Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Sıçanlarda Endoplazmik Retikulum Stresi ile İlişkili Klopidogrel Kaynaklı Gastrik Mukozal Hasar

65 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/72097

⸱

28 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Gastroenterology Department, Dagang Hospital of Binhai New Area, 2Clinical Laboratory, Tianjin Adicon Clinical Laboratories Co., Ltd.

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, sıçanlarda ve mide epitel hücrelerinde klopidogrel tedavisiyle ilişkili mide mukozası hasarını inceleyerek; bu durumun endoplazmik retikulum stresiyle ilgili moleküler değişiklikler, apoptoz ve sistemik inflamasyonla olan ilişkisini vurgulamaktadır.

Özet

Klopidogrel, arteriyel trombotik hastalıkların önlenmesi ve tedavisi için antiplatelet ajan olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır, ancak klinik uygulaması gastrik mukoza hasarı da dahil olmak üzere gastrointestinal advers etkiler nedeniyle sınırlanabilir. Epitel hücre sağkalımı gastrik mukoza bütünlüğünün korunması için temel olduğundan, klopidogrel kaynaklı gastrik epitel hasarının ER stresi ve apoptozla ilişkili belirteçlerdeki değişimlerle birlikte seyredeceği hipotezini kurduk. Bu hipotezi test etmek için GES-1 insan gastrik epitel hücreleri farklı konsantrasyonlarda klopidogrel ile tedavi edildi ve hücre canlılığı, apoptoz, hücre döngüsü dağılımı ve moleküler değişiklikler Cell Counting Kit-8 (CCK-8) testi, akış sitometrisi, kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ve Western blotting kullanılarak değerlendirildi. Paralel olarak, in vivo gastrik hasar modeli oluşturmak için Sprague-Dawley sıçanlara gavage yoluyla klopidogrel uygulandı. Gastrik mukozadaki patolojik değişiklikler hematoksilin ve eozin boyaması ile değerlendirildi ve serum enflamatuar sitokin seviyeleri enzim bağlı immünosorbent assay (ELISA) kullanılarak ölçüldü. Klopidogrel GES-1 hücre canlılığını azalttı, apoptozu teşvik etti ve hücre döngüsü ilerlemesini değiştirdi. Sıçanlarda klopidogrel; gastrik mukoza erozyonu, ödem ve enflamatuar hücre infiltrasyonunu indükledi ve buna serum interlökin (IL)-1β, IL-6 ve tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) seviyelerinin artışı eşlik etti. Klopidogrel ayrıca hem gastrik dokularda hem de GES-1 hücrelerinde ER stres belirteçleri olan C/EBP homolog proteini (CHOP) ve aktive edici transkripsiyon faktörü 5 (ATF5) ekspresyonunu artırdı, Bcl-2 ilişkili X proteini (Bax) ekspresyonunu artırdı, B-hücre lenfoma 2 (Bcl-2) ekspresyonunu azalttı ve Bax/Bcl-2 oranını yükseltti. Bu bulgular, bu çalışmada doğrudan nedensel bir ER stresi-mitokondriyal apoptoz yolu kurulmamış olsa da, klopidogrel kaynaklı gastrik mukoza hasarının artan ER stresiyle ilişkili belirteç ekspresyonu ve Bax/Bcl-2 dengesinin bozulması ile ilişkili olduğunu göstermektedir.

Giriş

Epitel hücreleri, bağışıklık hücreleri ve sinyal moleküllerinden oluşan mide mukozasının doğal ve adaptif bağışıklık sistemleri, mukozal bütünlüğü korumak için birlikte çalışır ve zararlı faktörlere karşı kritik bir fizyolojik bariyer görevi görür1,2. Bu koruyucu işlev gastrointestinal homeostaz için esastır ve bozulması, gastrit dahil olmak üzere mide hastalıklarının gelişmesine katkıda bulunabilir3. Klinik olarak, ilaç kaynaklı mide mukozası hasarı yaygın bir komplikasyondur ve steroid olmayan anti-inflamatuvar ilaçlar ile antiplatelet ajanlar en sık görülen nedenler arasındadır4. Mide mukozasının bütünlüğü, hücre proliferasyonu ile apoptoz arasındaki dinamik bir dengeye bağlıdır5. İlaçlar dahil olmak üzere çevresel faktörlere kronik maruziyet bu dengeyi bozabilir, apoptozu teşvik edebilir ve mukoza hasarına yol açabilir6,7. Endoplazmik retikulum, hücre içi homeostazın korunmasında merkezi bir rol oynar. Hücresel stres koşulları altında, yanlış katlanmış veya katlanmamış proteinlerin birikmesi; apoptozu teşvik edebilen ve B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) ailesi proteinlerinin ekspresyonunu değiştirebilen PERK/eIF2α/ATF4/CHOP sinyalleri dahil olmak üzere katlanmamış protein yanıtını aktive eder8. ATF5 ayrıca mitokondriyal stres yanıtlarında ve mitokondriyal disfonksiyon ile endoplazmik retikulum stresi arasındaki etkileşimde rol oynar9. Güncel klinik kanıtlar, klopidogrel dahil olmak üzere devam eden antiplatelet tedavisinin, ilerleyici mide ve ince bağırsak mukozası hasarı ile ilişkili olduğunu göstermektedir10.

