Sinir Rejenerasyonunun İncelenmesi İçin Tüm Yuva Analizi Kullanarak Fare Olfaktör Sinir Sistemi Modelinde In Vivo Doku Karmaşıklığının Korunması

Özet

Bu protokol, farenlerin olfaktör sinir sisteminin anatomik karmaşıklığını korumak için eksiksiz bir iş akışını özetlemektedir. Burada disseksiyon, doku hazırlama ve görüntüleme dahil olmak üzere tüm iş akışı ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu protokol, olfaktör sistemin doğal onarım koşulları da dahil olmak üzere normal veya anormal koşullar altında incelenmesi için kullanılabilir.

Özet

Üç boyutlu (3D) görüntüleme çağında, standart immünohistokimyanın patoloji ve karmaşık insan anatomisi çalışmalarında oldukça sınırlı kaldığı kabul edilmektedir. Yalnızca dar kesitlerin analiz edilmesiyle, daha büyük yapılar ve doku mimarisinin temel yönleri kritik bağlamsal ayrıntıları kaybedebilir; bu da eksik veya yanıltıcı yorumlara yol açabilir. İki boyutlu (2D) kesitler histoarkitektürün temel düzeyde anlaşılmasını desteklemiş olsa da, biyolojik dokuların gerçek üç boyutlu gerçekliğini yakalamada yetersiz kalmaktadırlar.

Birden fazla anatomik bölgeyi kapsayan giderek artan sayıda çalışma, artık sağlam anatomik birimleri izole eden teknikleri -flat mount, whole-mount veya en face preparasyonlar- yüksek çözünürlüklü floresan mikroskopi ile birlikte kullanmaktadır. Bu yaklaşımlar, yapısal organizasyonun daha kapsamlı bir görselleştirilmesini ve yorumlanmasını sağlar. Bu durum, dikkat çekici rejenerasyon yeteneğinin altında yatan karmaşık hücresel mekanizmaları tanımlamanın tam kalınlıkta bir bağlam gerektirdiği olfaktör sinir sisteminde özellikle önemlidir. İnce kesitler, yeterince tanımlanmamış kalan temel patofizyolojik özelliklerin gözden kaçırılması riskini taşır.

Bu kısıtlamalar ve kokusal rejenerasyonu yönlendiren hücresel etkileşimlere ilişkin bilgi boşluğu göz önüne alındığında, tam kalınlıkta doku karmaşıklığını koruyabilen geliştirilmiş bir whole-mount tekniği geliştirilmesi temel bir gereklilikti. Tüm koku mukozaları, optimize edilmiş bir antikor penetrasyon protokolü eşliğinde tam kalınlıkta örnekler olarak izole edildi. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme (EVIDENT SpinSR) ve 3D rekonstrüksiyon, hücresel etkileşimlerin in vivo olarak doğru şekilde görselleştirilmesini sağladı.

Giriş

Koku sinir sistemi (KSS), yaşam boyunca nöronal yenilenme kapasitesini koruduğu için nöral rejenerasyon mekanizmalarını incelemek adına benzersiz ve iyi tanımlanmış bir model teşkil eder¹. Ancak, koku sistemindeki hücrelerin davranışlarına dair anlayışımızdaki önemli eksiklikler nedeniyle, bu nöro-onarıcı yeteneğin klinik uygulamaya dönüştürülme potansiyeli sınırlı kalmaktadır^2,3,4. Birincil koku nöronları, koku kılıf hücreleri (OEC'ler) ve perineural fibroblastlar dahil olmak üzere KSS'nin hücresel yanıtları ve anatomik organizasyonu; kemirgen KSS'ye uygulanan ağır fiziksel yaralanma modelleri ile kombine edilmiş ultra ince (<2 µm) doku kesitlerine dayanan çeşitli hayvan çalışmalarında tanımlanmıştır^1,2. Bu çalışmalardaki hayvanlar genellikle yaralanmadan sonraki 10. günde sakrifiye edilmiş olup, bu durum nöral yaralanma sırasında söz konusu dokunun geçirdiği kapsamlı ve daha karmaşık yeniden şekillenmenin yalnızca belirli bir anına dair dar bir pencere sunmuştur². Bu çalışmalar, aksonal ölümden sonra OEC'lerin ve fibroblastların yaralanmayı takiben sürekli kanallar şeklinde varlıklarını sürdürdüklerini rapor etmiştir.

Bilgi verici olsa da, yukarıda açıklanan birçok kısıtlama nedeniyle, kullanılan yaklaşım ONS'nin yüzeysel bir düzeyde düşük çözünürlüklü kavramsal bir genel görünümü sağlamış ve nihayetinde sağlam ONS içindeki gerçek hücresel organizasyonun kapsamlı bir değerlendirmesini engellemiştir³. Sonuç olarak, kritik uzaysal ilişkiler gözden kaçmış olabilir.

Üç boyutlu doku yapısının korunması, doğru anatomik ve hücresel analizler için temel teşkil eder ve birçok organ ile patoloji üzerinde başarıyla uygulanmıştır^{4,5,6,7,8,9,10,11,12}. Olfaktör mukozadaki nöral organizasyonun haritalanması için bütun bağlama (whole-mount) yaklaşımları kullanılmıştır^13,14; ancak, korunmuş bir lamina propria da dahil olmak üzere, tam kalınlıkta bir ONS yapısı ile hücresel etkileşimlerin görselleştirilmesi henüz gerçekleştirilmemiştir.

