Yöntem makalesi

Lezyon görselleştirmesi için ex vivo Cy5.5 boya-doplanmış silika nanopartikül etiketlemesi kullanan bir fare endometriozis modeli

123 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/72070

⸱

4 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Women’s Health, University of Missouri, 2Department of Biomedical Engineering, Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, endometriozisin Cy5.5 boya-doplanmış silika nanopartikülleriyle ex vivo etiketleme kullanılarak indüksiyonunu göstermekte; böylece genetik manipülasyon olmadan endometriyotik lezyonların floresan görselleştirilmesini mümkün kılmaktadır.

Özet

Endometriozis, rahim boşluğunun dışında endometriyal benzeri dokunun büyümesi ile karakterize edilen yaygın bir jinekolojik bozukluktur; bu da kronik iltihaplanma, pelvik ağrı ve kısırlığa yol açar. Hastalık gelişimi ve ilerlemesini etkileyen moleküler, hormonal, bağışıklık ve çevresel mekanizmaların araştırılması için güvenilir fare modelleri gereklidir. Endometriyotik lezyonları tespit etmek için geleneksel yöntemler genellikle genetik olarak tasarlanmış floresan raporlayıcı farelere dayanır; bu farelerin üretimi zaman alıcı ve maliyetlidir. Burada, nakil öncesinde donör rahim dokusu parçalarını Cy5.5-doplanmış silika nanopartikülleriyle ex vivo etiketleyerek farelerde endometriozisi indüklemek ve görselleştirmek için basit ve genetik olmayan bir yaklaşım sunuyoruz. Nanopartiküller, uygun fizikokimyasal özellikler, yüksek floresans stabilitesi ve minimal sitotoksisite sergiler; böylece rahim dokusunun deneysel prosedürlerden ödün vermeden etkili etiketlenmesini sağlar. Alıcı farelere intraperitoneal implantasyonun ardından, Cy5.5 etiketli endometriyotik lezyonlar floresan görüntüleme kullanılarak çevredeki konak dokulardan kolayca ayırt edilebilir. Bu protokol, lezyon görselleştirme ve takibi için tekrarlanabilir ve çok yönlü bir yöntem sunar; endometriozis patogenezi çalışmalarını ve genetik manipülasyona gerek kalmadan tanı ve tedavi stratejilerinin preklinik değerlendirmesini kolaylaştırır.

Giriş

Endometriozis, endometriyumun kaplı hücrelerinin rahim dışında büyüdüğü yaygın bir jinekolojik hastalıktır. Ortaya çıkan endometriyotik lezyonlar kronik bir inflamatuarduruma yol açar 1 ve etkilenen kadınlar genellikle pelvik ağrı ve kısırlıkyaşar 2. Endometriyal stromal ve epitel hücrelerindeki disfonksiyon, endometriyotik lezyonların hayatta kalma ve gelişimini artırır 3,4,5,6. Bu yaygın bozukluk, yalnızca ABD'deki kadınların yaklaşık %11'ini etkilemektedir. Kısırlık ve pelvik ağrının başlıcanedenidir 7 ve yaygın olarak kronik pelvik ağrısı ve kısırlığı olan kadınlarda %50–%60'açıkar 8,9,10,11,12,13. Amerika Birleşik Devletleri'nde endometriozisin teşhisi ve tedavisi için tahmini yıllık maliyet 22 milyar dolarıaşmaktadır 14,15. Mevcut tedaviler arasında lezyonların cerrahi olarak alınması veya hipostrojenik bir durumun indüksiyonu yer almaktadır. Ancak, ameliyat sonrası nükleme yaygındır ve mevcut tedaviler genellikle etkisizolur 9,16. Tanı genellikle yalnızca cerrahi görselleştirme ve histolojik doğrulama yoluylabelirlenir 17,18. Ayrıca, endometrioz sıklıkla teşhis edilmez veya yanlış teşhis edilir; tanı gecikmesi 9–11 yıl 19,20 arasındadır. Bu gecikme, hem hastalar hem de sağlık sistemi üzerinde önemli bir duygusal ve finansal yükoluşturur 20,21. Bu nedenle, endometriozisin hem tanısı hem de tedavisi için invaziv olmayan yöntemlerin geliştirilmesine acil ihtiyaç vardır.

