Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İlaç Dağıtım Çalışmaları İçin BBB-Glioblastoma Mikroakışkan Çipinde Ultrason Kontrollü Kan-Beyin Bariyeri (BBB) Açılması

184 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/72041

⸱

18 Ağustos 2026

 ,  , 
1Ningbo No.2 Hospital, 2Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Neurological Diseases, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 3Lab of Nanopharmacology Research for Neurodegeneration, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 4Lab of Dementia and Neurorehabilitation Research, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, bir mikroakışkan KKK-glioblastoma (KKK-GBM) çip modelinin oluşturulmasını açıklamaktadır. Model, KKK bütünlüğü açısından doğrulanmıştır ve düşük yoğunluklu ultrasonla indüklenen geçici ve büyük ölçüde tersinir KKK açılmasının araştırılmasına olanak tanıyarak, ultrason aracılı nanomiselllerin KKK üzerinden taşınımının ve tümör hedefleme verimliliğinin nicel olarak değerlendirilmesini sağlar.

Özet

Kan-beyin bariyeri (KBB), çoğu terapötik molekülün beyne girişini kısıtlayarak glioblastoma (GBM) tedavisinin önündeki temel bir engel teşkil eder. KBB yapısı ve işlevindeki türler arası farklılıklar, hayvan modellerinin klinik çevrimini zorlaştırmakta ve GBM terapisinde ilaç geçirgenliğini değerlendirmek için insanla ilişkili in vitro KBB platformlarına olan ihtiyacı vurgulamaktadır. Burada, mikroakışkan bir KBB-GBM çip modelinin oluşturulmasına yönelik bir protokol açıklanmaktadır. Bu model, Matrigel gömülü bir mikroakışkan platform içerisinde insan serebral mikrovasküler endotel hücrelerini (HCMEC'ler), primer astrositleri (AC'ler) ve U87-MG hücrelerini içeren bir tri-kültür sistemi kurar. KBB bütünlüğü, sürekli zonula occludens-1 (ZO-1) immünboyaması ve FITC-dekstran geçirgenlik testi ile doğrulanır. Ardından, geçici ve büyük ölçüde geri döndürülebilir bir KBB açılması sağlamak için düşük yoğunluklu ultrason (US) (1 MHz, 1 W/cm2, 30 s) uygulanarak, tümöre hedefleyen nanomisellerin (SFN@RB@SPMs) bariyeri etkili bir şekilde geçmesi ve GBM hücrelerinde birikmesi sağlanır. Bu protokolün temel özelliği, gerçek zamanlı KBB geçirgenliği ve ilaç iletimi ölçümlerinin tek bir ultrason-duyarlı çip içerisinde entegre edilmesidir; bu da GBM'de ultrasonla artırılmış ilaç iletim mekanizmalarını analiz etmek için güçlü bir platform sunar.

Giriş

Glioblastoma (GBM) tedavisi, neredeyse tüm terapötik ajanların beyne girişini ciddi şekilde kısıtlayan KKB tarafından güçlü bir şekilde sınırlandırılmaktadır1,2. KKB; sıkı bağlantı proteinleri (örneğin, occludin, ZO-1) ile birleşmiş fenestrasyonsuz endotel hücrelerinden oluşur ve perisitler ile astrositik ayak uçlarından ek destek alır3. Hayvan modelleri KKB fonksiyonuna dair değerli bilgiler sağlamış olsa da, fizyoloji ve metabolizmadaki türe özgü varyasyonlar, insan ilaç yanıtlarını doğru şekilde tahmin etme yeteneklerini sınırlamaktadır4,5. Sonuç olarak, GBM terapisinde ilaç geçirgenliğinin değerlendirilmesi için fizyolojik olarak ilgili insan KKB modelleri vazgeçilmezdir.

Transwell kültür sistemi gibi geleneksel in vitro KKB modelleri; hücre-hücre etkileşimi, dinamik akışkan değişimi ve akışla tetiklenen kayma gerilimi dahil olmak üzere KKB'nin karmaşıklığını yeniden oluşturmakta yetersiz kalmaktadır6. Buna karşılık, mikroakışkan KKB modelleri, bu in vivo benzeri özellikleri yakından taklit eden üstün platformlar olarak ortaya çıkmıştır7. Bu tür çip üzerinde KKB sistemleri, beyin tümörü metastazını incelemek8, Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklarda KKB disfonksiyonunu araştırmak9 ve KKB üzerinden ilaç transportunu değerlendirmek10,11 için yaygın olarak kullanılmıştır. Ancak, mevcut KKB-çip modellerinin çoğu temel olarak ilaç geçirgenlik testleri için kullanılmakta olup KKB geçirgenliğini modüle eden harici fiziksel uyaranları entegre etme yeteneğinden yoksundur. Günümüzde, odaklanmış ultrason (FUS), KKB'yi önemli ölçüde geri dönüşümlü olacak şekilde geçici olarak açmak için gelecek vaat eden bir strateji olarak ortaya çıkmış ve terapötik ajanların beyne daha etkin iletilmesini sağlamıştır12,13. Önceki mekanistik çalışmalar, ultrason kaynaklı mekanik stimülasyonun, hücre-hücre bağlantılarını yeniden şekillendirerek ve endotelyal geçirgenliği artırarak bariyer fonksiyonunu geçici olarak modüle edebildiğini göstermiştir. Örneğin, Silvani ve ark., ultrason kaynaklı mekanik kuvvetlerin in vitro çip üzerinde damar modelinde geri dönüşümlü interendotelyal boşluk oluşumuna yol açtığını göstermiştir14. Bu bulgularla uyumlu olarak, Beekers ve ark., ultrason aracılı mekanik biyoeffektlerin endotelyal hücre-hücre temaslarının geçici olarak açılmasını tetiklediğini ve böylece endotelyal geçirgenliği artırdığını kanıtlamıştır15. Daha yakın zamanda Qiao ve ark., endotelyal bariyer geçirgenliğinin, özellikle darbe uzunluğu olmak üzere ultrason maruziyet parametreleri tarafından kritik şekilde düzenlendiğini bildirmiş ve güvenli ve kontrol edilebilir KKB modülasyonu sağlamak için akustik parametrelerin optimizasyonunun önemini vurgulamıştır16. Bu ilerlemelere rağmen, ultrason aracılı KKB açılmasının ve bunun nanoiçsel teslimat üzerindeki etkisinin eş zamanlı olarak kantitatif analizine olanak tanıyan in vitro platformlar halen sınırlıdır.

