Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Sinir Rejenerasyonunun İncelenmesi İçin Tüm Yuva Analizi Kullanarak Fare Olfaktör Sinir Sistemi Modelinde In Vivo Doku Karmaşıklığının Korunması

116 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/72036

⸱

18 Ağustos 2026

 ,  ,  , 
1Griffith Institute for Biomedicine and Glycomics, Griffith University, 2Clem Jones Centre for Neurobiology and Stem Cell Research, Griffith University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, farenlerin olfaktör sinir sisteminin anatomik karmaşıklığını korumak için eksiksiz bir iş akışını özetlemektedir. Burada disseksiyon, doku hazırlama ve görüntüleme dahil olmak üzere tüm iş akışı ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu protokol, olfaktör sistemin doğal onarım koşulları da dahil olmak üzere normal veya anormal koşullar altında incelenmesi için kullanılabilir.

Özet

Üç boyutlu (3D) görüntüleme çağında, standart immünohistokimyanın patoloji ve karmaşık insan anatomisi çalışmalarında oldukça sınırlı kaldığı kabul edilmektedir. Yalnızca dar kesitlerin analiz edilmesiyle, daha büyük yapılar ve doku mimarisinin temel yönleri kritik bağlamsal ayrıntıları kaybedebilir; bu da eksik veya yanıltıcı yorumlara yol açabilir. İki boyutlu (2D) kesitler histoarkitektürün temel düzeyde anlaşılmasını desteklemiş olsa da, biyolojik dokuların gerçek üç boyutlu gerçekliğini yakalamada yetersiz kalmaktadırlar.

Birden fazla anatomik bölgeyi kapsayan giderek artan sayıda çalışma, artık sağlam anatomik birimleri izole eden teknikleri -flat mount, whole-mount veya en face preparasyonlar- yüksek çözünürlüklü floresan mikroskopi ile birlikte kullanmaktadır. Bu yaklaşımlar, yapısal organizasyonun daha kapsamlı bir görselleştirilmesini ve yorumlanmasını sağlar. Bu durum, dikkat çekici rejenerasyon yeteneğinin altında yatan karmaşık hücresel mekanizmaları tanımlamanın tam kalınlıkta bir bağlam gerektirdiği olfaktör sinir sisteminde özellikle önemlidir. İnce kesitler, yeterince tanımlanmamış kalan temel patofizyolojik özelliklerin gözden kaçırılması riskini taşır.

Bu kısıtlamalar ve kokusal rejenerasyonu yönlendiren hücresel etkileşimlere ilişkin bilgi boşluğu göz önüne alındığında, tam kalınlıkta doku karmaşıklığını koruyabilen geliştirilmiş bir whole-mount tekniği geliştirilmesi temel bir gereklilikti. Tüm koku mukozaları, optimize edilmiş bir antikor penetrasyon protokolü eşliğinde tam kalınlıkta örnekler olarak izole edildi. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme (EVIDENT SpinSR) ve 3D rekonstrüksiyon, hücresel etkileşimlerin in vivo olarak doğru şekilde görselleştirilmesini sağladı.

Giriş

Koku sinir sistemi (KSS), yaşam boyunca nöronal yenilenme kapasitesini koruduğu için nöral rejenerasyon mekanizmalarını incelemek adına benzersiz ve iyi tanımlanmış bir model teşkil eder1. Ancak, koku sistemindeki hücrelerin davranışlarına dair anlayışımızdaki önemli eksiklikler nedeniyle, bu nöro-onarıcı yeteneğin klinik uygulamaya dönüştürülme potansiyeli sınırlı kalmaktadır2,3,4. Birincil koku nöronları, koku kılıf hücreleri (OEC'ler) ve perineural fibroblastlar dahil olmak üzere KSS'nin hücresel yanıtları ve anatomik organizasyonu; kemirgen KSS'ye uygulanan ağır fiziksel yaralanma modelleri ile kombine edilmiş ultra ince (<2 µm) doku kesitlerine dayanan çeşitli hayvan çalışmalarında tanımlanmıştır1,2. Bu çalışmalardaki hayvanlar genellikle yaralanmadan sonraki 10. günde sakrifiye edilmiş olup, bu durum nöral yaralanma sırasında söz konusu dokunun geçirdiği kapsamlı ve daha karmaşık yeniden şekillenmenin yalnızca belirli bir anına dair dar bir pencere sunmuştur2. Bu çalışmalar, aksonal ölümden sonra OEC'lerin ve fibroblastların yaralanmayı takiben sürekli kanallar şeklinde varlıklarını sürdürdüklerini rapor etmiştir.