Klopidogrel, trombosit P2Y12 reseptörlerine geri dönüşümsüz olarak bağlanmadan önce metabolik aktivasyon gerektiren, böylece adenozin difosfat aracılı trombosit agregasyonunu inhibe ederek antitrombotik etkiler üreten, yaygın olarak reçete edilen bir antiplatelet ajandır11. Bu biyooksidasyon öncelikle hepatik sitokrom P450 enzimleri aracılığıyla gerçekleşir. Bu nedenle, kültürlenmiş gastrik epitelyal hücrelerin klopidogrel ana bileşiğine doğrudan maruz bırakılması, klopidogrel tedavisinin in vivo tam metabolik ve farmakokinetik bağlamını yeniden oluşturmaz. Bununla birlikte, artan kanıtlar klopidogrel tedavisinin tekrarlayan gastrik ülserler ve gastrointestinal kanamalarla ilişkili olabileceğini göstermekte ve antitrombotik etkinlik ile gastrointestinal güvenliğin dengelenmesinin önemini vurgulamaktadır12,13,14. Bu yan etkiler rapor edilmiş olsa da, klopidogrel ile ilişkili gastrik mukozal hasarın altında yatan mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılamamıştır ve bu durum hedefli önleyici ve terapötik stratejilerin geliştirilmesini sınırlamaktadır. Mevcut çalışmada, Sprague–Dawley sıçanlar ve GES-1 hücreleri kullanarak klopidogrelin gastrik mukoza üzerindeki etkilerini inceledik. Sıçanlara gavage yoluyla klopidogrel verildi ve GES-1 hücreleri kullanılarak tamamlayıcı in vitro deneyler gerçekleştirildi. Klopidogrel kaynaklı gastrik mukozal hasarın endoplazmik retikulum stresi ve apoptoz ile ilişkili olup olmadığını araştırmak için histopatolojik, moleküler ve hücresel analizler yapıldı. Buna göre, mevcut çalışma, nedensel bir sinyal yolunu belirlemekten ziyade klopidogrel kaynaklı gastrik hasarla ilişkili moleküler değişiklikleri karakterize etmeye odaklanmıştır. Bulgularımız, klopidogrel kaynaklı gastrik mukozal hasarla ilişkili moleküler değişikliklere dair ek bilgiler sağlamakta ve bu yan etkilerin önlenmesi ve yönetilmesi amaçlanan gelecekteki çalışmalara katkıda bulunabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deney prosedürleri, Dr. Can Biotechnology (Zhejiang) Co., Ltd. Hayvan Deneyleri Etik İnceleme Kurulu tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır. Çalışma, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımıyla ilgili kurumsal yönergelerle uyumlu olarak yürütülmüştür. Hayvan etiği onay numarası DRK-20251015210'dur.

