Memeli Hücrelerinde Floresan Peptidil Engelleyici Hedeflemenin Mitokondriyal ClpXP'nin Flüoresans Mikroskopisiyle Gösterilmesi

Özet

Bu protokol, floresan peptidil ClpP inhibitörü FAM-FAPAL-CMK (Karboksifluorescein-FAPAL-kloromethil keton) mitokondrilere seçici lokalizasyonunu izlemek için konfokal mikroskopi uygulanmasını içeren nicel görüntüleme iş akışını ve ClpP inhibisyonu nedeniyle mitokondride oluşan morfolojik değişiklikleri izlemeyi içerir.

Özet

Mitokondriyal ATP'ye bağımlı proteazlar, hasar görmüş veya yanlış katlanmış proteinlerin bozulması yoluyla protein homeostazını korumak için gereklidir. Bunlar arasında, ClpXP proteaz kompleksi mitokondriyal matrikste bulunur ve fizyolojik ve stres koşullarında mitokondriyal kalite kontrolüne katkıda bulunur. Bu çalışma, floresan peptidil inhibitörü FAM-FAPAL-CMK'nin mitokondriyal hedeflenmesini değerlendirmek ve memeli hücrelerinde ClpXP inhibitörüyle ilişkili mitokondriyal morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için nicel bir floresan mikroskopi iş akışını göstermektedir. HeLa hücreleri FAM-FAPAL-CMK ile işlendi ve mitokondriyal belirteçlerin immünoflüoresans boyaması ile ve nicel görüntü analiziyle konfokal mikroskopi kullanılarak analiz edildi. Costes eşik sınırları ve Manders'in örtüşme katsayıları kullanılarak yapılan kolokalizasyon analizi, inhibitör sinyalinin mitokondriyal zenginleşmesini göstermiştir. Sonuç olarak, ClpP'nin inhibisyonu mitokondriyal morfolojiyi değiştirdi. İmmünoblot analizi, inhibitör tedavisinde ClpP protein bolluğunda anlamlı bir değişiklik göstermemiştir. Bir arada, bu çalışma tekrarlanabilir görüntüleme tabanlı bir iş akışını tanımlıyor; bu çalışma homeostazın bozuk etkilerine yanıt olarak sağlam hücrelerde mitokondriyal ClpXP fonksiyonlarının sorgulanmasını sağlayacak ve oksidatif stres gibi bir çözüm sunuyor.

Giriş

Mitokondriyal ATP'ye bağımlı proteazlar, protein homeostazında merkezi rol oynar ve yanlış katlanmış veya hasar görmüş^proteinleri 1,2,3,4,5,6 parçalar. Bunlar arasında, ClpXP, mitokondriyal matriksde bulunan hetero-oligomerik AAA+ proteaz kompleksidir. ClpX ATPaz, proteinleri tanır ve açar, ardından onları ClpP proteolitik^odası 7,8,9'a aktarır. Diğer mitokondriyal proteazlarla birlikte, ClpXP hem normal hem de stres koşullarında, oksidatif stres ve metabolik bozulmalar dahil olmak üzere protein kalite ^{kontrolünü sürdürür 1,2,4}. Mitokondriyal protein homeostazının bozulması, nörodejenerasyon ve kanser gibi hastalıklarla ilişkilendirilmiştir; bu da sağlam hücresel sistemlerde bu proteaz aktivitelerinin anlaşılmasının önemini^{vurgulamaktadır 3,6,10}.

Alandaki büyük zorluklardan biri, sağlam hücrelerde mekânsal çözünürlükle mitokondriyal proteaz aktivitesini doğrudan izlemek için yöntemlerin eksikliğidir. Mevcut yaklaşımlar esas olarak ayrıntılı kinetik bilgi sağlayan ancak alt hücresel bağlamı korumayan saflaştırılmış proteinler veya hücre lizatları kullanılarak yapılan biyokimyasal^{testlere dayanır.} 11,12,13,14. Kimyasal biyoloji stratejileri, florojenik peptid substratları ve aktif bölgeye yönlendirilmiş inhibitörler geliştirerek bu sınırlamayı kısmen ele almıştır. Floresan peptidil substratlar, ATP'ye bağlı peptidaz aktivitesinin nicel ölçümünü sağlarken, peptidil inhibitörler proteolitik bölgeyle geri dönebilir kovalent etkileşimler oluşturur ve seçici inhibisyon 13,15,16,17,18,19 elde eder. Daha önce, laboratuvarda sentezlenen ClpXP inhibitörü FAPAL-CMK'nin ClpP²⁰ ile kovalent bir bağ oluşturduğu gösterilmiştir. Bu çalışmada, FAPAL-CMK'nin floressein etiketli bir türevi olan FAM-FAPAL-CMK, ClpP'nin mekanizma tabanlı bir inhibitörü olarak geliştirildi ve bu da hücre içi lokalizasyonunun görselleştirilmesini mümkün kılmıştır.