Bilgi verici olsa da, yukarıda açıklanan birçok kısıtlama nedeniyle, kullanılan yaklaşım ONS'nin yüzeysel bir düzeyde düşük çözünürlüklü kavramsal bir genel görünümü sağlamış ve nihayetinde sağlam ONS içindeki gerçek hücresel organizasyonun kapsamlı bir değerlendirmesini engellemiştir3. Sonuç olarak, kritik uzaysal ilişkiler gözden kaçmış olabilir.

Üç boyutlu doku yapısının korunması, doğru anatomik ve hücresel analizler için temel teşkil eder ve birçok organ ile patoloji üzerinde başarıyla uygulanmıştır4,5,6,7,8,9,10,11,12. Olfaktör mukozadaki nöral organizasyonun haritalanması için bütun bağlama (whole-mount) yaklaşımları kullanılmıştır13,14; ancak, korunmuş bir lamina propria da dahil olmak üzere, tam kalınlıkta bir ONS yapısı ile hücresel etkileşimlerin görselleştirilmesi henüz gerçekleştirilmemiştir.

Bu çalışmada, ONS mimarisinin ayrıntılı analizine olanak tanıyan; bütün doku (whole-mount) işleme, immünboyama, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve üç boyutlu yeniden yapılandırma içeren bir fare modeli iş akışı oluşturuyoruz. Bu protokol, lamina propria dahil olmak üzere tam kalınlıktaki koku mukozasını koruyan ve muhafaza eden, böylece hücreler arası etkileşimlerin incelenmesine imkan veren, mevcut yayınlanmış yöntemlerdeki boşluğu doldurmak amacıyla geliştirilmiştir. Özellikle, bu geliştirilmiş doku toplama ve işleme metodolojisi, çeşitli koku sistemi modellerine uygulanabilir ve bunlarla kombine edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvanlar ve transgenik olarak modifiye edilmiş hücreler içeren tüm deneyler, Avustralya Commonwealth Gen Teknolojisi düzenleyici ofisinin (OGTR) kılavuzlarına uygun olarak, Griffith University Biyogüvenlik Komitesi (NLRD/003/2020_var3) ve Griffith University Hayvan Etik Komitesi'nin (MHIQ/04/23/AEC) onayıyla yürütülmüştür.

NOT: Çalışmada her iki cinsiyetten toplam 15 yetişkin laboratuvar faresi (8–9 haftalık) kullanılmıştır. Spesifik olarak, tüm OEC'lerin S100β promotörü kontrolü altında parlak kırmızı DsRed proteinini eksprese ettiği S100β-DsRed transgenik fareler kullanılmıştır. S100β, daha geniş bir kalsiyum bağlayıcı protein ailesinin bir parçasıdır ve OEC'ler gibi merkezi sinir sistemindeki glial hücrelerde yaygın olarak eksprese edilir. Bu model, endojen floresan sinyaller kullanılarak hedef hücre popülasyonlarının kolayca lokalizasyonuna olanak tanıdığı için bu deneylerin amaçları doğrultusunda optimal seçilmiştir. S100β-DsRed transgenik fareler daha önce üretilmiş olup, bu transgenik farelerin kullanımının fikslemiş doku analizleri için uygulanan immünohistokimyaya kıyasla OEC'lerin daha iyi tespit edilmesini sağladığı gösterilmiştir15,16,17,18.