Bu çalışmada, ONS mimarisinin ayrıntılı analizine olanak tanıyan; bütün doku (whole-mount) işleme, immünboyama, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve üç boyutlu yeniden yapılandırma içeren bir fare modeli iş akışı oluşturuyoruz. Bu protokol, lamina propria dahil olmak üzere tam kalınlıktaki koku mukozasını koruyan ve muhafaza eden, böylece hücreler arası etkileşimlerin incelenmesine imkan veren, mevcut yayınlanmış yöntemlerdeki boşluğu doldurmak amacıyla geliştirilmiştir. Özellikle, bu geliştirilmiş doku toplama ve işleme metodolojisi, çeşitli koku sistemi modellerine uygulanabilir ve bunlarla kombine edilebilir.

Protokol

Hayvanlar ve transgenik olarak modifiye edilmiş hücreler içeren tüm deneyler, Avustralya Commonwealth Gen Teknolojisi düzenleyici ofisinin (OGTR) kılavuzlarına uygun olarak, Griffith University Biyogüvenlik Komitesi (NLRD/003/2020_var3) ve Griffith University Hayvan Etik Komitesi'nin (MHIQ/04/23/AEC) onayıyla yürütülmüştür.

NOT: Çalışmada her iki cinsiyetten toplam 15 yetişkin laboratuvar faresi (8–9 haftalık) kullanılmıştır. Spesifik olarak, tüm OEC'lerin S100β promotörü kontrolü altında parlak kırmızı DsRed proteinini eksprese ettiği S100β-DsRed transgenik fareler kullanılmıştır. S100β, daha geniş bir kalsiyum bağlayıcı protein ailesinin bir parçasıdır ve OEC'ler gibi merkezi sinir sistemindeki glial hücrelerde yaygın olarak eksprese edilir. Bu model, endojen floresan sinyaller kullanılarak hedef hücre popülasyonlarının kolayca lokalizasyonuna olanak tanıdığı için bu deneylerin amaçları doğrultusunda optimal seçilmiştir. S100β-DsRed transgenik fareler daha önce üretilmiş olup, bu transgenik farelerin kullanımının fikslemiş doku analizleri için uygulanan immünohistokimyaya kıyasla OEC'lerin daha iyi tespit edilmesini sağladığı gösterilmiştir^15,16,17,18.

1. Baş toplama ve doku fiksasyonu

1. Deneysel zaman noktalarında hayvanları artan CO₂ inhalasyonu ile ötanize edin.
2. Ölümün, kornea ve pedal geri çekilme reflekslerinin yokluğuyla onaylandığından emin olun, ardından servikal dislokasyon uygulayın veya onaylanmış SOP'ye uygun hareket edin.
3. Tüm başı ve çeneleri makasla çıkarın.
4. Kafatası üzerindeki deriyi çıkarın ve nazal boşluğu açığa çıkarmak ve fiksatif ajanın etkili bir şekilde nüfuz etmesini sağlamak için burnun ucundaki kıkırdağı kaldırın.
   NOT: Hayvanın burun kıkırdağının en ön kısmının kesildiği bu adımın, nazal boşluktaki dokunun doğru şekilde fikse edilmesini sağlamak için kritik olduğu gözlemlenmiştir.
5. Fazla kanı temizlemek için başları hızlıca 1× PBS ile durulayın.
6. Dokuyu, bir roller üzerinde 4 °C'de, en az 6 saat boyunca (ilgilenilen dokunun fikse edilmesi için yeterli süre) boyunca %4 paraformaldehitte gece boyu (12–18 sa) daldırarak fikse edin.
   DİKKAT: Paraformaldehit, formaldehit buharı salan tehlikeli bir kimyasaldır. İnhalasyon, cilt teması ve ağız yoluyla alım durumunda toksiktir; göz, cilt ve solunum yolu irritasyonuna neden olur ve şüpheli bir kanserojendir. Sadece eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruması dahil olmak üzere uygun KKD giyilmiş haldeyken çeker ocak altında çalışın. Protokol sırasında oluşan tehlikeli kimyasalların ve biyolojik atıkların güvenli bertarafı, kurumsal ve yerel düzenlemelere uygun olarak yapılmalıdır.
   ​NOT: Optimizasyonlar sırasında, ilgili dokuyu fikse etmek için 6 saatin yeterli olduğu; ancak 12 saatin üzerindeki sürelerin aşırı fiksasyona ve mukozal yapıların dejenerasyonuna yol açabileceği gözlemlenmiştir.
7. Başları fiksatif ajandan çıkarın ve bir roller üzerinde oda sıcaklığında (20–25 °C) 3 saat boyunca 1× PBS ile yıkayın.
8. Başları 4 °C'de taze PBS içinde saklayın ve 48 saat içinde whole-mount mukozal dokuyu toplayın.