Yukarıda belirtilen eksikliği gidermek amacıyla, mikroakışkan bir BBB-GBM çipi oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Mikroakışkan cihaz; Matrigel içine gömülmüş HCMEC, primer AC ve U87-MG GBM hücrelerinden oluşan bir üçlü kültürü desteklemektedir. Yeniden yapılandırılan BBB, hücreler arası bağlantılar boyunca sürekli ZO-1 lokalizasyonu ve vasküler arayüz boyunca 40 kDa FITC-dekstranın sınırlı difüzyonu ile kanıtlandığı üzere, sağlam bir bariyerin hem yapısal hem de fonksiyonel özelliklerini sergilemiştir. Önemli bir nokta olarak bu çip, geçici BBB açılımı sağlamak için kontrollü ultrason stimülasyonu ile eşleştirilebilir ve böylece nanomisellerin sonraki taşınımı ve tümör hedefleme verimliliği artırılabilir. Bu sistem kullanılarak, SFN@RB@SPM nanomisellerinin taşınımı ve tümör hedefleme verimliliği kantitatif olarak değerlendirilebilir. Genel olarak bu platform; ultrason parametreleri, geri dönüşümlü özelliklere sahip BBB modülasyonu ve GBM tedavisinde artırılmış nanomiseller iletimi arasındaki ilişkiyi incelemek için kullanışlı bir araç sağlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Deneysel Hayvan Refahının Etik İncelemesine yönelik Kılavuzlara (GB/T35892-2018) uygun olarak yürütülmüş ve UCAS, Ningbo Yaşam ve Sağlık Endüstrisi Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (Onay No. GK-2023-XM-0073). Kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Materyal Tablosu'nda listelenmiştir.