1. Baş toplama ve doku fiksasyonu

  1. Deneysel zaman noktalarında hayvanları artan CO2 inhalasyonu ile ötanize edin.
  2. Ölümün, kornea ve pedal geri çekilme reflekslerinin yokluğuyla onaylandığından emin olun, ardından servikal dislokasyon uygulayın veya onaylanmış SOP'ye uygun hareket edin.
  3. Tüm başı ve çeneleri makasla çıkarın.
  4. Kafatası üzerindeki deriyi çıkarın ve nazal boşluğu açığa çıkarmak ve fiksatif ajanın etkili bir şekilde nüfuz etmesini sağlamak için burnun ucundaki kıkırdağı kaldırın.
    NOT: Hayvanın burun kıkırdağının en ön kısmının kesildiği bu adımın, nazal boşluktaki dokunun doğru şekilde fikse edilmesini sağlamak için kritik olduğu gözlemlenmiştir.
  5. Fazla kanı temizlemek için başları hızlıca 1× PBS ile durulayın.
  6. Dokuyu, bir roller üzerinde 4 °C'de, en az 6 saat boyunca (ilgilenilen dokunun fikse edilmesi için yeterli süre) boyunca %4 paraformaldehitte gece boyu (12–18 sa) daldırarak fikse edin.
    DİKKAT: Paraformaldehit, formaldehit buharı salan tehlikeli bir kimyasaldır. İnhalasyon, cilt teması ve ağız yoluyla alım durumunda toksiktir; göz, cilt ve solunum yolu irritasyonuna neden olur ve şüpheli bir kanserojendir. Sadece eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruması dahil olmak üzere uygun KKD giyilmiş haldeyken çeker ocak altında çalışın. Protokol sırasında oluşan tehlikeli kimyasalların ve biyolojik atıkların güvenli bertarafı, kurumsal ve yerel düzenlemelere uygun olarak yapılmalıdır.
    ​NOT: Optimizasyonlar sırasında, ilgili dokuyu fikse etmek için 6 saatin yeterli olduğu; ancak 12 saatin üzerindeki sürelerin aşırı fiksasyona ve mukozal yapıların dejenerasyonuna yol açabileceği gözlemlenmiştir.
  7. Başları fiksatif ajandan çıkarın ve bir roller üzerinde oda sıcaklığında (20–25 °C) 3 saat boyunca 1× PBS ile yıkayın.
  8. Başları 4 °C'de taze PBS içinde saklayın ve 48 saat içinde whole-mount mukozal dokuyu toplayın.

2. Tüm doku örneği toplama

  1. Doku izolasyonunu mikroskop altında gerçekleştirin.
  2. Başları, mid-sagittal hattı takip ederek bir bistüri yardımıyla ortadan ikiye kesin.
  3. Burun boşluğunun iç kısmını açığa çıkarın (Şekil 1). Anatomik bölgeleri belirleyin ve tüm anatomik kesiti kaplayan mukozal dokuyu toplayın (Şekil 1B).
  4. Bir kemik kesici kullanarak, mukoza boşluğunun bir kısmını örten septal kemiği nazikçe kırın ve çıkarın.
    NOT: Bakınız Şekil 2ABu adım, akson demetlerinin dorsal duvardan geçtiği kemiğin altındaki konkav boşluğu açığa çıkarmak için kritik öneme sahiptir (Şekil 1B).
  5. Bu bölge açığa çıktıktan sonra, kavisli pensler kullanarak dokuyu konkav dorsal duvardan nazikçe ayırın ve dışarı çıkarın. Dokuyu alttaki kemikten kaldırın ve sağlam bütün bağlama (whole-mount) preparatını toplamak için geri kalan olfaktör mukozayı nazikçe soyun.
    NOT: Dokunun yırtılmasını önlemek için bu aşamada aşırı dikkatli olunması gerekmiştir.
  6. Her iki burun deliğinden de ilgili dokuları toplayın: mukoza; septumu, sol ve sağ dorsal duvarları ve burun boşluğunun cribriform plakasını kaplar (Şekil 1A, B)Birincil olfaktor yapıları içeren anatomik bölgeyi izole etmek için septum, dorsal duvarlar ve kribriform plak dahil olmak üzere her iki burun deliğinden doku toplayın (Şekil 2C).
  7. Toplanan dokuları 1× PBS ile yıkayın ve kemik parçaları dahil istenmeyen tüm dokuları uzaklaştırın. Dokuları, gelecekteki immünohistokimya analizleri için 1× PBS içinde 4 °C'de saklayın.
    NOT: Dokunun uzun süreli saklanması gerekiyorsa, 4 °C'de 1× PBS ve %0,001 (A/H) Sodyum Azid çözeltisi içinde saklanması önerilir.

