Yöntem makalesi

Akciğer dokusunda Elastik Lif Profili Nicel Görüntüleme Analizleriyle

DOI:

10.3791/72114

⸱

4 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Molecular Medicine and Experimental Immunology Bonn, University of Bonn, University Hospital Bonn, 2Institute for General Pathology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz, 3TRON Translational Oncology Mainz

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, fare akciğer dokusunda elastik lif görselleştirme ve nicel profilleme için doku hazırlığını detaylandıran bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, fizyolojik ve patolojik durumlarda doku mimarisi, mekansal lif organizasyonu ve hücre dışı matriks yeniden modellenmesinin sağlam bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akciğer ekstrasellüler matriksin (ECM) yeniden şekillendirilmesi, akciğer hasarı ve hastalığının önemli bir özelliğidir. Elastik lifler, akciğer ECM'nin merkezi bir bileşenidir; normal solunum fonksiyonu için gerekli dayanıklılık ve geri tepme sağlar ve bunların bozulması, doku mekaniğinin bozulmasına katkıda bulunur. Bu protokol, fare akciğer dokusunun hazırlanması ve analizi için sağlam ve tekrarlanabilir bir iş akışını tanımlar; özellikle elastik liflerin görselleştirilmesi ve nicel profillenmesine odaklanır. Elastin yapılarını korumak ve tespit etmek için optimize edilmiş doku işleme ve histolojik boyama yöntemlerini ortaya koyar. Ayrıca, protokol akciğer içinde elastik lif bolluğu, organizasyonu ve mekansal dağılımı nicel olarak değerlendirilmesini sağlayan bir görüntü analiz boru hattını detaylandırır. İş akışı ayrıca QuPath'te leke vektör tahminini, Fiji/ImageJ'de renk dekonvolüsyonunu ve TWOMBLI tabanlı görüntü analizini de içererek elastik lif bolluğu, dallanma ve ağ karmaşıklığının nicel olarak değerlendirilmesini mümkün kılar. Tekrarlanabilirliği sağlamak ve kullanıcıya bağlı önyargıyı en aza indirmek için görüntü alımı, ilgi alanı seçimi, parametre optimizasyonu ve kalite kontrolü stratejileri dahil edilmiştir. Bu iş akışını kullanarak, obez farelerin akciğerlerinde elastik lif organizasyonu ve ağ mimarisindeki değişiklikleri başarıyla tespit ettik ve bunun hastalıkla ilişkili ECM yeniden modellemesinin tespitinde uygulanabilirliğini gösterdik. Bu yaklaşımlar birlikte, elastik lif yeniden modellemesini ve bunun fizyolojik ve patolojik durumlarda doku mimarisine katkısını incelemek için kapsamlı bir çerçeve sağlar. Bu yöntem, fibroblast kaynaklı yapısal değişikliklerin incelenmesini kolaylaştırır ve akciğer hastalığının altında yatan ECM değişikliklerine dair mekanik içgörüleri destekler.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elastik lifler, esas olarak elastin ve ilişkili mikrofibriller proteinlerden oluşan ve yüksek organizasyonlu, dayanıklı ağlar oluşturan akciğer ekstrasellüler matriksin (ECM) temelbileşenleridir 1. Akciğerde, elastik lifler alveolar septa ve peribronşiyal yapılar boyunca düzenlenir ve normal solunum mekaniği için gerekli elastikiyet ve geri tepmeyisağlarlar 1,2. Akciğer, aorta ve rahim gibi dokularda en bol bulunan yapısal ECM bileşenlerinden biri olarak, bütünlüğü doku uyumunu sürdürmek içinkritik öneme sahiptir 1,2. Lif yapısının bozulması, fibroz, amfizem ve kronik inflamatuar hastalıklar gibi çeşitli akciğer hastalıklarında gözlemlenmiştir; burada değişmiş lif yapısı akciğer fonksiyonu ve mekanik özelliklerin bozulmasına katkıda bulunur 2,3.

