Yöntem makalesi

Bir Petri Kabında Sirkadiyen Ritimler: Sirkadiyen Saat Gen Ekspresyon Analizi İçin Fare Hipotalamik mHypoE-42 Hücrelerinin Senkronizasyonu

159 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/72039

⸱

3 Eylül 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CNC-UC-Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 2CiBB-Centre for Innovative Biomedicine and Biotechnology, University of Coimbra, 3Faculty of Pharmacy, University of Coimbra, 4Gene Therapy Center of Excellence (GeneT), University of Coimbra, 5Institute for Interdisciplinary Research (IIIUC), University of Coimbra

Bu makalede

Özet

Bu protokol; kültürlenmiş hücrelerin senkronize edilmesi, gece boyunca toplama yapmadan 24–72 saatlik süre boyunca kademeli zaman serisi örneklemesinin gerçekleştirilmesi ve sirkadiyen saat geni ekspresyonunun analiz edilmesi için pratik ve tekrarlanabilir bir iş akışı sunmaktadır.

Özet

Sirkadyen ritimler; gen ekspresyonu, metabolizma ve davranış dahil olmak üzere geniş bir yelpazedeki hücresel ve fizyolojik süreçleri düzenleyen, yaklaşık 24 s saatlik endojen osilasyonlardır. Bu ritimler, zamansal ve çevresel ipuçlarına yanıt veren, birbirine bağlı transkripsiyonel-translasyonel geri besleme döngülerinden kaynaklanır. Sirkadyen düzenleme oldukça dinamik olduğu için, küçük deneysel varyasyonlar bile fazı, amplitüdü ve ritmicity'yi etkileyebilir; bu durum, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için standartlaştırılmış deneysel iş akışlarını temel hale getirir. Mevcut protokolün amacı; kültürlenmiş hücrelerin senkronize edilmesi, zaman serisi örneklemesinin gerçekleştirilmesi ve standart laboratuvar koşulları altında sirkadyen saat geni ekspresyonunun analiz edilmesi için pratik ve tekrarlanabilir bir iş akışı sağlamaktır. Protokol; serum şoku tabanlı senkronizasyonu, gece boyunca örnekleme yapmaktan kaçınmak için 24–72 s saat boyunca kademeli örnek toplamayı, ribonükleik asit ekstraksiyonunu, tamamlayıcı deoksiribonükleik asit sentezini, kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonunu ve uygun istatistiksel yaklaşımlar kullanılarak yapılan sirkadyen ritim analizini tanımlamaktadır. İş akışı ayrıca, deneyler arasındaki tekrarlanabilirliği artırmak için senkronizasyon koşulları, örnek kalite değerlendirmesi, referans gen seçimi ve veri analizi gibi kritik deneysel hususlara dikkat çekmektedir. Bu yöntem, moleküler sirkadyen mekanizmaların araştırılması ve kültürlenmiş hücrelerde ritmik gen ekspresyonunun değerlendirilmesi için erişilebilir bir yaklaşım sunarak, fizyolojik ve hastalıkla ilişkili deneysel modellerde sirkadyen düzenleme çalışmalarını kolaylaştırmaktadır.

Giriş

Sirkadiyen ritimler, çok çeşitli fizyolojik, metabolik ve hücresel süreçleri düzenleyen, yaklaşık 24 saatlik periyoda sahip endojen döngülerdir1. Memeli sistemlerinde bu ritimler, hipotalamusun suprakiyasmatik çekirdeğinde (SCN) yer alan merkezi bir saat ve hücresel düzeydeki kendi kendini sürdüren moleküler saatler tarafından koordine edilir. Bu saatler; sirkadiyen lokomotor çıktı döngüleri proteini kaput (Clock), temel heliks-ilmek-heliks aril hidrokarbon reseptörü nükleer translokaz benzeri 1 (Bmal1), period (Per) ve kriptokrom (Cry) dahil olmak üzere temel saat genlerini içeren birbirine bağlı transkripsiyonel-translasyonel geri besleme döngülerinden oluşur2. Sirkadiyen saatin çeşitli biyolojik süreçlerdeki merkezi rolü göz önüne alındığında, in vitro hücre modelleri, kontrollü deneysel koşullar altında zamansal düzenlemenin moleküler mekanizmalarını araştırmak için önemli araçlar haline gelmiştir.

Bu protokolün amacı; serum şoku protokolü kullanarak kültüre edilmiş hücrelerin senkronizasyonu, kademeli zaman serisi örneklemesi yapılması ve gece boyunca örnek toplama zorunluluğunu ortadan kaldırarak sirkadiyen saat geni ekspresyonunun analizi için güvenilir, pratik ve tekrarlanabilir bir iş akışı sağlamaktır. Veri kalitesinden ödün vermeden sirkadiyen örneklemenin uygulanabilirliğini artıran bu iş akışı, standart laboratuvar teknikleri kullanılarak ritmik biyolojik süreçlerin incelenmesini kolaylaştırmayı hedeflemektedir.

Sirkadiyen çalışmalar, insan kanser hücre hatları3, rat-1 fibroblastları4, SCN ekplantları5 ve organoidler6 dahil olmak üzere geniş bir yelpazedeki in vitro modellerde gerçekleştirilmiştir. Memeli hücrelerin çoğu fonksiyonel sirkadiyen saatlere sahip olsa da ışık gibi senkronize edici uyaranların yokluğu, kültür ortamında hızla desenkronizasyona yol açarak sirkadiyen ritimlerin in vitro incelenmesini sınırlandırmaktadır7. Bu nedenle, moleküler saat mekanizmalarını ve bunların sağlık ve hastalıklar üzerindeki etkilerini araştırmak için senkronizasyon teknikleri temel öneme sahiptir.

Kültürlenmiş memeli hücreleri için çeşitli senkronizasyon stratejileri geliştirilmiştir. Deksametazon kullanılan glukokortikoid bazlı senkronizasyon, birçok hücre tipinde sirkadiyen ritimleri güçlü bir şekilde sıfırlarken serum stimülasyonu ile ilişkili bazı değişkenlikleri azalttığı için en yaygın kullanılan yaklaşımlardan biridir8. Benzer şekilde, siklik adenozin monofosfat sinyalizasyonunun forskolin aracılığıyla aktivasyonu, seçili hücresel modellerde periferik saatlerin senkronize edilmesi için başarıyla kullanılmıştır9. Diğer yaklaşımlar arasında kan yoluyla taşınan sinyallerle tedavi4, farklı kimyasal bileşikler8,10, besiyeri değişimi3, sıcaklık şoku11, oksijen döngüleri12 ve mekanik stimülasyon13 yer almaktadır. Topluca bakıldığında, bu yöntemler sirkadiyen araştırmaları önemli ölçüde ilerletmiştir; ancak, özel ekipmanlar, belirli deneysel koşullar veya ek optimizasyonlar gerektirebilirler, bu da seçilen senkronizasyon stratejisinin her biyolojik model ve deneysel uygulama için doğrulanmasını önemli kılmaktadır14.

Serum şoku, en yaygın olarak kabul görmüş senkronizasyon yaklaşımlarından biridir ve kültüre edilmiş hücrelerin kısa süreli, yüksek serum uyarısına maruz bırakılmasından oluşur4. Uyarı geçici olduğu için, hücresel sinyal yollarının uzun süreli pertürbasyonu minimize edilir4 ve böylece sonraki analizler üzerindeki potansiyel karıştırıcı etkiler azaltılır. Sonuç olarak serum şoku, sirkadiyen gen ekspresyonu ve moleküler saat fonksiyonu çalışmalarına özellikle uygundur. Ayrıca, prosedürün uygulanması basit olup özel ekipman gerektirmez, bu da onu laboratuvarlar arasında erişilebilir ve kolaycale tekrarlanabilir kılar. Bununla birlikte, serum şoku deneylerinin pratik bir sınırlaması, sirkadiyen ritmikliği doğru şekilde karakterize etmek için gereken yoğun örnekleme takvimidir. Güvenilir ritim analizi genellikle, bir veya daha fazla sirkadiyen döngü (24–72 h) boyunca, genellikle her 2–6 h aralıklarla düzenli örnek toplamayı gerektirir14 ve bu durum sıklıkla gece boyu örnekleme yapılmasını zorunlu kılar.