Biyokimyasal testlerle karşılaştırıldığında, konfokal floresan mikroskopisi, sağlam hücrelerde prob dağılımı ve mitokondriyal morfolojinin mekansal olarak çözülmesini sağlar ve yalnızca lizatlardan elde edilemeyecek bilgiler sağlar. Ancak, enzimatik testlerin aksine, floresans lokalizasyonu doğrudan katalitik aktiviteyi veya moleküler bağlanma olaylarını ölçmez ve prob alım verimliliği, mitokondriyal dinamikler ve görüntüleme koşulları tarafından etkilenebilir. Ayrıca, başarılı uygulama yeterli prob birikimine ve yeterince çözülmüş mitokondriyal ağlara bağlıdır; bu da bu iş akışını, mitokondriyal morfolojisi açıkça ayırt edilebilir yapışkan kültürlü hücreler için en uygun yapar.

Bu çalışmanın amacı, mekanizmaya dayalı floresan probları konfokal mikroskopi ile entegre eden niceliksel bir iş akışı oluşturarak mitokondriyal proteaz lokalizasyonunu ve sağlam hücrelerdeki işlevlerini izlemektir. Seçici kimyasal probları yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme ile birleştirerek, bu iş akışı mitokondriyal lokalizasyonun, prob dağılımı ve mitokondriyal homeostazın bozulmalarına karşı morfolojik yanıtların sağlam hücrelerde değerlendirilmesini sağlar. Proteaz aktivitesini doğrudan ölçen ancak mekansal çözünürlüğü olmayan mevcut biyokimyasal testleri tamamlayabilir.

Protokol

Deneyler, ticari olarak mevcut HeLa hücreleri kullanılarak gerçekleştirildi. İnsan katılımcılar, omurgalı hayvanlar veya birincil insan veya omurgalı kaynaklı biyolojik materyaller kullanılmadı. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Hücre kültürü ve tedavisi

1. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) HeLa hücreleri, %5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37 °C'de %10 fetal sığır serumu (FBS)_{ile takviye} edilmiş.
2. Hücreleri steril cam kapak kapaklarına örtüler ve hücre tutması için 24 saat kuluçka yapın.
3. FAM-FAPAL-CMK inhibitörü DMSO'da çözülerek 50 μM'lik bir stok hazırlanır ve -20 °C'de dondurularak depolama yapılır.
4. İşlenmiş hücre örneklerindeki hücre büyüme ortamına 50 nM FAM-FAPAL-CMK ekleyin.
5. Kontrol örneklerine eşit miktarda DMSO ekleyin, böylece inhibitörle işlenmiş örneklerin nihai çözücü konsantrasyonuna uydurun, böylece herhangi bir etkinin DMSO'dan kaynaklanmamasını sağlar.
6. Hücreleri aynı kültür koşullarında ek 18 saat kuluçka edin, sonra sonraki işleme yapılacak.
   Not: FAM-FAPAL-CMK inhibitörü laboratuvarda tasarlanmış ve sentezlenmiştir; sentez yöntemi daha^{önce 20} yılında bildirilmiştir.

2. Sabitleme ve permeabilizasyon

1. Hücreleri önceden ısıtılmış D-PBS ile 5 dakika yıkayın ve bir kez tekrarlayın.
2. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PHEM tamponu (68 mM PIPES, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA, 3 mM MgCl₂, pH 6.9) kullanarak sabitleyin; bu tampon %2,4 (v/v) formaldehit, %0,05 (v/v) glutaraldehit ve %0,5 (w/v) saponin içerir.
3. Taze sodyum borohidrit çözeltisi (5 mg/mL D-PBS içinde) hazırlayın.
4. Hücreleri sodyum borohidrid çözeltisinde oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka altına alın ve kalıntı glutaraldehit nötralize edilir.
5. Hücreleri boyamadan önce D-PBS ile üç kez 5 dakika boyunca durulayın.
   NOT: Formaldehit ve glutaraldehit toksik fiksatörlerdir. Kapüşonla fiksasyon adımlarını yapın ve uygun kişisel koruyucu ekipman (eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruması) giyin. Sodyum borohidrit, reaktif bir indirgençtir ve dikkatli ele alınmalıdır. Formaldehit, glutaraldehit ve saponin içeren PHEM tabanlı fiksasyon tamponu, mitokondriyal morfolojiyi korumak ve immün boyama sırasında antijen erişimini korumak için seçildi. Formaldehit ve glutaraldehit, yapısal koruma için protein çapraz bağlaması sağlarken, PHEM'in tamponlama bileşimi ve pH mitokondriyal^{ultrayapıyı stabilize etmeye yardımcı olur 21}. Saponin, membran geçirimliliğini kolaylaştırarak fiksatif penetrasyon hızını artırır. Bu fiksasyon stratejisi, mitokondriyal ağların bozulmasını en aza indirir ve özellikle mitokondriyal morfolojinin nicel analizi için uygundur.

