATT	CDS klonlama, dsRNA şablonu
Aj_gene007424_RNAi_Fwd	GAGGAGAGTGGAAGCCAGTTGTAG	dsRNA şablonu
T7_Aj_gene007424_ex10_Rev	GGATCCTAATACGACTCACTATAGGT CAGCACCTTCTACCCGGCAAATT	dsRNA şablonu
T7_Aj_gene007424_ RNAi_Fwd	GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAG GAGAGTGGAAGCCAGTTGTAG	dsRNA şablonu
※ Bu primerler ve dsRNA şablonları Kamiyama ve ark. 2022.
※ gene007424 , IDDF-1 anlamına gelir.

Tablo 3: Bu çalışmada kullanılan primer ve dsRNA şablonlarının dizileri.

Discussion

Bu çalışmada, moleküler düzeyde parazitoid-konak etkileşimlerini araştırmak için çok yönlü bir deneysel platform oluşturduk. Yetiştirme koşullarını optimize ederek, tek yumurtlama enfeksiyonu testi ve RNAi protokolüyle, parazitoid kaynaklı faktörlerin fonksiyonel çalışmaları için sağlam bir sistem sağlıyoruz. Bu platform, parazitoid eşek arılarının konak gelişimini nasıl manipüle ettiğini ortaya çıkarmaya yönelik gelecekteki çalışmaları kolaylaştıracak ve biyolojik haşere kontrol stratejilerinin geliştirilmesine katkıda bulunabilir.

Wolbachia ile enfekte olan A. japonica'nın TK suşu, parazitizmi analiz etmek için son derece tekrarlanabilir bir deneysel sistem sağlar. Birçok parazitoid-konak çalışmasında, deneysel sonuçlar genellikle değişkendir; konak hayatta kalması ve parazitoid başarısı çevresel ve fizyolojik koşullara duyarlı olarak bağlıdır. Buna karşılık, TK tipi sürekli yüksek parazitizm başarısı sergiler ve enfeksiyon sonucunun büyük ölçüde uniform olduğu "parazitoid baskın" bir durum yaratır. Ayrıca, partenogenetik bir suş olarak, genetik arka planı uniform olması nedeniyle bireyler arasındaki deneysel varyasyonu azaltır. Bu tekrarlanabilirlik, parazitizm sürecinin güvenilir şekilde takip edilmesini sağlar ve konak yanıtları ile parazitoidlerden türetilen faktörlerin nicel analizlerini kolaylaştırır.

Ayrıca, thelytoköz üreme, yüksek kaliteli genom montajı için kritik olan yüksek homojen genomik DNA'nın üretilmesini mümkün kılarak genomik^{analizleri büyük ölçüde kolaylaştırır 9}. Bu tür partenogenetik suşlar tüm parazitoid türlerde mevcut olmasa da, sonuçlarımız Wolbachia kaynaklı thelytoky'nin genomik kaynakları iyileştirme stratejisi olarak potansiyelini vurguluyor. Bu nedenle, diğer parazitoid türlerde Wolbachia enfekte hatlar oluşturmak, genomik kaynakları genişletmek ve parazitoidler arasında karşılaştırmalı moleküler çalışmaları hızlandırmak için güçlü bir yaklaşım olabilir.

Parazitizm sonuçları, konak beslenme koşullarından güçlü şekilde etkilenir; bu da yetiştirme koşullarının parazitoid başarısının kritik belirleyicisi olduğunu gösterir. Başarılı parazitizm, konak ve eşek arısı gelişimiyle hassas zamansal koordinasyona bağlı olduğundan, kontrolsüz beslenme koşulları bu süreci bozabilir ve tekrarlanabilirliği azaltır. Bu nedenle, parazitoid-konak etkileşimlerini incelemek için güvenilir bir deneysel sistem oluşturmak için konak yetiştirme koşullarının dikkatli standartlaştırılması, gereklidir. Ayrıca, eşek arılarının varlığı sinek yumurtlama davranışlarını azalttığı için, sinek stok şişeleri eşek arısı şişelerinden ayrı^{tutulmalıdır 20,21}.

Parazitoid-konak etkileşimlerinin nicel olarak değerlendirilmesini mümkün kılmak için, her konakta tek bir yumurta yerleştirilen tek bir yumurtlama enfeksiyon testi geliştirdik. Bu test, genellikle aşırı konak hasarı ve ölüme yol açan çoklu yumurtlama olaylarını içeren geleneksel toplu enfeksiyon testlerinden tezat oluşturur. Sınırlı bir zaman aralığında (~15 dakika) verimli yumurtlamayı teşvik etmek için, yeni kapatılmış eşek arısı yetişkinleri glikoz ve C vitamini çözeltisi ile ön koşullandırıldı; böylece yumurtlama etkinliği ve genel tekrarlanabilirlik artırıldı.

Ayrıca, parazitoid eşek arılarında gen fonksiyon analizi için RNAi protokolünü optimize ettik. Mikroenjeksiyon sistemini kullanarak, enjeksiyon hacminin hassas kontrolünü sağladık ve devre verimliliğinin tutarlılığını artırdık. IDDF-1 kullanılarak yapılan fonksiyonel doğrulama, bu yöntemin gen ifadesini etkili bir şekilde bastırdığını ve tekrarlanabilir fenotipik sonuçlar ürettiğini doğruladı. Transkriptomik ve proteomik çalışmaların çok sayıda aday zehir faktörünü belirlemeye devam ettiği göz önüne alındığında, işlevsel bir tarama platformunun varlığı biyolojik rollerini belirlemek için hayati öneme sahiptir.