1. BBB-GBM organ-on-a-chip cihazının üretimi ve hazırlanması

  1. Çip tasarımı ve fotomaske yerleşimi
    1. Auto CAD yazılımını kullanarak çipi tasarlayın.
      NOT: Çip; bir kan damarı kanalı, bir beyin kanalı ve bir tümör kanalı olmak üzere üç paralel mikroakışkan kanaldan oluşur. Kan damarı ve tümör kanallarının genişlikleri 1000 µm, beyin kanalının genişliği ise 1300 µm'dir. Üç kanalın yüksekliği 150 µm'dir ve komşu kanallar, bölmeler arası moleküler difüzyona ve hücresel iletişime izin veren 200 µm genişliğinde trapezoidal mikro sütün dizileriyle birbirinden ayrılmıştır. Detaylı fotomaske tasarım yerleşimi Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2'de verilmiştir. Bu çalışmada kullanılan SU-8 fotoresist 3050'dir.
  2. SU-8 fotoresist ile standart fotolitografi kullanarak silikon ana kalıp üretin.
    1. Boş bir silikon gofreti spin coater vakum tablasına yerleştirin ve gofretin güvenli bir şekilde sabitlenmesi için vakumu etkinleştirin.
    2. Gofretin merkezine yavaşça 10 mL SU-8 fotoresist damlatın.
    3. Homojen bir fotoresist tabakası elde etmek için iki aşamalı bir spin-coating işlemi gerçekleştirin: önce 10 s boyunca 500 rpm, ardından 90 s boyunca 2500 rpm.
    4. Kaplanmış gofretle bir ısıtıcı plakaya aktarın ve solventin buharlaşması için 95 °C'de 30 dk boyunca soft bake işlemi uygulayın.
    5. Gofretin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve bir kalınlık ölçer kullanarak SU-8 tabakasının kalınlığını ölçün.
      NOT: Optimal BBB oluşumu için 110–150 µm kanal yüksekliği önerilir. Tek bir spin-coat işlemi (adım 1.2.3) tipik olarak 40–50 µm film kalınlığı sağlar; bu nedenle istenen toplam kalınlığa ulaşmak için iki ila üç spin-coating işlemi gereklidir.
  3. Fotolitografik desenleme
    1. Maske hizalayıcının ultraviyole (UV) ışık yoğunluğunu 14–15 mW/cm2 olarak ayarlayın.
    2. Krom fotomaskeyi SU-8 ile kaplanmış silikon gofretle hizalayın ve 10 s boyunca UV maruziyeti uygulayın.
    3. Silikon gofretle hemen şu koşullar altında poz sonrası pişirme (post-exposure baking) için bir ısıtıcı plakaya aktarın: 10 s boyunca 65 °C, ardından 300 s boyunca 95 °C.
    4. Silikon gofret oda sıcaklığına soğuduktan sonra, geliştirici çözeltiye (propilen glikol monometil eter asetat, PGMEA) daldırın ve 4–6 dk boyunca gelişmeye bırakın.
    5. Geliştirme işlemini sonlandırmak için gofretle izopropanol ile durulayın ve ardından deiyonize su ile yıkayın.
    6. Gofreti azot gazı kullanarak kurutun ve desenlenmiş mikrokanal yapılarını bir optik mikroskop altında inceleyin.
      NOT: Geliştirilmemiş fotoresist kalıntıları kalırsa, mikro yapılar net bir şekilde tanımlanana kadar geliştirme adımını tekrarlayın.
    7. SU-8 fotoresist ile silikon gofret yüzeyi arasındaki yapışmayı artırmak için tamamlanan silikon ana kalıbı bir fırında 200 °C'de 1 s boyunca pişirin.
  4. PDMS çip üretimi
    1. Homojen bir PDMS prepolimeri elde etmek için baz prepolimeri ve kürleme ajanını 10:1 ağırlık oranında (w/w) 30 dk boyunca iyice karıştırarak polidimetilsiloksan (PDMS) hazırlayın.
    2. PDMS karışımını, mikro yapıların tamamen kaplandığından emin olarak üretilen silikon ana kalıbın üzerine dökün.
    3. Hava kabarcıklarını gidermek için ana kalıbı bir vakum desikatörüne yerleştirin.
    4. Ana kalıbı bir fırına aktarın ve 65 °C'de 1,5–2 s boyunca kürleyin.
    5. Kürlemeden sonra, PDMS tabakasını bir maket bıçağı kullanarak çip sınırları boyunca dikkatlice kesin ve silikon ana kalıptan nazikçe soyun.
    6. PDMS çipi ön sterilizasyon için %70–%75'lik etanolde 30 dk boyunca bekletin, ardından deiyonize su ile durulayın ve havada kurumaya bırakın.
    7. 2 mm'lik bir biyopsi punch kullanarak giriş ve çıkış portlarını açın.
  5. Plazma bağlama ve cihaz montajı
    1. PDMS çipi ve temiz bir cam lamı, PDMS'in mikrokanal tarafı yukarı bakacak şekilde bir plazma temizleyici haznesine yerleştirin.
    2. Basınç 30 Pa'nın altına düşene kadar hazneyi vakumlayın, ardından oksijen gazı verin.
    3. Hazne basıncını 40 Pa'nın altında tutarak oksijen akışını 90 s boyunca sürdürün.
    4. Radyo Frekansı (RF) gücünü %55'e ayarlayın ve PDMS ile cam yüzeyleri aktive etmek için 90 s boyunca plazma işlemi uygulayın.
    5. Aktive edilen PDMS çipi hemen cam lam ile temas ettirin ve geri dönüşü olmayan bir bağlama sağlamak için hafifçe bastırın.
    6. Bağlanmayı stabilize etmek ve hidrofobikliğini geri kazandırmak için monte edilen cihazı 65 °C'deki bir fırında 24 s boyunca bekletin.
    7. Hücre ekimi öncesinde, bağlanmış cihazı 30 dk boyunca ultraviyole ışınlama ile sterilize edin.
      NOT: Sterilize edilmiş çipleri, kullanıma kadar bir biyogüvenlik kabini içindeki kapalı Petri kaplarında saklayarak steril koşulları koruyun.