Burada açıklanan iş akışı, senkronizasyon başlangıcını birden fazla kültür plağına yayarak bu lojistik zorluğu gidermekte ve böylece gece boyu örnek toplama işlemine gerek kalmadan standart çalışma saatleri içerisinde eksiksiz sirkadiyen örnekleme yapılmasını sağlamaktadır. Bu protokol, yeni bir senkronizasyon stratejisi sunmak yerine, yerleşik bir serum şoku yönteminin pratik bir örnekleme takvimi ve ardından gelen gen ekspresyon analizi ile birleştirilmiş ayrıntılı ve tekrarlanabilir bir uygulamasını sunmaktadır. Bu iş akışı, yaygın olarak kullanılan laboratuvar teknikleri ile kültürlenmiş hücrelerdeki sirkadiyen gen ekspresyonu çalışmalarına özellikle uygundur. Protokol ek hücresel modellere uyarlanırken; hücre yoğunluğu, senkronizasyon koşulları, örnekleme aralıkları ve referans gen seçimi dahil olmak üzere deneysel parametreler, uygulamadan önce ilgili hücre tipi için optimize edilmeli ve doğrulanmalıdır.

Protokol

Aşağıdaki protokol, mHypoE-42 embriyonik fare hipotalamik hücre hattı için doğrulanmış bir senkronizasyon yöntemini açıklamaktadır. Senkronizasyon protokolünü diğer kültürlenmiş hücre tiplerine uygulamadan önce bağımsız olarak doğrulayın ve optimize edin. İş akışının genel görünümü için Şekil 1'e ve haftalık örnekleme çizelgesi için Ek Şekil 1'e bakınız. Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler, ekipmanlar ve cihazlar için Materyaller Tablosu'na başvurun. Tüm hücre kültürü prosedürlerini, steril reaktifler ve ekipmanlar kullanarak sertifikalı bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.

Hücre senkronizasyon süreci diyagramı, serum şoku yöntemi, zaman çizelgesi, deneysel düzenek, CT aralıkları.
Şekil 1. Kademeli serum şoku senkronizasyon protokolünün şematik özeti. mHypoE-42 hücrelerini iki kademeli deneysel set halinde serum şokuyla senkronize etmek için kullanılan iş akışını gösteren şema. Kademeli tasarım, gece boyunca örnekleme yapılmasına gerek kalmadan, standart çalışma saatleri içinde sirkadiyen örnek toplanmasına olanak tanır. Örnekler daha sonra RNA ekstraksiyonu, kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ve sirkadiyen ritim analizi için işlenir. Biorender.com ile oluşturulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Hücre kültürü

  1. Adherent mHypoE-42 hücrelerini; %10 (v/v) ısı-inaktive fetal sığır serumu (FBS), 3,7 g/L sodyum bikarbonat ve %1 antibiyotik çözeltisi ile takviye edilmiş yüksek glukozlu (4500 mg/L) Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) içerisinde kültüre edin.
  2. Hücreleri, %95 hava ve %5 karbondioksit (CO2) içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde, 37°C sıcaklıkta, 10 mL final kültür hacmine sahip T75 kültür flaskları kullanarak muhafaza edin.
    NOT: Serum partileri farklılık gösterebileceği için deneylere başlamadan önce her yeni FBS partisini test edin.
  3. Hücreler yaklaşık %80–%90 konfluense ulaştığında subkültür yapın. Hücreleri steril 1× fosfat tamponlu salin (PBS; pH 7.4) ile yıkayın, 3 mL %0,5 tripsin çözeltisi ekleyin ve hücreleri ayırmak için 3–5 dk inkübe edin.
  4. Tripsini nötralize etmek için, tripsin hacminin en az iki katı kadar %10 (v/v) FBS içeren komple kültür ortamı ekleyin.
  5. Hücreleri taze büyüme ortamı ile 1:2'ye kadar olan bir oranda dilüe edin.
    NOT: Aşırı pasajlanmış hücreleri (örneğin mHypoE-42 hücreleri için 40'tan fazla pasaj) kullanmaktan kaçının. Tüm çözeltileri kullanmadan önce önceden ısıtın. Kültürleri düzenli olarak mikoplazma kontaminasyonu açısından test edin.
  6. Adım 2'de açıklandığı gibi, hücreleri kuyuk başına 2,0 × 105 hücre olacak şekilde ekledikten 24 saat sonra senkronizasyon analizlerine geçin. Rutin hücre kültürlerini pasajlama öncesinde yaklaşık %80–%90 konfluens düzeyinde tutun.

2. mHypoE-42 Hücre Hattının Senkronizasyonu

  1. Hücre hazırlama
    1. Tripsinizasyondan sonra hücreleri 5 dk boyunca 700 × g hızında santrifüjleyin.
    2. Süpernatantı atın ve hücre peletini 10 mL taze kültür besiyerinde yeniden süspanse edin.
    3. Hücre süspansiyonunu 1:1 oranında trypan blue boyası ile karıştırın (toplam hacim 20 μL) ve bir hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin.
      NOT: Trypan blue içeren çözeltileri, kurumsal kimyasal atık bertaraf kılavuzlarına uygun olarak imha edin. Kullanılmayan boyayı lavaboya dökmeyin.
  2. Hücre ekimi ve kademeli deneysel tasarım
    1. 6 kuyucuklu plaklara veya 35-mm kültür kaplarına kuyucuk başına 2.0 × 105 hücre ekin. Kültürleri 37°C'de 24 saat inkübe edin.
      NOT: Serum senkronizasyonunu hücre ekiminden 24 saat sonra başlatın. Bu nedenle, senkronizasyondan önce önceden tanımlanmış bir hücre konfluensine gerek yoktur. Bunun yerine, senkronizasyon prosedürüne başlamadan önce hücrelerin tamamen yapıştığını ve uygun morfoloji sergilediğini doğrulamak için kültürleri mikroskop altında inceleyin.
    2. Kültür plaklarını rastgele iki deneysel sete ayırın. İlk seti sirkadiyen zaman noktaları (CT) CT0, CT4, CT8, CT24, CT28 ve CT32'yi oluşturmak için kullanın. İkinci seti CT12, CT16, CT20, CT36, CT40, CT44 ve CT48'i oluşturmak için kullanın (Şekil 1; Ek Şekil 1).
    3. Teknik tekrarları dahil etmek için gerektiği gibi kuyucuk veya plak sayısını artırın.
      NOT: Tüm plakları aynı hücre süspansiyonundan hazırlayarak, özdeş ekim yoğunluklarını ve kültür koşullarını koruyarak ve senkronizasyonu aynı reaktifler ve deneysel ayarları kullanarak gerçekleştirerek değişkenliği en aza indirin. Diğer hücre tipleri için kültür kabı formatını ve ekim yoğunluğunu gerektiği gibi ayarlayın. 6 kuyucuklu plaklar kullanırken, plak kullanımını optimize etmek için eş zamanlı toplanan CT'leri birleştirin.
  3. Senkronizasyon
    1. 24 saat sonra, birinci plak setindeki besiyerini aspire edin ve 1 mL serumsuz DMEM ekleyin. Serum açlığını indüklemek için 12 saat inkübe edin.
    2. Kullanımdan hemen önce yüksek glukozlu DMEM içinde %50 (v/v) at serumu çözeltisi hazırlayın.
    3. Birinci setten açlık besiyerini aspire edin ve hücreleri 2 saat boyunca taze hazırlanmış 1 mL %50 at serumu çözeltisine maruz bırakın.
    4. Eş zamanlı olarak ikinci plak setindeki besiyerini aspire edin ve bunu 1 mL serumsuz DMEM ile değiştirin. 12 saat inkübe edin.
    5. 2 saatlik serum şokundan sonra, besiyerini aspire edin ve %10 (v/v) ısı ile inaktive edilmiş FBS ile desteklenmiş 1 mL yüksek glukozlu DMEM ekleyin. Bu zaman noktasını CT0 olarak belirleyin.
  4. Örnek toplama
    1. Kültür plaklarını buza yerleştirin. Besiyerini aspire edin, hücreleri 1 mL soğuk steril 1× PBS ile iki kez yıkayın, yıkama çözeltisini atın ve hücreleri 1 mL'ye kadar lizis reaktifi kullanarak mekanik olarak lize edin.
      DİKKAT: Lizis reaktifi tehlikeli kimyasallar içerir. Tüm uygulama adımlarını, uygun kişisel koruyucu ekipman giyerek, onaylı bir kimyasal çeker ocak içinde gerçekleştirin. Atıkları kurumsal kimyasal güvenlik kılavuzlarına göre imha edin.
    2. Her bir lizatı steril bir tüpe aktarın ve örnekleri RNA ekstraksiyonuna kadar −80°C'de saklayın.
    3. CT4 ve CT8'de örnek toplamak için Adım 2.4.1 ve 2.4.2'yi tekrarlayın.
    4. CT8'de, diğer hücreleri senkronize etmek için ikinci deneysel set için Adım 2.3.2'yi tekrarlayın.
    5. 2 saatlik serum şokundan sonra, besiyerini %10 (v/v) ısı ile inaktive edilmiş FBS ile desteklenmiş 1 mL yüksek glukozlu DMEM ile değiştirerek ikinci deneysel setin senkronizasyonunu sonlandırın.
    6. CT12, CT24, CT16, CT28, CT20 ve CT32'yi elde etmek için iki deneysel setten dönüşümlü olarak örnekler toplayın. Ertesi gün, CT36, CT40, CT44 ve CT48'i elde etmek için toplama prosedürünü tekrarlayın.
      NOT: Serum açlığı ve senkronizasyon, önceden tanımlanmış bir hücre konfluensi yerine, hücre ekiminden sonra deneysel zaman çizelgesine göre başlatılmıştır. Senkronizasyona başlamadan önce hücrelerin tamamen yapıştığını ve uygun morfoloji sergilediğini doğrulayın. Ardışık CT'ler 4 saat fark etse de, toplamalar 4 saatlik aralıklarla yapılmaz. Tam haftalık toplama programı için Ek Şekil 1'e bakın.