In vitro modeller ileri düzeyde endometriozis araştırmalarına sahiptir. Ancak, hastalığın karmaşıklığını tam olarak taklit etme yetenekleri sınırlıdır. En büyük zorluklardan biri, hormonlar, iltihaplanma, bağışıklık hücreleri, sinirler ve çeşitli hücre tipleri arasında dinamik üç boyutlu bir ortamda karmaşık etkileşimleri içeren endometriozisin çok faktörlü doğasında yatmaktadır. Ayrıca, in vitro sistemler yumurtalık steroid hormonlarının doğal dalgalanmalarını yakalamaz, bu da üreme sistemi üzerindeki hastalık etkilerini inceleme yeteneğinisınırlar. 21,22,23. Böylece, sağlam farelerle indüklenmiş endometriozis modeli, bağışıklık sisteminin bireysel ve etkileşimli rollerini (hormonlar) 24, hormonlar 25,26 ve çevresel faktörlerin 27,28 endometriozis gelişimi ve üreme sistemi üzerindeki etkilerini incelemek için çok yönlü bir platform sağlar. Ayrıca, belirli genlerin endometriumda seçici olarak silindiği veya aşırı eksprese edildiği transgenik fare modellerinin kullanımı, araştırmacıların endometriozisin gelişimi ve ilerlemesinde farklı moleküler yolların rollerini aydınlatmasına olanak tanır. Ancak, endometriyotik lezyonları çevredeki konak dokulardan doğru şekilde ayırt etmek önemli bir teknik zorluk olmaya devam etmektedir.

Boya ile doplanmış silika nanopartikülleri, hücresel takip ve biyogörüntüleme için çok yönlü ve sağlam problardır. Sentezi basittir, yüksek dağınık, fotostabil, biyouyumlu ve hücre etiketlemesindeetkilidirler 30,31. Silika omurgası, matriks içindeki hidrofobik floroforları stabilize eder ve onları verimli, yüksek kuantum verimli (QY) floresan moleküler raporlayıcılar yapar. Yıllar içinde, bu floresan silika nanopartikülleri, nakil öncesi hücreler ve doku yapıları için parlak, dayanıklı ex vivo etiketler olarak yaygın şekilde benimsenmiştir ve ardından in vivogörüntüleme yapılmıştır 32,33,34,35. Burada, önceki biryayında 35 kullanıldığı gibi, Cy5.5 boya-doplanmış silika nanopartikülleri kullanılarak ex vivo etiketleme ile farelerde endometriozisin indüklenmesi için ayrıntılı bir prosedürü anlatıyoruz; bu yöntem, lezyon takibi için stabil görüntüleme belirteçleri olarak kullanılmasını mümkün kılmaktadır.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Missouri Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış (Protokol No.65323) ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kurumsal yönergeler ile geçerli ulusal düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Cy5.5-APTES konjugatının hazırlanması

  1. 1 mg siyanin 5.5-NHS esterini, 100 μL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde şeffaf 11.1 mL cam dişli bir şişede çöz. Şişeyi hemen alüminyum folyo ile kaplayın, böylece çözeltiyi ışıktan koruyun.
    NOT: Cy 5.5-APTES konjugatı, oda sıcaklığında 4 °C'de bir hafta boyunca saklanabilir.
  2. Boya çözeltisine 1 μL (3-aminopropil)trietoksisilan (APTES) ekleyin.
  3. 0,5 μL trietilamin (TEA) ekleyin ve reaksiyonu kolaylaştırmak için hemen karıştırın.
  4. Reaksiyon karışımını 300 rpm'de 30 °C'de karanlıkta 24 saat karıştırın, böylece Cy5.5 ile APTES arasında kovalent bağlantı sağlanır.
  5. Şişeni kapağıyla kapatın ve ışığa karşı korumaya alüminyum folyo ile sarmaya devam edin.

2. Cy5.5 boyalı silika nanopartiküllerinin sentezi

  1. Yeni şeffaf cam dişli şişeye 1 μL konsantre amonyak çözeltisi (%28) ekleyin.
  2. 8,5 mL mutlak etanol (moleküler biyoloji derecesi) ekleyin.
  3. 350 μL tetraetil ortosilikat (TEOS) ekleyin.
  4. Silika sentezi reaksiyon karışımına hazırlanmış Cy5.5-APTES çözeltisinden 15 μL ekleyin.
  5. Reaksiyon karışımını 500 rpm'de oda sıcaklığında karanlıkta 24 saat karıştırın, böylece boyanın silika matrisine kovalent dahil edilmesini mümkün kılın.

3. Arındırma ve dağılım

  1. Tüm reaksiyon karışımını 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
  2. Santrifüj için eşit hacimde damıtılmış su içeren bir denge borusu hazırlayın.
  3. Her iki tüpü de 12.074 × g sıcaklığında 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Santrifüjleme sonrası tüpün tabanında görünür bir pelet oluştuğunu doğrulayın.
  4. Pelleti 10 mL %95 etanol ile 12.074 × g sıcaklığında 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yaparak yıkayın. Bu yıkamayı 3 kez tekrarlayın, peleti sonikasyonla yaklaşık 3–5 dakika boyunca tekrar saklayın veya tamamen dağılıyana kadar.
  5. Pelleti 5 mL damıtılmış su ile yıkayın ve 12.074 × g sıcaklığında 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Bu yıkamayı 2 kez tekrarlayın, peleti sonikasyonla yaklaşık 3–5 dakika boyunca tekrar askıya alın veya tamamen dağılıyana kadar.
  6. Pellet, tamamen dağınılana kadar sonikasyon yoluyla 5 mL damıtılmış suya askıya alın (dispersiyayı doğrulayan katı parçalar gözlemlenmedi). Parçacık süspansiyonunun tam dağıldıktan sonra gözle görülür şekilde mavi göründüğünü doğrulayın.
  7. Süspansiyonu cam şişeye aktarın, şişeni ışıktan korumak için alüminyum folyo ile sarın ve oda sıcaklığında saklayın.
  8. In vivo görüntüleme sistemi (IVIS) kullanarak parçacık dağılımı ve floresansı değerlendirin. Cy5.5 için 680 nm uyarılma dalga boyu ve 710 nm emisyon dalga boyu kullanın.