2. Hücre ekimi ve BBB-GBM modelinin oluşturulması

  1. Aşağıdaki reaktifleri hazırlayın:
    1. AC'ler kültür ortamı (beyin kanalı için): %20 fetal bovine serum (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin (P/S) içeren DMEM/F12 bazal ortamı.
    2. HCMEC'ler kültür ortamı (vasküler kanal için): %1 P/S ile desteklenmiş endotel hücre ortamı (ECM).
    3. GBM hücre kültür ortamı (gliom kanalı için): %10 FBS ve %1 P/S içeren MEM bazal ortamı.
    4. Hücre dissosiyasyon reaktifi: Adherent hücreleri ayırmak için %0,25 trypsin-EDTA çözeltisi kullanın.
      NOT: Trypsin'e uzun süre maruz kalmak hücre canlılığını azaltabilir. Hücre ayrılmasını mikroskop altında izleyin ve trypsin'i tam ortam ile hızla nötralize edin.
    5. Tüm hücreleri (AC'ler, HCMEC'ler ve U87-MG), mikroakışkan cihaza ekim yapmadan önce 100 mm'lik kültür kaplarında muhafaza edin.
  2. Primer AC'lerin izolasyonu
    1. Neonatal farelerin (postnatal gün 1–3) serebral kortekslerinden primer AC'leri izole edin. Meningleri ve kan damarlarını buz üzerinde dikkatlice temizledikten sonra, kortikal dokuyu steril cerrahi makasla kıyın ve enzimatik digestiyona tabi tutun.
    2. Dissosiye edilmiş hücre süspansiyonunu buz gibi soğuk PBS ile yıkayın, tek hücreli dissosiyasyon sağlamak için trypsin ile işlem yapın ve pelletleri santrifüjle toplayın (400 x g, 5 dk, oda sıcaklığı).
    3. Hücreleri yeniden süspande edin ve AC'ler kültür ortamı içeren T25 kültür flasklarına ekim yapın.
    4. AC'leri, immunofloresan boyama yoluyla GFAP ile tanımlayın. Görüntü Ek Şekil 3'te sunulmuştur.
  3. Hücre ekimi
    ​NOT: 1. Gün - Beyin kanalına AC'lerin ekimi.
    1. AC içeren kültür kabına 1 mL %0,25 trypsin-EDTA ekleyin. Eşit dağılım sağlamak için hafifçe dairesel hareketlerle sallayın.
    2. Hücreler kültür kabından ayrılana kadar 37 °C'de 1–2 dk inkübe edin.
    3. Trypsin'i nötralize etmek için 3 mL AC'ler kültür ortamı (adım 2.1.1'den) ekleyin. Tek hücreli süspansiyon elde etmek için nazikçe pipetleyin.
    4. Hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne toplayın ve 4 °C'de 3 dk boyunca 300 × g hızında santrifüjleyin.
    5. Süpernatantı uzaklaştırın ve hücre pelletini 200 µL AC ortamında yeniden süspande edin.
    6. Otomatik bir hücre sayıcı kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin ve yoğunluğu 2,5 × 106 hücre/mL olarak ayarlayın.
    7. AC hücresi süspansiyonunu Matrigel ile 3:5 (v/v) oranında (AC hücreleri: Matrigel) karıştırın.
    8. Bir mikropipet kullanarak, 10 µL Matrigel-AC'ler karışımını beyin kanalına dağıtın.
      NOT: Matrigel'in erken polimerizasyonunu önlemek için yükleme işlemini çip buz üzerinde tutularak gerçekleştirin.
    9. Matrigel polimerizasyonu ve hücre stabilizasyonu için çipi %5 CO2 inkübatöründe 37 °C'de 30 dk inkübe edin.
      NOT: 1. Gün - Vasküler kanala HCMEC'lerin ekimi.
    10. 1 mL %0,25 trypsin-EDTA uygulayın ve hücreler ayrılana kadar yaklaşık 30 sn boyunca 37 °C'de inkübe edin.
    11. Enzimatik digestiyonu durdurmak için 3 mL HCMEC'ler ortamı (adım 2.1.2) ekleyin.
    12. Homojen bir tek hücreli süspansiyon oluşturmak için nazikçe pipetleyin.
    13. Süspansiyonu toplayın ve 4 °C'de 3 dk boyunca 300 × g hızında santrifüjleyin.
    14. Süpernatantı uzaklaştırın ve hücre pelletini 200 µL HCMEC'ler ortamında yeniden süspande edin.
    15. Hücreleri sayın ve konsantrasyonu 2 × 106 hücre/mL olarak ayarlayın.
    16. 10 µL HCMEC'ler süspansiyonunu çipin vasküler kanalına dikkatlice ekleyin.
    17. Endotel hücrelerinin kanal duvarı boyunca tutunmasını teşvik etmek için çipi hücre inkübatöründe 30 dk boyunca yan konumda tutun.
    18. Vasküler kanaldaki endotel yoğunluğunu artırmak için vasküler kanala ek 10 µL HCMEC'ler süspansiyonu ekleyin.
    19. HCMEC'lerin adezyonunu sağlamak için çipi ek 30–60 dk inkübe edin.
    20. Çip girişine 100 µL karışık kültür ortamı ekleyin.
      NOT: Karışık ortam, 1:1 oranında (v/v) AC ortamı ve HCMEC'ler ortamından oluşur.
      3. Gün - Gliom kanalına U87-MG hücrelerinin ekimi.
    21. Kültür kabına 1 mL %0,25 trypsin-EDTA ekleyin ve 37 °C'de 1–2 dk inkübe edin.
    22. Digestiyonu sonlandırmak için 3 mL U87-MG ortamı (adım 2.1.3'ten) ekleyin.
    23. Homojen bir tek hücreli süspansiyon elde etmek için nazikçe pipetleyin.
    24. Hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın ve 3 dk boyunca 300 × g hızında santrifüjleyin.
    25. Süpernatantı dökün ve hücre pelletini 200 µL U87-MG ortamında yeniden süspande edin.
    26. Hücre konsantrasyonunu sayın ve yoğunluğu 2 × 106 hücre/mL olarak ayarlayın.
    27. 10 µL U87-MG hücre süspansiyonunu çipin gliom kanalına ekleyin.
    28. Hücre tutunmasını sağlamak için çipi 37 °C'de %5 CO2 ile 30–60 dk inkübe edin.
    29. Çip girişine 100 µL U87-MG kültür ortamı ekleyin.
    30. Endotel sıkı bağlantı (tight junction) oluşumuna izin vermek için mikroakışkan cihazı %5 CO2 içeren 37 °C ortamda ek 48 saat boyunca muhafaza edin.