Hayvanlar ve Hücre Hatları

Etik onay, 20 SPF düzeyinde Sprague–Dawley sıçağın kullanımını kapsamıştır. Mevcut çalışmaya, deney başlangıcında 6–8 haftalık ve 280–300 g ağırlığında olan toplam 12 erkek SPF düzeyinde Sprague–Dawley sıçan dahil edilmiştir. Sıçanlar, Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd.'den (Hangzhou, Çin; Üretim Lisans No. SCXK [Zhejiang] 2024-0004) temin edilmiş ve her grupta altı sıçan olacak şekilde kontrol ve klopidogrel tedavili gruplara rastgele atanmıştır. Sıçanlar, yaklaşık 22°C'de, 12 saatlik ışık/karanlık döngüsü altında, standart yeme ve sterilize içme suyuna serbest erişimi olacak şekilde kontrollü bir ortamda barındırılmıştır. Tüm sıçanların deneyden önce bir hafta boyunca aklimatize olmasına izin verilmiştir. Klopidogrel hidrojensülfat, 0,781 mg/mL konsantrasyonda %0,5 sodyum karboksimetil selüloz (CMC-Na) içerisinde süspanse edilmiştir. Klopidogrel tedavili gruptaki sıçanlar, 3 ardışık gün boyunca günde bir kez, vücut ağırlığı başına 10 mL/kg (1 mL/100 g vücut ağırlığına ve 7,81 mg/kg doza eşdeğer) oral gavaj yoluyla klopidogrel hidrojensülfat almışlardır. Kontrol grubundaki sıçanlar ise eşit hacimde %0,5 CMC-Na almışlardır. Doz ve 3 günlük tedavi süresi, daha önce raporlanmış kısa süreli oral klopidogrel uygulaması sıçan modeline dayanarak seçilmiştir. 3. gündeki son gavajın ardından, su ad libitum olarak sağlanırken, yem 12 saat boyunca verilmemiştir. Sıçanlar, bir indüksiyon odasında oksijen içinde %3 izofluran ile anestezi altına alınmış ve anestezi, bir burun konisi aracılığıyla iletilen %1,5–2,0 izofluran ile sürdürülmüştür. Yeterli anestezi derinliği, korneal ve pedal çekilme reflekslerinin yokluğu ile doğrulanmıştır. Kan, derin anestezi altında terminal kardiyak ponksiyon ile toplanmıştır. Sıçanlar derin anestezi halindeyken, eksanguinasyon ve ardından bilateral torakotomi ile ötanize edilmiştir. Ölüm, korneal ve pedal çekilme reflekslerinin yokluğuyla birlikte, en az 5 dakika boyunca spontan respirasyon ve kardiyak aktivitenin olmamasıyla doğrulanmıştır. Ardından mide hızla çıkarılmış, büyük kurvatur boyunca açılmış ve buz gibi soğuk salin ile nazikçe durulanmıştır.

İnsan gastrik mukoza epitel hücre hattı GES-1, iCell Bioscience Inc.'den (Şanghay, Çin; Kat. No. iCell-h062) temin edilmiş ve tedarikçi tarafından kısa tandem tekrar profillemesi ile doğrulanmıştır. Hücreler, %10 fetal bovine serum (FBS) ve %1 penisilin–streptomisin ile desteklenmiş RPMI-1640 besiyerinde, %5 CO₂ içeren, nemlendirilmiş bir inkübatörde 37°C'de kültüre edilmiştir. Deneyler için pasaj 3 ile 10 arasındaki erken pasaj hücreleri kullanılmıştır. Hücre konfluensi yaklaşık %80%–90'a ulaştığında, hücreler 1:3 ayırma oranıyla pasajlanmıştır. Sonraki deneyler için logaritmik büyüme fazındaki hücreler kullanılmıştır. CCK-8 analizi için hücreler, 96 kuyucuklu plakalara 6 × 103 hücre/kuyucuk yoğunluğunda ekilmiştir. Apoptoz ve hücre döngüsü analizleri için hücreler, 6 kuyucuklu plakalara yaklaşık 5 × 105 hücre/kuyucuk yoğunluğunda ekilmiş ve klopidogrel uygulaması öncesinde yapışmaları beklenmiştir.

Kimyasallar ve Çözeltiler

Hayvan ve hücre deneyleri için klopidogrel hidrojensülfat (Kat. No. C874834; saflık ≥ 99%) kullanılmıştır. 100 mg klopidogrel tozunun dimetil sülfoksitte (DMSO) çözülmesiyle 1 M stok çözelti şeklinde klopidogrel stok çözeltisi hazırlanmıştır. Stok çözelti, kullanımdan önce gerekli çalışma konsantrasyonlarına kadar seyreltilmiştir. 1 M stok çözelti, 10, 100, 200, 400, 600, 800 ve 1000 mM konsantrasyonlarında 1000× dozlama çözeltileri hazırlamak için DMSO ile seri olarak seyreltilmiştir. Uygulamadan hemen önce, sırasıyla 0.01, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 ve 1.0 mM nihai klopidogrel konsantrasyonları elde etmek için her bir 1000× dozlama çözeltisi, tamamlayıcı kültür ortamına 1:1000 (v/v) oranında eklenmiştir. Araç kontrol grubu, klopidogrel içermeyen eşit hacimde DMSO almıştır. Böylece, tüm gruplarda nihai DMSO konsantrasyonu %0.1 (v/v) düzeyinde tutulmuştur. Kültüre edilmiş GES-1 hücreleri, klopidogrelin hepatik sitokrom P450 aracılı biyovaktivasyonunu yeniden üretmemektedir. Bu nedenle, doğrudan klopidogrel tedavisi, keşifsel bir ana bileşik maruziyet modeli olarak kullanılmıştır. Konsantrasyon aralığı, deneysel koşullar altında konsantrasyona bağlı hücresel yanıtları karakterize etmek için seçilmiştir ve klinik olarak ulaşılabilir plazma veya mide dokusu konsantrasyonlarına eşdeğer olarak yorumlanmamalıdır.