4. Cy5.5 boyalı silika nanopartikülleriyle ex vivo etiketleme ile endometriozis indüksiyonu

  1. 8 haftalık dişi donör fareye (suş: C57Bl6J X129Sv) subkutan olarak E2 (100 μL 1 μg/mL susam yağında) ile günde bir kez üç gün üst üste hormonal senkronizasyon için enjekte edin.
  2. Son E2 enjeksiyonundan 6 saat sonra servikal dislokasyon ile donör fareyi ötenazi yapın ve rahim alın.
  3. Rahim dokusunu bir Petri kabında yaklaşık 1 mm3 parçaya parçalayın ve birskalpel 30,36 ile alın.
  4. Rahim dokusu parçalarını (45 mg) %20 (v/v) Cy5.5 boya-doplanmış silika nanopartikülleriyle tam RPMI-1640 ortamı (%10 FBS) içeren 24 kuyu bir plakada 3 saat boyunca 37 °C'de, %5CO2 içinde inkübe edin.
  5. Alıcı fareyi (suş: C57Bl6J X129Sv) oksijende %3 izofluran ile anestezi edin ve 0,5 cm orta çizgi karın kesisi yapın.
    NOT: Anestezi sağlanana kadar fareyi %3 izofluran içeren bir indüksiyon odasına yerleştirin. Karın bölgesini tıraş edin ve fareyi cerrahi platforma aktarın. Ameliyata başlamadan önce anestezik burun konisini konumlandırın.
  6. Ex vivo etiketli rahim dokusu parçalarını oda sıcaklığında kültür ortamında 380 × g'de santrifüjle 2 dakika boyunca yıkayın. Yıkamayı 3 kez tekrarlayın.
  7. Anestezi altında, alıcı farelerde 1 cm orta hattı karın kesisi yapılsın. 45 mg Cy5.5 etiketli doku parçalarını 500 μL PBS içinde askıya alın ve süspansiyonu 20 gauge iğne ile periton boşluğuna enjekte edin.
  8. Peritonu emilebilir dikişle kapatın ve deriyi yara klipsleriyle kapatın. Faresi sıcak bir ortama yerleştirin ve anesteziden iyileşene kadar izleyin.
  9. Seçilmiş deneysel uç noktada servikal dislokasyon yoluyla fareyi ötenazi yapın ve endometriyotik lezyonları toplayın.

Sonuçlar

Boya ile doplanmış silika nanopartikülleri, hücre etiketleme uygulamaları için görüntüleme probları olarak kullanılabilir. Cy5.5 boya ile doplanmış silika nanopartikülleri (Cy5.5-SiNP'ler), silika sol-jel süreciyle iki adımda sentezlendi ve silan kimyası kullanılarak floresan siyanin boyası Cy5.5 ile işlevselleştirildi (Şekil 1). Geçirimli elektron mikroskopisi (TEM), 156,67 ± 15,23 nm çaplı uniform küresel nanopartiküller ortaya çıkardı (Şekil 1A). Dinamik ışık saçılması (DLS), sentezlenen nanopartiküllerin (SiNP'ler ve Cy5.5-SiNP'ler) kolloidal olarak stabil olduğunu, hidrodinamik çaplarının (Hd) sırasıyla 130,67 ± 3,20 nm (PDI = 0,152 ± 0,009) ve 185,9 ± 5,44 nm (PDI = 0,14 ± 0,009) olduğunu göstermiştir (Şekil 1B). Çıplak SiNP ve Cy5.5-SiNP'lerin zeta potansiyelleri sırasıyla −32.39 ± 3.55 mV ve −50.53 ± 2.47 mV idi (Şekil 1C). Fotolüminesans spektroskopisi (uyarılma dalga boyu = 680 nm; emisyon dalga boyu = 710 nm) Cy5.5'in silika nanopartiküllerine başarılı bir şekilde dahil edildiğini doğruladı ve Cy5.5-SiNP'ler karakteristik floresans sergiledi (Şekil 1D). Başarılı boya konjugasyonu fotolüminesans spektrumu ile daha da doğrulandı. Ayrıca, Cy5.5-SiNP'lerin kuantum verimi (QY) (φ = 0.31) serbest Cy5.5 boyasının verimiyle karşılaştırılabilirdi (φ = 0.23)36.