3. İmmünofluoresans boyama

1. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca blok hücreleri, %3 (w/v) sığır serum albümini (BSA) içeren PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na_{2HPO 4}, 1,8 mM KH_{2 PO 4}, pH 7,4) içeren blok tampon içinde%0,1 (v/v) Triton X-100 ile sağlanır.
2. Hücreleri, oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloklayıcı tamponda seyreltilmiş birincil antikorlarla inkübe edin. Fare anti-TOMM20 (1:500) ve tavşan anti-ClpP (1:500) kullanın.
3. Hücreleri PBS ile üç kez 5 dakika boyunca yıkayıp bağlanmış birincil antikorları çıkarın.
4. Hücreleri, oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloklayıcı tamponda seyreltilmiş ikincil antikorlarla kuluçka yapın. CF405S ile konjuge fare ikincil antikoru (1:500) ve Alexa Fluor 647 ile konjuge tavşan ikincil antikoru (1:500) kullanın.
5. İkincil antikor kuluçka sırasında ve sonrasında örnekleri ışıktan koruyun.
6. 3.3. adımı tekrarlayın.
7. Kaplama kaymalarını cam sürgülere montaj ortamı kullanarak monte edin.
   NOT: ClpP ve TOMM20, FAM sinyalleriyle spektral örtüşmeyi önlemek için 405 nm ve 647 nm altında görselleştirildi.

4. Görüntü Edinimi

1. Yüksek sayısal açıklıklı yağ daldırma hedefiyle donatılmış konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntü alın.
2. 405 nm ve 633 nm lazer çizgileriyle floroforları uyarın. Uyarıcı ışığı yansıtmak ve yayılan floresansı dedektörlere iletmek için uygun dikroik ışın ayırıcıları kullanın.
3. Mitokondriyal yapıların yeterli eksenel örneklemesini sağlamak için piksel boyutunu 35,3 nm (X, Y) ve Z-adımını 0,1 μm olarak ayarlayın.
4. 1900 x 1900 piksel (X, Y) çerçeve boyutuna sahip görüntüler elde edin ve üst mitokondriyal sinyalden başlayıp mitokondriyal sinyalin altına kadar her Z-yığını başına 5 optik bölüm toplayarak baskın mitokondriyal sinyalin toplanmasını sağlar.
   NOT: Temsilci mikroskop alım ayarları Ek Şekil 1'de sağlanmıştır. HeLa hücrelerinde mitokondriler genellikle ince tübü şeklinde yapılardır, yaklaşık 0,5-1 μm^{çapı 22}. Yani 0,5 μm Z-hacmi bireysel mitokondriyal matriksin önemli bir kısmını yakalamak için yeterlidir, ancak mutlaka tüm hücreyi yakalamak zorunda değildir. Hücre görüntüleme sırasında hareketle ilgili artefaktları en aza indirmek için mitokondriyal yapıların yeterli örneklemesini hızlı görüntü alımıyla dengelemek için 5 bölümlü bir Z-yığını seçildi.