3. Örnek İşleme: RNA Ekstraksiyonu

NOT: Protokoller, deneysel bağlama ve uygulamaya göre değişiklik gösterebilir. Aşağıdaki iş akışı; RNA ekstraksiyonu, tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi ve kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) için etkili bir prosedür örneğini açıklamaktadır. Toplam RNA'yı, fenol tabanlı bir liz ve faz ayrımı yönteminin ardından silika spin kolonlar ile saflaştırma işlemini kullanarak ekstrakte edin.

  1. Numune hazırlama ve faz ayrımı
    1. Numuneleri çözdürün, lizatları yeniden homojenize edin ve oda sıcaklığında 5 dk inkübe edin.
    2. Her 1 mL lizis reaktifi için 200 μL kloroform ekleyin.
      UYARI: Kloroform uçucu ve toksiktir. Kloroform içeren tüm işlemleri, uygun kişisel koruyucu ekipman giyerek, onaylı bir kimyasal çeker ocak altında gerçekleştirin.
    3. Tüpleri 15 sn boyunca kuvvetlice çalkalayın ve oda sıcaklığında 3 dk inkübe edin.
    4. Numuneleri 4°C'de 15 dk boyunca 12,000 × g hızda santrifüjleyin. Numunelerin üç faza ayrılmasına izin verin: proteinleri içeren alt fenol-kloroform fazı, DNA içeren beyaz ara faz ve RNA bakımından zengin üst sulu faz.
    5. Sulu fazı, ara faza dokunmadan dikkatlice yeni steril bir tüpe aktarın. Eğer daha sonra protein veya DNA izolasyonu planlanıyorsa, organik fazı 4°C'de saklayın.
      NOT: Bu biyomoleküller organik fazdan geri kazanılacaksa, protein veya DNA izolasyonunu uygun protokole göre gerçekleştirin.
  2. RNA saflaştırma
    1. Sulu faza, eşit hacimde %70 etanol (RNazden arındırılmış su ile hazırlanmış) ekleyin ve RNA bağlanmasını artırmak için iki kez 15 sn boyunca vorteksleyin.
    2. Numuneyi bir silika spin kolona yükleyin ve RNA'yı kolon saflaştırma iş akışına göre saflaştırın.
    3. Kontamine genomik DNA'yı, oda sıcaklığında 15 dk boyunca DNaz ile sindirin.
    4. Kolonu, sağlanan yıkama tamponlarını kullanarak yıkayın.
    5. 100 μL yıkama tamponu ile ek bir yıkama işlemi gerçekleştirin ve silika membranı kurutmak için 11,000 × g hızda 2 dk santrifüjleyin.
    6. Spin kolonu temiz bir mikrocentrifüj tüpüne aktarın. Suyu doğrudan silika membranının merkezine uygulayarak ve 11,000 × g hızda 1 dk santrifüjleyerek RNA'yı 40–60 μL RNazden arındırılmış su ile elüe edin.
      NOT: Elüsyon hacmini, istenen RNA verimi ve konsantrasyonuna göre seçin. 60 μL'lik bir elüsyon hacmi genellikle silika membrandan daha tam bir RNA geri kazanımı sağlar ancak daha seyreltik bir RNA çözeltisi oluşturur. Buna karşılık, 40 μL'lik bir elüsyon hacmi daha konsantre bir RNA preparatı sağlar ancak toplam RNA geri kazanımını azaltabilir. Elüsyon hacmini üretici tavsiyelerine ve sonraki uygulama gereksinimlerine göre optimize edin.
  3. RNA kalite değerlendirmesi
    1. RNA numunelerini buza yerleştirin ve kalite değerlendirmesi için her numuneden 5 μL'yi yeni steril bir mikrocentrifüj tüpüne aktarın.
    2. RNA bütünlüğünü %1,5 agaroz jel elektroforezi veya kapiler elektroforez kullanarak değerlendirin. Belirgin 28S ve 18S ribosomal RNA bantlarının varlığını doğrulayın.
    3. Absorbansı bir spektrofotometre ile ölçerek RNA konsantrasyonunu ve saflığını belirleyin.
      NOT: Fenol içeren atıkları, kurumsal kimyasal atık bertaraf yönergelerine göre imha edin. Tehlikeli kimyasal atıkları lavaboya dökmeyin. Kültürlenmiş hücre numuneleri için RNA konsantrasyonları tipik olarak 200 ile 1000 ng/μL arasında değişir ve cDNA sentezi ile qRT-PCR için uygundur. A260/230 oranı 2,0 ile 2,2 arasında ve A260/280 oranı yaklaşık 2,0 olan RNA numunelerini kabul edin (bkz. Ek Tablo 1).
  4. RNA saklama
    1. Saflaştırılmış RNA numunelerini cDNA sentezine kadar −80°C'de saklayın.

4. Numune İşleme: cDNA Sentezi

NOT: Bir birinci zincir cDNA sentez kiti kullanarak 1 μg toplam RNA'dan cDNA sentezleyin. Reaksiyon hacimlerini ve inkübasyon koşullarını üretici talimatlarına göre ayarlayın.

  1. Ters transkripsiyon
    1. RNA örneklerini buz üzerinde çözün. 1 μg toplam RNA, 10 μL 2× Master Mix (ribonükleaz inhibitörü, rastgele hekzamerler, oligo(deoksitimidin) primerleri, magnezyum iyonları [Mg2+] ve deoksinükleotid trifosfatları içerir), 2 μL enzim karışımı (ters transkriptaz içerir) ve toplam hacim 20 μL olacak şekilde dietil pirokarbonat ile işlem görmüş su içeren 20 μL'lik bir ters transkripsiyon reaksiyonu hazırlayın.
    2. Primerlerin bağlanması için reaksiyonu bir termal döngüleyicide 25°C'de 10 dakika, ardından cDNA sentezi için 50°C'de 30 dakika inkübe edin. Reaksiyonu 85°C'de 5 dakika inkübe ederek ters transkriptazı inaktive edin.
    3. RNA–DNA hibritinin RNA zincirini degrade etmek için 1 μL RNase H ekleyin ve reaksiyonu 37°C'de 20 dakika inkübe edin.
    4. cDNA hazırlığını, analiz optimizasyon gereksinimlerine göre steril su ile 1:20 oranına kadar seyreltin ve seyreltilmiş cDNA'yı kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) analizine kadar −20°C'de saklayın.