2. Tüm doku örneği toplama

1. Doku izolasyonunu mikroskop altında gerçekleştirin.
2. Başları, mid-sagittal hattı takip ederek bir bistüri yardımıyla ortadan ikiye kesin.
3. Burun boşluğunun iç kısmını açığa çıkarın (Şekil 1). Anatomik bölgeleri belirleyin ve tüm anatomik kesiti kaplayan mukozal dokuyu toplayın (Şekil 1B).
4. Bir kemik kesici kullanarak, mukoza boşluğunun bir kısmını örten septal kemiği nazikçe kırın ve çıkarın.
   NOT: Bakınız Şekil 2ABu adım, akson demetlerinin dorsal duvardan geçtiği kemiğin altındaki konkav boşluğu açığa çıkarmak için kritik öneme sahiptir (Şekil 1B).
5. Bu bölge açığa çıktıktan sonra, kavisli pensler kullanarak dokuyu konkav dorsal duvardan nazikçe ayırın ve dışarı çıkarın. Dokuyu alttaki kemikten kaldırın ve sağlam bütün bağlama (whole-mount) preparatını toplamak için geri kalan olfaktör mukozayı nazikçe soyun.
   NOT: Dokunun yırtılmasını önlemek için bu aşamada aşırı dikkatli olunması gerekmiştir.
6. Her iki burun deliğinden de ilgili dokuları toplayın: mukoza; septumu, sol ve sağ dorsal duvarları ve burun boşluğunun cribriform plakasını kaplar (Şekil 1A, B)Birincil olfaktor yapıları içeren anatomik bölgeyi izole etmek için septum, dorsal duvarlar ve kribriform plak dahil olmak üzere her iki burun deliğinden doku toplayın (Şekil 2C).
7. Toplanan dokuları 1× PBS ile yıkayın ve kemik parçaları dahil istenmeyen tüm dokuları uzaklaştırın. Dokuları, gelecekteki immünohistokimya analizleri için 1× PBS içinde 4 °C'de saklayın.
   NOT: Dokunun uzun süreli saklanması gerekiyorsa, 4 °C'de 1× PBS ve %0,001 (A/H) Sodyum Azid çözeltisi içinde saklanması önerilir.

3. Optimize edilmiş boyama protokolü

NOT: Yaygın olarak kullanılan boyama protokolleri genellikle ince-orta kalınlıktaki kesitler (örneğin, 50 µm'ye kadar) için optimize edilmiştir. Bu nedenle, protokolün çok daha kalın olan dokuya uyarlanması gerekmiştir.
​Kritik bir adımın, tüm boyama süreci boyunca dokunun Eppendorf tüpleri içinde yüzer halde tutulması ve reaktifler nüfuz ederken tüplerin bir silindir üzerine yerleştirilmesi olduğu gözlemlenmiştir. Bu nedenle, boyama işlemleri doku bir görüntüleme lamı üzerindeyken gerçekleştirilmemiştir. Doku önce yüzer halde boyanmış ve ardından görüntüleme lamlarına monte edilmiştir. Bu ayrıntılar, dokunun katlanmamasını ve reaktifler ile antikorların tüm bölgeye nüfuz edebilmesini sağlamıştır.

1. Dokuları saklama koşullarından çıkarın ve bloklama çözeltisi (kullanılacak çözelti boyamaya özgü olacaktır) içeren bir Eppendorf tüpüne yerleştirin.
   ​NOT: Bloklama çözeltisi: PBS içinde %3 BSA, %0,3 Triton X-100. Bir diğer önemli ayarlama, dokunun her bir reaktife ve antikor kokteyline maruz kaldığı süredir.
2. Dokuyu oda sıcaklığında, roller üzerinde 3 saat boyunca bloklama çözeltisinde bekletin.
   NOT: Standart ince kesit immünohistokimyasal boyama yaklaşımına kıyasla maruz kalma süresi artırıldığında, seçilen antikorların ve boyama reaktiflerinin (Tablo 1) konsantrasyonunu artırmanın gerekli olmadığı gözlemlenmiştir. Bu durum, pahalı antikor reaktiflerinin kullanımını da minimize etmiştir. İnkübasyonlar, roller üzerinde dönebilmesi için kapak tutucusu kesilmiş 1,5 mL'lik bir Eppendorf tüpünde gerçekleştirilir. Reaktif hacmi 500 µL idi.
3. Primer antikorlar ile roller üzerinde 4 °C'de 72 saat boyunca inkübe edin.
4. Dokuyu oda sıcaklığında, roller üzerinde PBS 1× kullanarak iki kez yıkayın (her bir yıkama 1,5 saat).
5. Dokuyu sekonder antikor (alüminyum folyoya sarılı) ve çekirdek boyaması ile önce oda sıcaklığında roller üzerinde en az 4 saat, ardından gece boyunca (12–18 saat) 4 °C'de roller üzerinde inkübe edin.
6. Dokuyu oda sıcaklığında, roller üzerinde PBS 1× kullanarak iki kez yıkayın (her seferinde 1,5 saat).