5. Canlı hücre tedavisi ve görüntüleme

1. HeLa hücreleri, %10 FBS ile 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka içinde, %5_CO2 ile DMEM'de 35 mm cam tabanlı tabaklarda kültürlendirin.
2. Tohumlamadan 24 saat sonra hücrelere inhibitör (son konsantrasyon: 50 nM) veya eşdeğer bir hacimde DMSO ekleyin. Hücreleri standart kültür koşullarında ek 18 saat kuluçka edin.
3. İnhibörü veya DMSO'yu içeren kültür ortamını çıkarın ve hücreleri önceden ısıtılmış D-PBS ile 5 dakika boyunca bir kez durulayın.
4. 20 nM MitoTracker DeepRed içeren canlı hücre görüntüleme çözümü ekleyin.
5. Yukarıda tanımlanan aynı mikroskop ayarlarıyla oda sıcaklığında canlı hücre görüntüleme yapılmalıdır. Yaklaşık 4.72 saniye (5 bölümlü Z-yığını başına toplamda yaklaşık 24 saniye) kare başına tarama modunda görüntü alın.
   NOT: Her Z-yığını başına beş optik bölüm, mitokondriyal yapıların yeterli örneklemesini yönetilebilir alım süreleriyle dengelemek için ayarlanmıştır. Ayrıca, 37 °C'deki görüntülemeye kıyasla mitokondriyal hareketliliği azaltmak için oda sıcaklığında canlı hücre görüntüleme çözümü kullanılır. Canlı hücre görüntüleme sırasında mitokondriyal hareket kolokalizasyon ölçümlerinde değişkenliğe katkıda bulunabilse de, tüm örneklerde tutarlı edinim ayarları sistematik yanlılığı azaltmaya yardımcı olur. Temsilci yazılım ayarları Ek Şekil 2'de gösterilmiştir.

6. Mitokondriyal morfoloji analizi

1. Fiji^23'te görüntü dosyalarını açın ve Z-yığınlarından maksimum yoğunluk projeksiyonları oluşturun; Görüntü → Yığınları → Z projesini seçip Maksimum Yoğunluk'u seçin.
2. Otsu eşik yöntemini uygulayın; Image → Adjust → Threshold seçeneklerinden Otsu'yu seçin. Eşik noktasını segment mitokondrilerine uygulayın.
3. Mitochondria Analyzer^{eklentisi 24'ü} çalıştırın ve her bir ölçü bazında 2D analiz modunu seçin.
4. Mitokondri Analizörü çıktısını kullanarak mitokondri büyüklüğü (alanı) ve çevresini ölçün.
5. Mitokondriyal form faktörü değerlerini doğrudan Mitokondri Analizörü çıktısından alın; burada form faktörü P²/(4πA) olarak hesaplanır, P çevresini, A ise alanı temsil eder.
6. Mitokondriyal bağlantıyı değerlendirmek için eklenti içindeki ağ analiz fonksiyonunu kullanarak mitokondri başına toplam dal uzunluğunu ölçün.
7. Verileri, her durumda 30 hücreden elde edilen ortalama değerlerle birlikte, üç bağımsız biyolojik kopya için bireysel mitokondriyal ölçümlerin dağılımları olarak sunun.
8. Welch'in t-testini kullanarak istatistiksel anlamlılığı bir istatistiksel analiz yazılımında değerlendirin.

7. Kolokalizasyon analizi

1. Fiji'de görüntü dosyalarını açın ve 3D görüntü yığınlarından maksimum yoğunluklu 2B projeksiyonlar oluşturun. Tutarlılık için, tüm örnekleri aynı projeksiyon ve satın alma stratejisiyle analiz edin.
2. Görüntü → Renk → Bölünmüş Kanallar seçerek floresans kanallarını bölebilirsiniz.
3. Coloc 2 eklentisini Plugins → Colocalization → Coloc 2'yi seçerek başlatın.
4. Analiz için uygun kanalları atayın ve eklenti ayarlarında Costes eşik regresyonunu etkinleştirin. Analizi hücre bazında yap.
5. Manders'ın örtüşme katsayılarını (M1 ve M2) kaydederek her kanalda diğeriyle mekânsal olarak örtüşen sinyal oranını değerlendirin.
6. Coloc 2 ayarlarında Costes rastgeleleştirmesini etkinleştirin ve istatistiksel anlamlılığı değerlendirmek için randomizasyon sayısını 50'ye ayarlayın.