5. Numune İşleme: Gerçek Zamanlı Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qRT-PCR)

NOT: Sirkadiyen saat genlerinin ekspresyonunu qRT-PCR kullanarak ölçün. Doğrulanmış primer dizileri, bağlanma sıcaklıkları ve primer konsantrasyonları için Ek Tablo 2'ye bakın.

  1. Analiz optimizasyonu
    1. Deneysel örnekleri analiz etmeden önce, havuzlanmış cDNA örnekleri ve bir standart eğri kullanarak primer konsantrasyonunu, tavlama sıcaklığını ve cDNA giriş miktarını doğrulayın ve optimize edin. Analiz optimizasyonunu ve doğrulamasını daha önce açıklandığı şekilde gerçekleştirin15,16.
  2. Reaksiyon kurulumu
    1. Bir 96 kuyucuklu PCR plakasına 5 μL 2× master mix, ileri ve geri primerlerin her birinden 0.4 μL, 0.2 μL dietil pirokarbonatla işlem görmüş su ve 4 μL cDNA kalıbını birleştirerek her bir 10 μL qRT-PCR reaksiyonunu hazırlayın.
    2. Plakayı optik olarak şeffaf bir sızdırmazlık filmi veya sızdırmazlık matı ile kapatın. Kabarcıkları gidermek ve reaksiyon karışımını her kuyucuğun dibinde toplamak için plakayı 4°C'de 5 dakikaya kadar 700 × g hızında santrifüjleyin.
    3. Hedef genler Bmal1 ve Per2'nin ekspresyonunu belirlemek için tüm cDNA örneklerini analiz edin.
    4. Örnekler genelinde gen ekspresyonunu normalleştirmek için aynı cDNA dilüsyonunu kullanarak seçilen referans geni (B2m) analiz edin.
  3. Termal döngü
    1. qRT-PCR'ı aşağıdaki döngü koşullarını kullanarak gerçekleştirin: 95°C'de 2 dakika boyunca başlangıç denatürasyonu ve hot-start DNA polimeraz aktivasyonu, ardından 95°C'de 5 saniye ve 60°C'de 30 saniye şeklinde 39 döngü.
    2. Reaksiyonları 5 saniye boyunca 95°C'ye ısıtıp ardından 95°C'ye kadar 0.5°C'lik artışlarla ve her artışta 5 saniye bekleyerek eritme eğrisi analizi yapın.
      NOT: Gerektiğinde bekleme sürelerini ve eritme eğrisi ayarlarını master mix önerilerine göre düzenleyin.
  4. Referans gen doğrulaması
    NOT: Serum senkronizasyon deneylerinde, serum tedavisi housekeeping gen ekspresyonunu değiştirebileceği için aday referans genleri değerlendirin17. Ekspresyon stabilitesini BestKeeper18, geNorm19, NormFinder20 veya karşılaştırmalı ΔCt yöntemi21 gibi yöntemlerle değerlendirin. Normalizasyon için en stabil gen(ler)i seçin. Bu çalışmada, birden fazla referans gen doğrulama algoritmasını entegre eden RefFinder yazılımı22 kullanılarak β-actin (Actb) ve β-2-microglobulin (B2m) değerlendirilmiştir. B2m, sirkadiyen zaman seyri boyunca en yüksek ekspresyon stabilitesini göstermiş ve bu nedenle normalizasyon için seçilmiştir.
  5. Ürün doğrulaması
    1. PCR ürünlerini %2'lik agaroz jel elektroforezi ile analiz ederek amplifikasyon özgüllüğünü doğrulayın.
      NOT: Birden fazla sıcaklığı (örneğin, 58 °C, 60°C ve 62°C) test ederek optimal tavlama sıcaklığını belirleyin. Primer-dimer oluşumu kanıtı olmaksızın tek bir eritme eğrisi piki korurken en düşük kantifikasyon döngüsü (Cq) değerini üreten sıcaklığı seçin.
      NOT: Amplifikasyon verimlilikleri %90 ile %110 arasında olan ve determinasyon katsayısı (R2) 0.99 veya daha yüksek olan analizleri kabul edin. Teknik tekrarlar arasındaki eritme sıcaklıklarının 0.5°C'den fazla fark göstermediğini onaylayın. Analiz için yalnızca Cq farkı ≤0.5 olan teknik tekrarları kabul edin ve ortalama ekspresyon seviyelerini hesaplamak için bu değerleri kullanın. Tüm reaksiyonları teknik tekrarlar halinde (örneğin, triplicate) gerçekleştirin ve hem bir şablon içermeyen kontrol hem de bir ters transkripsiyonsuz kontrol ekleyin.

6. Veri Analizi

  1. Gen ekspresyon analizi
    1. Alt analizlerden önce her örnek için teknik tekrarların ortalamasını alın.
    2. Aşağıdaki denklemi kullanarak her örnek ve zaman noktası için ΔCq değerini hesaplayın:
      ΔCq   = Cqhedef gen  -  Cqhousekeeping geni
    3. Aşağıdaki denklemi kullanarak her örnek ve zaman noktası için ΔΔCq değerini hesaplayın:
      ΔΔCq   = ΔCqörnek  -  ΔCqkontrol  
      NOT: ΔΔCq hesaplaması için ΔCqkontrol, tüm CT'ler genelindeki tüm kontrol örneklerinin ortalaması alınarak elde edilen ortalama ΔCq değeri olarak tanımlanmıştır.
    4. Sirkadiyen ritmin orta hattı tahmin istatistiği (MESOR), genlik, pik ve faz dahil olmak üzere sirkadiyen parametreleri CircaCompare23 kullanarak değerlendirin. Analizi çevrimiçi uygulama veya R paket uygulaması üzerinden gerçekleştirin.
  2. Çevrimiçi CircaCompare analizi
    NOT: Çevrimiçi uygulama, yalnızca veri seti ritmiktelik için istatistiksel kriterleri karşıladığında tam sirkadiyen parametre tahminlerini raporlar. Ritmiktelik zayıf olduğunda veya istatistiksel olarak anlamlı olmadığında, tüm veri setleri için parametre tahminlerini elde etmek üzere R uygulamasını kullanın.
    1. Virgülle ayrılmış değerler (.csv) dosyası hazırlayın.
      1. Zaman değişkenini (sayısal; saat) 1. Sütuna girin.
      2. Gruplandırma değişkenini (yalnızca iki deneysel grup) 2. Sütuna girin.
      3. Sonuç değişkenini (sayısal; ΔΔCq) 3. Sütuna girin.
    2. .csv dosyasını çevrimiçi CircaCompare uygulamasına yükleyin.
    3. Zaman, grup ve sonuç değişkenlerini ilgili sütunlara atayın.
    4. Analizi gerçekleştirmek için Run seçeneğini seçin.
  3. R'da CircaCompare analizi
    1. Analizi R versiyon 4.5.1 ve CircaCompare paket versiyon 0.2.024 kullanarak gerçekleştirin.
    2. Gerekli R paketlerini yükleyin.
      1. devtools paketini (versiyon 2.5.2) yükleyin.
      2. circacompare paketini (versiyon 0.2.0) yükleyin.
      3. ggplot2 paketini (versiyon 4.0.3) yükleyin.
      4. svglite paketini (versiyon 2.2.2) yükleyin.
    3. Girdi .csv dosyasını yükleyin.
    4. alpha_threshold = 1 olarak ayarladıktan sonra CircaCompare analizini yürütün.
      NOT: alpha_threshold = 1 olarak ayarlanması, istatistiksel anlamlılığa bakılmaksızın tüm uydurulmuş osilasyonlar için sirkadiyen parametre tahminlerini raporlar. Ancak, yalnızca p-value < 0.05 olan osilasyonlar ritmik ve istatistiksel olarak anlamlı olarak yorumlanmalıdır.
    5. Betiği yürütmeden önce Ek Dosya 1'i özelleştirin.
      1. “XXX.csv” ifadesini girdi veri dosyası adı ile değiştirin.
      2. “YYY.csv” ifadesini istenen sonuç dosyası adı ile değiştirin.
      3. “ZZZ.svg” ifadesini istenen grafik dosyası adı ile değiştirin.
      4. y-ekseni sınırlarını (ylim) ve diğer ek grafik parametrelerini veri setine göre ayarlayın.
    6. Örnek girdi dosyası için Ek Tablo 3'e bakın.