Hücre Alt Kültürü

Bazal kültür ortamı FBS ve penisilin-streptomisin ile desteklenerek tam besiyeri hazırlandı. Hücre konfluenslemesi yaklaşık %80'e ulaştığında, kültür ortamı uzaklaştırıldı ve hücreler steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkandı. Ardından hücreler, yaklaşık 1-2 dk boyunca tripsin-etilendiaminotetraasetik asit (EDTA) solüsyonu ile sindirildi. Hücrelerin kısmi ayrılması sonrası, sindirimi sonlandırmak için tam besiyeri eklendi. Hücre süspansiyonu 1.200 × g'de 3 dk santrifüj edildi. Süpernatan uzaklaştırıldıktan sonra, hücre peleti 1-2 mL tam besiyerinde yeniden süspanse edildi ve deneysel gereksinimlere göre yeni kültür kaplarına ekildi.

CCK-8 Hücre Canlılık Analizi

Logaritmik büyüme aşamasındaki GES-1 hücreleri, 96 kuyucuklu plakalara kuyucuk başına 6 × 103 hücre olacak şekilde ekildi ve hücrelerin yapışması için gece boyunca kültüre edildi. Yapışma gerçekleştikten sonra hücreler, farklı konsantrasyonlarda clopidogrel (0, 0.01, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 ve 1.0 mM) ile 24 sa boyunca işleme tabi tutuldu. Kontrol grubu, aynı nihai konsantrasyonda taşıyıcı madde aldı. İşlem sonrası, her kuyucuğa CCK-8 solüsyonu eklendi ve kit talimatlarına uygun olarak 37°C'de inkübe edildi. 450 nm'deki absorbans, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçüldü. Hücre canlılığı, kontrol grubunun yüzdesi olarak hesaplandı. Konsantrasyon-yanıt sonuçlarına dayanarak, sonraki apoptoz, hücre döngüsü, qPCR ve Western blot analizleri için 24 saat boyunca 0.1 mM clopidogrel uygulaması seçildi.

Akış Sitometrisi Analizi

GES-1 hücreleri 6 kuyucuklu plakalara ekildi ve hücre yapışması gerçekleştikten sonra 24 saat boyunca 0,1 mM clopidogrel ilele işleme tabi tutuldu. İşlem sonrası, hem yüzen hem de yapışık hücreler toplandı. Yapışık hücreler EDTA içermeyen tripsin ile digeste edildi, soğuk PBS ile iki kez yıkandı ve bağlanma tamponunda yeniden süspanse edildi. Hücreler, üretici talimatlarına uygun olarak Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit kullanılarak boyandı. Oda sıcaklığında ve karanlıkta inkübasyon sonrası, apoptotik hücreler RaiseCyte 2L6C akış sitometresi kullanılarak tespit edildi. Veriler RaiseFlower veri toplama yazılımı ile elde edildi ve FlowJo yazılımı (versiyon 10.8.1) kullanılarak analiz edildi. Erken apoptotik, geç apoptotik ve toplam apoptotik hücre popülasyonları FlowJo yazılımı ile nicelendirildi.

Hücre Döngüsü Dağılımının Akış Sitometrik Analizi

GES-1 hücreleri 6 kuyucuklu plakalara ekildi ve 24 saat boyunca 0,1 mM klopidogrel ilele işleme tabi tutuldu. İşlemden sonra hücreler toplandı, PBS ile yıkandı ve 4°C'de önceden soğutulmuş %70 etanol ile fikse edildi. Fikse edilen hücreler, kalıntı etanolü uzaklaştırmak için yıkandı ve üretici talimatlarına uygun olarak karanlıkta RNase A ve propidyum iyodür boyama çözeltisi ile inkübe edildi. Hücre döngüsü dağılımı, bir akış sitometresi kullanılarak analiz edildi. Veriler, veri toplama yazılımı kullanılarak elde edildi ve FlowJo yazılımı ile analiz edildi. Hücre döngüsü dağılımları Watson modeli kullanılarak fit edildi ve G0/G1, S ve G2/M fazlarındaki hücrelerin yüzdeleri hesaplandı.

Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR (qPCR)

Toplam RNA, bir RNA ekstraksiyon kiti kullanılarak kit talimatlarına uygun olarak GES-1 hücrelerinden ve sıçan mide dokusu örneklerinden ekstrakte edildi. Doku örnekleri için gastrik mukoza dokuları hızla toplandı, düşük sıcaklık koşulları altında homojenize edildi ve RNA ekstraksiyonuna tabi tutuldu. RNA konsantrasyonu ve saflığı, 260 ve 280 nm'deki absorbans ölçülerek belirlendi. Eşit miktardaki RNA, genomik DNA uzaklaştırma özellikli bir ters transkripsiyon kiti kullanılarak komplemanter DNA'ya (cDNA) ters transkribe edildi. Kantitatif gerçek zamanlı PCR, SYBR Green tabanlı bir PCR master mix kullanılarak gerçekleştirildi. Her reaksiyon; 10 µL 2× master mix, 1 µL cDNA, 0,4 µL ileri primer, 0,4 µL geri primer ve 8,2 µL RNase-free ddH₂O içeren toplam 20 µL hacimde gerçekleştirildi. Termal döngü koşulları şu şekildeydi: 95°C'de 10 dk başlangıç denatürasyonu, ardından 95°C'de 10 sn denatürasyon, 60°C'de 30 sn bağlanma ve 72°C'de 30 sn uzama şeklinde 40 döngü. CHOP, ATF5, Bcl-2 ve Bax ekspresyon seviyeleri belirlendi. İç referans gen olarak GAPDH kullanıldı. Relatif gen ekspresyonu 2−ΔΔCt yöntemi kullanılarak hesaplandı. Primer dizileri Ek Tablo 1'de listelenmiştir.

Western Blot

GES-1 hücrelerinden ve sıçan mide dokusu örneklerinden toplam protein ekstraksiyonu yapıldı. Hücre örnekleri için, işlem görmüş GES-1 hücreleri soğuk PBS ile yıkandı ve proteaz inhibitörü içeren radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lizis tamponu kullanılarak lizlendi. Doku örnekleri için, mide mukozal dokuları düşük sıcaklık koşullarında RIPA tamponunda homojenize edildi ve ardından süpernatantı toplamak için santrifüj edildi. Protein konsantrasyonları BCA protein analizi ile belirlendi. Her şeride toplam 20 µg protein, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrılarak poliviniliden diflorür (PVDF) membranlara aktarıldı. Sığır serum albümini (BSA) ile bloklama işleminden sonra membranlar; CHOP (1:1000), ATF5 (1:1000), Bcl-2 (1:1000), Bax (1:1000) ve β-actin (1:5000) karşıtı primer antikorlar ile 4°C'de gece boyunca inkübe edildi. Yıkamanın ardından membranlar, ilgili yaban turpu peroksidaz-konjuge sekonder antikorlar (1:10000) ile inkübe edildi. Protein bantları, geliştirilmiş kemilüminesans reaktifi kullanılarak görselleştirildi ve bir kemilüminesans görüntüleme sistemi ile kaydedildi. Bant yoğunlukları görüntü analiz yazılımı kullanılarak nicelendirildi ve β-actin'e göre normalize edildi.

Histopatolojik Değerlendirme

Gastrik doku örnekleri, klopidogrel tedavisi sonrası Sprague–Dawley sıçanlarından toplandı ve %10 nötr tamponlu formalinle sabitlendi. Örnekler dehidrate edildi, şeffaflaştırıldı, parafine gömüldü ve 4 µm kalınlığında kesildi. Parafin kesitler hematoksilin ve eozin ile boyandı. Histopatolojik değişiklikler; mukoza morfolojisi, epitelyal bütünlük, ödem ve inflamatuar hücre infiltrasyonu baz alınarak bir ışık mikroskobu altında kalitatif olarak değerlendirildi. Temsili görüntüler kaydedildi. Herhangi bir histolojik skorlama sistemi uygulanmadı.

İmmünohistokimya

Parafine gömülü mide dokusu kesitleri ksilen ile deparafine edildi ve dereceli bir etanol serisi aracılığıyla yeniden hidrate edildi. Isı ile uyarılmış antijen geri kazanımı sitrat tamponunda gerçekleştirildi. Endojen peroksidaz aktivitesi %3 hidrojen peroksit ile 10 dk boyunca bloke edildi ve spesifik olmayan bağlanma, oda sıcaklığında 30 dk boyunca normal keçi serumu ile bloke edildi. Kesitler daha sonra CHOP, ATF5, Bcl-2 ve Bax'a karşı primer antikorlarla birlikte 4°C'de gece boyu inkübe edildi. PBS ile yıkamanın ardından kesitler, uygun yaban turbası peroksidaz-konjuge ikincil antikorla inkübe edildi. İmmünreaktif sinyaller DAB kromojenik çözeltisi kullanılarak görselleştirildi ve ardından hematoksilin ile karşıt boyama yapıldı. Kesitlerledehidrate edildi, şeffaflaştırıldı, lam üzerine monte edildi ve bir ışık mikroskobu altında incelendi. Temsili görüntüler yakalandı ve pozitif boyama alanı görüntü analiz yazılımı kullanılarak nicelendirildi.