Akciğer matrizomu yakın zamanda karakterize edilmiş olup, kollajen ve laminin gibi çekirdek ECM proteinleri ile sitokinler, ECM düzenleyicileri ve ECM'ye bağlı proteinler (örneğin, integrin ligandları, galektinler) gibi matrizom ile ilişkili bileşenler ortaya çıkmıştır.4,5. Yapısal destek sağlamanın yanı sıra, bu bileşenler doku fonksiyonunu aktif olarak düzenler ve yerleşik ve göç eden hücreleri destekleyen özel nişleroluşturur 6,7. Özellikle, son çalışmalar, obezite gibi metabolik hastalıkların elastik lif organizasyonunda önemli değişikliklerle ilişkili olduğunu ve sistemik metabolik düzensizliği akciğer ECM yapısı ve fibroblast fonksiyonundakideğişikliklerle ilişkilendirdiğini ortaya koymuştur 3. Bu bulgular, elastik lif yeniden modellemenin dinamik ve hastalıkla ilgili bir süreç olarak anlaşılmasının önemini vurgulamaktadır.

Elastik liflerin geleneksel değerlendirmesi genellikle niteliksel histolojik değerlendirme, yarı nicel puanlama sistemleri veya elastin bolluğu ölçümlerine dayanır; bunlar lif organizasyonu, bağlantı ve ağ karmaşıklığı hakkında sınırlı bilgisağlar 8,9. Bu yaklaşımlar elastin içeriğindeki büyük değişiklikleri tespit etmek için faydalı olsa da, doku yeniden şekillendirilmesiyle ilişkili ince mimari değişiklikleri yakalamayabilirler. Nicel görüntü tabanlı analizler, elastik fiber ağlarının nesnel ve tekrarlanabilir karakterizasyonunu mümkün kılarak ve deneysel koşullar ile çalışmalar arasında karşılaştırmaları kolaylaştırarak bu sınırlamaları aşma potansiyeline sahiptir. Bunu çözmek için, burada açıklanan protokol, özellikle elastik lif mimarisine odaklanarak pulmoner ECM organizasyonunun entegre analizini mümkün kılar. ECMkarakterizasyonu 4,5 için yerleşik yaklaşımların yanı sıra, bu iş akışı Elastica boyama ve akciğer dokusu mimarisi için optimize edilmiş TWOMBLItabanlı 10 görüntü analiz hattını da içermektedir. Elastica boyama ile nicel ağ analizini birleştirerek, bu iş akışı geleneksel histolojik değerlendirmenin ötesine geçer ve lif bolluğu, parçalanma, mekansal organizasyon ve yapısal karmaşıklığın ayrıntılı karakterizasyonunu sağlar. Protokol, özellikle fibroz, amfizema, obeziteyle ilişkili akciğer yeniden yapılandırması, inflamatuar akciğer hastalıkları, yaşlanma ve akciğerde hücre dışı matriks yeniden modellenmesiyle karakterize edilen diğer durumları araştıran çalışmalar için oldukça uygundur.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada tanımlanan tüm fare deneyleri, Almanya'nın Kuzey Ren-Vestfalya eyaleti Hayvan Etik Komitesi'nin onayına göre gerçekleştirilmiştir (AZ: 81-02.04.2021.A221).

NOT: İşlem boyunca uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven, göz koruma) giyin.

1. Sürün akciğer dokusunun örneklenmesi ve hazırlanması

NOT: Fareler, doku toplamadan önce kurumsal ve devlet yönergelerine göre izofluran aşırı dozuyla ötenaze edildi.

