Bu çalışma, sıçanlarda ve mide epitel hücrelerinde klopidogrel tedavisiyle ilişkili mide mukozası hasarını inceleyerek; bu durumun endoplazmik retikulum stresiyle ilgili moleküler değişiklikler, apoptoz ve sistemik inflamasyonla olan ilişkisini vurgulamaktadır.
Araştırma makalesi
Sıçanlarda Endoplazmik Retikulum Stresi ile İlişkili Klopidogrel Kaynaklı Gastrik Mukozal Hasar
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Klopidogrel, arteriyel trombotik hastalıkların önlenmesi ve tedavisi için antiplatelet ajan olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır, ancak klinik uygulaması gastrik mukoza hasarı da dahil olmak üzere gastrointestinal advers etkiler nedeniyle sınırlanabilir. Epitel hücre sağkalımı gastrik mukoza bütünlüğünün korunması için temel olduğundan, klopidogrel kaynaklı gastrik epitel hasarının ER stresi ve apoptozla ilişkili belirteçlerdeki değişimlerle birlikte seyredeceği hipotezini kurduk. Bu hipotezi test etmek için GES-1 insan gastrik epitel hücreleri farklı konsantrasyonlarda klopidogrel ile tedavi edildi ve hücre canlılığı, apoptoz, hücre döngüsü dağılımı ve moleküler değişiklikler Cell Counting Kit-8 (CCK-8) testi, akış sitometrisi, kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ve Western blotting kullanılarak değerlendirildi. Paralel olarak, in vivo gastrik hasar modeli oluşturmak için Sprague-Dawley sıçanlara gavage yoluyla klopidogrel uygulandı. Gastrik mukozadaki patolojik değişiklikler hematoksilin ve eozin boyaması ile değerlendirildi ve serum enflamatuar sitokin seviyeleri enzim bağlı immünosorbent assay (ELISA) kullanılarak ölçüldü. Klopidogrel GES-1 hücre canlılığını azalttı, apoptozu teşvik etti ve hücre döngüsü ilerlemesini değiştirdi. Sıçanlarda klopidogrel; gastrik mukoza erozyonu, ödem ve enflamatuar hücre infiltrasyonunu indükledi ve buna serum interlökin (IL)-1β, IL-6 ve tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) seviyelerinin artışı eşlik etti. Klopidogrel ayrıca hem gastrik dokularda hem de GES-1 hücrelerinde ER stres belirteçleri olan C/EBP homolog proteini (CHOP) ve aktive edici transkripsiyon faktörü 5 (ATF5) ekspresyonunu artırdı, Bcl-2 ilişkili X proteini (Bax) ekspresyonunu artırdı, B-hücre lenfoma 2 (Bcl-2) ekspresyonunu azalttı ve Bax/Bcl-2 oranını yükseltti. Bu bulgular, bu çalışmada doğrudan nedensel bir ER stresi-mitokondriyal apoptoz yolu kurulmamış olsa da, klopidogrel kaynaklı gastrik mukoza hasarının artan ER stresiyle ilişkili belirteç ekspresyonu ve Bax/Bcl-2 dengesinin bozulması ile ilişkili olduğunu göstermektedir.
Giriş
Epitel hücreleri, bağışıklık hücreleri ve sinyal moleküllerinden oluşan mide mukozasının doğal ve adaptif bağışıklık sistemleri, mukozal bütünlüğü korumak için birlikte çalışır ve zararlı faktörlere karşı kritik bir fizyolojik bariyer görevi görür1,2. Bu koruyucu işlev gastrointestinal homeostaz için esastır ve bozulması, gastrit dahil olmak üzere mide hastalıklarının gelişmesine katkıda bulunabilir3. Klinik olarak, ilaç kaynaklı mide mukozası hasarı yaygın bir komplikasyondur ve steroid olmayan anti-inflamatuvar ilaçlar ile antiplatelet ajanlar en sık görülen nedenler arasındadır4. Mide mukozasının bütünlüğü, hücre proliferasyonu ile apoptoz arasındaki dinamik bir dengeye bağlıdır5. İlaçlar dahil olmak üzere çevresel faktörlere kronik maruziyet bu dengeyi bozabilir, apoptozu teşvik edebilir ve mukoza hasarına yol açabilir6,7. Endoplazmik retikulum, hücre içi homeostazın korunmasında merkezi bir rol oynar. Hücresel stres koşulları altında, yanlış katlanmış veya katlanmamış proteinlerin birikmesi; apoptozu teşvik edebilen ve B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) ailesi proteinlerinin ekspresyonunu değiştirebilen PERK/eIF2α/ATF4/CHOP sinyalleri dahil olmak üzere katlanmamış protein yanıtını aktive eder8. ATF5 ayrıca mitokondriyal stres yanıtlarında ve mitokondriyal disfonksiyon ile endoplazmik retikulum stresi arasındaki etkileşimde rol oynar9. Güncel klinik kanıtlar, klopidogrel dahil olmak üzere devam eden antiplatelet tedavisinin, ilerleyici mide ve ince bağırsak mukozası hasarı ile ilişkili olduğunu göstermektedir10.
Klopidogrel, trombosit P2Y12 reseptörlerine geri dönüşümsüz olarak bağlanmadan önce metabolik aktivasyon gerektiren, böylece adenozin difosfat aracılı trombosit agregasyonunu inhibe ederek antitrombotik etkiler üreten, yaygın olarak reçete edilen bir antiplatelet ajandır11. Bu biyooksidasyon öncelikle hepatik sitokrom P450 enzimleri aracılığıyla gerçekleşir. Bu nedenle, kültürlenmiş gastrik epitelyal hücrelerin klopidogrel ana bileşiğine doğrudan maruz bırakılması, klopidogrel tedavisinin in vivo tam metabolik ve farmakokinetik bağlamını yeniden oluşturmaz. Bununla birlikte, artan kanıtlar klopidogrel tedavisinin tekrarlayan gastrik ülserler ve gastrointestinal kanamalarla ilişkili olabileceğini göstermekte ve antitrombotik etkinlik ile gastrointestinal güvenliğin dengelenmesinin önemini vurgulamaktadır12,13,14. Bu yan etkiler rapor edilmiş olsa da, klopidogrel ile ilişkili gastrik mukozal hasarın altında yatan mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılamamıştır ve bu durum hedefli önleyici ve terapötik stratejilerin geliştirilmesini sınırlamaktadır. Mevcut çalışmada, Sprague–Dawley sıçanlar ve GES-1 hücreleri kullanarak klopidogrelin gastrik mukoza üzerindeki etkilerini inceledik. Sıçanlara gavage yoluyla klopidogrel verildi ve GES-1 hücreleri kullanılarak tamamlayıcı in vitro deneyler gerçekleştirildi. Klopidogrel kaynaklı gastrik mukozal hasarın endoplazmik retikulum stresi ve apoptoz ile ilişkili olup olmadığını araştırmak için histopatolojik, moleküler ve hücresel analizler yapıldı. Buna göre, mevcut çalışma, nedensel bir sinyal yolunu belirlemekten ziyade klopidogrel kaynaklı gastrik hasarla ilişkili moleküler değişiklikleri karakterize etmeye odaklanmıştır. Bulgularımız, klopidogrel kaynaklı gastrik mukozal hasarla ilişkili moleküler değişikliklere dair ek bilgiler sağlamakta ve bu yan etkilerin önlenmesi ve yönetilmesi amaçlanan gelecekteki çalışmalara katkıda bulunabilir.