İmmünofloresan Boyama

Parafin gömülü mide doku kesitleri deparafine edildi, rehidre edildi ve sitrat tamponunda ısı ile tetiklenen antijen geri kazanım işlemine tabi tutuldu. Normal keçi serumu ile 30 dk boyunca bloklama yapıldıktan sonra kesitler; CHOP (1:50), ATF5 (1:100), Bcl-2 (1:50) ve Bax (1:200) karşıtı primer antikorlarla 4°C'de gece boyunca inkübe edildi. PBS ile yıkamanın ardından kesitler, uygun floresan sekonder antikorlar (1:500) ile oda sıcaklığında, karanlıkta 1 saat boyunca inkübe edildi ve ardından DAPI ile karşı boyama yapıldı. Görüntüler, bir floresan mikroskobu kullanılarak ×200 büyütmede kaydedildi. Her hayvandan rastgele seçilen, birbiriyle örtüşmeyen üç alan Image-Pro Plus 6.0 kullanılarak analiz edildi ve floresan yoğunluğu IOD/Area olarak ifade edildi. Analize grup başına üç hayvan dahil edildi.

Enzim Bağlı İmmunosorbent Deneyi (ELISA)

Kan örnekleri, tedavi sonrası Sprague–Dawley sıçanlarından toplandı ve oda sıcaklığında pıhtılaşmaya bırakıldı. Serum, santrifüj ile ayrıldı ve analiz edilene kadar −80°C'de saklandı. IL-1β, IL-6 ve TNF-α serum düzeyleri, kit talimatlarına uygun olarak ELISA kitleri kullanılarak ölçüldü. Absorbans, bir mikroplaka okuyucu ile ölçüldü ve sitokin konsantrasyonları standart eğrilerle hesaplandı.

İstatistiksel Analiz

İstatistiksel analizler, istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Veriler, ortalama ± SD olarak sunulmuştur. Normalite ve varyans homojenliği, sırasıyla Shapiro–Wilk testi ve Levene testi kullanılarak değerlendirilmiştir. İki grup arasındaki karşılaştırmalar Student's t-testi ile yapılmıştır. Birden fazla grup arasındaki karşılaştırmalar, tek yönlü varyans analizi ve ardından Dunnett post hoc testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. P < 0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Tüm hücre deneyleri, en az üç bağımsız biyolojik tekrarlı olarak yürütülmüştür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Clopidogrel, GES-1 Hücre Canlılığını Azaltır ve In Vitro Apoptozu Artır

İlk olarak, klopidogrelin GES-1 hücre canlılığı ve apoptozu üzerindeki etkilerini araştırdık. CCK-8 analizleri, klopidogrel uygulamasının GES-1 hücrelerinin canlılığını önemli ölçüde azalttığını göstermiştir (Şekil 1A,B), bu da hücre canlılığının azaldığına işaret etmektedir. Test edilen konsantrasyon aralığında hücre canlılığındaki genel azalma baz a...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Klopidogrel, kardiyovasküler hastalıkların önlenmesi ve tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır; ancak klinik kullanımı, peptik ülserler, kanama ve perforasyon dahil olmak üzere kanama riskleri ve gastrointestinal komplikasyonlarla ilişkilidir19. Bu nedenle, klopidogrel kaynaklı gastrik yaralanmalarla ilişkili moleküler değişikliklerin anlaşılması, bu yan etkilerin önlenmesi ve yönetilmesinin iyileştirilmesi açısından önemlidir. Mevcut çalışmada, klopidogrelin gastrik epitel hücreleri ve sıçan ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar Çatışması:

Yazarlar, bu çalışmada rapor edilen çalışmaları etkilediği görülebilecek herhangi bir finansal çıkar çatışması veya kişisel ilişkilerinin bulunmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, “Klopidogrel Kaynaklı Gastrik Mukozal Epitel Hücre Apoptozunda CHOP/ATF5/Bcl-2 Sinyal Yolu Üzerine Temel Araştırmalar” (Proje No. 2023BWKY009) projesi tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Annexin V-FITC/PI Apoptozis Tespit KitiElabscienceE-CK-A211Apoptoz tespit kiti
ATF5 AntikoruProteintech67066-1-APPrimer antikor
BCA Protein Analiz KitiSolarbioPC0020Protein konsantrasyon analizi
Bax AntikoruProteintech50599-1-APBirincil antikor
Bcl-2 AntikoruProteintech26593-1-APPrimer antikor
β-aktin AntikoruProteintech66009-1-IgBirincil antikor
Bloklama TamponuBeyotimeP0252Western blot bloklama solüsyonu
CCK-8 Hücre Sayım KitiKeyGen BiotechKGA317Hücre canlılık analizi
cDNA Sentez KitiTransGen BiotechAU341Genomik DNA gidermeli birinci zincir cDNA sentez kiti
Hücre Döngüsü Tespit KitiLianke BiotechnologyCCS012Hücre döngüsü analiz kiti
CHOP AntikoruProteintech15204-1-APPrimer antikor
Klopidogrel Hidrojen Sülfat (Saflık ≥99%)MacklinC874834Deneysel ilaç
DAB Kromojen KitiBeyotimeP0201Mİmmünohistokimya substratı
Dimetil Sülfoksit (DMSO)MedChemExpressHY-Y0320CÇözücü
Geliştirilmiş Kemilüminesans (ECL) ReajanıMeilunbioMA0186Kemilüminesans substratı
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10099-141Hücre kültürü takviyesi
GES-1 İnsan Gastrik Epitel Hücre HattıiCell BioscienceiCell-h062İnsan gastrik epitel hücre hattı
Hematoksilin ve Eozin (H&E)&E) Boyama KitiBeyotimeC0105SHistolojik boyama
Yaban Turbu Peroksidazı (HRP)-Konjuge İkincil AntikorProteintechRGAM001/RGAR001Sekonder antikor
Hidrojen Peroksit ÇözeltisiAbsinABS9333-100mLEndojen peroksidaz bloklama reaktifi
IL-1β ELISA KitiMEIMIANMM-0047R2Serum sitokin analizi
IL-6 ELISA KitiMEIMIANMM-0190R2Serum sitokin analizi
Mikroplaka OkuyucuBeijing Liuyi BiyoteknolojiWD-2102BAbsorbans ölçümü
Penisilin-Streptomisin ÇözeltisiSolarbioP1400Antibiyotik çözeltisi
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)ServicebioG4202-500ML1× PBS
Poliviniliden Diflorür (PVDF) MembranMilliporeIPVH00010Western blot membranı
Primer Antikor SeyrelticiBeyotimeP0023AAntikor seyreltici
Protein Moleküler Ağırlık MarkörüYeasenWJ103Önceden boyanmış protein merdiveni
Kantitatif Real-Time PCR Master Mix (SYBR Green)CWBioCW3008qPCR reaktifi
Radyoimmünopresipitasyon Analizi (RIPA) Lizis TamponuSolarbioLütfen çevirmek istediğiniz İngilizce metni sağlayın. Metni ilettiğinizde, belirtmiş olduğunuz tüm bilimsel çeviri standartlarına ve akademik kriterlere uygun olarak çeviriyi gerçekleştireceğim.Protein ekstraksiyon tamponu
RNaz ALianke BiotechnologyCCS012Hücre döngüsü analizi reaktifi
RPMI-1640 BesiyeriServicebioG4535-500MLBazal hücre kültürü ortamı
Sprague-Dawley SıçanlarıHangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd.Lütfen çevirmemi istediğiniz kaynak metni sağlayın. Metni ilettiğinizde, belirtmiş olduğunuz akademik standartlara, bilimsel terminolojiye ve JoVE yayın formatına uygun olarak çeviriyi gerçekleştireceğim.SPF derecesi
TNF-α ELISA KitiMEIMIANMM-0180R2Serum sitokin analizi
Toplam RNA Ekstraksiyon KitiTransGen BiotechER501-01RNA ekstraksiyon kiti
Tripsin-EDTA ÇözeltisiSolarbioT1300Hücre disosiasyon reaktifi