4. Lam hazırlama

1. Dokuyu Eppendorf tüpünden nazikçe çıkarın
2. Bir mikroskop altında, dokuyu bir lam üzerine yerleştirin ve dokuda herhangi bir katlanma olmadığından emin olun.
   NOT: Herhangi bir floresans olmadan, dokunun yönü mikroskop altında belirlenebilir. Mukozal dokunun lamina propria tarafı, epitel lam camına bakacak ve lamina propria lameller örtü camına bakacak şekilde yerleştirilmelidir. Lamina propria, boyama olmadan görülebilen kalın sinir demetlerinin varlığıyla tanımlanabilir. Yönlendirmenin lamina propriyanın örtü camına, epitel tarafının ise lam camına bakacak şekilde yapılması, hem boyama hem de görüntüleme sürecini kolaylaştıracaktır.
3. Lamları floresan montaj medyumu kullanarak örtü camı ile kapatın ve lamları mühürleyin.
4. Lamlar, oda sıcaklığında karanlıkta gece boyunca (12–18 h) kurutulduktan sonra 4 °C'de saklanabilir

5. Görüntüleme ve Son İşleme

1. Düşük büyütmeli immünofloresan görüntülerin elde edilmesi
   1. Görüntü elde etme işlemi sırasında doğrusal alfa harmanlama (linear alpha-blending) kullanarak otomatik dikme (stitching) gerçekleştirin.
      ​NOT: Doku hacminin tamamen kapsandığından emin olmak için z-yığın (z-stack) çerçeve sayısı, numunenin kalınlığına göre ayarlanmalıdır.
   2. Komşu görüş alanlarını %15 örtüşme ile yakalayın. Meander elde etme deseni kullanarak karolu (tiled) görüntüler edinin.
   3. Toplam optik kesit sayısını doku kalınlığına göre ayarlayın.
   4. Görüntü kalibrasyonunu hem X hem de Y eksenlerinde 215.594 nm/pixel olarak ayarlayın. Görüntüleri 0.8 µm z-adım boyutu kullanarak z-yığınları şeklinde edinin.
   5. Montajı yapılmış bütün dokuyu konfokal mikroskop tablasına yerleştirin. 30x objektif lens (NA 1.04) kullanarak genel bakış görüntüleri elde edin.
2. Yüksek büyütmeli immünofloresan görüntülerin elde edilmesi.
   1. 60× objektif lens (NA 1.5) kullanarak detaylı görüntüler edinin. Görüntü kalibrasyonunu hem X hem de Y eksenlerinde 107.923 nm/pixel olarak ayarlayın. 0.41 µm z-adım boyutu kullanarak z-yığın görüntüleri edinin.
   2. Toplam optik kesit sayısını doku kalınlığına göre ayarlayın ve görüntüleri tek bir görüş alanından yakalayın.
      ​NOT: 60× elde etme işlemleri için görüntü dikme işlemine gerek yoktur çünkü her veri seti tek bir görüş alanından oluşur.
3. Histolojik referans görüntülerin elde edilmesi
   1. HE boyalı mid-sagittal fare kafa kesitlerini, parlak alan aydınlatması altında bir lam tarama mikroskobu kullanarak görüntüleyin.
   2. 40× objektif lens (NA 0.95) ve 0.63x kamera büyütmesi kullanarak, efektif 25.2× büyütme ile görüntüler edinin.
   3. Hem X hem de Y eksenlerinde 136.905 nm/pixel piksel kalibrasyonunu doğrulayın ve görüntüyü tek bir odak düzlemi olarak edinin.
   4. Meander elde etme deseni ve doğrusal alfa harmanlama kullanarak karolu görüntüleri otomatik olarak dikin.
4. Genel bakış immünofloresan referans görüntülerinin elde edilmesi
   1. 10x objektif lens kullanarak tamamlayıcı genel bakış immünofloresan görüntüleri edinin.
   2. Görüntü elde etme sırasında %0 karo örtüşmesi kullanarak numuneyi tek bir z-kesit olarak yakalayın.
   3. Görüntü kalibrasyonunu hem X hem de Y eksenlerinde 647.249 nm/pixel olarak ayarlayın ve ilgili tüm anatomik bölgeyi kapsayan bir genel bakış görüntüsü oluşturun.
5. Görüntü işleme ve final figürlerin oluşturulması.
   1. Elde edilen görüntü veri setlerini görüntü analiz yazılımına aktarın. z-yığın veri setlerinden maksimum yoğunluk projeksiyonları (MIPs) oluşturun.
   2. Sonraki analizler ve figür hazırlığı için ilgilenilen bölgeleri (ROI'ler) seçin.
   3. Anatomik referans figürler oluşturmak için genel bakış immünofloresan görüntülerini karşılık gelen HE görüntüleri ile birleştirin. Ardından, figür hazırlığından önce floresan ve histolojik veri setleri arasındaki hizalamayı ve anatomik uygunluğu doğrulayın.
      NOT: Tüm görüntü dikme işlemleri, önceden belirlenmiş mikroskop ayarları kullanılarak görüntü elde etme sırasında otomatik olarak gerçekleştirilmeli ve ek bir son işlem gerektirmemelidir. Bizim durumumuzda, 3D oluşturma işlemi Imaris yazılımı kullanılarak yapılmıştır: 3D rekonstrüksiyonu üretmek için her elde edilen kanal için eşik yoğunluğuna dayalı yüzey oluşturma (surface rendering) eklentisi kullanılmıştır. Son olarak, final görüntüler Adobe Illustrator üzerinde derlenmiştir.

Sonuçlar

Burada sunduğumuz bütün montaj (whole-mount) yaklaşımı, olfaktör mukozanın bütünüyle izole edilmesini ve korunmasını sağlamıştır. Bizim çalışmamızda odak noktamız, hem makro (tam anatomik görünüm) hem de mikro (hücresel düzey) ölçeklerdeki hücresel ve anatomik değişiklikleri anlamaktı.