3. Optimize edilmiş boyama protokolü

NOT: Yaygın olarak kullanılan boyama protokolleri genellikle ince-orta kalınlıktaki kesitler (örneğin, 50 µm'ye kadar) için optimize edilmiştir. Bu nedenle, protokolün çok daha kalın olan dokuya uyarlanması gerekmiştir.
​Kritik bir adımın, tüm boyama süreci boyunca dokunun Eppendorf tüpleri içinde yüzer halde tutulması ve reaktifler nüfuz ederken tüplerin bir silindir üzerine yerleştirilmesi olduğu gözlemlenmiştir. Bu nedenle, boyama işlemleri doku bir görüntüleme lamı üzerindeyken gerçekleştirilmemiştir. Doku önce yüzer halde boyanmış ve ardından görüntüleme lamlarına monte edilmiştir. Bu ayrıntılar, dokunun katlanmamasını ve reaktifler ile antikorların tüm bölgeye nüfuz edebilmesini sağlamıştır.

  1. Dokuları saklama koşullarından çıkarın ve bloklama çözeltisi (kullanılacak çözelti boyamaya özgü olacaktır) içeren bir Eppendorf tüpüne yerleştirin.
    ​NOT: Bloklama çözeltisi: PBS içinde %3 BSA, %0,3 Triton X-100. Bir diğer önemli ayarlama, dokunun her bir reaktife ve antikor kokteyline maruz kaldığı süredir.
  2. Dokuyu oda sıcaklığında, roller üzerinde 3 saat boyunca bloklama çözeltisinde bekletin.
    NOT: Standart ince kesit immünohistokimyasal boyama yaklaşımına kıyasla maruz kalma süresi artırıldığında, seçilen antikorların ve boyama reaktiflerinin (Tablo 1) konsantrasyonunu artırmanın gerekli olmadığı gözlemlenmiştir. Bu durum, pahalı antikor reaktiflerinin kullanımını da minimize etmiştir. İnkübasyonlar, roller üzerinde dönebilmesi için kapak tutucusu kesilmiş 1,5 mL'lik bir Eppendorf tüpünde gerçekleştirilir. Reaktif hacmi 500 µL idi.
  3. Primer antikorlar ile roller üzerinde 4 °C'de 72 saat boyunca inkübe edin.
  4. Dokuyu oda sıcaklığında, roller üzerinde PBS 1× kullanarak iki kez yıkayın (her bir yıkama 1,5 saat).
  5. Dokuyu sekonder antikor (alüminyum folyoya sarılı) ve çekirdek boyaması ile önce oda sıcaklığında roller üzerinde en az 4 saat, ardından gece boyunca (12–18 saat) 4 °C'de roller üzerinde inkübe edin.
  6. Dokuyu oda sıcaklığında, roller üzerinde PBS 1× kullanarak iki kez yıkayın (her seferinde 1,5 saat).