Sonuçlar

Başarılı senkronizasyon, kontrol koşulu altında analiz edilen saat genlerinin istatistiksel olarak anlamlı sirkadiyen ritmikliği ile belirlenmiştir (p < 0.05). Bu çalışmada, %0,1 dimetil sülfoksit negatif kontrol olarak kullanılarak üç bağımsız biyolojik deney gerçekleştirilmiştir. Moleküler sirkadiyen saatin temel bileşenleri olmaları ve iyi tanımlanmış antipfazik ekspresyon paterni sergilemeleri nedeniyle, temsilci sirkadiyen markörler olarak Bmal1 ve Per2 seçilmiştir. Senkronizasyonu takiben elde edilen temsilci ritmik ekspresyon profilleri Şekil 2'de gösterilmiştir. Ritmiklik, MESOR, amplitüd ve pik zamanı dahil olmak üzere ilgili sirkadiyen parametreler Tablo 1'de özetlenmiş; Bmal1 ve Per2 arasındaki ikili karşılaştırma ise Tablo 2'de sunulmuştur.

Sirkadiyen mRNA ekspresyon grafiği; 24-48 saat boyunca Per2/Bmal1 seviyeleri; ritmik gen ekspresyon analizi.
Şekil 2. Serum şoku senkronizasyonu sonrası Bmal1 ve Per2'nin sirkadiyen osilasyonları. Senkronize mHypoE-42 hücrelerinde, senkronizasyondan 24 ila 48 saat sonra kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile ölçülen Bmal1 (koyu mavi) ve Per2 (açık mavi)'ye ait temsili sirkadiyen ekspresyon profilleri. Eğriler, CircaCompare kullanılarak oluşturulan uyarlanmış sirkadiyen modelleri temsil etmektedir.Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

GenRitmiklik
(p-değeri)		MESORGenlikZirve zamanı
(h)
Bmal10.0205−0.29480.464820.4239
Per20.0071−0.3180.46299.4883
Bmal1 + Bileşik A0.1068———

Tablo 1: Bazal koşullar altında Bmal1 ve Per2 için ve Bileşik A tedavisi sonrası Bmal1 için tahmin edilen sirkadiyen ritim parametreleri. Sirkadiyen ritmiklik CircaCompare kullanılarak değerlendirilmiştir. Tablo; ritmiklik için p-değerini, ritmin orta hat tahmin istatistiğini (MESOR), genliği ve her bir durum için zirve zamanını bildirmektedir. Bileşik A tedavisi sonrası Bmal1 için ritmiklik istatistiksel olarak anlamlı olmadığından (p = 0.1068), sirkadiyen parametreler rapor edilmemiştir.

MESOR fark tahmini
(p-değeri)		Genlik farkı tahmini
(p-değeri)		Faz farkı tahmini
(p-değeri)		Ortak dönem
(h)
−0.0232 (p = 0.8904)−0.0019 (p = 0.9936)−10.9356 (p = 2.3155 × 10⁻6)24

Tablo 2: Bmal1 ve Per2 arasındaki sirkadiyen parametrelerin ikili karşılaştırması. CircaCompare kullanılarak tahmin edilen Bmal1 ve Per2'nin uyarlanmış sirkadiyen ekspresyon profilleri arasındaki ritim orta hattı tahmin istatistiğinin (MESOR), amplitüdün ve fazın ikili karşılaştırması. Değerler, karşılık gelen p-değerleri ile birlikte parametre farkları olarak sunulmuştur. Model uyarlaması sırasında ortak periyot 24 h olarak sabitlenmiştir.

Bazal koşullar altında, hem Bmal1 hem de Per2 istatistiksel olarak anlamlı ritmisite sergilemiştir (Bmal1: p = 0.0205; Per2: p = 0.0071). CircaCompare analizi, iki genin −10.9356 h'lik bir faz farkı ile (p = 2.3155 × 10⁻6) zıt fazlarda osile olduğunu göstermiş olup, bu durum moleküler sirkadiyen saat ağı içindeki beklenen antipazik ilişkileriyle uyumludur. Alt gen ekspresyon analizlerini destekleyen RNA kalite metrikleri Ek Tablo 1'de sunulmuştur.

Protokol, sağlıklı modellere karşı hastalık modelleri veya kontrol gruplarına karşı tedavi grupları dahil olmak üzere, deneysel koşullar arasındaki sirkadiyen ritmikliği karşılaştırmak için de uygulanabilir. Temsili bir örnek olarak, daha önce insan hipotalamusunda tespit edilmiş, yükselen bir çevresel kirletici ve endokrin bozucu değerlendirilmiş olup burada Bileşik A olarak adlandırılmıştır. Temsili sonuçlar Şekil 3'te gösterilmekte ve ilgili ritmiktik analiz Tablo 1'de özetlenmektedir.

Zamanla RNA ekspresyon grafiği; mRNA (ΔΔCq) zamana karşı; kontrol vs. Bileşik A; veri analizi.
Şekil 3. Bileşik A'nın Bmal1 ekspresyonunun sirkadiyen ritmikliği üzerindeki etkisi. Bileşik A ile işlem sonrası senkronize edilmiş mHypoE-42 hücrelerinde, kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile ölçülen temsili Bmal1 ekspresyon profili. Eğriler, CircaCompare kullanılarak oluşturulan uyarlanmış sirkadiyen modelleri temsil etmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Bileşik A'ya maruz kalmanın ardından, Bmal1 artık istatistiksel olarak anlamlı bir ritmisite göstermemiştir (p = 0.1068). Bu koşullar altında, uyarlanmış sirkadiyen model ritmisite için gerekli istatistiksel kriterleri karşılamamıştır. Sonuç olarak, ritmisitenin istatistiksel olarak anlamlı olmadığı durumlarda biyolojik olarak yorumlanabilir kabul edilmedikleri için MESOR, genlik ve pik zamanı gibi sirkadiyen parametreler rapor edilmemiştir. Bu örnek, iş akışının ritmik ekspresyon profillerini ritmik olmayanlardan nasıl ayırt edebileceğini ve farklı deneysel koşullar altında sirkadiyen gen ekspresyonundaki potansiyel değişimleri değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Kademeli örnekleme stratejisiyle ilişkili olası teknik değişkenliği en aza indirmek için, tüm kültür plakaları aynı hücre süspansiyonundan hazırlanmış, özdeş kültür koşullarında tutulmuş ve yalnızca senkronizasyon zamanlaması farklı olacak şekilde aynı deneysel iş akışı kullanılarak senkronize edilmiştir.