  1. Toraks boşluğunu orta hat kesiyle dikkatlice açın, ardından diyaframı bağlantı boyunca kesin ve akciğerleri nazikçe açığa çıkarın.
  2. Sağ ve sol lobları birlikte çıkararak tüm akciğeri çıkarın, tüm lobların sağlam kalmasına özen gösterin.
  3. Akciğer loblarını tek tek 2 mL %10 nötr tamponlu formalin içeren 5 mL'lik bir tüpte yerleştirin ve 4 °C'de 15–20 saat kuluçka yapın.
    NOT: Fiksasyon, sonraki histolojik ve elastik lif analizleri için doku mimarisini korur. Bu iş akışının birincil amacı, alveolar morfometrik analizler yerine elastik lif organizasyonunun görselleştirilmesi ve nicel değerlendirmesi olduğundan, akciğerler doku işlemeden önce şişmeye sabit değildi.
    DIKKAT: Nötr tamponlu formalin, toksik, kanserojen olan ve cilt, göz ve solunum solunumunda tahriş oluşmasına neden olabilecek formaldehit içerir. Formalini sertifikalı kimyasal duman davlumonunda kullanırken eldiven, laboratuvar önlüğü ve güvenlik gözlüğü dahil uygun kişisel koruyucu ekipman takın.
  4. Sabit akciğer dokusunu standart bir histolojik gömme protokolü kullanarak parafinegömülmek 11.
    NOT: Sonraki boyama için doku morfolojisini korumak için tam dehidrasyon ve parafin infiltrasyonunu sağlayın. Örnekler arasındaki değişkenliği en aza indirmek ve deneysel koşullar arasında uyumluluğu sağlamak için, her analiz için her zaman aynı akciğer loblarını kullanın. Histoloji için sol lobun kullanılması önerilir.
  5. FFPE akciğer dokusunu mikrotom kullanarak 5–7 μm kalınlığında kesimlere kesin ve standart cam slaytlara monte edin. Slaytları 60 °C'de 1 saat boyunca pişirin, ardından sonraki uygulamalara geçin. Slaytlar, RT'de tozsuz bir ortamda birkaç hafta veya uzun süreli depolama için 4 °C'de saklanabilir.
    NOT: Depolama sırasında nem maruziyetinden kaçının, çünkü nem parafin oksidasyonuna ve lekelenme kalitesinin zedelenmesine neden olabilir. Uzun süreli depolama gerekiyorsa slaytları, kurutucu ile kapalı plastik bir sürgü kutusunda saklayın.
    Duraklama Noktası: Sürgüleri RT veya 4 °C'de tutun, ta ki boyaya kadar.

2. Elastik lif boyama

  1. Alveolar ve damar yapılarındaki elastik lifleri görselleştirmek için 5–7 μm parafinli akciğer dokusu kesitlerinde elastika (resorsin-fuksin) boyama uygulanır.
    NOT: Örnekler arasında tutarlı boyama yoğunluğu ve tekrarlanabilirlik sağlamak için aynı anda işlenebildiği kadar çok slayt boyanmalıdır.
    1. Slaytları iki kez ksilen (karışık izomerler) içine batırarak her biri 5 dakika boyunca deparafin edilir.
      DIKKAT: Ksilen toksik ve yanıcıdır. Kimyasal bir duman davlumbazında tutun ve uygun koruyucu ekipman takın.
    2. Slaytları inen etanol serileriyle %80 etanole kadar yeniden nemlendirin.
      1. Sürgüyü RT'de %100 etanol içeren bir boyama odasında 3 dakika kuluçka yapın.
      2. Slaytı taze %100 etanole aktarın ve RT'de 3 dakika kuluçka yapın.
      3. Slaytı %95 etanole aktarın ve RT'de 3 dakika kuluçka yapın.
      4. Slaytı %80 etanole aktarın ve RT'de 3 dakika kuluçka yapın.
    3. Slaytı, Resorcin-Fuchsin çözeltisi içeren yeni bir boyama odasına aktarın ve RT'de 20–30 dakika kuluçka yapın.
      NOT: Resorcin-Fuchsin boyama çözeltisi birkaç kez kullanılabilir ve RT zamanı stabildir.
      DIKKAT: Resorcin-fuksin boyama çözeltisi potansiyel olarak tehlikeli kimyasallar içerir; bunlar konsantre asitler ve boyalar da dahil olmak üzere, cilt ve göz tahrişine neden olabilir. Çözümü iyi havalandırılan bir alanda veya duman kaputu içinde kullanın ve kurumsal güvenlik yönergelerine uygun kişisel koruyucu ekipman takın.
    4. Kaydırı, akan damıtılmış suyun altında bir boyama odasına yerleştirin ve 1 dakika yıkayın.
    5. %95–96 etanolde 15–60 saniye fark edin, mikroskop altında izleyin.
      NOT: Elastik lifler koyu mor-menekşe kaldığında ve arka plan yeterince temizlendiğinde durun. Lekeli elastik lifler koyu mor görünür. Kolajen lifleri lekesiz kalır ve genellikle soluk görünür. Aşırı leke arka planı artırabilir; doku kalınlığı ve fiksasyona göre kuluçka süresini ayarlayın.
    6. Slaytı hemen bidistile suya aktarıp 30 saniye durulayarak farklılaşmayı durdurun. İsteğe bağlı: Ek akciğer değerlendirmesi için gerekirse karşı boyama yapılabilir, ancak lif segmentasyon verimliliğini azaltabilir. Bitişik kesiklerde akciğeri değerlendirmek için H&E boyama yapılmasını öneriyoruz.
    7. Slaytları ardışık olarak %95 etanolde 1–2 dakika boyunca kurutun, ardından %100 etanol ile iki kez 1–2 dakika boyunca kurtularak kalıntı suyu alın.
    8. Ksilen içindeki kesitleri 3 dakika boyunca 2 kez temizleyin, doku optik olarak şeffaf görünene kadar.
    9. Kaplama kaymalarını ksilen uyumlu kalıcı sentetik reçine kullanarak monte edin ve sürgülerin RT'de düz kurumasına izin verin.
      NOT: Tam dehidrasyon ve temizlik, bulanıklığı önlemek ve lekelenmiş bölümlerin uzun vadeli korunmasını sağlamak için gereklidir.
      Duraklama Noktası: Boyalı montajlı kaydırakları görüntülemeye kadar RT'de sakla.