4. Lam hazırlama

  1. Dokuyu Eppendorf tüpünden nazikçe çıkarın
  2. Bir mikroskop altında, dokuyu bir lam üzerine yerleştirin ve dokuda herhangi bir katlanma olmadığından emin olun.
    NOT: Herhangi bir floresans olmadan, dokunun yönü mikroskop altında belirlenebilir. Mukozal dokunun lamina propria tarafı, epitel lam camına bakacak ve lamina propria lameller örtü camına bakacak şekilde yerleştirilmelidir. Lamina propria, boyama olmadan görülebilen kalın sinir demetlerinin varlığıyla tanımlanabilir. Yönlendirmenin lamina propriyanın örtü camına, epitel tarafının ise lam camına bakacak şekilde yapılması, hem boyama hem de görüntüleme sürecini kolaylaştıracaktır.
  3. Lamları floresan montaj medyumu kullanarak örtü camı ile kapatın ve lamları mühürleyin.
  4. Lamlar, oda sıcaklığında karanlıkta gece boyunca (12–18 h) kurutulduktan sonra 4 °C'de saklanabilir

5. Görüntüleme ve Son İşleme

  1. Düşük büyütmeli immünofloresan görüntülerin elde edilmesi
    1. Görüntü elde etme işlemi sırasında doğrusal alfa harmanlama (linear alpha-blending) kullanarak otomatik dikme (stitching) gerçekleştirin.
      ​NOT: Doku hacminin tamamen kapsandığından emin olmak için z-yığın (z-stack) çerçeve sayısı, numunenin kalınlığına göre ayarlanmalıdır.
    2. Komşu görüş alanlarını %15 örtüşme ile yakalayın. Meander elde etme deseni kullanarak karolu (tiled) görüntüler edinin.
    3. Toplam optik kesit sayısını doku kalınlığına göre ayarlayın.
    4. Görüntü kalibrasyonunu hem X hem de Y eksenlerinde 215.594 nm/pixel olarak ayarlayın. Görüntüleri 0.8 µm z-adım boyutu kullanarak z-yığınları şeklinde edinin.
    5. Montajı yapılmış bütün dokuyu konfokal mikroskop tablasına yerleştirin. 30x objektif lens (NA 1.04) kullanarak genel bakış görüntüleri elde edin.
  2. Yüksek büyütmeli immünofloresan görüntülerin elde edilmesi.
    1. 60× objektif lens (NA 1.5) kullanarak detaylı görüntüler edinin. Görüntü kalibrasyonunu hem X hem de Y eksenlerinde 107.923 nm/pixel olarak ayarlayın. 0.41 µm z-adım boyutu kullanarak z-yığın görüntüleri edinin.
    2. Toplam optik kesit sayısını doku kalınlığına göre ayarlayın ve görüntüleri tek bir görüş alanından yakalayın.
      ​NOT: 60× elde etme işlemleri için görüntü dikme işlemine gerek yoktur çünkü her veri seti tek bir görüş alanından oluşur.
  3. Histolojik referans görüntülerin elde edilmesi
    1. HE boyalı mid-sagittal fare kafa kesitlerini, parlak alan aydınlatması altında bir lam tarama mikroskobu kullanarak görüntüleyin.
    2. 40× objektif lens (NA 0.95) ve 0.63x kamera büyütmesi kullanarak, efektif 25.2× büyütme ile görüntüler edinin.
    3. Hem X hem de Y eksenlerinde 136.905 nm/pixel piksel kalibrasyonunu doğrulayın ve görüntüyü tek bir odak düzlemi olarak edinin.
    4. Meander elde etme deseni ve doğrusal alfa harmanlama kullanarak karolu görüntüleri otomatik olarak dikin.
  4. Genel bakış immünofloresan referans görüntülerinin elde edilmesi
    1. 10x objektif lens kullanarak tamamlayıcı genel bakış immünofloresan görüntüleri edinin.
    2. Görüntü elde etme sırasında %0 karo örtüşmesi kullanarak numuneyi tek bir z-kesit olarak yakalayın.
    3. Görüntü kalibrasyonunu hem X hem de Y eksenlerinde 647.249 nm/pixel olarak ayarlayın ve ilgili tüm anatomik bölgeyi kapsayan bir genel bakış görüntüsü oluşturun.
  5. Görüntü işleme ve final figürlerin oluşturulması.
    1. Elde edilen görüntü veri setlerini görüntü analiz yazılımına aktarın. z-yığın veri setlerinden maksimum yoğunluk projeksiyonları (MIPs) oluşturun.
    2. Sonraki analizler ve figür hazırlığı için ilgilenilen bölgeleri (ROI'ler) seçin.
    3. Anatomik referans figürler oluşturmak için genel bakış immünofloresan görüntülerini karşılık gelen HE görüntüleri ile birleştirin. Ardından, figür hazırlığından önce floresan ve histolojik veri setleri arasındaki hizalamayı ve anatomik uygunluğu doğrulayın.
      NOT: Tüm görüntü dikme işlemleri, önceden belirlenmiş mikroskop ayarları kullanılarak görüntü elde etme sırasında otomatik olarak gerçekleştirilmeli ve ek bir son işlem gerektirmemelidir. Bizim durumumuzda, 3D oluşturma işlemi Imaris yazılımı kullanılarak yapılmıştır: 3D rekonstrüksiyonu üretmek için her elde edilen kanal için eşik yoğunluğuna dayalı yüzey oluşturma (surface rendering) eklentisi kullanılmıştır. Son olarak, final görüntüler Adobe Illustrator üzerinde derlenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada sunduğumuz bütün montaj (whole-mount) yaklaşımı, olfaktör mukozanın bütünüyle izole edilmesini ve korunmasını sağlamıştır. Bizim çalışmamızda odak noktamız, hem makro (tam anatomik görünüm) hem de mikro (hücresel düzey) ölçeklerdeki hücresel ve anatomik değişiklikleri anlamaktı.