Ek Şekil 1. Kademeli senkronizasyon protokolünün haftalık çizelgesi. İki kademeli deney seti (Set 1, mor; Set 2, yeşil) için hücre ekimi, serum açlığı, serum şoku senkronizasyonu, senkronizasyon durdurması ve sirkadiyen örnek toplama süreçlerini gösteren temsilci haftalık zaman çizelgesi. Kademeli tasarım, gece boyunca örnek toplama zorunluluğunu ortadan kaldırarak sirkadiyen zaman noktalarının (CT) CT0–CT48 arasının standart çalışma saatleri içinde toplanmasını sağlar. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1. Sirkadiyen zaman seyri deneyine dahil edilen tüm biyolojik örnekler için RNA kalite metrikleri. RNA saflığı A260/A280 ve A260/A230 absorbans oranları kullanılarak değerlendirilmiş ve komplemanter DNA (cDNA) sentezi öncesinde RNA konsantrasyonu spektrofotometrik olarak belirlenmiştir. Örnekler; toplama zamanı, tedavi grubu ve biyolojik tekrar ile tanımlanmıştır. Bu ölçümler, sonraki aşamadaki kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) analizi öncesinde RNA kalitesini doğrulamak için kullanılmıştır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) için kullanılan primer dizileri ve amplifikasyon koşulları. Her bir hedef genin amplifikasyonu için kullanılan ileri ve geri oligonükleotid primer dizileri, ilgili NCBI erişim numaraları, bağlanma sıcaklığı ve primer konsantrasyonu ile birlikte 5′-3′ yöneliminde sunulmuştur. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ek Tablo 3. CircaCompare kullanılarak yapılan sirkadiyen ritim analizi için örnek girdi veri seti. CircaCompare ile analiz için formatlanmış örnek virgülle ayrılmış değerler (CSV) veri seti. Veri seti; Veri Analizi protokolünde açıklanan formata karşılık gelen ve sirkadiyen parametre kestirimi için örnek girdi dosyası olarak kullanılan üç zorunlu değişkeni içerir: Time (h), Group ve Outcome (ΔΔCq). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1. CircaCompare kullanılarak yapılan sirkadiyen ritim analizi için örnek R betiği. R (versiyon 4.5.1) içerisinde CircaCompare paketini (versiyon 0.2.0) kullanarak sirkadiyen gen ekspresyon verilerini analiz etmek için hazırlanan örnek R betiği. Betik; girdi veri setini içe aktarır, 24-saatlik bir periyot ile sirkadiyen parametre kestirimini gerçekleştirir, istatistiksel özeti dışa aktarır ve yayın kalitesinde bir grafik oluşturur. Kullanmadan önce, yer tutucu dosya adlarını (XXX.csv, YYY.csv ve ZZZ.svg) istenen girdi ve çıktı dosya adlarıyla değiştiriniz ve grafikleme parametrelerini (örneğin, ylim) veri setine uygun şekilde ayarlayınız. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Sirkadiyen ritimler, korunmuş moleküler saat mekanizmaları aracılığıyla geniş bir fizyolojik, metabolik ve hücresel süreç yelpazesini düzenleyen yaklaşık 24 saatlik endojen döngülerdir1,2. In vitro senkronizasyon modelleri, bu mekanizmaları incelemek için kontrollü bir deneysel ortam sağlar ve çevresel kirleticilere maruz kalma ile diğer deneysel pertürbasyonlar da dahil olmak üzere, normal ve patolojik koşullar altında sirkadiyen düzenlemeyi çalışmak için değerli araçlar haline gelmiştir25. Burada sunulan protokol; serum şokuyla kültürlenmiş hücrelerin senkronize edilmesi, kademeli bir örnekleme stratejisi kullanılarak zaman serisi örneklerinin toplanması ve qRT-PCR ile sirkadiyen gen ekspresyonunun nicelleştirilmesi için pratik bir iş akışını açıklamaktadır. Bu iş akışı, özellikle gece boyunca örnek toplama ile ilişkili lojistik zorlukları en aza indirirken zamansal gen ekspresyon profillemesi gerektiren çalışmalar için uygundur. Bu protokolün başarısını ve tekrarlanabilirliğini belirleyen birkaç kritik adım bulunmaktadır. Hücre konfluensinin, serum açlığının, serum şoku süresinin ve senkronizasyon koşullarının uygun şekilde kontrol edilmesi esastır; çünkü yetersiz senkronizasyon, zayıf veya tespit edilemeyen ritmisite ile sonuçlanabilir14. Tutarlı hücre ekim yoğunluğu, tüm deneysel plakaların aynı hücre süspansiyonundan hazırlanması ve kademeli deneysel setler genelinde özdeş kültür koşullarının sağlanması, teknik değişkenliği daha da azaltır. RNA kalitesi, cDNA sentezi, primer validasyonu ve stabil referans genlerin seçimi de güvenilir qRT-PCR sonuçlarının önemli belirleyicileridir. Her sirkadiyen senkronizasyon protokolünde olduğu gibi, bu iş akışının farklı hücre tiplerine veya deneysel koşullara uyarlanması sırasında bu parametrelerin optimizasyonu gerekebilir.

Serum şoku, sirkadiyen biyolojideki en yaygın kullanılan senkronizasyon yöntemlerinden biri olsa da4,26, her deneysel uygulama için evrensel olarak optimal değildir. Deksametazon tedavisi, forskolin stimülasyonu, sıcaklık entrenmanı ve raporer tabanlı sistemler dahil olmak üzere alternatif senkronizasyon yaklaşımları, biyolojik modele ve araştırma amacına bağlı olarak daha uygun olabilir14. Her biri farklı avantajlara ve sınırlamalara sahip olduğu için, bu yöntemler birbirine rakip yaklaşımlardan ziyade tamamlayıcı yaklaşımlar olarak değerlendirilmelidir. Serum şoku, özel enstrümantasyon veya genetik olarak kodlanmış raporer sistemleri gerektirmeden, deneysel basitlik, erişilebilirlik ve tekrarlanabilirlik arasında pratik bir denge sağlar. Buna rağmen, araştırmacılar senkronizasyon stimülüsünün biyolojik sistemleri üzerindeki potansiyel etkisini dikkatle değerlendirmeli ve deneysel sorularına en iyi yanıt veren yaklaşımı seçmelidir. Serum açlığı adımını içermeyen serum şoku protokolleri de bildirilmiştir ve belirli deneysel bağlamlarda uygun alternatifler olabilir27. Bu protokolün esnekliği, çeşitli modifikasyonlara ve sorun giderme stratejilerine olanak tanır. Kademeli örnekleme tasarımı, gece boyunca örnek toplamaktan kaçınırken tamamlayıcı CT'ler üretmek için farklı zamanlarda senkronize edilmiş paralel kültür plakalarına dayanır. Plaklar arası değişkenliği minimize etmek için, tüm plakaları aynı hücre süspansiyonundan hazırlayın, aynı yoğunluklarda ekim yapın, aynı kültür koşullarını koruyun ve yalnızca senkronizasyon zamanlaması farklı olacak şekilde aynı deneysel iş akışını kullanarak senkronizasyonu gerçekleştirin. Bu yaklaşım seriyle ilgili varyasyonu tamamen ortadan kaldıramasa da, gece boyunca örnekleme ile ilişkili lojistik zorlukları önemli ölçüde azaltırken teknik değişkenliği minimize eder ve biyolojik olarak anlamlı sirkadiyen ritimleri tespit etme yeteneğini korur. Kademeli örnekleme stratejisi, tüm deneysel setlerde aynı kültür koşullarını koruyarak teknik değişkenliği minimize etmek için tasarlanmış olsa da, bu çalışmada geleneksel sürekli örnekleme tasarımıyla doğrudan karşılaştırılmamıştır. Gelecekteki çalışmalar, bu yaklaşımların ek deneysel modellerdeki eşdeğerliğini daha ayrıntılı değerlendirebilir. Bu iş akışını yeni hücre tiplerine veya deneysel koşullara uyarlarken, senkronizasyon verimliliğini optimize edin ve protokol validasyonu sırasında potansiyel seri etkilerini değerlendirin. Deneysel amaca bağlı olarak, senkronizasyon başlangıç zamanlarını ayarlayarak veya azaltılmış bir örnekleme penceresiyle tek bir senkronize kültürü koruyarak senkronizasyon programını modifiye edin. Sorun giderme stratejileri arasında serum şoku süresinin optimizasyonu, senkronizasyon öncesinde hücre canlılığının ve konfluensinin doğrulanması, downstream analizler öncesinde RNA kalitesinin onaylanması ve sirkadiyen ritim tespitini iyileştirmek için örnekleme aralıklarının ayarlanması yer alır. Mevcut protokol mHypoE-42 embriyonik fare hipotalamik hücre hattında valide edilmiştir ve bu nedenle diğer hücresel modellere uygulanmadan önce bağımsız olarak optimize edilmeli ve valide edilmelidir. Mevcut çalışmada değerlendirilmemiş olsa da, bu protokol laboratuvarımızda diğer hücre hatları (örneğin, N2a hücreleri ve insan fibroblastları) kullanılarak yapılan önceki optimizasyonlar temel alınarak geliştirilmiştir ve bu da farklı hücresel modellere potansiyel uygulanabilirliğini desteklemektedir. Benzer şekilde, kademeli örnekleme stratejisi, standart çalışma saatleri içinde tam sirkadiyen örneklemeye olanak tanıyarak deneysel uygulanabilirliği önemli ölçüde artırır; ancak kullanıcılar, potansiyel seri etkilerini minimize etmek için tüm kültür plakalarında aynı deneysel koşulları korumalıdır. Uygun şekilde optimize edildiğinde bu iş akışı, sirkadiyen gen ekspresyonunu araştırmak ve geniş bir araştırma uygulamaları yelpazesinde moleküler saat fonksiyonunu değiştiren deneysel müdahaleleri değerlendirmek için erişilebilir ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar.