Protokol
Tüm hayvan deney prosedürleri, Dr. Can Biotechnology (Zhejiang) Co., Ltd. Hayvan Deneyleri Etik İnceleme Kurulu tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır. Çalışma, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımıyla ilgili kurumsal yönergelerle uyumlu olarak yürütülmüştür. Hayvan etiği onay numarası DRK-20251015210'dur.
Hayvanlar ve Hücre Hatları
Etik onay, 20 SPF düzeyinde Sprague–Dawley sıçağın kullanımını kapsamıştır. Mevcut çalışmaya, deney başlangıcında 6–8 haftalık ve 280–300 g ağırlığında olan toplam 12 erkek SPF düzeyinde Sprague–Dawley sıçan dahil edilmiştir. Sıçanlar, Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd.'den (Hangzhou, Çin; Üretim Lisans No. SCXK [Zhejiang] 2024-0004) temin edilmiş ve her grupta altı sıçan olacak şekilde kontrol ve klopidogrel tedavili gruplara rastgele atanmıştır. Sıçanlar, yaklaşık 22°C'de, 12 saatlik ışık/karanlık döngüsü altında, standart yeme ve sterilize içme suyuna serbest erişimi olacak şekilde kontrollü bir ortamda barındırılmıştır. Tüm sıçanların deneyden önce bir hafta boyunca aklimatize olmasına izin verilmiştir. Klopidogrel hidrojensülfat, 0,781 mg/mL konsantrasyonda %0,5 sodyum karboksimetil selüloz (CMC-Na) içerisinde süspanse edilmiştir. Klopidogrel tedavili gruptaki sıçanlar, 3 ardışık gün boyunca günde bir kez, vücut ağırlığı başına 10 mL/kg (1 mL/100 g vücut ağırlığına ve 7,81 mg/kg doza eşdeğer) oral gavaj yoluyla klopidogrel hidrojensülfat almışlardır. Kontrol grubundaki sıçanlar ise eşit hacimde %0,5 CMC-Na almışlardır. Doz ve 3 günlük tedavi süresi, daha önce raporlanmış kısa süreli oral klopidogrel uygulaması sıçan modeline dayanarak seçilmiştir. 3. gündeki son gavajın ardından, su ad libitum olarak sağlanırken, yem 12 saat boyunca verilmemiştir. Sıçanlar, bir indüksiyon odasında oksijen içinde %3 izofluran ile anestezi altına alınmış ve anestezi, bir burun konisi aracılığıyla iletilen %1,5–2,0 izofluran ile sürdürülmüştür. Yeterli anestezi derinliği, korneal ve pedal çekilme reflekslerinin yokluğu ile doğrulanmıştır. Kan, derin anestezi altında terminal kardiyak ponksiyon ile toplanmıştır. Sıçanlar derin anestezi halindeyken, eksanguinasyon ve ardından bilateral torakotomi ile ötanize edilmiştir. Ölüm, korneal ve pedal çekilme reflekslerinin yokluğuyla birlikte, en az 5 dakika boyunca spontan respirasyon ve kardiyak aktivitenin olmamasıyla doğrulanmıştır. Ardından mide hızla çıkarılmış, büyük kurvatur boyunca açılmış ve buz gibi soğuk salin ile nazikçe durulanmıştır.
İnsan gastrik mukoza epitel hücre hattı GES-1, iCell Bioscience Inc.'den (Şanghay, Çin; Kat. No. iCell-h062) temin edilmiş ve tedarikçi tarafından kısa tandem tekrar profillemesi ile doğrulanmıştır. Hücreler, %10 fetal bovine serum (FBS) ve %1 penisilin–streptomisin ile desteklenmiş RPMI-1640 besiyerinde, %5 CO₂ içeren, nemlendirilmiş bir inkübatörde 37°C'de kültüre edilmiştir. Deneyler için pasaj 3 ile 10 arasındaki erken pasaj hücreleri kullanılmıştır. Hücre konfluensi yaklaşık %80%–90'a ulaştığında, hücreler 1:3 ayırma oranıyla pasajlanmıştır. Sonraki deneyler için logaritmik büyüme fazındaki hücreler kullanılmıştır. CCK-8 analizi için hücreler, 96 kuyucuklu plakalara 6 × 103 hücre/kuyucuk yoğunluğunda ekilmiştir. Apoptoz ve hücre döngüsü analizleri için hücreler, 6 kuyucuklu plakalara yaklaşık 5 × 105 hücre/kuyucuk yoğunluğunda ekilmiş ve klopidogrel uygulaması öncesinde yapışmaları beklenmiştir.
Kimyasallar ve Çözeltiler
Hayvan ve hücre deneyleri için klopidogrel hidrojensülfat (Kat. No. C874834; saflık ≥ 99%) kullanılmıştır. 100 mg klopidogrel tozunun dimetil sülfoksitte (DMSO) çözülmesiyle 1 M stok çözelti şeklinde klopidogrel stok çözeltisi hazırlanmıştır. Stok çözelti, kullanımdan önce gerekli çalışma konsantrasyonlarına kadar seyreltilmiştir. 1 M stok çözelti, 10, 100, 200, 400, 600, 800 ve 1000 mM konsantrasyonlarında 1000× dozlama çözeltileri hazırlamak için DMSO ile seri olarak seyreltilmiştir. Uygulamadan hemen önce, sırasıyla 0.01, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 ve 1.0 mM nihai klopidogrel konsantrasyonları elde etmek için her bir 1000× dozlama çözeltisi, tamamlayıcı kültür ortamına 1:1000 (v/v) oranında eklenmiştir. Araç kontrol grubu, klopidogrel içermeyen eşit hacimde DMSO almıştır. Böylece, tüm gruplarda nihai DMSO konsantrasyonu %0.1 (v/v) düzeyinde tutulmuştur. Kültüre edilmiş GES-1 hücreleri, klopidogrelin hepatik sitokrom P450 aracılı biyovaktivasyonunu yeniden üretmemektedir. Bu nedenle, doğrudan klopidogrel tedavisi, keşifsel bir ana bileşik maruziyet modeli olarak kullanılmıştır. Konsantrasyon aralığı, deneysel koşullar altında konsantrasyona bağlı hücresel yanıtları karakterize etmek için seçilmiştir ve klinik olarak ulaşılabilir plazma veya mide dokusu konsantrasyonlarına eşdeğer olarak yorumlanmamalıdır.
Hücre Alt Kültürü
Bazal kültür ortamı FBS ve penisilin-streptomisin ile desteklenerek tam besiyeri hazırlandı. Hücre konfluenslemesi yaklaşık %80'e ulaştığında, kültür ortamı uzaklaştırıldı ve hücreler steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkandı. Ardından hücreler, yaklaşık 1-2 dk boyunca tripsin-etilendiaminotetraasetik asit (EDTA) solüsyonu ile sindirildi. Hücrelerin kısmi ayrılması sonrası, sindirimi sonlandırmak için tam besiyeri eklendi. Hücre süspansiyonu 1.200 × g'de 3 dk santrifüj edildi. Süpernatan uzaklaştırıldıktan sonra, hücre peleti 1-2 mL tam besiyerinde yeniden süspanse edildi ve deneysel gereksinimlere göre yeni kültür kaplarına ekildi.