Bütün mount (whole-mount) yaklaşımı, hem epitel hem de lamina propria kompartmanlarını toplamamıza ve akson demetleri, olfaktör kılıf hücreleri (OEC'ler) ve fibroblastlar –ilgilenilen hücrelerimiz– arasındaki uzamsal ilişkileri korumamıza olanak tanır. Bu yaklaşım, mukozal dokunun tüm kalınlığını ve geniş yüzey alanını kapsayan büyük, sürekli veri setlerinin elde edilmesini sağlamış (Şekil 3) ve karmaşık hücresel yapı ile etkileşimin ayrıntılarını (Şekil 3) ve bunların sağlam (n = 3) (Şekil 3A, B) ve hasarlı durumlar (n = 12) (Şekil 3C, D) arasında nasıl değiştiğini yakalamamıza imkan vermiştir.

Bu optimize edilmiş doku işleme ve boyama prosedürünü yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile birleştirerek, dokunun tüm derinliği boyunca hücre düzeyinde yüksek ve hassas detaylara sahip daha geniş mukoza bölgelerinin görüntülerini elde edebildik. Birbirine komşu birden fazla bölge boyunca gerçekleştirilen Z-stack alımı, çözünürlükten veya sinyal bütünlüğünden ödün vermeden genişletilmiş anatomik alanların yeniden yapılandırılmasına olanak tanıdı (Şekil 4A–F). Yüksek çözünürlüklü hücresel detaylar sayesinde, doku mikro-mimarısını daha iyi anlamak için tam doku kalınlığının elde edilen Z-stack'lerini (Şekil 4G) kullanarak render edilmiş görüntüler (Şekil 4H) oluşturabildik.

Montaj ve görüntüleme öncesinde doku yöneliminin güvenilir bir şekilde belirlenmesi, floresan işaretleme gereksinimi olmadan tutarlı bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Lamina propria tarafı, epitel tabakasından net bir şekilde ayırt edilebilen kalın sinir demetlerinin varlığı sayesinde parlak alan mikroskobisi altında kolayca tanımlanabilmiştir. Lamina propriayı lamelle komşu, epitel yüzeyi ise cam lamla karşı karşıya gelecek şekilde konumlandırarak örnek yöneliminin standardize edilmesi, örnekler arası görüntüleme tutarlılığını artırmış ve sonraki aşamadaki üç boyutlu rekonstrüksiyonu kolaylaştırmıştır. Antikor penetrasyonu, doku kalınlığı boyunca gözlemlenen ilişkili sinyal analiz edilerek belirlenebilir. Bu durum genellikle, ya sinyalin tamamen yokluğuyla ya da dokunun derinliklerine doğru ilerledikçe kademeli olarak azalan bir sinyalle kendini belli eder.

Imaris'te gerçekleştirilen üç boyutlu oluşturma, sağlam mukoza içindeki karmaşık hücresel ağların ve aksonal organizasyonun net bir şekilde görselleştirilmesini sağlamıştır. Kanal spesifik yoğunluk eşiklemesi yoluyla uygulanan yüzey tabanlı oluşturma, ince yapısal detayları korurken doku mimarisinin doğru 3D temsillerini üretmiştir.

Boyama ve görselleştirme için beklenen sonuçlar, dokuların tüm kalınlığı boyunca sinyalde herhangi bir anormal kayıp veya bozulma olmaksızın, hedef boyama sinyalinin net bir şekilde görselleştirilmesini içermelidir. Mikroskop altında bilinen boyanmış bir hedefin görselleştirilememesi, başarısız bir sonuç olarak değerlendirilmelidir.