Pratik avantajlarına rağmen, bu yöntemin çeşitli kısıtlamaları bulunmaktadır. Kademeli örnekleme stratejisi, sürekli izleme yerine ayrık zaman noktası ölçümleri sağlar; bu da floresan veya biyolüminesans tabanlı raporlayıcı analizlerle karşılaştırıldığında zamansal çözünürlüğü düşürür7. Sonuç olarak, periyot kestiriminin doğruluğu ve hafif faz kaymalarının veya düşük genlikli osilasyonların saptanması azalabilir. Ayrıca, her bir koşul için ek kültür plakaları gerektiğinden, işlem veya deneysel koşulların sayısı arttıkça plaka tabanlı örnekleme iş akışı giderek daha fazla emek yoğun hale gelir. Mevcut metodolojiler arasında bu iş akışı, canlı hücrelerde sirkadiyen aktivitenin gerçek zamanlı izlenmesine olanak tanıyan E-box güdümlü lusiferaz analizleri (örneğin, Bmal1-Luc ve Per2-Luc) dahil olmak üzere raporlayıcı tabanlı sistemlere pratik bir alternatif sunar28,29. Floresan ve biyolüminesans tabanlı raporlayıcı sistemler yüksek zamansal çözünürlük sağlamasına ve özellikle aday sirkadiyen modülatörlerin yüksek kapasiteli taraması için yararlı olmasına rağmen; tüm laboratuvarlarda mevcut olmayabilecek stabil genetik modifikasyon, özel deteksiyon ekipmanları ve sıkı kontrollü çevresel koşullar gerektirirler30. Dahası, raporlayıcı sistemler genellikle önceden tanımlanmış raporlayıcı konstrüktlerle sınırlıdır ve konstitütif sinyallere veya hücresel bolluğa göre normalizasyon gerektirebilir; bu da birden fazla genin eş zamanlı değerlendirmesini veya alt moleküler analizleri sınırlar. Buna karşılık, burada açıklanan iş akışı, kantitatif gen ekspresyon analizi ve protein tabanlı analizler dahil olmak üzere birçok alt uygulamayla uyumludur; bu da onu moleküler sirkadiyen regülasyonu araştıran laboratuvarlar için erişilebilir ve çok yönlü bir yaklaşım haline getirir.

Numune toplama ve sonraki analizlerin ardından, gözlemlenen osilasyonların hem istatistiksel olarak anlamlı hem de biyolojik olarak anlamlı olup olmadığını belirlemek için uygun bir istatistiksel değerlendirme esastır. Bu protokolde CircaCompare; cosinor tabanlı regresyon modellerini kullanarak MESOR, amplitüd ve fazın tahmin edilmesi ve istatistiksel olarak karşılaştırılması için sağlam bir çerçeve sunar23. Yalnızca ritmicity'yi değerlendiren yaklaşımların aksine CircaCompare, deneysel gruplar arasında sirkadiyen parametrelerin doğrudan ikili karşılaştırmalarına olanak tanıyarak tedavi etkilerinin, genetik perturbasyonların veya sirkadiyen davranışta hastalıkla ilişkili değişikliklerin değerlendirilmesini kolaylaştırır. Bu analitik iş akışı, sirkadiyen gen ekspresyonundaki değişiklikleri yorumlamak için standardize edilmiş kantitatif ölçümler sağlayarak senkronizasyon protokolünü tamamlar. Temsili Sonuçlarda gösterildiği üzere, başarılı senkronizasyon, serum şokunu takiben Bmal1 ve Per2 haberci RNA (mRNA) düzeylerinin beklenen osilatuvar ekspresyon modelleri ile belirtilmiştir (Şekil 2). Buna karşılık, Bileşik A'ya maruz kalma, istatistiksel olarak anlamlı Bmal1 ritmicity'sinin kaybıyla sonuçlanmış (Şekil 3), bu da iş akışının sirkadiyen gen ekspresyonunu değiştiren deneysel müdahaleleri değerlendirmedeki faydasını örneklemiştir. Sirkadiyen gen ekspresyon verilerini yorumlarken dikkat edilmesi gereken önemli bir husus, bağımsız deneyler arasındaki biyolojik değişkenliktir. Bu çalışmada, temsili sonuçlar farklı günlerde ve farklı hücre pasajlarında gerçekleştirilen bağımsız biyolojik tekrarlardan elde edilmiştir. Sonuç olarak, belirli bir düzeyde değişkenlik beklenmektedir ve bu durum teknikten ziyade biyolojik varyasyonu yansıtmaktadır. Bu nedenle, senkronizasyon deneyleri bağımsız biyolojik tekrarlar içermeli ve incelenen hücresel modelin beklenen biyolojik değişkenliği bağlamında yorumlanmalıdır. Bu değişkenliğe rağmen, istatistiksel olarak anlamlı ritmicity ve Bmal1 ile Per2 arasındaki beklenen antiphasic ilişki tutarlı bir şekilde gözlemlenmiştir. Ayrıca, osilasyon amplitüdü, faz, periyot uzunluğu ve sönümlenme oranı dahil olmak üzere sirkadiyen özellikler hücresel modeller arasında farklılık gösterir. Bu nedenle, senkronizasyon performansı, ilgisiz modellerle doğrudan karşılaştırma yapılarak değil, incelenen spesifik hücre tipi bağlamında değerlendirilmelidir.