CCK-8 Hücre Canlılık Analizi
Logaritmik büyüme aşamasındaki GES-1 hücreleri, 96 kuyucuklu plakalara kuyucuk başına 6 × 103 hücre olacak şekilde ekildi ve hücrelerin yapışması için gece boyunca kültüre edildi. Yapışma gerçekleştikten sonra hücreler, farklı konsantrasyonlarda clopidogrel (0, 0.01, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 ve 1.0 mM) ile 24 sa boyunca işleme tabi tutuldu. Kontrol grubu, aynı nihai konsantrasyonda taşıyıcı madde aldı. İşlem sonrası, her kuyucuğa CCK-8 solüsyonu eklendi ve kit talimatlarına uygun olarak 37°C'de inkübe edildi. 450 nm'deki absorbans, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçüldü. Hücre canlılığı, kontrol grubunun yüzdesi olarak hesaplandı. Konsantrasyon-yanıt sonuçlarına dayanarak, sonraki apoptoz, hücre döngüsü, qPCR ve Western blot analizleri için 24 saat boyunca 0.1 mM clopidogrel uygulaması seçildi.
Akış Sitometrisi Analizi
GES-1 hücreleri 6 kuyucuklu plakalara ekildi ve hücre yapışması gerçekleştikten sonra 24 saat boyunca 0,1 mM clopidogrel ilele işleme tabi tutuldu. İşlem sonrası, hem yüzen hem de yapışık hücreler toplandı. Yapışık hücreler EDTA içermeyen tripsin ile digeste edildi, soğuk PBS ile iki kez yıkandı ve bağlanma tamponunda yeniden süspanse edildi. Hücreler, üretici talimatlarına uygun olarak Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit kullanılarak boyandı. Oda sıcaklığında ve karanlıkta inkübasyon sonrası, apoptotik hücreler RaiseCyte 2L6C akış sitometresi kullanılarak tespit edildi. Veriler RaiseFlower veri toplama yazılımı ile elde edildi ve FlowJo yazılımı (versiyon 10.8.1) kullanılarak analiz edildi. Erken apoptotik, geç apoptotik ve toplam apoptotik hücre popülasyonları FlowJo yazılımı ile nicelendirildi.
Hücre Döngüsü Dağılımının Akış Sitometrik Analizi
GES-1 hücreleri 6 kuyucuklu plakalara ekildi ve 24 saat boyunca 0,1 mM klopidogrel ilele işleme tabi tutuldu. İşlemden sonra hücreler toplandı, PBS ile yıkandı ve 4°C'de önceden soğutulmuş %70 etanol ile fikse edildi. Fikse edilen hücreler, kalıntı etanolü uzaklaştırmak için yıkandı ve üretici talimatlarına uygun olarak karanlıkta RNase A ve propidyum iyodür boyama çözeltisi ile inkübe edildi. Hücre döngüsü dağılımı, bir akış sitometresi kullanılarak analiz edildi. Veriler, veri toplama yazılımı kullanılarak elde edildi ve FlowJo yazılımı ile analiz edildi. Hücre döngüsü dağılımları Watson modeli kullanılarak fit edildi ve G0/G1, S ve G2/M fazlarındaki hücrelerin yüzdeleri hesaplandı.
Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR (qPCR)
Toplam RNA, bir RNA ekstraksiyon kiti kullanılarak kit talimatlarına uygun olarak GES-1 hücrelerinden ve sıçan mide dokusu örneklerinden ekstrakte edildi. Doku örnekleri için gastrik mukoza dokuları hızla toplandı, düşük sıcaklık koşulları altında homojenize edildi ve RNA ekstraksiyonuna tabi tutuldu. RNA konsantrasyonu ve saflığı, 260 ve 280 nm'deki absorbans ölçülerek belirlendi. Eşit miktardaki RNA, genomik DNA uzaklaştırma özellikli bir ters transkripsiyon kiti kullanılarak komplemanter DNA'ya (cDNA) ters transkribe edildi. Kantitatif gerçek zamanlı PCR, SYBR Green tabanlı bir PCR master mix kullanılarak gerçekleştirildi. Her reaksiyon; 10 µL 2× master mix, 1 µL cDNA, 0,4 µL ileri primer, 0,4 µL geri primer ve 8,2 µL RNase-free ddH₂O içeren toplam 20 µL hacimde gerçekleştirildi. Termal döngü koşulları şu şekildeydi: 95°C'de 10 dk başlangıç denatürasyonu, ardından 95°C'de 10 sn denatürasyon, 60°C'de 30 sn bağlanma ve 72°C'de 30 sn uzama şeklinde 40 döngü. CHOP, ATF5, Bcl-2 ve Bax ekspresyon seviyeleri belirlendi. İç referans gen olarak GAPDH kullanıldı. Relatif gen ekspresyonu 2−ΔΔCt yöntemi kullanılarak hesaplandı. Primer dizileri Ek Tablo 1'de listelenmiştir.
Western Blot
GES-1 hücrelerinden ve sıçan mide dokusu örneklerinden toplam protein ekstraksiyonu yapıldı. Hücre örnekleri için, işlem görmüş GES-1 hücreleri soğuk PBS ile yıkandı ve proteaz inhibitörü içeren radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lizis tamponu kullanılarak lizlendi. Doku örnekleri için, mide mukozal dokuları düşük sıcaklık koşullarında RIPA tamponunda homojenize edildi ve ardından süpernatantı toplamak için santrifüj edildi. Protein konsantrasyonları BCA protein analizi ile belirlendi. Her şeride toplam 20 µg protein, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrılarak poliviniliden diflorür (PVDF) membranlara aktarıldı. Sığır serum albümini (BSA) ile bloklama işleminden sonra membranlar; CHOP (1:1000), ATF5 (1:1000), Bcl-2 (1:1000), Bax (1:1000) ve β-actin (1:5000) karşıtı primer antikorlar ile 4°C'de gece boyunca inkübe edildi. Yıkamanın ardından membranlar, ilgili yaban turpu peroksidaz-konjuge sekonder antikorlar (1:10000) ile inkübe edildi. Protein bantları, geliştirilmiş kemilüminesans reaktifi kullanılarak görselleştirildi ve bir kemilüminesans görüntüleme sistemi ile kaydedildi. Bant yoğunlukları görüntü analiz yazılımı kullanılarak nicelendirildi ve β-actin'e göre normalize edildi.
Histopatolojik Değerlendirme
Gastrik doku örnekleri, klopidogrel tedavisi sonrası Sprague–Dawley sıçanlarından toplandı ve %10 nötr tamponlu formalinle sabitlendi. Örnekler dehidrate edildi, şeffaflaştırıldı, parafine gömüldü ve 4 µm kalınlığında kesildi. Parafin kesitler hematoksilin ve eozin ile boyandı. Histopatolojik değişiklikler; mukoza morfolojisi, epitelyal bütünlük, ödem ve inflamatuar hücre infiltrasyonu baz alınarak bir ışık mikroskobu altında kalitatif olarak değerlendirildi. Temsili görüntüler kaydedildi. Herhangi bir histolojik skorlama sistemi uygulanmadı.