Şekil 1. Mukoza tüm-mont doku bindirmesi ile anatomik bölgenin temsili. (A–C). Fare sol burun deliğinin içinin sagital görünümü (A) (Hematoksilin ve Eozin, HE boyama) ve aynı bölgenin anatomik yönlendirme için mukoza tüm-mont boyamasının bindirmesi (B); burada akson demetleri yeşil, hücre çekirdekleri ise mavi renkte gösterilmiştir. Bu teknik, tüm anatomik yapının korunmasını sağlamıştır: primer olfaktör sinir (ON) ve aksesuar (vomeronazal sinirler, VNN) akson demetlerini net bir şekilde ayırt etmek ve bunların septumdan kribriform plak üzerinden olfaktör bulba (OB) kadar olan izlerini sürmek mümkündür (B, C). Burada gösterilen doku, çekirdekler için Hoechst (mavi) ve akson demetleri için β-III-Tubulin (yeşil) ile boyanmıştır. n = 15 bağımsız preparattan alınan temsilci görüntüler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Koku sisteminin makro ve şematik görünümleri. (A) Kemik kesici kullanılarak, kırmızı noktalı hattı takip ederek septal kemik çıkarılır (sarı bölge). (B) Alttaki konkav burun boşluğu açığa çıktığında (kahverengi), bu bölgeden solunum ve koku mukozasına kadar uzanan tüm mukoza dokusu toplanabilir. (C) Koku epitelinden koku soğancuğuna kadar uzanan bu yapıların sürekliliğini gösteren grafiksel temsil. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. Tüm mount toplama ve boyama protokolü ile elde edilen anatomik bölgenin genişletilmiş görünümü. (A–D). Sağlıklı ve hasarlı mukozalardan alınan temsilci görüntüler gösterilmiştir. Yukarıdan aşağıya doğru, sağlıklı dokudan sağlam mukoza (n = 3) ve hasarlı mukoza (n = 12). Sağlıklı dokuda (A), uzamış bipolar morfolojilerine sahip OEC'ler (A, sol), akson demetlerini sarar (A, orta) ve fibroblastlar bu tünel benzeri yapıların dış tabakasını oluşturur (A, sağ, beyaz ok). Seçilen üç ROI bu detayları yansıtmaktadır (B). Hasarlı mukozada OEC'ler hem bipolar hem de yuvarlak morfolojiler sergiler (C, D, sol, beyaz oklar). Akson demetleri daha az tekdüze ve daha masif görünür (C, D, orta, beyaz oklar). Fibroblastlar tüm bölge boyunca yaygın görünmektedir (C, D, sağ, beyaz oklar). Ölçek çubuğu = 100 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4. Mukozal tüm montajların üç boyutlu floresan görüntülemesi. (A–H). Hücrelerin düşük büyütmeli görüntüleri (A–F) ve bir yüksek büyütmeli görüntü (G), SpinSR mikroskobu kullanılarak çok sayıda ardışık bölgenin görüntü yığınlarından elde edilmiştir. Olfaktör kılıf hücreleri (OEC'ler) kırmızı, fibroblastlar magenta, aksonlar yeşil ve çekirdekler mavi renktedir. Oklar, farklı OEC morfolojilerini (A) ve akson demetleri etrafındaki fibroblastların dış katmanını (B ve C) göstermektedir. D–F bölümlerindeki oklar, fibroblastların sağlıklı yapılarındaki benzerlikleri vurgulamaktadır. Bu görüntüler, daha sonra Imaris yazılımı kullanılarak modellenen (H) hücresel bileşenlerin mekansal organizasyonunu ortaya koymuştur. Ölçek çubuğu = 50 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Reaktif	Hedef	Dilüsyon	İnkübasyon koşulları	Gerekçe
Birincil antikor
β-III-Tubulin (Rabbit)	Aksonlar	1:300	Roller üzerinde, 4 °C'de 72 sa boyunca	tam kalınlık penetrasyonuna izin vermek için
PDGFR-β (Rat)	Fibroblastlar	1:100
İkincil antikor
Alexa 488	Tavşan birincil antikorlar	1:250	Alüminyum folyoya sarılı halde, roller üzerinde oda sıcaklığında en az 4 sa, ardından roller üzerinde 4 °C'de gece boyunca.	Alüminyum folyo fotobeyazlamayı önler; süre, sıcaklık ve roller kaynaklı ajitasyon iyi penetrasyon sağlar
Alexa 647	Sıçan birincil antikorlar	1:500
Çekirdekler
Hoechst	Hücre çekirdekleri	1:2500

Tablo 1: Bu protokol için optimize edilmiş dilüsyonlarla antikor listesi.Bu tablo, boyama reaktiflerini; hedefleri, dilüsyonları ve inkübasyon koşullarının gerekçeleriyle birlikte listelemektedir.

Tartışma

Son birkaç on yıla, bilimsel alanda birçok yenilikçi yaklaşımın gelişmesiyle birlikte, üç boyutlu dönemin başlangıcına yavaş yavaş tanıklık edilmiştir. Örneğin, yüksek çözünürlüklü floresan mikroskoplarla eşleştirilmiş karmaşık whole-mount görüntüleme yöntemlerinin geliştirilmesiyle mümkün hale gelen üç boyutlu yeniden yapılandırma yaklaşımları, birçok tam kalınlıkta doku histoarkitektürünün daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırmıştır. Bu üç boyutlu modelleme yaklaşımları; damarlar, bezler ve yaygın tümörler gibi çeşitli insan vücudu yapılarını tanımlamak için kullanılmıştır^4,5,6,7,8,9. Dahası, örneğin tam fare beyinlerinde^10,11,12, patolojik ve normal yapılar arasındaki farklar hakkında bilgiler toplanmıştır. Bu yaklaşım, çeşitli biyolojik sistemlerin daha iyi anlaşılması yolunda kritik bir adım olarak tanımlanmış; hücresel devrelerin, bunların yapısal ve fonksiyonel uzaysal organizasyonlarının ve insan patolojilerine potansiyel katkılarının daha derinlemesine kavranmasını kolaylaştırmıştır.

Üç boyutlu doku rekonstrüksiyonu ve görüntülemenin farklı kombinasyonlarının bir dezavantajı, çoğu yaklaşımın doku berraklaştırma adımları içermesidir. Bu yöntem birçok doku için yararlı olsa da, tüm doku tipleri için uygun değildir^8,9,19. Aslında, berraklaştırma prosedürleri, hedef epitoplara potansiyel olarak zarar verebilecek ve endojen sinyalleri etkileyebilecek birkaç yıkama adımı içerir²⁰.

Yukarıda açıklanan yaklaşımlar, farklı sistemler içindeki birçok önemli hücresel yapıyı tanımlamak için kullanılmıştır. Ancak, koku sistemi ve ilgilenilen yapıları, kolayca izole edilebilecekleri kemikli bileşenlerin minimum düzeyde bulunduğu bölgelerdir; bu nedenle, son yıllarda şeffaflaştırma basamaklarını içermeyen whole-mount yaklaşımları denenmiştir^13,14.