Kaynaklar

  1. Mills JC, Shivdasani RA. Gastric epithelial stem cells. Gastroenterology. 2011;140(2):412-424.
  2. Zhou CB, et al. The role of pyroptosis in gastrointestinal cancer and immune responses to intestinal microbial infection. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2019;1872(1):1-10.
  3. Boltin D, Niv Y. Pharmacological and alimentary alteration of the gastric barrier. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2014;28(6):981-994.
  4. Kwon DA, et al. Protective effects of a standardized extract (HemoHIM) using indomethacin- and ethanol/HCl-induced gastric mucosal injury models. Pharm Biol. 2019;57(1):543-549.
  5. Guo XZ, et al. Effect of Bax, Bcl-2 and Bcl-xL on regulating apoptosis in tissues of normal liver and hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 2002;8(6):1059-1062.
  6. Gomi A, et al. Effect of Bifidobacterium bifidum BF-1 on gastric protection and mucin production in an acute gastric injury rat model. J Dairy Sci. 2013;96(2):832-837.
  7. Chiou SK, et al. Suppression of growth arrest and DNA damage-inducible 45alpha expression confers resistance to sulindac- and indomethacin-induced gastric mucosal injury. J Pharmacol Exp Ther. 2010;334(3):693-702.
  8. Chen X, et al. Endoplasmic reticulum stress: molecular mechanism and therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8(1):352.
  9. Lian X, et al. ATF5-regulated mitochondrial unfolded protein response attenuates neuronal damage in epileptic rats by reducing endoplasmic reticulum stress through mitochondrial ROS. Neurochem Res. 2024;49(2):388-401.
  10. He C, et al. Progression of gastrointestinal injury during antiplatelet therapy after percutaneous coronary intervention: a secondary analysis of the OPT-PEACE randomized clinical trial. JAMA Netw Open. 2023;6(11):e2343219.
  11. Zongdan J, et al. The mechanism of miR-363-3p/DUSP10 signaling pathway involved in the gastric mucosal injury induced by clopidogrel. Toxicol Mech Methods. 2021;31(2):150-158.
  12. Chan FK, et al. Clopidogrel versus aspirin and esomeprazole to prevent recurrent ulcer bleeding. N Engl J Med. 2005;352(3):238-244.
  13. Taha AS, et al. Upper gastrointestinal mucosal abnormalities and blood loss complicating low-dose aspirin and antithrombotic therapy. Aliment Pharmacol Ther. 2006;23(4):489-495.
  14. Wu HL, et al. Increased endoplasmic reticulum stress response is involved in clopidogrel-induced apoptosis of gastric epithelial cells. PLoS One. 2013;8(9):e74381.
  15. Forsgard RA, et al. Intestinal permeability to iohexol as an in vivo marker of chemotherapy-induced gastrointestinal toxicity in Sprague-Dawley rats. Cancer Chemother Pharmacol. 2016;78(4):863-874.
  16. Wu H, et al. Clopidogrel-induced gastric injury in rats is attenuated by stable gastric pentadecapeptide BPC 157. Drug Des Devel Ther. 2020;14:5599-5610.
  17. Zhu XM, et al. The involvement of endoplasmic reticulum stress response in immune dysfunction of dendritic cells after severe thermal injury in mice. Oncotarget. 2017;8(6):9035-9052.
  18. Oakes SA, Papa FR. The role of endoplasmic reticulum stress in human pathology. Annu Rev Pathol. 2015;10:173-194.
  19. Abrignani MG, et al. Gastroprotection in patients on antiplatelet and/or anticoagulant therapy: a position paper of the National Association of Hospital Cardiologists (ANMCO) and the Italian Association of Hospital Gastroenterologists and Endoscopists (AIGO). Eur J Intern Med. 2021;85:1-13.
  20. Takahashi K, et al. Influence of antiplatelet drugs on gastric ulcer healing after endoscopic submucosal dissection in patients with early gastric cancer. DEN Open. 2025;5(1).
  21. Wu H, et al. Role of MKP-5-p38/MAPK pathway in clopidogrel-induced gastric mucosal epithelial cells apoptosis and tight junction dysfunction. Am J Transl Res. 2020;12(5):1741-1753.
  22. Fu X, et al. Protective effect of teprenone on gastric mucosal injury induced by dual antiplatelet therapy in rats. Am J Transl Res. 2021;13(4):2702-2709.
  23. Oyadomari S, Mori M. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress. Cell Death Differ. 2004;11(4):381-389.
  24. Sears TK, Angelastro JM. The transcription factor ATF5: role in cellular differentiation, stress responses, and cancer. Oncotarget. 2017;8(48):84595-84609.
  25. Zhang Y, et al. Puerarin attenuates neurological deficits via Bcl-2/Bax/cleaved caspase-3 and Sirt3/SOD2 apoptotic pathways in subarachnoid hemorrhage mice. Biomed Pharmacother. 2019;109:726-733.
  26. Manas A, et al. Immunohistochemical detection of the pro-apoptotic BaxΔ2 protein in human tissues. Histochem Cell Biol. 2020;154(1):41-53.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Clopidogrel Kaynaklı Gastrik HasarGES-1 HücreleriApoptoz BelirteçleriHücre Canlılığı AnaliziAkış SitometrisiWestern Blotİnflamatuar SitokinlerBax/Bcl-2 Oranı

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.