Nanopartikül biyouyumlulukunu değerlendirmek için, 12Z endometriyal epitel hücreleri, DMEM'de 37 °C'de %5 CO₂ altında Cy5.5-SiNP ile gece boyunca kuluçka edildi. Hücre canlılığı, 0, 0.5, 1, 2.5, 5 ve 10 μg/mL nanopartikül konsantrasyonlarıyla yapılan tedaviden sonra MTT testi kullanılarak değerlendirildi (Şekil 1E). 10 μg/mL'ye kadar olan konsantrasyonlarda sitotoksisite gözlemlenmedi. 5 μg/mL Cy5.5-SiNP ile kuluçka edilen hücreler, verimli nanoparçacık alımı gösterdi ve floresans mikroskopisi perinükleer bölgede parçacık lokalizasyonunu gösterdi (Şekil 1F). Buna karşılık, tedavi edilmeyen kontrol hücrelerinde Cy5.5 floresansı tespit edilmedi. Hazırlanan Cy5.5-SiNP'ler ayrıca sulu stabilite, deionize suda 170–190 nm arasında hidrodinamik çaplarla ve DLS ile floresans görüntüleme ile belirlenen kararlı floresans yoğunluğunu yedi gün boyunca sabit koruyarak sulu stabillik göstermiştir (Şekil 1G, H).

Cy5.5 boyalı silika nanopartiküllerinin ex vivo doku etiketlemesi için uygunluğunu belirlemek için, floresans özellikleri endometriozis indüksiyonundan önce doğrulandı. IVIS görüntüleme, nanopartikül süspansiyonlarından sağlam floresan emisyonu gösterdiken, sadece su içeren negatif kontrolde tespit edilebilir bir floresan sinyali gözlemlenmedi ve bu da Cy5.5 floresans algısının özgüllüğünü ve hassasiyetini doğruladı (Şekil 2).

Rahim dokusu parçalarının ex vivo etiketlenmesi için konsantrasyon ve kuluçka süresi daha sonra optimize edilmiştir. Floresans, %20 (v/v) Cy5.5 boyalı silika nanopartikülleriyle kuluçka edilen rahim dokusu parçalarında 3 saat boyunca 37 °C'de %5CO2 35 altında inkubasyon edilmiştir. IVIS görüntüleme, etiketlenmiş doku parçalarından güçlü ve tutarlı floresan sinyallerini doğruladı. Bu sonuçlar, Cy5.5 boyayla doplanmış silika nanopartiküllerinin rahim dokusu parçalarını genetik modifikasyon olmadan verimli şekilde etiketlediğini göstermektedir (Şekil 3).

Cy5.5 boyalı silika nanopartikül etiketli rahim dokusu parçalarının endometriozisi indükleme ve lezyon tanımını kolaylaştırma yeteneği daha sonradeğerlendirildi 35. Etiketlenmiş doku parçaları, alıcı farelerin periton boşluğuna enjekte edildi ve hastalık ilerlemesi bir ay boyunca izlendi. Deneysel son noktada, peritoneal boşluğu içinde endometriotik lezyonlar kolayca tespit edildi. Cy5.5-pozitif lezyonlar, IVIS görüntüleme ve floresan mikroskopisi ile çevredeki konak dokulardan net şekilde ayırt edildi, böylece hızlı ve net bir lezyon tespit edildi. Lezyonlar içindeki Cy5.5 floresansı floresan mikroskopisiyle daha da doğrulandı.

Bu sonuçlar, Cy5.5 boyalı silika nanopartikülleriyle ex vivo etiketlemenin endometriozisin başarılı indüksiyonunu desteklediğini ve endometriyotik lezyonların in vivo güvenilir görselleştirmesini mümkün kıldığını göstermektedir (Şekil 4).