3. Elastik fiber görüntüleme ve ağ analizi

  1. Görüntü edinimi
    1. 40× hedefli bir slayt tarayıcı kullanarak akciğer dokusu kesitlerinin yüksek çözünürlüklü parlak alan görüntülerini elde edin. Tüm örneklerde tutarlı pozlama ve beyaz dengesi ayarlarını sağla.
      NOT: Çalışma boyunca görüntüler, büyütme, mekansal çözünürlük (0,25 μm/piksel), aydınlatma ve pozlama dahil olmak üzere aynı tarayıcı ayarlarıyla alındı.
    2. Tarama sırasında tam kapsamı sağlamak için tüm akciğer dokusu bölümünü kapsayan bir ilgi alanı (ROI) çizin.
    3. Görüntü analizi sırasında arka plan yoğunluğunu ölçmek ve çıkarmak için doku olmadan bir arka plan referans alanı tanımlayın.
    4. Tarayıcının otomatik odak algılamasını, doku boyunca optimal sayıda odak noktası atamak için kullanarak, eşit keskinlik ve görüntü kalitesi sağlanır.
    5. Görüntüyü eşit aydınlatma ve pozlama ayarlarıyla elde edin.
      NOT: Yoğun veya düzensiz bölgelerde otomatik odaklama başarısız olursa, tüm doku yapılarının, alveolar ve damar alanlar dahil, keskin şekilde yakalandığından emin olmak için manuel ince odak ayarı kullanın.
  2. Görüntü Dekonvolüsyonu: QuPath12'de leke vektör tahmini. Boyama vektörleri, her histolojik boyanın spesifik RGB absorbans değerlerini temsil eder ve renk dekonvolüsyasyonu sırasında üst üste düşen boyaların ayrılmasına olanak tanır.
    NOT: Bu protokolde, resorsin-fuksin için önceden tanımlanmış boyama vektörleri Fiji'de bulunmadığı için boyama vektörleri QuPath'te tanımlanmıştır.
    1. QuPath'te görüntüyü açın ve parlak alan görüntü türünü seçin.
      NOT: Yanlılığı en aza indirmek için, veri setinden temsil görüntülerle leke vektörleri hesaplayın ve tüm görüntülere aynı değerleri uygulayın.
    2. İlk leke bileşenini tanımlamak için ağırlıklı olarak elastik lifler içeren bir ilgi alanı (ROI) çizin.
    3. Görüntü sekmesinde Boyama vektör bölümlerine gidin.
    4. Boyama 1'e tıklayın, ardından ROI'den leke vektörü ayarlayarak elastik lifler (genellikle mor-mor) için renk vektörü tanımlanabilir.
    5. Elastik olmayan doku içeren bir ROI (örneğin arka plan veya kollajen) seçin ve boyama 2'ye tıklayın, ardından ROI'den leke vektörünü ikincil renk bileşenini belirlemek için ayarlayın.
    6. QuPath, arka plana karşılık gelen Leke 3'ü otomatik olarak hesaplar.
    7. Fiji'de hesaplanan ve uygulanan vektörler için bir örnek: Resorcin-Fuchsin R:0.6201225, G:0.6541292, B:0.43308553; Belirsiz sinyal R:0.31585205; G:0.815618; B:0.48477295; Arka plan R:-0.105005614, G:-0.4780256, B:0.87204665.
      NOT: Bu değerler yalnızca resorcin-fuksin ile boyanmış görüntüler için boyanmıştır. Karşı boya varsa, yeni leke vektörleri hesaplanmalıdır.
    8. Bunları özel boyama vektörleri olarak kaydedin ve tüm örneklerde tutarlı renk dekonvolüsyonunu sağlamak için uygulayın.
      NOT: Temsilci bölgelerden özel boyama vektörlerinin tanımlanması, özellikle elastin ve arka plan renklerinin partiler arasında değişebileceği resorcin-fuchsin boyama için renk dekonvolüsyon doğruluğunu artırır.