3. KKB bütünlüğünün değerlendirilmesi

  1. Geçirgenlik analizi
    1. Karışık kültür ortamında (ACs ortamı: HCMEC ortamı = 1:1, v/v), 10 µg/mL final konsantrasyonunda 40 kDa moleküler ağırlığa sahip floresein izotiyosiyanat-dekstran (FITC-dekstran) hazırlayın.
    2. Vasküler kanala 10 µL FITC-dekstran çözeltisi ekleyin.
    3. Dekstranın endotel bariyer boyunca difüzyonunu izlemek için, vasküler kanalın ve bitişikteki beyin kanalının floresans görüntülerini 20 dakikalık aralıklarla almak üzere mikroakışkan çipi bir ters floresans mikroskobunun tablasına yerleştirin.
    4. Geçirgenlik katsayısını (Papp, cm/s) aşağıdaki formülü kullanarak hesaplayın:
      Papp (cm/s)= Fs, Fc ve Δt'yi içeren işlem verimliliği denklemi; bilimsel araştırma için matematiksel formül.
      Burada Papp görünür geçirgenlik katsayısı (cm/s), FS başlangıç zamanındaki kan kanalındaki floresans yoğunluğu, FC difüzyon aralığının sonundaki beyin kanalındaki floresans yoğunluğu, Δt difüzyon süresi (s), VT beyin kanalındaki FITC-dekstranın difüzyon hacmi (cm3) ve A endotel yüzey alanıdır (cm2).
      NOT: Daha düşük bir geçirgenlik katsayısı, daha yüksek KKB bütünlüğüne ve daha sıkı bir endotel bariyer oluşumuna işaret eder.
    5. Veri analizini ve parametre tanımlamalarını gerçekleştirin.
      NOT: Hem kan hem de beyin kanallarından elde edilen floresans yoğunluk değerlerinden, çipin hücre içermeyen bölgelerinden alınan ölçümler kullanılarak arka plan çıkarımı yapılmıştır. ROI'ler, floresans difüzyon uzunluğuna göre kan-beyin arayüzünün her iki tarafında tanımlanmıştır. Endotel yüzey alanı (A), vasküler ve beyin kanalları arasındaki arayüz alanından (iki mikro sütun arasındaki boşluk referans alınarak) hesaplanmıştır: 200 µm × 150 µm = 30,000 µm2 = 3 × 10-6 cm2. FITC-dekstran difüzyon hacmi (VT), beyin kanalındaki difüzyon penetrasyon mesafesinin A ile çarpılmasıyla elde edilmiştir. Floresans görüntüleri 60 dakikalık bir süre boyunca her 20 dakikada bir (1200 s) alınmış; geçirgenlik katsayısı 20 dakikalık aralık verileri kullanılarak hesaplanmıştır. Geçirgenlik değerleri, her deneysel grup için üç bağımsız çipten hesaplanmıştır. Tüm birim dönüşümleri, geçirgenlik cm/s olarak ifade edilmeden önce gerçekleştirilmiştir.
  2. ZO-1'in immünofloresans analizi
    1. Kalıntı kültür ortamını uzaklaştırmak için mikroakışkan kanalları fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkayın.
    2. Kanallara %4 paraformaldehit (PFA) ekleyip oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ederek hücreleri fikse edin.
    3. Hücreleri PBS içinde %0,1 Triton X-100 ile oda sıcaklığında 15 dakika permeabilize edin.
    4. Kanalları PBS içinde %2 sığır serum albümini (BSA) ile oda sıcaklığında 45 dakika inkübe ederek spesifik olmayan antikor bağlanmasını bloke edin.
    5. Kanallara anti-ZO-1 primer antikoru (1:200 dilüsyon) ekleyin ve 4 °C'de gece boyu inkübe edin.
    6. Bağlanmamış primer antikoru uzaklaştırmak için kanalı PBS ile iyice yıkayın.
    7. Çipleri, Alexa Fluor 555-konjuge anti-tavşan sekonder antikor (1:1000 dilüsyon) ile oda sıcaklığında, karanlıkta 45 dakika inkübe edin.
    8. Çekirdekleri 1 µg/mL 4’6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ile oda sıcaklığında, karanlıkta 1 dakika boyunca karşıt boyayın.
      NOT: DAPI ışığa duyarlıdır ve boyama sırasında ışıktan korunmalıdır.
    9. Kanalları PBS ile üç kez yıkayın.
    10. Endotel hücre bağlantısı boyunca ZO-1 lokalizasyonunu görselleştirmek için mikroakışkan cihazı bir ters floresans mikroskobu ve bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak görüntüleyin.