İmmünohistokimya
Parafine gömülü mide dokusu kesitleri ksilen ile deparafine edildi ve dereceli bir etanol serisi aracılığıyla yeniden hidrate edildi. Isı ile uyarılmış antijen geri kazanımı sitrat tamponunda gerçekleştirildi. Endojen peroksidaz aktivitesi %3 hidrojen peroksit ile 10 dk boyunca bloke edildi ve spesifik olmayan bağlanma, oda sıcaklığında 30 dk boyunca normal keçi serumu ile bloke edildi. Kesitler daha sonra CHOP, ATF5, Bcl-2 ve Bax'a karşı primer antikorlarla birlikte 4°C'de gece boyu inkübe edildi. PBS ile yıkamanın ardından kesitler, uygun yaban turbası peroksidaz-konjuge ikincil antikorla inkübe edildi. İmmünreaktif sinyaller DAB kromojenik çözeltisi kullanılarak görselleştirildi ve ardından hematoksilin ile karşıt boyama yapıldı. Kesitlerledehidrate edildi, şeffaflaştırıldı, lam üzerine monte edildi ve bir ışık mikroskobu altında incelendi. Temsili görüntüler yakalandı ve pozitif boyama alanı görüntü analiz yazılımı kullanılarak nicelendirildi.
İmmünofloresan Boyama
Parafin gömülü mide doku kesitleri deparafine edildi, rehidre edildi ve sitrat tamponunda ısı ile tetiklenen antijen geri kazanım işlemine tabi tutuldu. Normal keçi serumu ile 30 dk boyunca bloklama yapıldıktan sonra kesitler; CHOP (1:50), ATF5 (1:100), Bcl-2 (1:50) ve Bax (1:200) karşıtı primer antikorlarla 4°C'de gece boyunca inkübe edildi. PBS ile yıkamanın ardından kesitler, uygun floresan sekonder antikorlar (1:500) ile oda sıcaklığında, karanlıkta 1 saat boyunca inkübe edildi ve ardından DAPI ile karşı boyama yapıldı. Görüntüler, bir floresan mikroskobu kullanılarak ×200 büyütmede kaydedildi. Her hayvandan rastgele seçilen, birbiriyle örtüşmeyen üç alan Image-Pro Plus 6.0 kullanılarak analiz edildi ve floresan yoğunluğu IOD/Area olarak ifade edildi. Analize grup başına üç hayvan dahil edildi.
Enzim Bağlı İmmunosorbent Deneyi (ELISA)
Kan örnekleri, tedavi sonrası Sprague–Dawley sıçanlarından toplandı ve oda sıcaklığında pıhtılaşmaya bırakıldı. Serum, santrifüj ile ayrıldı ve analiz edilene kadar −80°C'de saklandı. IL-1β, IL-6 ve TNF-α serum düzeyleri, kit talimatlarına uygun olarak ELISA kitleri kullanılarak ölçüldü. Absorbans, bir mikroplaka okuyucu ile ölçüldü ve sitokin konsantrasyonları standart eğrilerle hesaplandı.
İstatistiksel Analiz
İstatistiksel analizler, istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Veriler, ortalama ± SD olarak sunulmuştur. Normalite ve varyans homojenliği, sırasıyla Shapiro–Wilk testi ve Levene testi kullanılarak değerlendirilmiştir. İki grup arasındaki karşılaştırmalar Student's t-testi ile yapılmıştır. Birden fazla grup arasındaki karşılaştırmalar, tek yönlü varyans analizi ve ardından Dunnett post hoc testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. P < 0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Tüm hücre deneyleri, en az üç bağımsız biyolojik tekrarlı olarak yürütülmüştür.
Sonuçlar
Clopidogrel, GES-1 Hücre Canlılığını Azaltır ve In Vitro Apoptozu Artır
İlk olarak, klopidogrelin GES-1 hücre canlılığı ve apoptozu üzerindeki etkilerini araştırdık. CCK-8 analizleri, klopidogrel uygulamasının GES-1 hücrelerinin canlılığını önemli ölçüde azalttığını göstermiştir (Şekil 1A,B), bu da hücre canlılığının azaldığına işaret etmektedir. Test edilen konsantrasyon aralığında hücre canlılığındaki genel azalma baz alınarak, sonraki tüm hücre deneyleri için 24 saat boyunca 0,1 mM klopidogrel seçilmiştir. Ardından, apoptozu ve hücre döngüsü dağılımını analiz etmek için akış sitometrisi gerçekleştirilmiştir (Şekil 1C–F). Akış sitometrik analiz, G0/G1 popülasyonunda azalma ve G2/M popülasyonunda belirgin bir artış olmaksızın, S fazındaki hücre oranında bir artış olduğunu göstermiş; bu durum G2/M-fazı duraksamasından ziyade S-fazı birikimine işaret etmiştir. Sonuçlar, klopidogrelin kontrol grubuna kıyasla GES-1 hücrelerinde apoptozu önemli ölçüde artırdığını ve hücre döngüsü dağılımını değiştirdiğini ortaya koymuştur. Toplamda bu bulgular, klopidogrelin GES-1 hücre canlılığını azalttığını, artan apoptoz ve hücre döngüsü ilerlemesindeki değişikliklerle ilişkili olduğunu göstermektedir. Bu bulgular, seçilen deneysel koşullar altında doğrudan klopidogrel ana bileşiğine maruz kalma sonrası sitotoksik yanıtları kanıtlamaktadır. Ancak bu sonuçlar, klinik olarak ilgili maruziyet seviyelerinde benzer etkilerin oluştuğunu veya gözlemlenen yanıtların aktif klopidogrel metaboliti aracılığıyla gerçekleştiğini kesin olarak ortaya koymamaktadır.
Şekil 1Clopidogrel, GES-1 hücre canlılığını azaltır ve apoptozu artır. (Aİnsan gastrik epitel hücre hattı GES-1'in hücre canlılığı, artan konsantrasyonlarda clopidogrel (0–1,0 mM) ile 24 saat boyunca uygulanan işlem sonrası CCK-8 testi kullanılarak değerlendirilmiştir.B) Kontrol grubu ile 24 saat boyunca 0,1 mM klopidogrel ile tedavi edilen grup arasındaki hücre canlılığının kantitatif karşılaştırması. (C) Watson modeli kullanılarak analiz edilen temsili akış sitometrik hücre döngüsü profilleri. (D) G0/G1, S ve G2/M evrelerindeki hücre yüzdelerinin kantifikasyonu. Klopidogrel tedavisi, G2/M popülasyonunda belirgin bir artış olmaksızın S-evresi popülasyonunu artırmıştır. (E) Annexin V-floresan izotiyosiyanat (FITC) ve propidyum iyodür (PI) boyamasının ardından apoptozu gösteren temsilci akış sitometrisi nokta grafikleri. (F) Toplam apoptotik hücre popülasyonunun nicelendirilmesi. Tüm hücre deneyleri, üç bağımsız biyolojik tekrar (n = 3) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulmuştur. İstatistiksel anlamlılık, kontrol grubu ile karşılaştırma yapılarak belirlenmiştir. ***P < 0.001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Klopidogrelle indüklenen gastrik hasar, sistemik inflamasyon ile ilişkilidir
Sprague–Dawley sıçanlar rastgele iki gruba (grup başına n = 6) ayrıldı: bir kontrol grubu ve günlük gavage yoluyla klopidogrel uygulanan grup. Klopidogrel dozu ve 3 günlük tedavi rejimi, daha önce raporlanmış klopidogrel kaynaklı gastrik hasardır sıçan modeline göre seçilmiştir16. 3 gün sonra, hematoksilin ve eozin (H&E) boyaması için gastrik dokular toplandı. Histopatolojik inceleme, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında klopidogrel uygulanan grupta gastrik mukoza erozyonları, ödem ve inflamatuar hücre infiltrasyonu olduğunu ortaya koydu (Şekil 2A). Serum inflamatuar sitokin seviyeleri ELISA ile ölçüldü. Klopidogrel uygulanan grup, kontrol grubuna göre anlamlı derecede daha yüksek serum interlökin (IL)-1β, IL-6 ve tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) seviyeleri gösterdi (Şekil 2B–D). Bu bulgular, klopidogrel tedavisinin gastrik mukoza hasarı ve artan sistemik inflamatuar yanıtlar ile ilişkili olduğunu göstermektedir15,16.