Bütünle montaj yaklaşımı, hem epitelyal hem de lamina propria bölmelerini toplamamıza ve ilgilendiğimiz hücreler olan akson demetleri, olfaktör kılıf hücreleri (OEC'ler) ve fibroblastlar arasındaki mekansal iliş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Son birkaç on yıla, bilimsel alanda birçok yenilikçi yaklaşımın gelişmesiyle birlikte, üç boyutlu dönemin başlangıcına yavaş yavaş tanıklık edilmiştir. Örneğin, yüksek çözünürlüklü floresan mikroskoplarla eşleştirilmiş karmaşık whole-mount görüntüleme yöntemlerinin geliştirilmesiyle mümkün hale gelen üç boyutlu yeniden yapılandırma yaklaşımları, birçok tam kalınlıkta doku histoarkitektürünün daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırmıştır. Bu üç boyutlu modelleme yaklaşımları; damarlar, bezler ve yaygın tümörler gibi çeşitli in...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma; JSTJ ve RR'ye Clem Jones Foundation, Perry Cross Spinal Research Foundation ve Motor Accident Insurance Commission tarafından sağlanan fonlar; RR'ye National Injury Insurance Scheme Queensland bursu ve FO'ya Perry Cross Spinal Research Foundation bursu ile desteklenmiştir. Bu projenin bir kısmı, FO'ya verilen “Griffith University Post-Graduate Research Scholarship (GUPRS)” ve “Griffith University International Postgraduate Research Scholarship (GUIPRS)” bursları ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma-AldrichA3294-50Gİmmünohistokimya
Adobe Illustratorversiyon 28.5
Anti-beta III Tubulin antikoru - Nöronal MarkörAbcamab18207
Anti-PDGFR beta antikoru [APB5]Abcamab91066
bisBenzimide H 33342 trihidroklorürSigma Aldrich14533
LAMEL 24X50MM NO. 1.5 100ADETBio-strategyEPBRCS245015GPİmmünohistokimya
Eşek anti-Tavşan IgG (H+L) Yüksek Derecede Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluo 488Thermo FisherA-21206
Dumont #15A Kemik Kesici - Epoksi KaplıDaniels Health Laboratory Products P/L11215-02Doku diseksiyonu
Dumont #7 Pens - Biologie/DumostarDaniels Health Laboratory Products P/L11297-10Doku diseksiyonu
Keçi anti-Sıçan IgG (H+L) Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor™ 647Thermo FisherA-21247
Imaris yazılımıImarisversiyon 9.5.0Görüntüleme
Mayo diseksiyon makasıProSciTech420SSDoku diseksiyonu
ParaformaldehitSigma-AldrichP6148-500GDoku İşleme
Fosfat tamponlu salin, steril PBS Tabletleri (PBS)Thermo Fisher Scientific18912014Doku İşleme
ProLong Glass Antifade KapatıcıThermo Fisher ScientificP36980İmmünohistokimya
Neşter ucu #23Scalpel Blades Swann MortonCOS240BDoku diseksiyonu
Neşter sapı #4ProSciTechT134Doku diseksiyonu
Sodyum AzidSigma-AldrichS2002-25GDoku İşleme
SükrozChem-Supply57-50-1Doku İşleme
TOMO Adhezyon mikroskop lamlarıProSciTechGEMS63705-09İmmünohistokimya
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100mLİmmünohistokimya