Bu iş akışı, sirkadiyen ritimlerin hastalık mekanizmaları ve terapötik yanıtlar üzerindeki rolünün araştırılması için özellikle uygundur. Sirkadiyen regülasyonun bozulmasının, kanser, metabolik bozukluklar ve nörodejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere çok sayıda patolojik durumla ilişkili olduğu bildirilmiştir31,32. Ritmik gen ekspresyonunun veya protein bolluğunun in vitro olarak değerlendirilebilmesi, bu süreçlerin araştırılması ve giderek daha fazla potansiyel bir terapötik hedef olarak kabul edilen moleküler sirkadiyen saat üzerindeki farmakolojik müdahalelerin etkilerinin değerlendirilmesi için pratik bir çerçeve sunmaktadır14,33. Örneğin, bu protokol, uygun optimizasyon ve doğrulamanın ardından, aday modülatörlerin hastalıkla ilgili hücresel modellerde sirkadiyen gen ekspresyonunu nasıl etkilediğini incelemek için uygulanabilir. Önemli bir nokta olarak, mevcut çalışmanın amacı serum şokunu diğer senkronizasyon yöntemlerinin yerine geçecek bir alternatif olarak savunmak veya alternatif yaklaşımlardan üstün olduğunu öne sürmek değildir. Bunun yerine bu protokol; yaygın olarak kullanılan bir senkronizasyon stratejisinin uygulanması, kademeli bir örnekleme tasarımı kullanılarak standart çalışma saatleri içinde sirkadiyen örneklerin toplanması ve ritmik gen ekspresyonunun erişilebilir alt yöntemlerle analiz edilmesi için ayrıntılı ve tekrarlanabilir bir iş akışı sağlamaktadır. Bu çerçevenin, sirkadiyen deneyler kuran veya mevcut hücresel modellere zamansal analizleri dahil etmek için pratik, tekrarlanabilir ve erişilebilir bir iş akışı arayan laboratuvarlar için özellikle yararlı olacağını öngörüyoruz.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Avrupa Birliği (AB) Toparlanma ve Dayanıklılık Tesisi ile FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia aracılığıyla LA/P/0058/2020 (DOI: 10.54499/LA/P/0058/2020), UID/04539/2025, UID/PRR/04539/2025 (DOI: 10.54499/UID/PRR/04539/2025) ve UID/PRR2/04539/2025 (DOI: 10.54499/UID/PRR2/04539/2025) projeleri kapsamındaki Portekiz ulusal fonları; Centro 2030 Bölgesel Operasyonel Programı aracılığıyla CENTRO2030-FEDER-02360200 projesi kapsamındaki Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (ERDF) ve FCT aracılığıyla 2023.17896.ICDT (DOI: 10.54499/2023.17896.ICDT), 2023.12355.PEX (DOI: 10.54499/2023.12355.PEX), 2021.02220.CEECIND/CP1656/CT0008 (DOI: 10.54499/2021.02220.CEECIND/CP1656/CT0008), 2020.04850.BD (DOI: 10.54499/2020.04850.BD) ve 2021.05334.BD (DOI: 10.54499/2021.05334.BD) hibeleri kapsamındaki Portekiz ulusal fonları tarafından ortaklaşa finanse edilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
6 kuyucuklu hücre kültürü plakasıNest Biotechnology15140122Hücre kültürü plakası
AgarozNZYtechMB02702RNA kalite değerlendirmesi
Antibiyotik karışımı (penisilin/streptomisin)Gibco, Thermo Fisher ScientificD5648Hücre kültürü takviyesi
cDNA sentez kiti (birinci zincir)NZYtechMB12502Ters transkripsiyon
KloroformSigma-AldrichA5256701Faz ayırma reaktifi
DMEM, yüksek glikoz (4500 mg/L glikoz, L-glutamin)Sigma-Aldrich26050088Hücre kültürü ortamı
Eppendorf mikrocentrifüj tüpleriEppendorf30120086Numune saklama
Etanol (96%)Fisher Bioreagents15552393RNA saflaştırma
Fetal bovine serum, ısı-inaktiveGibco, Thermo Fisher ScientificJ62692.K7Hücre kültürü takviyesi
Sert gövdeli 96 kuyucuklu PCR plakasıBio-Rad LaboratoriesHSP9601qRT-PCR plakası
At serumu, ısı-inaktiveGibco, Thermo Fisher Scientific15400054Serum şoku senkronizasyonu
mHypoE-42 hücre hattı (CVCL_D443)CELLutions Biosystems Inc.MB13402Embriyonik fare hipotalamik hücre hattı
Oligonükleotid primerleriNZYtechMB12501qRT-PCR primerleri
Fosfat tamponlu salin (PBS)Thermo Fisher ScientificMB18502Hücre yıkama
qPCR Green Master Mix (2×)NZYtechMB22403qRT-PCR reaktifi
Real-time PCR deteksiyon sistemiBio-Rad LaboratoriesEP0030108116qRT-PCR cihazı
RNA izolasyon kitiNZYtech288306Silika spin-kolon saflaştırma
RNA lizis reaktifiNZYtechMB18502Fenol tabanlı RNA ekstraksiyon reaktifi
Sodyum bikarbonatSigma-AldrichMB22401Hücre kültürü ortamı takviyesi
Steril 35-mm kültür kabıThermo Fisher Scientific121VHücre kültürü kabı
T100 termal döngüleyiciBio-Rad Laboratories1861096cDNA sentezi
T75 doku kültürü flaskıCorning430641UHücre kültürü kabı
Trypan blue çözeltisi (0.4%)Gibco, Thermo Fisher Scientific15250061Hücre sayımı
Trypsin-EDTA (0.5%)Gibco, Thermo Fisher Scientific15400054Hücre disosyasyonu

Kaynaklar

  1. Fuhr L, Abreu M, Pett P, Relógio A. Circadian systems biology: When time matters. Comput Struct Biotechnol J. 2015;13:417-426.
  2. Albrecht U. Timing to perfection: The biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 2012;74(2):246-260.
  3. Relógio A, et al. Ras-mediated deregulation of the circadian clock in cancer. PLoS Genet. 2014;10(5):e1004338.
  4. Balsalobre A, Damiola F, Schibler U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 1998;93(6):929-937.
  5. Hughes ATL, et al. Constant light enhances synchrony among circadian clock cells and promotes behavioral rhythms in VPAC2-signaling deficient mice. Sci Rep. 2015;5:12092.
  6. Fuhr L, et al. The circadian clock regulates metabolic phenotype rewiring via HKDC1 and modulates tumor progression and drug response in colorectal cancer. EBioMedicine. 2018;33:105-121.
  7. Nagoshi E, et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: Cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 2004;119(5):693-705.
  8. Balsalobre A, et al. Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling. Science. 2000;289(5488):2344-2347.
  9. Kaneko H, Kaitsuka T, Tomizawa K. Response to stimulations inducing circadian rhythm in human induced pluripotent stem cells. Cells. 2020;9(3):732.
  10. Chalmers JA, et al. Vascular circadian rhythms in a mouse vascular smooth muscle cell line (Movas-1). Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2008;295:R1529-R1538.
  11. Brown SA, et al. Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks. Curr Biol. 2002;12(18):1574-1583.
  12. Adamovich Y, et al. Rhythmic oxygen levels reset circadian clocks through HIF1α. Cell Metab. 2017;25(1):93-101.
  13. Rogers EH, et al. Comparing circadian dynamics in primary derived stem cells from different sources of human adult tissue. Stem Cells Int. 2017;2017:2057168.
  14. Gaspar LS, et al. The importance of determining circadian parameters in pharmacological studies. Br J Pharmacol. 2019;176(16):2827-2847.
  15. Nolan T, Hands RE, Bustin SA. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 2006;1(3):1559-1582.
  16. Derveaux S, Vandesompele J, Hellemans J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 2010;50(4):227-230.
  17. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 2001;25(4):402-408.
  18. Pfaffl MW, Tichopad A, Prgomet C, Neuvians TP. Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper—Excel-based tool using pair-wise correlations. Biotechnol Lett. 2004;26(6):509-515.
  19. Vandesompele J, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 2002;3(7):research0034.1-research0034.11.
  20. Andersen CL, Jensen JL, Ørntoft TF. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization. Cancer Res. 2004;64(15):5245–5250.
  21. Silver N, Best S, Jiang J, Thein SL. Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR. BMC Mol Biol. 2006;7:33.
  22. Xie F, Wang J, Zhang B. RefFinder: a web-based tool for comprehensively analyzing and identifying reference genes. Funct Integr Genomics. 2023;23:125.
  23. Parsons R, Garner N, Oster H, Rawashdeh O. CircaCompare: A method to estimate and statistically support differences in mesor, amplitude and phase between circadian rhythms. Bioinformatics. 2020;36(4):1208-1212.
  24. Parsons R. circacompare: Analyses of circadian data. R package version 0.2.0. 2021. Available at: https://CRAN.R-project.org/package=circacompare
  25. Di Nisio A, et al. Impairment of human dopaminergic neurons at different developmental stages by perfluoro-octanoic acid (PFOA) and differential human brain areas accumulation of perfluoroalkyl chemicals. Environ Int. 2022;158:106982.
  26. Xiang S, et al. Oscillation of clock and clock-controlled genes induced by serum shock in human breast epithelial and breast cancer cells: Regulation by melatonin. Breast Cancer (Auckl). 2012;6:155-168.
  27. Chang HC, Guarente L. SIRT1 mediates central circadian control in the SCN by a mechanism that decays with aging. Cell. 2013;153(7):1448-1460.
  28. Yoo SH, et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(15):5339-5346.
  29. Ueda HR, et al. System-level identification of transcriptional circuits underlying mammalian circadian clocks. Nat Genet. 2005;37(2):187-192.
  30. Beaulé C, Granados-Fuentes D, Marpegan L, Herzog ED. In vitro circadian rhythms: Imaging and electrophysiology. Essays Biochem. 2011;49(1):103-117.
  31. Ribeiro RFN, et al. Circadian rhythms are disrupted in patients and preclinical models of Machado-Joseph disease. Brain. 2025;148(11):4127-4142.
  32. Masri S, Sassone-Corsi P. The emerging link between cancer, metabolism, and circadian rhythms. Nat Med. 2018;24(12):1795-1803.
  33. Ribeiro RFN, Cavadas C, Silva MMC. Small-molecule modulators of the circadian clock: Pharmacological potentials in circadian-related diseases. Drug Discov Today. 2021;26(7):1620-1641.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Serum oku ile SenkronizasyonFare Hipotalamik H creleriZaman Serisi rneklemesiKantitatif PCRRNA EkstraksiyonuReferans Gen Se imiSirkadiyen Ritim AnaliziGen Ekspresyon Ritmisitesi

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.