figure-results-1
Şekil 1: Cy5.5 boyalı silika nanopartiküllerinin (Cy5.5-SiNP) fiziksel karakterizasyonu. (A) Cy5.5-SiNP'lerin temsil iletim elektron mikroskopisi (TEM) görüntüsü. Parçacık çapı = 156.67 ± 15.23 nm. Ölçek çubuğu = 100 nm. (B) SiNP'lerin (130,67 ± 3,20 nm, PDI = 0,152 ± 0,009) ve Cy5,5-SiNP'lerin (185,9 ± 5,44 nm, PDI = 0,14 ± 0,009) hidrodinamik çaplarının dinamik ışık saçılması (DLS) ölçümleri. (C) SiNP'lerin (−32,39 ± 3,55 mV) ve Cy5,5-SiNP'lerin (−50,53 ± 2,47 mV) zeta potansiyel ölçümleri; Cy5.5 konjugasyonu sonrası zeta potansiyelindeki azalmayı göstermektedir. (D) Cy5.5-SiNP'lerin floresans profili (uyarılma dalga boyu = 680 nm; emisyon dalga boyu = 710 nm). İç Detay: Suya dağılmış Cy5.5-SiNP'lerin parlak alan ve floresans görüntüleri. (E) 0, 0.5, 1, 2.5, 5 ve 10 μg/mL konsantrasyonlarda Cy5.5-SiNP ile işlenmiş 12Z hücrelerinin MTT hücre canlılık testi. (F) 12Z hücreleri tarafından Cy5.5-SiNP'lerin hücresel alımı. Hücreler PBS (kontrol) veya Cy5.5-SiNP ile tedavi edildi. Mavi = DAPI; kırmızı = Cy5.5-SiNP'ler. Ölçek çubuğu = 200 μm. (G) Suda 7 gün depolanan Cy5.5-SiNP'lerin boyut kararlılığı, hidrodinamik çapta önemli bir değişiklik göstermemektedir. (H) Suda 7 gün depolanan Cy5.5-SiNP'lerin floresans stabilitesi, floresans yoğunluğunda önemli bir değişiklik göstermemiştir. Giriş: 1, 3 ve 6. günlerde alınan temsil floresan görüntüleri. NS = anlamlı değil. Değerler ortalama SD ± olarak sunulmaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Cy5.5 boya-doplanmış silika nanopartiküllerinin doğrulanması. (A) Cy5.5 boya-doplanmış silika nanopartiküllerinin temsil görüntüsü. (B) IVIS görüntüleme kullanılarak Cy5.5 boya ile doplanmış silika nanopartiküllerinden Cy5.5 floresansının tespiti. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Cy5.5 boyalı silika nanopartikülleriyle rahim dokusu parçalarının ex vivo etiketlenmesi. Sol panelde tedavi edilmemiş kontrol rahim dokusu parçaları, sağ panelde ise Cy5.5 boya ile doplanmış silika nanopartikülleriyle etiketlenmiş rahim dokusu parçaları yer alır. IVIS görüntüleme ile Cy5.5 floresansı tespit edildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Cy5.5 boyalı silika nanopartikülleriyle etiketlenmiş endometriotik lezyonların tespiti. (A) Periton boşluğunun IVIS görüntüsü. (B) Cy5.5 işaretli endometriyotik lezyonların floresans mikroskopisi, peritoneal boşluğu içinde net bir tanımlama sağlar. (C) Endometriotik lezyonların temsil floresan mikroskopik görüntüleri. Sarı floresans Cy5.5 sinyalini gösterir ve çekirdekler DAPI ile karşı boyanmıştır. (D) Endometriyotik bir lezyonun temsil görüntüsü. Ok, Cy5.5 boya ile doplanmış silika nanopartiküllerini gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Mevcut çalışma, fare modellerinde endometriotik lezyonların görselleştirilmesi için pratik ve etkili bir yöntem olarak Cy5.5 boya-doplanmış silika nanopartikül tabanlı bir yaklaşımsunmaktadır 35. Bu strateji, basitliği, esnekliği ve genetik olmayan doğası gibi birçok avantaj sunar; böylece transjenik muhabir hayvanlar üretme ihtiyacını ortadan kaldırır. Floresan raporlayıcı fare modelleri gibi geleneksel görselleştirme yaklaşımlarıyla karşılaştırıldığında, bu yöntem teknik karmaşıklığı azaltırken sağlam etiketleme verimliliğini korur ve böylece endometriozis araştırmalarına erişimini genişletir. Ayrıca, silika nanopartikülleri, floresan boyaların dahil edilmesi ve doku içinde verimli tutulması için kararlı bir platform sağlar; böylece tekrarlanabilir lezyon tanımlamasını destekler.

Endometriotik lezyonların çevredeki konak dokusundan ayırt edilmesi, fare modellerinde hastalığın başlangıcı ve ilerlemesini incelemek için çok önemlidir. Rosa26mTmG muhabir fareleri, belirli hedef dokularda cre-aracılı eksizyon sonucunda membran hedefli tandem dimer Domates floresan proteini (mT) her yerde ifade edilir; bu protein, belirli hedef dokularda cre-aracılı eksizyon sonucunda membran hedefli yeşil floresan proteine (mG) dönüştürülür. Endometriozisde gen fonksiyonunu araştırmak için çok sayıda transgenik fare modeli mevcut olmasına rağmen, floresan raporlayıcı hayvanlar üretmek emek yoğun ve zaman alıcıdır. Buna karşılık, Cy5.5 boyalı silika nanopartikülleriyle ex vivo etiketleme, lezyon görselleştirmesi için hızlı, esnek ve genetik olmayan bir alternatif sunarken, mevcut fare modellerinin geniş bir yelpazesiyle uyumlu kalır.