Bu çalışmalar, olfaktor sistemdeki nöronal yapıların organizasyonunun daha iyi tanımlanmasının önemini ortaya koymuştur. Buna bağlı olarak, temel odak noktaları, farklı belirteçlerin ekspresyonuna dayalı olarak olfaktor duyusal nöronların dağılımının net bir topografik haritasını çıkarmak¹⁴ ve bunların özgün siliyaları hakkında yeni bilgiler sunmaktı¹³.

Burada geliştirilen ve sunulan bütün montaj (whole-mount) tekniği, mukozal dokunun bütün halindeyken toplanmasını ve korunmasını sağlayarak; bizim durumumuzda özellikle OEC'ler, fibroblastlar ve akson demetleri arasındaki ilişkiye odaklanarak, bu ortamın anatomik ve fizyolojik yapısına dair kritik bilgiler edinme olasılığını açmaktadır. Bu geliştirilmiş izolasyon ve boyama tekniğinin yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme ile eşleştirilmesi, tüm hedef bölgenin yapısını ve burada yer alan hücreleri yansıtan geniş görüntülerin toplanmasını mümkün kılmıştır. Spesifik olarak, geliştirilmiş tekniğimiz iki belirgin avantaj sunmaktadır: lamina propria mimarisi de dahil olmak üzere tüm mukoza hasat edilip işlenir¹³ ve daha nazik doku hazırlama yöntemi, diğer düz montaj (flat-mount) protokollerine kıyasla¹⁴ makro ölçekli anatominin yanı sıra hücreler arası etkileşimlerin (koku kılıf hücreleri, aksonlar ve fibroblastlar gibi) korunmasına yardımcı olur. Bu protokolün ince kesit boyamasına karşı doğrulama içermemesinin nedeni de budur.

Yukarıda belirtildiği gibi, bütün bağlama (whole-mount) teknikleri genellikle uzun doku işleme süreleri gerektirir ve spesifik, pahalı reaktiflerin kullanımını içerir. Bu yöntem, hem zaman çizelgesini hem de önemli hücresel yapıların zarar görme riskini en aza indirmek amacıyla, minimum doku işlemeye odaklanılarak geliştirilmiştir. Dolayısıyla optimize edilen bu yöntem, ince kesitlerde immünohistokimya için yaygın olarak kullanılan reaktiflerle gerçekleştirilebilen hızlı bir süreci temsil etmekte olup; daha uzun işlem süreleri gerektiren ve mukozal doku gibi kemiksiz yapılar için uygun olmayan yaklaşımlara geçerli bir alternatif sunmaktadır.

Görüntüleme ve son işlemleme, kalın doku örneklerinden yüksek çözünürlüklü z-yığınları elde edebilen ve ilgili mukozalar boyunca görüntüleme yapabilecek yeterli lazer penetrasyonuna sahip herhangi bir konfokal mikroskopi platformu kullanılarak gerçekleştirilebilir (görüntüleme ve görüntü işleme ayarlarımız hakkında daha fazla ayrıntı için yöntemler bölümüne bakınız).

Uygun modifikasyonlarla, bu protokolün diğer yaygın kemirgen modellerine uyarlanabileceğine ve uygulanabileceğine inanıyoruz. Bazı dokuya özgü modifikasyonlarla bu yöntem; solunum sistemi ve gastrointestinal sistemdeki (GİS) mukozal ve submukozal dokuların çalışılması, sinir sistemindeki doku organizasyonunun ve çoklu sistem etkileşimlerinin incelenmesi, inflamatuar süreçlerin ve mukoza ile ilişkili lenfoid dokuların (MALTs) analizi ve ayrıca bağırsak-beyin ekseni gibi farklı çoklu sistem eksenlerinin araştırılması dahil olmak üzere çeşitli farklı bağlamlara uygulanabilir.

Bu protokolün temel gücü, doku bütünlüğünü korurken yüksek kaliteli üç boyutlu görüntülemeye olanak tanıyan ve aynı zamanda alanda önceden denenen diğer bütün mount (whole-mount) metodolojilerine kıyasla nispeten daha hızlı bir yaklaşım sağlayan metodolojik iyileştirmelerde yatmaktadır.

Bu yaklaşımın başarılı bir şekilde uygulanması, ilgili dokunun derin anatomik bilgisine güçlü bir şekilde bağımlıydı. Aslında bizim durumumuzda, kafatasının içi açıldıktan sonra toplama işleminin invazivliğini minimize etmek için akson demetlerinin beklenen lokalizasyonunu bilmek temel bir gereklilikti. Bu anatomik bilgi, ilgili bölgeyi ve dokuyu hızlıca lokalize edebilmek ve mukozanın genel yapısını korumak açısından kritikti; bu da başarılı doku işlemenin, yalnızca işlem sonrası adımlardan ziyade, bilgiye dayalı bir toplama stratejisiyle iç içe olduğunu vurgulamaktadır.