Şekil 2Clopidogrel, sıçanlarda gastrik mukoza hasarı indükler ve dolaşımdaki inflamatuar sitokin seviyelerini artır. (A) Temsili hematoksilin ve eosin (H&E)&Kontrol ve klopidogrel uygulanmış Sprague-Dawley sıçanlarının mide mukozasından alınan H&E boyalı kesitler. Histolojik inceleme, kontrol grubunda korunmuş mide mukozası mimarisini ve klopidogrel uygulanan grupta morfolojik değişiklikleri göstermektedir. Sarı oklar mide mukozası epitel hücrelerini, kırmızı oklar mukoza tabakası içindeki fokal konjesyonu ve siyah oklar hafif inflamatuar hücre infiltrasyonunu belirtmektedir. Orijinal büyütme, ×20; ölçek çubuğu = 100 µm. grup başına n = 6 hayvan. (B–D) İnterlökin (IL)-1β, IL-6 ve tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) serum konsantrasyonları, enzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) kullanılarak ölçülmüştür. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur; grup başına n = 6 hayvan. ***P < kontrol grubu ile karşılaştırıldığında 0,01. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Clopidogrel, sıçan mide mukozasında ER stres ve apoptozla ilişkili belirteçleri değiştirir
Klopidogrel kaynaklı gastrik hasarla ilişkili moleküler değişiklikleri araştırmak için gastrik doku kesitlerinde immünohistokimyasal boyama gerçekleştirilmiştir. Temsili görüntüler, klopidogrel uygulanan grupta CHOP, ATF5 ve Bax boyamasının kontrol grubuna göre daha güçlü olduğunu, Bcl-2 boyamasının ise daha zayıf olduğunu göstermiştir (Şekil 3A). IOD/alan miktarının kantitatif analizi, klopidogrel tedavisi sonrası CHOP, ATF5 ve Bax boyamasının anlamlı düzeyde arttığını kanıtlamıştır (Şekil 3B,C,E). Bcl-2 boyaması, fark istatistiksel anlamlılığa ulaşmasa da azalan bir eğilim göstermiştir (Şekil 3D). Bu sonuçlar, klopidogrel tedavisinin sıçan gastrik mukozasında stres ve apoptozla ilişkili proteinlerin ekspresyonunun değişmesiyle ilişkili olduğunu göstermektedir. İmmünofloresan analizi, klopidogrel uygulanan grubun gastrik mukoza dokusunda daha güçlü CHOP ve ATF5 sinyalleri olduğunu göstermiştir. Kantitatif analiz, CHOP (Şekil 4A ve 5A) ve ATF5 (Şekil 4B ve 5B) miktarlarındaki anlamlı artışları onaylarken; Bcl-2 (Şekil 4C ve 5C) ve Bax (Şekil 4D ve 5D) istatistiksel anlamlılığa ulaşmadan sırasıyla azalan ve artan eğilimler sergilemiştir. Birlikte değerlendirildiğinde bu bulgular, klopidogrel tedavisinin sıçan gastrik mukozasında ER stresi ve apoptozla ilişkili belirteçlerin ekspresyonunun değişmesiyle ilişkili olduğunu göstermektedir.
Şekil 3Gastrik dokuda endoplazmik retikulum stresi ve apoptozla ilişkili proteinlerin immünohistokimyasal tespiti. (A) Kontrol ve klopidogrel uygulanmış Sprague–Dawley sıçanlarının gastrik mukoza dokusunda C/EBP homolog proteini (CHOP), aktive edici transkripsiyon faktörü 5 (ATF5), B-hücreli lenfoma 2 (Bcl-2) ve Bcl-2 ilişkili X proteininin (Bax) temsili immünohistokimyasal boyama görüntüleri. Kahverengi boyama pozitif immünoreaktiviteyi göstermektedir ve çekirdekler hematoksilin ile karşı boyanmıştır. Gösterilen görüntüler, her grupta üç hayvanın yer aldığı analiz edilen tüm örnekleri temsil etmektedir. Orijinal büyütme, ×20; ölçek çubuğu = 100 µm. (B–E) CHOP, ATF5, Bcl-2 ve Bax için birim alan başına entegre optik yoğunluğun (IOD/Alan) sırasıyla kantitatif analizi. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. *P < 0,05 ve **P < kontrol grubuyla karşılaştırıldığında 0,01. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4Gastrik dokuda endoplazmik retikulum stres ve apoptozla ilişkili proteinlerin immünofloresan tespiti. Kontrol ve klopidogrel uygulanan Sprague–Dawley sıçanlarının mide mukoza dokusunda C/EBP homolog proteininin (CHOP), aktive edici transkripsiyon faktörü 5'in (ATF5), B-hücre lenfoma 2'nin (Bcl-2) ve Bcl-2 ile ilişkili X proteininin (Bax) lokalizasyonunu gösteren temsili immünofloresan görüntüler. Çekirdekler 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (mavi) ile karşı boyanmış olup pozitif immünofloresan boyama kırmızı renkte gösterilmiştir. Birleştirilmiş görüntüler sağ sütunda yer almaktadır.A) CHOP. (B) ATF5. (C) Bcl-2. (D) Bax. Orijinal büyütme, ×20; ölçek çubuğu = 100 µmGösterilen görüntüler, grup başına n = 3 hayvan olmak üzere analiz edilen tüm örnekleri temsil etmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5Gastrik dokuda endoplazmik retikulum stres ve apoptozla ilişkili proteinlerin immünofloresan kantitatif analizi. (A–DKontrol ve klopidogrel uygulanmış Sprague–Dawley sıçanların gastrik mukoza dokusunda C/EBP homolog proteini (CHOP), aktive edici transkripsiyon faktörü 5 (ATF5), B-hücre lenfoma 2 (Bcl-2) ve Bcl-2 ilişkili X proteini (Bax) için birim alan başına entegre optik yoğunluğun (IOD/Alan) nicelleştirilmesi. Her hayvan için, doku kesiti başına rastgele seçilmiş, örtüşmeyen üç mikroskobik alan görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edilmiş ve istatistiksel analiz için ortalama değer kullanılmıştır. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur; grup başına n = 3 hayvan. *P < 0,05 ve **P < kontrol grubu ile karşılaştırıldığında 0,01. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Clopidogrel, GES-1 hücrelerinde ve sıçan mide dokusunda ER stres ve apoptozla ilişkili gen ve protein ekspresyonunu değiştirir
Önceki çalışmalar, ER stresinin hücresel stres yanıtlarında ve apoptozda kilit bir rol oynadığını göstermiştir17,18. Klopidogrel tedavisi sonrası ER stresiyle ilişkili belirteçlerdeki değişiklikleri değerlendirmek için, GES-1 hücrelerinde CHOP ve ATF5 ekspresyonu incelenmiştir. qRT-PCR, klopidogrel tedavisi sonrası CHOP ve ATF5 mRNA ekspresyonunda artış olduğunu göstermiştir. Western blot analizi, artmış CHOP ve ATF5 protein ekspresyonunu daha da doğrulamıştır (Şekil 6A–E). Ardından, GES-1 hücrelerinde ve sıçan mide dokusunda apoptozla ilişkili proteinlerin ekspresyonu değerlendirilmiştir. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, klopidogrel tedavisi Bax ekspresyonunu artırmış ve Bcl-2 ekspresyonunu azaltmış, bu da Bax/Bcl-2 oranında artışla sonuçlanmıştır (Şekil 6A–J). Bu ekspresyon modelleri, hem GES-1 hücrelerinde hem de sıçan mide dokusunda, hem mRNA hem de protein düzeylerinde tutarlı bir şekilde gözlemlenmiştir. Birlikte değerlendirildiğinde, bu bulgular klopidogrel tedavisinin her iki deneysel modelde de ER stresi ve apoptozla ilişkili belirteçlerin değişen ekspresyonu ile ilişkili olduğunu kanıtlamaktadır.