Bu protokolün başarılı uygulanması, birkaç kritik deneysel parametrenin dikkatli kontrolüne bağlıdır. Nanoparçacık sentezi sırasında, katalizör konsantrasyonu, çözücü bileşimi, TEOS ekleme hızı, karıştırma koşulları ve yıkama verimliliği parçacık boyutunu, floresan yoğunluğunu ve etiketleme tekrarlanabilirliğini doğrudan etkiler. Stöber yöntemi, partikül boyutu ve kararlı boya dahil edilmesi üzerinde hassas kontrol ile floresan silika nanopartiküllerinin sentezlenmesi için basit, ölçeklenebilir ve tekrarlanabilirbir yaklaşım sunar (38,39,40,41). Ters mikroemülsiyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, Stöber yaklaşımı, yüzey aktif maddeyle ilişkili arıtma zorluklarını en aza indirir ve Cy5.5 floresansını hafif reaksiyon koşullarındakorur 39,40,41,42. Katalizör konsantrasyonunun artırılması genellikle parçacıkboyutunu 40 artırırken, daha hızlı TEOS ekleme hızı çekirdekleşmeyi teşvik eder ve daha küçükparçacıklar elde eder 41. Tepki vermemiş reaktifleri çıkarmak ve depolama sırasında nanopartikül kararlılığını artırmak için kapsamlı yıkama gereklidir.

Tekrarlanabilir ex vivo doku etiketleme ve lezyon oluşturulması için birkaç ek faktör önemlidir. Rahim dokusu parçalarının uniform boyutu, homojen nanopartikül dispersyonu ve tutarlı kuluçka koşulları, etiketleme verimliliğini artırır ve deneysel değişkenliği azaltır. Etiketlenmemiş kontrol dokularının paralel işlemesi, gerçek Cy5.5 floresansını doku otofloresansı ve spesifik olmayan arka plan sinyallerinden ayırt etmek için de gereklidir. Lezyon indüksiyonunda, donör farelerin sürekli hormonal primingi, etiketli doku parçalarının nazikçe implantasyonu ve uygun ameliyat sonrası bakım, doku travmasını ve spesifik olmayan iltihabı en aza indirerek lezyon oluşumunun tekrarlanabilirliğini artırır.

Bu avantajlara rağmen, birkaç sınırlama göz önünde bulundurulmalıdır. Floresan sinyalinin in vivo kalıcılığı ve stabilitesi, doku yeniden modellenmesi, hücresel proliferasyon ve bağışıklık aracılı klirens nedeniyle implantasyondan sonra değişebilir. Dışsal floresan etiket olarak, Cy5.5 sinyalinin işaretlenmiş hücreler bölündükçe kademeli olarak azalması beklenmektedir; bu da uzun vadeli uzun vadeli çalışmaların uygulanabilirliğini sınırlayabilir. Ayrıca, doku hazırlığı ve nanoparçacık alımındaki değişkenlik, deneyler arasında etiketleme verimliliğini etkileyebilir ve bu da standartlaştırılmış deneysel prosedürlerin önemini vurgular.

Mevcut çalışma ex vivo lezyon tespitine odaklansa da, Cy5.5 doku otofloresansını en aza indiren ve fotonların daha derin nüfuz etmesini sağlayan uzak kırmızı/yakın kızılötesi (NIR) bir floresan boyadır. Bu optik özellikler, Cy5.5'i in vivo görüntüleme uygulamaları için oldukça uygun kılar. Buna göre, yüksek kuantum verimli Cy5.5 boya ile doplanmış silika nanopartikül etiketleme stratejisi, NIR floresansı ve fotoakustik görüntüleme43,44 kullanarak invaziv olmayan uzunlamasına lezyon takibi için sağlam bir platform sağlar.

Gelecekteki çalışmalar, floresans dayanıklılığını artırmaya ve deneysel koşullarda etiketleme tutarlılığını daha da optimize etmeye odaklanmalıdır. Sinyal tutulmasının sistematik olarak değerlendirilmesi, uzunlamasına çalışmalar için optimal görüntüleme penceresini tanımlamaya yardımcı olurken, nanopartikül tasarımı ve etiketleme koşullarının sürekli geliştirilmesi hassasiyeti artırabilir ve bu yaklaşımın diğer hastalık modellerine uygulanabilirliğini genişletebilir. Genel olarak, bu nanopartikül tabanlı strateji, endometriyotik lezyonları görselleştirmek için genetik etiketleme yaklaşımlarına hızlı, tekrarlanabilir ve çok yönlü bir alternatif sunar ve mekanik çalışmaları ile tanı ile tedavi stratejilerinin preklinik değerlendirmesini kolaylaştırmalıdır.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü (NIICHD) (T.K. ve J.W.J.'ye R01HD108895) tarafından desteklendi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
(3-Aminopropil)trietoksisilan (APTES)Sigma-Aldrich440140Saflığı ≥99%
17β-EstradiolMilliporeSigmaE8875Saflığı ≥98%
Amonyum hidroksitFisher ScientificA669S-500%28 amonyum hidroksit çözeltisi
BD Autoclip Yara Kapama SistemiBD427631Cerrahi yara klipsleri
Açık cam vidalı şırıngaFisherbrandFS60910A-311.1 mL açık cam şırınga
Siyani 5.5 NHS esterSigma-AldrichGEPA15502Yakın kızılötesi floresan boya
Etanol, mutlakFisher ScientificBP2818Moleküler biyoloji sınıfı
Fetal boğa serumu (FBS)Gibco16000044Hücre kültürü takviyesi
Yüksek hızlı santrifüjBeckman Coulter Life SciencesAvanti J-EYüksek hızlı santrifüj
In vivo görüntüleme sistemiPerkinElmerIVIS SpectrumFloresan görüntüleme sistemi
İzofluranBaxterNDC1001-9-360-60İnhalasyon anestezisi
Manyetik karıştırma çubuğuFisherbrand14-513-648 mm
Manyetik karıştırma plakasıChelmsfordSP88854200Değişken hızlı manyetik karıştırıcı
Soğutmalı santrifüjEppendorf5427 RFA-45-48-11 rotoru ile donatılmış
RPMI-1640 ortamıGibco11835-030Hücre kültürü ortamı
Susam yağıMilliporeSigmaS3547Estradiol preparasyonu için taşıyıcı
Tetraetil ortosilikat (TEOS)Sigma-Aldrich86578Saflığı ≥99%
Trietilamina (TEA)Sigma-AldrichT0886Saflığı ≥99%
Ultrasonik banyoFisherbrandCPX1800HNanopartikül dispersiyonu için sonikasyon