4. GBM hücrelerine BBB üzerinden ultrasonla desteklenmiş nanomisellerin iletimi

  1. Ultrason stimülasyonu
    1. Çipi kültür kabından dikkatlice çıkarın ve bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin.
    2. 1 MHz transdüsere (etkin yayılma alanı: 5 cm2) sahip terapötik bir ultrason sistemi kullanarak ultrason stimülasyonu uygulayın.
    3. Etkin akustik iletimi sağlamak için ultrason probu ile mikroakışkan çipin yüzeyi arasına 3 mm kalınlığında tıbbi sınıf akustik kuplaj pedi yerleştirin.
    4. Ultrason probunu, mikroakışkan cihazın vasküler kanal bölgesinin doğrudan üzerine konumlandırın.
      NOT: Transdüser ile çip arasındaki hava kabarcıkları akustik enerji iletimini önemli ölçüde azaltır ve bunlardan kaçınılmalıdır.
    5. Ultrason parametrelerini şu şekilde ayarlayın: görev döngüsü: %60; frekans: 1 MHz; yoğunluk: 1 W/cm2; maruziyet süresi: 30 s; darbe tekrarlama frekansı (PRF): 100 Hz. Detaylı ultrason parametreleri Ek Tablo 1'de verilmiştir.
    6. İşlem görmemiş kontrol grubu için, ultrason transdüseri aynı konuma yerleştirin ancak sham kontrol olarak hizmet etmesi için inaktif durumda tutun; böylece akustik maruziyet olmaksızın özdeş işlem prosedürlerinin uygulanmasını sağlayın.
    7. Ultrason maruziyetinden sonra kuplaj pedini kaldırın ve çipi derhal steril bir kültür kabına geri koyun.
    8. Çipin giriş portlarına taze kültür ortamı ekleyin.
    9. Daha fazla analiz yapılana kadar cihazı 37 °C'de %5 CO2 ile inkübe edin.
  2. Ultrason kaynaklı BBB modülasyonunun değerlendirilmesi
    1. Sıkı bağlantı bütünlüğündeki değişiklikleri değerlendirmek için ultrason tedavisinden hemen sonra (0 sa) ve tedavi sonrası 24. saatte ZO-1 immünofloresan boyama yapın.
    2. Adım 3.2'de açıklanan immünofloresan boyama prosedürünü izleyin.
    3. Ultrason stimülasyonunun BBB sıkı bağlantı bütünlüğü üzerindeki etkisini değerlendirmek için z-ekseni boyunca ZO-1 boyama dağılımını karşılaştırın.
  3. SFN@RB@SPM nanomisellerinin hazırlanması ve karakterizasyonu
    1. SFN@RB@SPM nanomisellerini önceden belirlenmiş protokole17 göre hazırlayın. Kısaca; amfifilik peptidin (SPM olarak adlandırılan, 6 mg/mL), RB (0,6 mg/mL) ve SFN (6 mM) stok çözeltileri 1:1:1 hacim oranında karıştırıldı.
    2. Karışımı bir sonikatöre yerleştirin ve 28 kHz, 25 °C'de 30 dk boyunca sonikasyon uygulayın.
    3. Serbest RB ve SFN'yi uzaklaştırmak için karışımı (moleküler ağırlık kesme sınırı: 1000 Da) 48 sa boyunca diyalize edin.
    4. Nanomisellerin boyutunu ve zeta potansiyelini dinamik ışık saçılımı (DLS) ile ölçün. Karakterizasyon verileri Ek Şekil 4'te verilmiştir.
  4. Ultrason stimülasyonlu nanomiseller iletiminin ve glioma hücresi birikiminin değerlendirilmesi
    1. Ultrason maruziyetinin hemen ardından, nanomiseller içeren kültür ortamını mikroakışkan cihazın vasküler kanalına aktarın.
    2. Nanomisellerin BBB boyunca transportunu değerlendirmek için mikroakışkan çipi ters bir floresan mikroskobun tablasına yerleştirin ve 60 dk boyunca 20 dk aralıklarla hem vasküler kanalın hem de bitişik beyin kanalının floresan görüntülerini alın.
    3. Ultrasonla artırılmış nanomiseller geçirgenliğini değerlendirmek için beyin kanalındaki floresan görüntüleri nicelleştirin.
    4. Glioma hücrelerinde nanomiseller birikimini değerlendirmek için cihazı ultrason maruziyetinden sonra standart kültür koşullarında (37 °C, %5 CO2) 3 sa boyunca inkübe edin, ardından hücre içi nanomiseller alımını değerlendirmek için glioma kanalını bir floresan mikroskop kullanarak görüntüleyin.
  5. İstatistiksel analiz
    1. Tüm kantitatif verileri ortalama±ortalamanın standart hatası (SEM) olarak ifade edin.
    2. Her deneyi üç bağımsız biyolojik replika ile (deney koşulu başına n = 3 çip) gerçekleştirin. Veri güvenilirliğini sağlamak için her biyolojik replika için en az üç teknik replika (kanal başına ROI) ölçüldü.
    3. Birincil analiz birimi olarak hizmet eden her bağımsız çipten geçirgenlik katsayısını (Papp, cm/s) hesaplayın ve tüm istatistiksel karşılaştırmalarda kullanın.
      NOT: İki grup arasındaki karşılaştırmalar eşleştirilmemiş iki kuyruklu Student t-testi kullanılarak yapıldı. Üç veya daha fazla grup arasındaki karşılaştırmalar tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından çoklu karşılaştırmalar için Tukey post hoc testi kullanılarak analiz edildi. İki bağımsız değişken içeren deneyler için, tek yönlü ANOVA'yı takiben Tukey çoklu karşılaştırma testi uygulandı. İstatistiksel analizler, istatistik ve grafik yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. p-değerinin <0,05 olması istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

BBB'nin in vivo yapısını yeniden oluşturmak için HCMEC'ler, primer AC'ler ve U87-MG hücreleri içeren bir tri-kültür mikroakışkan çip geliştirilmiştir ("çip modeli" olarak adlandırılmıştır). Şekil 1A,B'de gösterildiği gibi, cihaz içinde üç paralel kanal düzenlenmiştir: vasküler (sol, mavi), Matrigel ile doldurulmuş beyin (merkezi, pembe) ve tümör (sağ, yeşil) kanalları sırasıyla HCMEC'ler, AC'ler ve U87-MG hücreleri ile ekilmiştir. Kanallar, merkezi bölmedeki matrige...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, ultrason aracılı BBB modülasyonu ve nanomiseller iletimini değerlendirmek için mikroakışkan bir BBB-GBM çipinin kurulmasını açıklamaktadır. Geleneksel in vitro BBB modelleriyle (örneğin Transwell) karşılaştırıldığında, bu mikroakışkan platform; endotel hücrelerinin, AC'lerin ve glioma hücrelerinin mekansal olarak tanımlanmış ko-kültürüne olanak tanıyarak, fizyolojik olarak ilgili bir BBB boyunca ilaç transportunun araştırılmasını sağlar. Protokoldeki birkaç kritik adım, güvenilir bariyer oluşumunu s...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Bu makalenin hazırlanması sırasında yazarlar, yalnızca dil düzenlemesi ve iyileştirmesi için ChatGPT (OpenAI) kullanmışlardır. Yazarlar, yapay zeka destekli tüm içeriği inceleyip düzenlemiş olup makalenin doğruluğu ve bütünlüğü konusunda tüm sorumluluğu üstlenmektedirler. Veri üretimi, analizi veya şekil hazırlama aşamalarında hiçbir yapay zeka aracı kullanılmamıştır.