Bu RNAi protokolünün bir sınırlaması, eşek arısı gelişiminin erken aşamalarında işlev gören genlerin analizi için uygun olmamasıdır; çünkü konak vücutlarında bulunan eşek arısı yumurtalarına dsRNA enjekte etmek teknik olarak zordur. Bunu aşmak için, ex vivo yetiştirme sistemi kurmak faydalı bir yaklaşım sağlayabilir²². Alternatif olarak, Direct Parental (DIPA)-CRISPR kullanılarak gen etkisi altına alma yaklaşımları, genom düzenlemeli yavru oluşturmak için yetişkin dişilere enjekte edilerek tamamlayıcı bir strateji^{sağlayabilir 23}. Gerçekten de, bu yaklaşım, yetişkin dişilere veya geç^{pupa evre 24'teki} bireylere reaktifler enjekte ederek pupal ektoparazitoid Nasonia vitripennis'te gen nakavt bireyleri başarıyla üretmiştir. RNAi tabanlı gen etkisi yöntemimizle birlikte, bu yaklaşımlar parazitizm sürecinde yer alan gen fonksiyonlarının daha kapsamlı analizlerini kolaylaştıracaktır.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL tube	Greiner Bio-One	210261	Infection assay
1 mL syringe	TERUMO	SS-01T	dsRNA injection
Agar	Daisin, Ltd.	P-700	Rearing
Asnol Petri Dish φ40×13.5mm	As One Corporation	1-8549-01	Infection assay
Asnol Petri Dish φ55×17mm	As One Corporation	1-8549-02	dsRNA injection
Blue dye (Erioglaucine disodium salt)	Sigma-Aldrich Co. Llc.	861146-25G	dsRNA injection
Butyl p-Hydroxybenzoate	Nacalai Tesque, Inc.	06327-15	Rearing
CO2 pressure regulator	YAMATOSANGYO	YR-507F-2	Infection assay
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	LSM700	Image analysis
Corn meal	Sunny Maize Co., Ltd.	No.4M	Rearing
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	PI62247	Nuclei staining, 1:10000
Deionized water	Millipore Inc.	ZLXEV030WW	Infection assay
Dual-Stage Glass Micropipette Puller	Narishige	PC-10	dsRNA injection
Fiji	NA	https://fiji.sc	Image analysis
Filter paper	Advantec	ITEM 526	Rearing
Fly food vial	Chiyoda Science Co., Ltd.	KFB-3M	Rearing
Fly food vial plug	Chiyoda Science Co., Ltd.	AS-275	Rearing
Forceps	Dumont Biologie	11252-20	Dissection
Freezer, -20 °C	Nihon Freezer	GS-3120HC	Sample storage
Freezer, -80 °C	Nihon Freezer	CLN-52UD2	Sample storage
Glass slides	Matsunami Glass Ind., Ltd	S7213	Infection assay
Glucose	Showa Sangyo Co., Ltd.	Not availavle	Rearing
KOD Plus Neo	Toyobo	KOD-401	dsRNA synthesis
Incubator	Panasonic	MIR-254-PJ	Rearing
Ligation high Ver.2	Toyobo	LGK-201	dsRNA synthesis
Micropipette Grinder	Narishige	EG-401	dsRNA injection
Mineral oil	Nacalai Tesque, Inc.	23306-84	dsRNA injection
Nanoject III	Drummond Scientific Company	3-000-207	dsRNA injection
Nanoject Glass Capillaries	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	dsRNA injection
pBluescript KS (+) plasmid	Not availavle	Not availavle	dsRNA synthesis
pBluescript SK (-) plasmid	Not availavle	Not availavle	dsRNA synthesis
PrimeScript reverse Transcriptase	Takara	2680A	dsRNA synthesis
Propionic acid	Nacalai Tesque, Inc.	29018-55	Rearing
PROWIPE	Daio Paper Corporation	2-2624-02	Infection assay, dsRNA injection.
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover	Toyobo	FSQ-301	qRT-PCR
RNAiso Plus reagent	Takara	9108	qRT-PCR
Small vial (Test tube 12 mL)	Sarstedt	REF 58.487	Infection assay
Small vial plug	Chiyoda Science Co., ltd.	QD-S4	Infection assay
Spatula	As One Corporation	6-522-02	Rearing
Square petri dish	Eiken Chemical Co., Ltd.	64-2192-55, AW2000	dsRNA injection
Stereomicroscope	Leica Microsystems	lvesta3 (C-Mount)	Infection assay
Stereomicroscope	Nikon Solutions Co., Ltd.	SMZ1000	dsRNA injection
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	dsRNA synthesis
Thermal Cycler Dice Real Time System	Takara	TP815	qRT-PCR
Thermal Cycler GeneAtlas	Astel	G02	dsRNA synthesis, qRT-PCR
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix	Toyobo	QPS-201	qRT-PCR
TissueLyser II	Qiagen	Not availavle	qRT-PCR
Vitamin C, L-Ascorbic Acid	Nacalai Tesque, Inc.	03420-65	Rearing
Welch's grape 100 juice	Asahi Soft drinks Co., Ltd.	32390	Infection assay
Yeast	Asahi Group Foods, Ltd.	HB-P02	Rearing