Kaynaklar

  1. Marquardt RM, Kim TH, Shin JH, Jeong JW. Progesterone and estrogen signaling in the endometrium: What goes wrong in endometriosis? Int J Mol Sci. 2019;20(15).
  2. Yilmaz BD, Bulun SE. Endometriosis and nuclear receptors. Hum Reprod Update. 2019;25(4):473–485.
  3. Kanzaki H, Wang HS, Kariya M, Mori T. Suppression of natural killer cell activity by sera from patients with endometriosis. Am J Obstet Gynecol. 1992;167(1):257–261.
  4. Oosterlynck DJ, Meuleman C, Waer M, Vandeputte M, et al. The natural killer activity of peritoneal fluid lymphocytes is decreased in women with endometriosis. Fertil Steril. 1992;58(2):290–295.
  5. Tanaka E, Sendo F, Kawagoe S, Hiroi M. Decreased natural killer cell activity in women with endometriosis. Gynecol Obstet Invest. 1992;34(1):27–30.
  6. Vigano P, Vercellini P, Di Blasio AM, Colombo A, et al. Deficient antiendometrium lymphocyte-mediated cytotoxicity in patients with endometriosis. Fertil Steril. 1991;56(5):894–899.
  7. Bulun SE. Endometriosis. N Engl J Med. 2009;360(3):268–279.
  8. Eskenazi B, Warner ML. Epidemiology of endometriosis. Obstet Gynecol Clin North Am. 1997;24(2):235–258.
  9. Johnson NP, Hummelshoj L, World Endometriosis Society Montpellier Consortium. Consensus on current management of endometriosis. Hum Reprod. 2013;28(6):1552–1568.
  10. Kim JJ, Kurita T, Bulun SE. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocr Rev. 2013;34(1):130–162.
  11. Burney RO, Giudice LC. Pathogenesis and pathophysiology of endometriosis. Fertil Steril. 2012;98(3):511–519.
  12. Fadhlaoui A, Bouquet de la Joliniere J, Feki A. Endometriosis and infertility: How and when to treat? Front Surg. 2014;1:24.
  13. D'Hooghe TM, Debrock S, Hill JA, Meuleman C. Endometriosis and subfertility: Is the relationship resolved? Semin Reprod Med. 2003;21(2):243–254.
  14. Simoens S, Hummelshoj L, D'Hooghe T. Endometriosis: Cost estimates and methodological perspective. Hum Reprod Update. 2007;13(4):395–404.
  15. Gao X, Outley J, Botteman M, Spalding J, et al. Economic burden of endometriosis. Fertil Steril. 2006;86(6):1561–1572.
  16. Brown J, Farquhar C. An overview of treatments for endometriosis. JAMA. 2015;313(3):296–297.
  17. Martin DC, Hubert GD, Vander Zwaag R, el-Zeky FA. Laparoscopic appearances of peritoneal endometriosis. Fertil Steril. 1989;51(1):63–67.
  18. Quesada J, Harma K, Reid S, Rao T, et al. Endometriosis: A multimodal imaging review. Eur J Radiol. 2023;158:110610.
  19. Culley L, Law C, Hudson N, Denny E, et al. The social and psychological impact of endometriosis on women's lives: A critical narrative review. Hum Reprod Update. 2013;19(6):625–639.
  20. Nnoaham KE, Hummelshoj L, Webster P, et al. Reprint of: Impact of endometriosis on quality of life and work productivity: A multicenter study across ten countries. Fertil Steril. 2019;112(4 Suppl 1):e137–e152.
  21. Herington JL, Bruner-Tran KL, Lucas JA, Osteen KG. Immune interactions in endometriosis. Expert Rev Clin Immunol. 2011;7(5):611–626.
  22. Malvezzi H, Marengo EB, Podgaec S, Piccinato CA. Endometriosis: Current challenges in modeling a multifactorial disease of unknown etiology. J Transl Med. 2020;18(1):311.
  23. Esfandiari F, Mansouri N, Shahhoseini M, Heidari Khoei H, et al. Endometriosis organoids: Prospects and challenges. Reprod Biomed Online. 2022;45(1):5–9.
  24. Lin YJ, Lai MD, Lei HY, Wing LY. Neutrophils and macrophages promote angiogenesis in the early stage of endometriosis in a mouse model. Endocrinology. 2006;147(3):1278–1286.
  25. Fang Z, Yang S, Lydon JP, DeMayo F, et al. Intact progesterone receptors are essential to counteract the proliferative effect of estradiol in a genetically engineered mouse model of endometriosis. Fertil Steril. 2004;82(3):673–678.