8. Hücre lizatı üretimi

1. HeLa hücrelerini %10 FBS ile DMEM'de tohumlayın ve %5_CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka atarında 37 °C'de kuluçka yapın.
2. Tohumlamadan 24 saat sonra hücrelere 50 nM inhibitörü veya eşdeğer hacimli DMSO eklenir ve standart kültür koşullarında ek 18 saat kuluçka yapılır.
3. Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri önceden ısıtılmış D-PBS ile 5 dakika durulayın, sonra ayrılmak için tripsinize edin.
4. Oda sıcaklığında 300 x g ve 300 x g sıcaklıkta taze hücre büyüme ortamı ile soğutma ve santrifüj ile soğutma yapın. Üst yüzeyi at.
5. Hücre pelletini D-PBS'ye yeniden süslü olarak yerleştirin ve hücreleri yıkamak için 300 x g sıcaklığında 3 dakika santrifüj yapın. Üst yüzeyi at.
6. Hücre pelletini önceden soğutulmuş lizis tamponunda (50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM sodyum klorür, %0.1 SDS, %0.5 sodyum deoksikolat, %2 CHAPS, 10 mM TCEP, 1 mM PMSF, 1x proteaz inhibitör kokteyli) yeniden askıya alın.
7. Lizatları buzda 20 dakika kuluçka için, lizatları ise buzlu su banyosunda 2 dakika kuluçka edin, böylece tam lizisi garanti edin.
8. Santrifüj, 13.000 x g, 4 °C'de 20 dakika boyunca lizatlanır.
9. Temizlenmiş süpernatantı taze önceden soğutulmuş bir tüpe aktarın ve sonraki akış analizi.
   NOT: PMSF toksiktir ve uygun kişisel koruyucu ekipmanla birlikte bir duman kaputucusunda ele alınmalıdır. SDS bir tahriş edici ve sonikasyon ısı ile aerosol üretir. Buz üzerinde liz ve sonikasyon adımlarını gerçekleştirin ve kurumsal güvenlik yönergelerine uyun.

9. Bradford testi

1. BSA kullanarak 0,15 M sodyum klorür içeren bir dizi standart çözelti hazırlayın. Konsantrasyonlar şunlardır: 0, 0,02 mg/mL, 0,04 mg/mL, 0,06 mg/mL, 0,08 mg/mL, 0,10 mg/mL.
2. Bilinmeyen hücre lizatını 0,15 M sodyum klorürde 50 kat ve 100 kat seyreltin.
3. Pipet, her standart eğri çözeltisi ve bilinmeyen örnekleri 96 kuyruklu bir plakaya çoğaltıyor.
4. Her kuyuya Bradford reaktifi ekleyin. Her kuyu için, ticari olarak mevcut olan 40 μL 5x Bradford reaktifiyle birlikte 160 μL protein çözeltisi kullanın. Nazikçe pipetle karıştırın.
5. Plakayı oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın ve bir plaka okuyucu ile 595 nm'de emilimi ölçün.
6. Y ekseninde tekrarlanan ölçümlerden x ekseninde BSA konsantrasyonlarını ve 595 nm'de ortalama absorbansı çizerek standart bir eğri oluşturun.
7. Standart eğri kullanılarak örneklerin protein konsantrasyonlarını belirleyin. Hesaplanan değerleri seyreltme faktörü ile çarparak orijinal konsantrasyonu elde edin.

10. İmmunoblotasyon

1. Eşit miktarda hücre lizatını %12 poliakrilamid jeline yükleyin ve proteinleri SDS-PAGE ile ayırın.
2. PVDF membranını kısa süreliğine etanole daldırarak aktive edin. Transfer tamponunda hem membranı hem de blotlama kağıtlarını dengeleyin.
3. Proteinleri jelden PVDF membranına yarı kuru transfer sistemi kullanarak aktarın.
4. Zarı, TBS (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.6) içinde 1 saat boyunca hafif çalkalama ile TBS (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.6) yağsız kuru sütle tıkayın.
5. Membranı, birincil antikoru bloklama tamponunda seyreltilmiş şekilde oda sıcaklığında 1 saat boyunca hafif bir çalkalama ile kuluçka edin. Tavşan anti-ClpP (1:2000) ve fare anti-beta-aktin (ACTB, 1:10,000) kullanın.
6. Zarı TBST ile üç kez yıkayın (20 mM Tris, 150 mM NaCl, %0.1 (v/v) Tween 20, pH 7.6) her yıkamada 5 dakika boyunca ve bağlanmamış antikoru çıkarın.
7. Zarı, HRP ile konjuge edilmiş ikincil antikorla, bloklayıcı tamponda (1:3000) seyreltilmiş oda sıcaklığında 1 saat boyunca hafif bir çaltlama ile inkübe edin.
8. Yıkama adımını tekrarlayın.
9. Protein bantlarını kemilyünesan tespit reaktifleriyle tespit edin.