Kaynaklar

  1. Li Y, Field P M, Raisman G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science. 1997;277 (5334),2000–2002.
  2. Li Y, Field P M, Raisman G. Olfactory ensheathing cells and olfactory nerve fibroblasts maintain continuous open channels for regrowth of olfactory nerve fibres. Glia. 2005;52(3):245–251.
  3. Yamaguchi M, et al. The New Era of Three-Dimensional Histoarchitecture of the Human Endometrium. J Pers Med. 2021;11(8).
  4. Falk M, Ynnerman A, Treanor D, Lundström C. Interactive visualization of 3D histopathology in native resolution. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 2018;25(1):1008–1017.
  5. Kiemen A, et al. In situ characterization of the 3D microanatomy of the pancreas and pancreatic cancer at single-cell resolution. BioRxiv. 2020.2012. 2008.416909, (2020).
  6. Tian J, et al. Three-dimensional reconstruction of laryngeal cancer with whole organ serial immunohistochemical sections. Sci Rep. 2020;10(1):18962.
  7. Lotz JM, et al. Integration of 3D multimodal imaging data of a head and neck cancer and advanced feature recognition. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 2017;1865(7):946–956.
  8. Nojima S, et al. CUBIC pathology: three-dimensional imaging for pathological diagnosis. Sci Rep. 2017;7(1):9269.
  9. Tainaka K, et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell reports. 2018;24(8):2196–2210.e2199.
  10. Onozato ML, Klepeis VE, Yagi Y, Mino-Kenudson M. A role of three-dimensional (3D)-reconstruction in the classification of lung adenocarcinoma. Stud Health Technol Inform. 2012;35(2):79–84.
  11. Hama H, et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of the transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 2011;14(11):1481–1488.
  12. Tainaka K, et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 2014;159(4):911–924.
  13. Oberland S, Neuhaus EM. Whole mount labeling of cilia in the main olfactory system of mice. J Vis Exp. 2014;10.3791/52299(94).
  14. Gavid M, et al. Technique of flat-mount immunostaining for mapping the olfactory epithelium and counting the olfactory sensory neurons. PLoS One. 2023;18(1):e0280497.
  15. Windus LC, et al. Stimulation of olfactory ensheathing cell motility enhances olfactory axon growth. Cell Mol Life Sci. 2011;68(19):3233–3247.
  16. Windus LC, Claxton C, Allen CL, Key B, St John JA. Motile membrane protrusions regulate cell-cell adhesion and migration of olfactory ensheathing glia. Glia. 2007;55(16):1708–1719.
  17. Windus LC, et al. Lamellipodia mediate the heterogeneity of central olfactory ensheathing cell interactions. Cell Mol Life Sci. 2010;67(10):1735–1750.
  18. Chehrehasa F, et al. Olfactory glia enhance neonatal axon regeneration. Mol Cell Neurosci. 2010;45(3):277–288.
  19. Ueda HR, et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 2020;21(2):61–79.
  20. Jing D, et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Res. 2018;28(8):803–818.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Üç Boyutlu GörüntülemeTam Kalınlıkta DokuYüksek Çözünürlüklü MikroskopiAntikor Penetrasyonu3B RekonstrüksiyonOlfaktör Mukoza

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.