Şekil 6Clopidogrel tedavisi sonrası GES-1 hücrelerinde ve sıçan mide dokusunda endoplazmik retikulum stres ve apoptozla ilişkili belirteçlerin ekspresyonu. (A–D( ) İnsan gastrik epitel hücre hattı GES-1'de C/EBP homolog proteini (CHOP), aktive edici transkripsiyon faktörü 5 (ATF5), B-hücre lenfoma 2 (Bcl-2) ve Bcl-2-ilişkili X proteininin (Bax) kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile belirlenen göreceli haberci RNA (mRNA) ekspresyonu. (E) GES-1 hücrelerinde CHOP, ATF5, Bcl-2 ve Bax protein ekspresyonunun ilgili densitometrik kantifikasyonları ile birlikte temsilci Western blot görüntüleri. Protein ekspresyon seviyeleri β-aktine göre normalize edilmiştir. Hücre deneyleri, üç bağımsız biyolojik tekrar (n = 3) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. (F–I) Sıçan mide dokusunda CHOP, ATF5, Bcl-2 ve Bax'ın qRT-PCR ile belirlenen bağıl mRNA ekspresyonu. (J) Sıçan mide dokusundaki CHOP, ATF5, Bcl-2 ve Bax protein ekspresyonlarının karşılık gelen densitometrik nicelleştirmeleriyle birlikte temsilî Western blot görüntüleri. Protein ekspresyon seviyeleri β-aktine göre normalize edilmiştir. Doku deneyleri grup başına n = 3 hayvanı içermektedir. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. İstatistiksel anlamlılık, kontrol grubu ile karşılaştırma yapılarak belirlenmiştir. *P < 0.05, **P < 0,01 ve ***P < 0.001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Kolektif olarak sonuçlar, klopidogrel tedavisinin GES-1 hücre canlılığını azalttığını, apoptozu artırdığını, ER stresi ve apoptozla ilişkili belirteçlerin ekspresyonunu değiştirdiğini ve sıçanlarda dolaşımdaki inflamatuar sitokin seviyelerinin artışıyla beraber seyreden gastrik mukoza hasarı ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Bu bulgular, klopidogrel tedavisinin gastrik mukoza hasarı ve eş zamanlı olarak ER stresi ve apoptozla ilişkili belirteçlerdeki değişikliklerle ilişkili olduğu yönündeki çalışma hipotezini desteklemektedir.
Veri Kullanılabilirliği:
Bu çalışma sırasında üretilen veya analiz edilen tüm veriler, bu yayınlanmış makalede ve ek materyallerinde yer almaktadır. RT-PCR için kullanılan primer dizileri Ek Tablo 1'de sunulmuştur. Orijinal deneysel veri setleri ve kaynak dosyaları dahil olmak üzere tüm şekilleri ve münferit şekil panellerini destekleyen ham veriler, beraberindeki Ham Veriler ek arşivinde (sıkıştırılmış dosya) sağlanmıştır.
Ek Tablo 1. RT-PCR analizi için kullanılan primer sekansları. Bu çalışmada GAPDH, CHOP, ATF5, Bcl-2 ve Bax'in RT-PCR analizlerinde kullanılan ileri (F) ve geri (R) primer sekansları 5′–3′ yöneliminde listelenmiştir.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tartışma
Klopidogrel, kardiyovasküler hastalıkların önlenmesi ve tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır; ancak klinik kullanımı, peptik ülserler, kanama ve perforasyon dahil olmak üzere kanama riskleri ve gastrointestinal komplikasyonlarla ilişkilidir19. Bu nedenle, klopidogrel kaynaklı gastrik yaralanmalarla ilişkili moleküler değişikliklerin anlaşılması, bu yan etkilerin önlenmesi ve yönetilmesinin iyileştirilmesi açısından önemlidir. Mevcut çalışmada, klopidogrelin gastrik epitel hücreleri ve sıçan gastrik dokusu üzerindeki etkilerini araştırdık; hücre canlılığı, apoptoz, inflamatuar yanıtlar ile ER stres ve apoptozla ilişkili belirteçlerin ekspresyonundaki değişiklikleri gözlemledik. Bu bulgular, klopidogrel kaynaklı gastrik mukoza yaralanmasının, ER stres ve apoptozla ilişkili belirteç ekspresyonundaki değişimlerle ilişkili olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, herhangi bir farmakolojik kurtarma veya genetik fonksiyon kaybı deneyi gerçekleştirilmediği için, bu bulgular ER stres ve apoptoz arasında nedensel bir ilişki kurmamaktadır.
Önceki çalışmalar, klopidogrelin gastrik mukoza onarımını bozabileceğini ve gastrik ülser iyileşmesini geciktirebileceğini göstermiştir20. Mevcut çalışmada, CCK-8 analizleri klopidogrelin GES-1 hücrelerinin canlılığını azalttığını, akış sitometrisi ise artan apoptozu ve değişmiş hücre döngüsü ilerlemesini ortaya koymuştur (Şekil 1). Bu bulgular, gastrik epitelyal hücrelerde klopidogrel kaynaklı apoptoza ilişkin önceki raporlarla tutarlıdır21. Bu gözlemler, klopidogrel tedavisinin, gastrik mukoza hasarına katkıda bulunabilecek bozulmuş gastrik epitelyal hücre canlılığı ve artmış apoptoz ile ilişkili olduğunu düşündürmektedir11. Sıçan modelinde, H&E boyaması klopidogrel tedavisi sonrası gastrik mukoza hasarını göstermiştir (Şekil 2A). IL-1β, IL-6 ve TNF-α serum düzeyleri de anlamlı şekilde artmış olup (Şekil 2B–D), bu durum gastrik mukoza hasarı ile ilişkili bir inflamatuar yanıtı işaret etmektedir22. Ayrıca, immünohistokimyasal ve immünofloresan analizler, klopidogrel tedavisi alan sıçanların gastrik dokularında, kontrol grubuna kıyasla ER stresi ve apoptoz ile ilişkili belirteçlerin ekspresyonunun değiştiğini göstermiştir (Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5).
CHOP, ATF5, Bcl-2 ve Bax, hücresel stres yanıtlarının ve apoptozun önemli düzenleyicileridir23,24,25,26. Bu çalışmada, klopidogrel tedavisi hem GES-1 hücrelerinde hem de sıçan mide dokusunda CHOP ve ATF5 ekspresyonunda artış ve Bax ile Bcl-2 ekspresyonunda değişimle ilişkilendirilmiştir (Şekil 6). Bu bulgular, stres ve apoptozla ilişkili belirteçlerde eş zamanlı değişimler olduğunu göstermektedir. Ancak, mevcut çalışma yalnızca ekspresyon değişikliklerini değerlendirmiş olup, bu moleküllerin klopidogrel kaynaklı gastrik mukoza hasarını doğrudan yönlendirip yönlendirmediğini belirlememiştir. Benzer şekilde, artmış bir Bax/Bcl-2 oranı gözlemlense de çalışma, mitokondriyal apoptoz yolunun aktivasyonunu doğrudan kanıtlamamıştır. Bu nedenle, söz konusu bulgular nedensel bir sinyal mekanizmasının kanıtı olarak değil, ilişkiler olarak yorumlanmalıdır.