11. Densitometrik analiz

1. Fiji'de Western Blot görseli açın.
2. Görüntü tipini 8-bit olarak değiştirin → 8-bit → tipi olarak.
3. Görüntü arka planını Süreç → arka planı çıkararak çıkar. Açık arka planı kontrol edin ve yuvarlanan top yarıçapını 50.0 piksele ayarlayın.
4. Dikdörtgen aracıyla ilk şeritteki bandı dairesel çiz, sonra analiz → jel → ilk şeridi seç.
5. Dikdörtgen aracı ikinci şeride taşıyın ve jel analiz → → sonraki şeridi seçin. Tüm şeritler seçilene kadar bu adımı tekrarlayın.
6. Bant yoğunluğunu analiz → jel → şeritleri çizerek çizin.
7. Düz çizgi aracını kullanarak bant yoğunluğu zirvesinin altına bir çizgi çizin ve bant yoğunluğunu okumak için asa aracını kullanın.
8. Yükleme kontrol leke görüntüsünde 11.1–11.8. adımlardaki aynı işlemi tekrarlayın.
9. Göreceli bant yoğunluğunu (ClpP) yoğunluğa (ACTB) bölerek raporlayın.

Sonuçlar

ClpP inhibisyonu, mitokondriyal morfolojiyi ve ağ organizasyonunu değiştirir
Mitokondriyal morfoloji, ClpP inhibisyonunun HeLa hücrelerinde mitokondriyal organizasyonu değiştirip değiştirmediğini belirlemek için değerlendirildi. Temsilli floresan görüntüleri, kontrol ve FAM-FAPAL-CMK ile işlenmiş hücreler arasında mitokondriyal organizasyonda net farklılıklar gösterdi (Şekil 1A). Nicel analizler, kontrol hücrelerinde mitokondriyal alanın ...

Tartışma

Peptit klorometil keton FAPAL-CMK^15'in, mitokondriyal ATP-bağımlı proteaz ClpXP'nin proteaz alt biriminin (ClpP) potansiyel geri döndürülemez inhibitörü olduğu daha önce gösterilmiştir. Kinetik deneyler inhibitörün gücünü ve etki mekanizmasını gösterse de, in vitro yaklaşım FAPAL-CMK'nin sağlam hücrelerde seçici mitokondriyal ClpP inhibitörü olarak etkinliğini değerlendiremedi. Floresans konfokal mikroskopi, FAM-FAPAL-CMK'nin ClpP'nin bulunduğu mitokondri...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Alexa Fluor 647-conjugated rabbit secondary antibody	Jackson Immuno Research	711-607-003
Beta Actin mouse antibody	Proteintech	66009
bovine serum albumin	Fisher bioreagents	BP1600
CHAPS	VWR	M127
ClpP rabbit PolyAb	Proteintech	15698
cOmplete protease inhibitor cocktail	Roche	11697498001
D-PBS	Corning	21-031-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Corning	10-013-CV
Dylight405-conjugated mouse secondary antibody	Jackson Immuno Research	715-475-150
ECL Select Western Blotting Detection Reagent	Cytiva	RPN2235
EGTA	Calbiochem	4100
fetal bovine serum	R&D Systems	S11550
glutaraldehyde, 70% solution	Polysciences, Inc	01201-2
GraphPad Prism	11.0.2 (100)
HEPES	Dot Scientific, Inc	DSH75030
HRP-conjugated nouse antibody	Cell Signaling Technology	7076S
HRP-conjugated rabbit antibody	Cell Signaling Technology	7074S
ImageJ/Fiji	2.16.0/1.54p
Live cell imaging solution	Gibco	A59688DJ
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher	BP214
Mitochondria-Analyzer plugin for Fiji	https://github.com/AhsenChaudhry/Mitochondria-Analyzer
MitoTracker DeepRed	Life Technologies	M22426
mouse anti-TOMM20	Santa Cruz Biotechnology	SC17764
paraformaldehyde, 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710
PIPES	Dot Scientific, Inc	DSP40140
PMSF	RPI research products	P20270
Potassium Chloride	Alfa Aesar	11595
potassium phosphate monobasic	VWR	BDH9268
ProLong mounting medium	Invitrogen	P36930
Protein Assay Dye	Bio-Rad	5000006
saponin	Thermo Scientific	A18820.14
sodium borohydride	Thermo Scientific	200050250
Sodium Chorlde	VWR	BDH9286
sodium deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium Dodecyl Sulfate	VWR	0227
sodium phosphate dibasic	AMERSCO	0348
Software name	Version information
Tris	Dot Scientific, Inc	DST60040
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	GOLD BIOTECHNOLOGY INC	TCEP-10
Triton X-100	Sigma	X100
Tween 20	VWR	0777
ZEISS Zen	2.3