Teşekkürler

Zhejiang Eyalet Doğa Bilimleri Vakfı (LQ24H160003), Zhejiang Eyaleti Tıbbi Bilimsel Araştırma Vakfı (2024KY351), Ningbo Doğa Bilimleri Vakfı (2023J365), Yongjiang Yetenek Getirme Programı (Genç Yenilikçi Yetenek Projesi, 2021A-012-G) ve Ningbo, Jiangbei Bölgesi Bei’An Yetenek Programı'ndan (2023RC004) sağlanan finansman için şükranlarımızı sunarız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alexa Fluor 555-konjuge anti-tavşan sekonder antikorCell Signaling Technology, Inc.4413
anti-ZO-1 antikoruThermo Fisher Scientific Co., Ltd.40-2200
Biyopsi punchZhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10305130004
Sığır serum albüminiAbsin Bioscience Inc.9048-46-8
Hücre sayacıThermo Fisher Scientific Co., Ltd.Countess TM3
Hücre kültürü kabı (100 mm)Corning Inc.430167
SantrifüjBeckman Coulter, Inc.Avanti J-15R
Krom maskeSuzhou Chip Scientific Instrument Co.,Ltd.ZX-GBYM
Konfokal Lazer Taramalı MikroskopCarl Zeiss AGZeiss LSM900
DAPIBeyotime Biotech Inc.C1002
Developer (Banyo)Suzhou Chip Scientific Instrument Co., Ltd.RCD-400
DMEM/F12ScienCell Research LaboratoriesC3130-0500
ECMScienCell Research Laboratories1001
EtanolNingbo Zhenhai Yongfeng Chemical Plant6923193900015
Fetal sığır serumuScienCell Research LaboratoriesC04001-500
Fiji (Fiji Is Just ImageJ)Açık kaynaklı projeN/A
FITC-Dekstran (40 kDa)Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.GC19938
Cam lamlarCitotest Scientific Co., Ltd.188105W
Graphpad prism 9.5GraphPad Software, Inc.N/A
İnsan serebral mikrovasküler endotel hücreleri (HCMECs)BeNa Culture CollectionBNCC337717
İnkübatörEsco Lifesciences Co., LtdCLM-170B-8-CN
Evirmeli floresan mikroskopNikon Instruments Inc.TS2-FL
İzopropanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.80109218
MatrigelCorning Inc.354234
MEMPricella Life Science & Technology Co., Ltd.PM150410
AzotNingbo Baifang Gas CO., Ltd.N/A
OksijenNingbo Baifang Gas CO., Ltd.N/A
Paraformaldehit (PFA, %4)Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1101-500mL
PBSScienCell Research LaboratoriesC3580-0500
PDMSCorning Inc.220777
Penisilin/streptomisinPricella Life Science & Technology Co., Ltd.PB180120
FotolitografiInstitute of Optics and Electronics, Chinese Academy of SciencesURE-2000\AL
Fotolitografi sıcak tablasıSuzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-HP-02
Plazma asherTIANKECHUANGDA Co., Ltd.PT-05-LF
Primer astrositlerN/AN/AYenidoğan sıçan (1-3. Gün) beyninden izole edildi
Silikon gofretZhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10204040001
Spin coater (Döndürmeli kaplayıcı)Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-SC-01
SU-8Kayaku Advanced Materials Inc.1030403002
Triton X-100Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.9002-93-1
TripsinScienCell Research LaboratoriesC3530-0100
U87-MG hücreleriPricella Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0238
Ultrasonyen cihaz Shenzhen Dongdixin Technology Co., Ltd.Sonic-Stimu Pro UT1041
Zen3.4(blue edition)Carl Zeiss AGN/A