Bu çalışma, clopidogrel tedavisinin neden olduğu morfolojik ve moleküler değişiklikleri değerlendirmek için in vivo bir sıçan modeli ile GES-1 hücrelerinde keşifsel doğrudan maruziyet deneylerini birleştirmektedir. in vivo model, gastrik mukoza hasarının birincil kanıtlarını sunarken, GES-1 deneyleri ana bileşiğe doğrudan maruz kalma sonrası hücresel yanıtlar hakkında destekleyici kanıtlar sağlamaktadır. Histopatolojik analiz, inflamatuar sitokin ölçümü, immünohistokimya, immünofloresans, qRT-PCR ve Western blotting yöntemlerinin kombinasyonu, gastrik hasarla ilişkili morfolojik ve moleküler değişikliklerin kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır. Bu deneysel yaklaşım, antiplatelet ajanların gastrointestinal etkilerinin araştırılması ve gelecek çalışmalarda potansiyel koruyucu müdahalelerin değerlendirilmesi için faydalı olabilir.
Bazı sınırlamalar kabul edilmelidir. Clopidogrel, hepatik metabolik aktivasyon gerektiren bir ön ilaçtır; buna karşılık, GES-1 hücrelerinin ana bileşiğe doğrudan maruz bırakılması bu süreci yeniden üretmez veya klinik farmakokinetiği tam olarak yansıtmaz. Ek olarak, in vitro ortamda kullanılan nispeten yüksek konsantrasyonlar spesifik olmayan sitotoksisiteye neden olmuş olabilir. Bu nedenle, GES-1 deneyleri, doğrudan maruz kalma koşulları altındaki hücresel yanıtların keşifsel kanıtları olarak değerlendirilmelidir. CCK-8 analizi, hücre canlılığındaki azalma için pozitif bir kontrol içermemekte olup bu durum analiz performansının bağımsız olarak doğrulanmasını kısıtlamıştır. Gözlemlenen ER stresiyle ilişkili değişikliklerden sorumlu olan yukarı akış mekanizmaları araştırılmamış ve ER stresinin Bax/Bcl-2 dengesini ve apoptozu doğrudan düzenleyip düzenlemediğini belirlemek için farmakolojik inhibisyon, gen nakavt (knockdown) veya gen nakavt (knockout) deneyleri gerçekleştirilmemiştir. Gelecekteki çalışmalar, ana bileşiği aktif metabolitiyle karşılaştırmalı, uygun bir metabolik aktivasyon sistemi entegre etmeli ve bu ilişkileri aydınlatmak için fonksiyonel müdahale deneyleri yürütmelidir. Ayrıca, Annexin V-FITC/PI analizine iyi tanımlanmış bir apoptoz indükleyici pozitif kontrol dahil edilmemiştir. Bu nedenle, clopidogrel tedavisi araç kontrolüne kıyasla artmış bir Annexin V-pozitif hücre popülasyonu ile ilişkilendirilmiş olsa da, apoptoz analizinin teknik performansı pozitif kontrol koşulu kullanılarak bağımsız olarak doğrulanmamıştır. Gelecekteki çalışmalar, aynı deneysel seriye staurosporin gibi bir apoptoz indükleyici dahil etmelidir.
Sonuç olarak, oral klopidogrel tedavisi sıçanlarda gastrik mukoza hasarına yol açmış ve ER stresi ile apoptozla ilişkili belirteçlerdeki değişiklikler eşlik etmiştir. GES-1 hücrelerinin doğrudan klopidogrel ana bileşiğine maruz bırakılması da deneysel koşullar altında hücre canlılığını azaltmış ve ilgili moleküler belirteçleri değiştirmiştir. Ancak, hücre modeli hepatik biyovaktivasyonu yeniden üretmediği ve nispeten yüksek konsantrasyonlar kullanıldığı için, in vitro bulgular doğrudan klinik maruziyete ekstrapole edilemez ve spesifik olmayan sitotoksisite dışlanamaz. Genel olarak bulgular, nedensel ilişkilerin kurulması için daha fazla mekanistik çalışmaya ihtiyaç duyulsa da, klopidogrel kaynaklı gastrik mukoza hasarının ER stresi ve apoptozla ilişkili belirteç ekspresyonundaki değişikliklerle ilişkili olduğunu göstermektedir.
Açıklamalar
Çıkar Çatışması:
Yazarlar, bu çalışmada rapor edilen çalışmaları etkilediği görülebilecek herhangi bir finansal çıkar çatışması veya kişisel ilişkilerinin bulunmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma, “Klopidogrel Kaynaklı Gastrik Mukozal Epitel Hücre Apoptozunda CHOP/ATF5/Bcl-2 Sinyal Yolu Üzerine Temel Araştırmalar” (Proje No. 2023BWKY009) projesi tarafından desteklenmiştir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Annexin V-FITC/PI Apoptozis Tespit Kiti | Elabscience | E-CK-A211 | Apoptoz tespit kiti |
| ATF5 Antikoru | Proteintech | 67066-1-AP | Primer antikor |
| BCA Protein Analiz Kiti | Solarbio | PC0020 | Protein konsantrasyon analizi |
| Bax Antikoru | Proteintech | 50599-1-AP | Birincil antikor |
| Bcl-2 Antikoru | Proteintech | 26593-1-AP | Primer antikor |
| β-aktin Antikoru | Proteintech | 66009-1-Ig | Birincil antikor |
| Bloklama Tamponu | Beyotime | P0252 | Western blot bloklama solüsyonu |
| CCK-8 Hücre Sayım Kiti | KeyGen Biotech | KGA317 | Hücre canlılık analizi |
| cDNA Sentez Kiti | TransGen Biotech | AU341 | Genomik DNA gidermeli birinci zincir cDNA sentez kiti |
| Hücre Döngüsü Tespit Kiti | Lianke Biotechnology | CCS012 | Hücre döngüsü analiz kiti |
| CHOP Antikoru | Proteintech | 15204-1-AP | Primer antikor |
| Klopidogrel Hidrojen Sülfat (Saflık ≥99%) | Macklin | C874834 | Deneysel ilaç |
| DAB Kromojen Kiti | Beyotime | P0201M | İmmünohistokimya substratı |
| Dimetil Sülfoksit (DMSO) | MedChemExpress | HY-Y0320C | Çözücü |
| Geliştirilmiş Kemilüminesans (ECL) Reajanı | Meilunbio | MA0186 | Kemilüminesans substratı |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Hücre kültürü takviyesi |
| GES-1 İnsan Gastrik Epitel Hücre Hattı | iCell Bioscience | iCell-h062 | İnsan gastrik epitel hücre hattı |
| Hematoksilin ve Eozin (H&E)&E) Boyama Kiti | Beyotime | C0105S | Histolojik boyama |
| Yaban Turbu Peroksidazı (HRP)-Konjuge İkincil Antikor | Proteintech | RGAM001/RGAR001 | Sekonder antikor |
| Hidrojen Peroksit Çözeltisi | Absin | ABS9333-100mL | Endojen peroksidaz bloklama reaktifi |
| IL-1β ELISA Kiti | MEIMIAN | MM-0047R2 | Serum sitokin analizi |
| IL-6 ELISA Kiti | MEIMIAN | MM-0190R2 | Serum sitokin analizi |
| Mikroplaka Okuyucu | Beijing Liuyi Biyoteknoloji | WD-2102B | Absorbans ölçümü |
| Penisilin-Streptomisin Çözeltisi | Solarbio | P1400 | Antibiyotik çözeltisi |
| Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | Servicebio | G4202-500ML | 1× PBS |