  26. Fang Z, Yang S, Gurates B, Tamura M, et al. Genetic or enzymatic disruption of aromatase inhibits the growth of ectopic uterine tissue. J Clin Endocrinol Metab. 2002;87(7):3460–3466.
  27. Foster WG, Ruka MP, Gareau P, Foster RA, et al. Morphologic characteristics of endometriosis in the mouse model: Application to toxicology. Can J Physiol Pharmacol. 1997;75(10–11):1188–1196.
  28. Cummings AM, Metcalf JL, Birnbaum L. Promotion of endometriosis by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in rats and mice: Time-dose dependence and species comparison. Toxicol Appl Pharmacol. 1996;138(1):131–139.
  29. Yoo JY, Kim TH, Shin JH, Marquardt RM, et al. Loss of MIG-6 results in endometrial progesterone resistance via ERBB2. Nat Commun. 2022;13(1):1101.
  30. Ow H, Larson DR, Srivastava M, Baird BA, et al. Bright and stable core-shell fluorescent silica nanoparticles. Nano Lett. 2005;5(1):113–117.
  31. Chung SJ, Hadrick K, Nafiujjaman M, Apu EH, et al. Targeted biodegradable near-infrared fluorescent nanoparticles for colorectal cancer imaging. ACS Appl Bio Mater. 2024;7(12):7861–7870.
  32. Pittet MJ, Swirski FK, Reynolds F, Josephson L, et al. Labeling of immune cells for in vivo imaging using magnetofluorescent nanoparticles. Nat Protoc. 2006;1(1):73–79.
  33. Nguyen TT, Nguyen HN, Nghiem THL, Do XH, et al. High biocompatible FITC-conjugated silica nanoparticles for cell labeling in both in vitro and in vivo models. Sci Rep. 2024;14(1):6969.
  34. Marquardt RM, Nafiujjaman M, Kim TH, Chung SJ, et al. A mouse model of endometriosis with nanoparticle labeling for in vivo photoacoustic imaging. Reprod Sci. 2022;29(10):2947–2959.
  35. Kim TH, Bae N, Kim T, Hsu AL, et al. Leptin stimulates endometriosis development in mouse models. Biomedicines. 2022;10(9).
  36. Bouteiller C, Clave G, Bernardin A, Chipon B, et al. Novel water-soluble near-infrared cyanine dyes: Synthesis, spectral properties, and use in the preparation of internally quenched fluorescent probes. Bioconjug Chem. 2007;18(4):1303–1317.
  37. Muzumdar MD, Tasic B, Miyamichi K, Li L, et al. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 2007;45(9):593–605.
  38. Stӧber W, Fink A, Bohn E. Controlled growth of monodisperse silica spheres in the micron size range. J Colloid Interface Sci. 1968;26(1):62–69.
  39. Thorat AV, Ghoshal T, Chen L, Holmes JD, et al. Synthesis and stability of IR-820 and FITC-doped silica nanoparticles. J Colloid Interface Sci. 2017;490:294–302.
  40. Silva AS, Santos JHZ. Silica particle size and polydispersity control from fundamental practical aspects of the Stöber method. Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 2024;702:135190.
  41. Saha A, et al. Greening the pathways: A comprehensive review of sustainable synthesis strategies for silica nanoparticles and their diverse applications. RSC Adv. 2024;14(16):11197-11216.
  42. Lian Y, Ding LJ, Zhang W, Zhang XA, et al. Synthesis of highly stable cyanine-dye-doped silica nanoparticles for biological applications. Methods Appl Fluoresc. 2018;6(3):034002.
  43. Kumar PPP, Chung SJ, Hadrick K, Hill ML, et al. Noninvasive detection and thermal ablation therapy of endometriosis using silica-coated gold nanorods. Adv Nanobiomed Res. 2025;5(12):2500101.
  44. Rahman MS, et al. Nanoceria as a non-steroidal anti-inflammatory drug for endometriosis theranostics. J Control Release. 2025;378:1015-1029.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

TıpSayı 234Sayı 234Boş DeğerSayıFITC Boya Katkılı Silika Nanopartikül

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.