Kaynaklar

  1. Narsinh KH, Perez E, Haddad AF, Young JS, Savastano L, Villanueva-Meyer JE, et al. Strategies to improve drug delivery across the blood-brain barrier for glioblastoma. Curr Neurol Neurosci Rep. 2024;24(5):123-139.
  2. Xie Y, Yang F, He L, Huang H, Chao M, Cao H, et al. Single-cell dissection of the human blood-brain barrier and glioma blood-tumor barrier. Neuron. 2024;112(18):3089-105 e7.
  3. Scalise AA, Kakogiannos N, Zanardi F, Iannelli F, Giannotta M. The blood-brain and gut-vascular barriers: from the perspective of claudins. Tissue Barriers. 2021;9(3):1926190.
  4. Sivandzade F, Cucullo L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 2018;38(10):1667-1681.
  5. Shawahna R, Decleves X, Scherrmann JM. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Curr Drug Metab. 2013;14(1):120-136.
  6. Oddo A, Peng B, Tong Z, Wei Y, Tong WY, Thissen H, et al. Advances in Microfluidic Blood-Brain Barrier (BBB) Models. Trends Biotechnol. 2019;37(12):1295-1314.
  7. Hajal C, Offeddu GS, Shin Y, Zhang S, Morozova O, Hickman D, et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nat Protoc. 2022;17(1):95-128.
  8. Xu H, Li Z, Yu Y, Sizdahkhani S, Ho WS, Yin F, et al. A dynamic in vivo-like organotypic blood-brain barrier model to probe metastatic brain tumors. Sci Rep. 2016;6:36670.
  9. Park J, Wetzel I, Marriott I, Dreau D, D'Avanzo C, Kim DY, et al. A 3D human triculture system modeling neurodegeneration and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 2018;21(7):941-951.
  10. Park TE, Mustafaoglu N, Herland A, Hasselkus R, Mannix R, FitzGerald EA, et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nat Commun. 2019;10(1):2621.
  11. Peng B, Tong Z, Tong WY, Pasic PJ, Oddo A, Dai Y, et al. In situ surface modification of microfluidic blood-brain-barriers for improved screening of small molecules and nanoparticles. ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(51):56753-56766.
  12. Mainprize T, Lipsman N, Huang Y, Meng Y, Bethune A, Ironside S, et al. Blood-brain barrier opening in primary brain tumors with non-invasive MR-guided focused ultrasound: a clinical safety and feasibility study. Sci Rep. 2019;9(1):321.
  13. Adriani G, Ma D, Pavesi A, Kamm RD, Goh EL. A 3D neurovascular microfluidic model consisting of neurons, astrocytes and cerebral endothelial cells as a blood-brain barrier. Lab Chip. 2017;17(3):448-459.
  14. Silvani G, Scognamiglio C, Caprini D, Marino L, Chinappi M, Sinibaldi G, et al. Reversible cavitation-induced junctional opening in an artificial endothelial layer. Small. 2019;15(51):e1905375.
  15. Beekers I, Vegter M, Lattwein KR, Mastik F, Beurskens R, van der Steen AFW, et al. Opening of endothelial cell-cell contacts due to sonoporation. J Control Release. 2020;322:426-438.
  16. Qiao C, Luo S, Liu Z, Bu Y, Cai Y, Liu Z, et al. Tuning endothelial barrier permeability with ultrasound: a pulse-length-dependent interplay between bubble dynamics and cellular bioeffects. Ultrason Sonochem. 2026;129:107851.
  17. Li Y, Yang X, Wei Z, Niu H, Wu L, Chen C, et al. Sulforaphane wrapped in self-assembled nanomicelle enhances the effect of sonodynamic therapy on glioma. Pharmaceutics. 2024;17(1):34.
  18. Yuan W, Lv Y, Zeng M, Fu BM. Non-invasive measurement of solute permeability in cerebral microvessels of the rat. Microvasc Res. 2009;77(2):166-173.
  19. Lee SWL, Campisi M, Osaki T, Possenti L, Mattu C, Adriani G, et al. Modeling nanocarrier transport across a 3D in vitro human blood-brain-barrier microvasculature. Adv Healthc Mater. 2020;9(7):e1901486.
  20. Mehta RI, Carpenter JS, Mehta RI, Haut MW, Ranjan M, Najib U, et al. Blood-brain barrier opening with MRI-guided focused ultrasound elicits meningeal venous permeability in humans with early Alzheimer disease. Radiology. 2021;298(3):654-662.
  21. Cho H, Seo JH, Wong KH, Terasaki Y, Park J, Bong K, et al. Three-dimensional blood-brain barrier model for in vitro studies of neurovascular pathology. Sci Rep. 2015;5:15222.
  22. Campisi M, Shin Y, Osaki T, Hajal C, Chiono V, Kamm RD. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 2018;180:117-129.
  23. Wang YI, Abaci HE, Shuler ML. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnol Bioeng. 2017;114(1):184-194.
  24. Jiang L, Li S, Zheng J, Li Y, Huang H. Recent progress in microfluidic models of the blood-brain barrier. Micromachines (Basel). 2019;10(6):375.
  25. Bonkowski D, Katyshev V, Balabanov RD, Borisov A, Dore-Duffy P. The CNS microvascular pericyte: pericyte-astrocyte crosstalk in the regulation of tissue survival. Fluids Barriers CNS. 2011;8(1):8.
  26. Hurtado-Alvarado G, Cabanas-Morales AM, Gomez-Gonzalez B. Pericytes: brain-immune interface modulators. Front Integr Neurosci. 2014;7:80.
  27. Santa-Maria AR, Walter FR, Figueiredo R, Kincses A, Vigh JP, Heymans M, et al. Flow induces barrier and glycocalyx-related genes and negative surface charge in a lab-on-a-chip human blood-brain barrier model. J Cereb Blood Flow Metab. 2021;41(9):2201-2215.
  28. van der Helm MW, van der Meer AD, Eijkel JC, van den Berg A, Segerink LI. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue Barriers. 2016;4(1):e1142493.
  29. Alluri H, Peddaboina CS, Tharakan B. Evaluation of tight junction integrity in brain endothelial cells using confocal microscopy. Methods Mol Biol. 2024;2711:257-262.
  30. Nitta T, Hata M, Gotoh S, Seo Y, Sasaki H, Hashimoto N, et al. Size-selective loosening of the blood-brain barrier in claudin-5-deficient mice. J Cell Biol. 2003;161(3):653-660.
  31. Ben-Zvi A, Lacoste B, Kur E, Andreone BJ, Mayshar Y, Yan H, et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 2014;509(7501):507-511.
  32. Andreone BJ, Chow BW, Tata A, Lacoste B, Ben-Zvi A, Bullock K, et al. Blood-brain barrier permeability is regulated by lipid transport-dependent suppression of caveolae-mediated transcytosis. Neuron. 2017;94(3):581-594 e5.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Glioblastoma ModeliUltrasonla KKB AçılmasıKKB GeçirgenliğiEndotel HücreleriAstrosit KokültürüFITC-Dekstran AnaliziNanomiseller Taşıma

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.