| Poliviniliden Diflorür (PVDF) Membran | Millipore | IPVH00010 | Western blot membranı |
| Primer Antikor Seyreltici | Beyotime | P0023A | Antikor seyreltici |
| Protein Moleküler Ağırlık Markörü | Yeasen | WJ103 | Önceden boyanmış protein merdiveni |
| Kantitatif Real-Time PCR Master Mix (SYBR Green) | CWBio | CW3008 | qPCR reaktifi |
| Radyoimmünopresipitasyon Analizi (RIPA) Lizis Tamponu | Solarbio | Lütfen çevirmek istediğiniz İngilizce metni sağlayın. Metni ilettiğinizde, belirtmiş olduğunuz tüm bilimsel çeviri standartlarına ve akademik kriterlere uygun olarak çeviriyi gerçekleştireceğim. | Protein ekstraksiyon tamponu |
| RNaz A | Lianke Biotechnology | CCS012 | Hücre döngüsü analizi reaktifi |
| RPMI-1640 Besiyeri | Servicebio | G4535-500ML | Bazal hücre kültürü ortamı |
| Sprague-Dawley Sıçanları | Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | Lütfen çevirmemi istediğiniz kaynak metni sağlayın. Metni ilettiğinizde, belirtmiş olduğunuz akademik standartlara, bilimsel terminolojiye ve JoVE yayın formatına uygun olarak çeviriyi gerçekleştireceğim. | SPF derecesi |
| TNF-α ELISA Kiti | MEIMIAN | MM-0180R2 | Serum sitokin analizi |
| Toplam RNA Ekstraksiyon Kiti | TransGen Biotech | ER501-01 | RNA ekstraksiyon kiti |
| Tripsin-EDTA Çözeltisi | Solarbio | T1300 | Hücre disosiasyon reaktifi |
Kaynaklar
- Mills JC, Shivdasani RA. Gastric epithelial stem cells. Gastroenterology. 2011;140(2):412-424.
- Zhou CB, et al. The role of pyroptosis in gastrointestinal cancer and immune responses to intestinal microbial infection. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2019;1872(1):1-10.
- Boltin D, Niv Y. Pharmacological and alimentary alteration of the gastric barrier. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2014;28(6):981-994.
- Kwon DA, et al. Protective effects of a standardized extract (HemoHIM) using indomethacin- and ethanol/HCl-induced gastric mucosal injury models. Pharm Biol. 2019;57(1):543-549.
- Guo XZ, et al. Effect of Bax, Bcl-2 and Bcl-xL on regulating apoptosis in tissues of normal liver and hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 2002;8(6):1059-1062.
- Gomi A, et al. Effect of Bifidobacterium bifidum BF-1 on gastric protection and mucin production in an acute gastric injury rat model. J Dairy Sci. 2013;96(2):832-837.
- Chiou SK, et al. Suppression of growth arrest and DNA damage-inducible 45alpha expression confers resistance to sulindac- and indomethacin-induced gastric mucosal injury. J Pharmacol Exp Ther. 2010;334(3):693-702.
- Chen X, et al. Endoplasmic reticulum stress: molecular mechanism and therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8(1):352.
- Lian X, et al. ATF5-regulated mitochondrial unfolded protein response attenuates neuronal damage in epileptic rats by reducing endoplasmic reticulum stress through mitochondrial ROS. Neurochem Res. 2024;49(2):388-401.
- He C, et al. Progression of gastrointestinal injury during antiplatelet therapy after percutaneous coronary intervention: a secondary analysis of the OPT-PEACE randomized clinical trial. JAMA Netw Open. 2023;6(11):e2343219.
- Zongdan J, et al. The mechanism of miR-363-3p/DUSP10 signaling pathway involved in the gastric mucosal injury induced by clopidogrel. Toxicol Mech Methods. 2021;31(2):150-158.
- Chan FK, et al. Clopidogrel versus aspirin and esomeprazole to prevent recurrent ulcer bleeding. N Engl J Med. 2005;352(3):238-244.
- Taha AS, et al. Upper gastrointestinal mucosal abnormalities and blood loss complicating low-dose aspirin and antithrombotic therapy. Aliment Pharmacol Ther. 2006;23(4):489-495.
- Wu HL, et al. Increased endoplasmic reticulum stress response is involved in clopidogrel-induced apoptosis of gastric epithelial cells. PLoS One. 2013;8(9):e74381.
- Forsgard RA, et al. Intestinal permeability to iohexol as an in vivo marker of chemotherapy-induced gastrointestinal toxicity in Sprague-Dawley rats. Cancer Chemother Pharmacol. 2016;78(4):863-874.
- Wu H, et al. Clopidogrel-induced gastric injury in rats is attenuated by stable gastric pentadecapeptide BPC 157. Drug Des Devel Ther. 2020;14:5599-5610.
- Zhu XM, et al. The involvement of endoplasmic reticulum stress response in immune dysfunction of dendritic cells after severe thermal injury in mice. Oncotarget. 2017;8(6):9035-9052.
- Oakes SA, Papa FR. The role of endoplasmic reticulum stress in human pathology. Annu Rev Pathol. 2015;10:173-194.
- Abrignani MG, et al. Gastroprotection in patients on antiplatelet and/or anticoagulant therapy: a position paper of the National Association of Hospital Cardiologists (ANMCO) and the Italian Association of Hospital Gastroenterologists and Endoscopists (AIGO). Eur J Intern Med. 2021;85:1-13.
- Takahashi K, et al. Influence of antiplatelet drugs on gastric ulcer healing after endoscopic submucosal dissection in patients with early gastric cancer. DEN Open. 2025;5(1).
- Wu H, et al. Role of MKP-5-p38/MAPK pathway in clopidogrel-induced gastric mucosal epithelial cells apoptosis and tight junction dysfunction. Am J Transl Res. 2020;12(5):1741-1753.
- Fu X, et al. Protective effect of teprenone on gastric mucosal injury induced by dual antiplatelet therapy in rats. Am J Transl Res. 2021;13(4):2702-2709.
- Oyadomari S, Mori M. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress. Cell Death Differ. 2004;11(4):381-389.
- Sears TK, Angelastro JM. The transcription factor ATF5: role in cellular differentiation, stress responses, and cancer. Oncotarget. 2017;8(48):84595-84609.
- Zhang Y, et al. Puerarin attenuates neurological deficits via Bcl-2/Bax/cleaved caspase-3 and Sirt3/SOD2 apoptotic pathways in subarachnoid hemorrhage mice. Biomed Pharmacother. 2019;109:726-733.
- Manas A, et al. Immunohistochemical detection of the pro-apoptotic BaxΔ2 protein in human tissues. Histochem Cell Biol. 2020;154(1):41-53.
Yeniden basım ve izinler
Bu makale yayımlandı
Video yakında