Metotlar bölümündeki çeşitli notlarda belirtildiği üzere, bu yöntemin geliştirilmesi ve optimizasyonu için çok sayıda teknik düzenleme kritik öneme sahipti. Tüm boyama işlemi boyunca dokunun Eppendorf tüpleri içerisinde serbestçe yüzmesinin, reaktif ve antikor inkübasyonu sırasındaki sürekli rotasyonla birleştirilmesi, daha statik olan bütün mount ve ince kesit protokollerinden ayrılan temel bir adımdı. Bu iyileştirme, dokunun katlanmasını önlerken reaktiflerin tüm numuneye homojen şekilde nüfuz etmesini sağlamış, böylece gereksiz şeffaflaştırma adımlarına ihtiyaç duymadan boyama tutarlılığını artırmıştır. Ayrıca, her bir reaktif ve antikor kokteyli için inkübasyon süresinin dikkatlice optimize edilmesi temel bir gereklilik olduğunu kanıtlamıştır. Bu son adım, seçilen antikor türüne bağlı olarak daha fazla ayarlanmaya ihtiyaç duyulabilir.

Tüm bunlar birlikte, genel işlem süresini ve sert numune işlemlerini azaltırken tekrarlanabilirliğin artmasını sağlamıştır.

Bir diğer önemli metodolojik adım, floresan işaretlemeye gerek kalmadan, örneği yerleştirmeden ve görüntülemeden önce doku yönelimini güvenilir bir şekilde belirleyebilme yeteneğiydi. Mukozal dokunun lamina propria tarafı, çevreleyen epitel dokuyla açıkça ayırt edilebilen kalın sinir demetlerinin varlığı sayesinde parlak alan mikroskobu altında kolayca tanımlanabildi. Lamina proprianın lam tarafına bakacak ve epitel tabakanın cam lam üzerine oturacak şekilde konumlandırılmasıyla örnek yöneliminin standartlaştırılmasının, görüntü elde etme kalitesini artırdığı saptandı. Bu basit ancak etkili iyileştirme, örnekler arasındaki görüntüleme tutarlılığını artırdı ve elde edilen üç boyutlu rekonstrüksiyonların kalitesine katkıda bulundu.

Ancak, dikkate alınması gereken bazı kısıtlamalar bulunmaktadır. Bu protokol, yaygın olarak kullanılan birçok fare suşu veya diğer kemirgen türleri üzerinde test edilmemiştir. Benzer şekilde, optimizasyonlar yukarıda açıklanan özel deneysel koşullar altında ve yalnızca listelenen antikor panelleriyle gerçekleştirilmiştir. Protokolün çoğu fare ve sıçan suşu, çeşitli farklı antikorlar ve mukozanın tam kalınlıkta toplanmasına olanak tanıyan her türlü deneysel model ile çalışması beklense de, daha dikkatli bir optimizasyon gerekebilir. Bir diğer önemli kısıtlama ise, her bir kesitin ayrı bir antikor paneliyle boyanabildiği ve dolayısıyla ince kesitli dokularda birden fazla farklı antikor panelinin test edilebildiğinin aksine, tek bir whole-mount kesitinin yalnızca tek bir antikor paneli ile boyanabilmesidir.

Genel olarak, bu metodolojik yenilikler; doku işleme, boyama koşulları ve numune oryantasyonuna yönelik nispeten basit düzenlemelerin, bütünleme (whole-mount) görüntüleme sonuçlarını nasıl önemli ölçüde iyileştirebileceğini göstermektedir. Kapsamlı doku işleme ve şeffaflaştırma adımlarından kaçınan bu yaklaşım, detaylı ve büyük ölçekli üç boyutlu verilerin elde edilmesine imkan tanırken, hassas ve kemiksiz dokuların incelenmesi için pratik ve uyarlanabilir bir alternatif sunmaktadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sığır Serum Albümini (BSA)	Sigma-Aldrich	A3294-50G	İmmünohistokimya
Adobe Illustrator		versiyon 28.5
Anti-beta III Tubulin antikoru - Nöronal Markör	Abcam	ab18207
Anti-PDGFR beta antikoru [APB5]	Abcam	ab91066
bisBenzimide H 33342 trihidroklorür	Sigma Aldrich	14533
LAMEL 24X50MM NO. 1.5 100ADET	Bio-strategy	EPBRCS245015GP	İmmünohistokimya
Eşek anti-Tavşan IgG (H+L) Yüksek Derecede Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluo 488	Thermo Fisher	A-21206
Dumont #15A Kemik Kesici - Epoksi Kaplı	Daniels Health Laboratory Products P/L	11215-02	Doku diseksiyonu
Dumont #7 Pens - Biologie/Dumostar	Daniels Health Laboratory Products P/L	11297-10	Doku diseksiyonu
Keçi anti-Sıçan IgG (H+L) Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor™ 647	Thermo Fisher	A-21247
Imaris yazılımı	Imaris	versiyon 9.5.0	Görüntüleme
Mayo diseksiyon makası	ProSciTech	420SS	Doku diseksiyonu
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Doku İşleme
Fosfat tamponlu salin, steril PBS Tabletleri (PBS)	Thermo Fisher Scientific	18912014	Doku İşleme
ProLong Glass Antifade Kapatıcı	Thermo Fisher Scientific	P36980	İmmünohistokimya
Neşter ucu #23	Scalpel Blades Swann Morton	COS240B	Doku diseksiyonu
Neşter sapı #4	ProSciTech	T134	Doku diseksiyonu
Sodyum Azid	Sigma-Aldrich	S2002-25G	Doku İşleme
Sükroz	Chem-Supply	57-50-1	Doku İşleme
TOMO Adhezyon mikroskop lamları	ProSciTech	GEMS63705-09	İmmünohistokimya
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100mL	İmmünohistokimya