  3. Fiji'de Görüntü Renk Dekonvolüsasyonu13,14.
    1. Fiji'yi açın (ImageJ) ve lekeli doku kesitinin parlak alan görüntüsünü yükleyin.
    2. Isteğe bağlı: Görüntü zaten RGB formatında değilse (örneğin 8-bit görüntüler) görüntüyü RGB formatına (Görüntü → Tip → RGB Color) dönüştürebilirsiniz. Bu adım yeni bir görüntü penceresi açar; Orijinal ham veriyi korumak için kaydedin.
    3. Renk dekonvolüsyonunu Görsel > Renk > Renk Dekonvolüsyonu > Kullanıcı Değerleri seçerek gerçekleştirin.
    4. QuPath'ten daha önce elde edilen özel leke vektörünü girin.
    5. Eklentiyi çalıştırın, elastik lifler, elastik lifler hariç doku ve arka plana karşılık gelen üç ayrı gri tonlu görüntü üretin.
    6. Resimleri doğrudan TWOMBLI için ek ön işleme olmadan kullanın. TWOMBLI, yeterli çözünürlüklü keskin görüntüler gerektirir; Yapısal detayları korumak için düzgünleştirme (örneğin, Gauss bulanıklığı) kaçınılmalıdır.
      NOT: QuPath'te vektör tahmini için seçilen bölgelerin tipik boyama özelliklerini temsil ettiğinden emin olun; çünkü bu özel vektörler tutarlı karşılaştırma için tüm görüntülere eşit şekilde uygulanacaktır.
    7. Elastik fiber kanalı, sonraki nicelleştirme ve analiz için TIFF dosyası olarak saklanın.
  4. Fiber Analizi İçin Yatırım Getirisi Seçimi
    1. Her akciğer bölümü için, alveolar bölgede beş tarafsız kare ROI ve peribronşiolar bölgede beş ROI (her biri 100 μm x 100 μm) seçin.
    2. Orijinal veriyi korumak için ham görüntüdeki her yatırım getirisini (Görüntü > Tekrarlayıcı) çoğaltın.
    3. Aynı yatırım getirisi dekonstrüklü elastik lif analizinde de tekrarlanın.
    4. Tüm tekrarlanan ROI'ları aşağı akış analizi için ayrı ayrı TIFF dosyaları olarak kaydedin.
      NOT: Doku kıvrımları, kesitleme artefaktları, yırtıklar, büyük kan damarları veya kötü korunmuş alveolar mimari içeren bölgeler analizden hariç tutuldu. TWOMBLI analizi için sadece dekonvolved elastik fiber yatırım getirisi girdi olarak kullanıldı; ilgili ham görüntü kopyaları ise kalite kontrolü ve görsel inceleme için referans dosyası olarak tutuldu. İlgi alanları (ROI'lar), dokunun tarafsız temsili için sistematik rastgele seçme yöntemiyle seçilmelidir. Operatör yanlılığını daha da en aza indirmek için, QuPath ile uyumlu otomatik bir ROI seçim betiği Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2'de sağlanmakta olup, uygulaması Bölüm 3.5'te açıklanmıştır.
  5. QuPath'te otomatik ROI seçimini otomatik bir ROI seçim betiği kullanarak uygulamak.
    1. QuPath'te görüntüyü açın ve görüntü tipini Brightfield olarak ayarlayın.
    2. Araçlar menüsünden, ilk açıklamaları oluşturmak için istediğiniz açıklama aracını seçin. Kare açıklamalar önerilir.
    3. Akciğer dokusu içinde kare notasyonlar çizin. Her annotasyon, analiz için yalnızca bir ilgi alanı (ROI) kapsamalıdır; ya alveolar bölge ya da peribronşiyal bölge.
    4. Açıklamalar oluşturulduktan sonra, Annotations'a gidin ve Lock annotations'u seçin; böylece yanlışlıkla hareket veya değişiklik yapılmasını önleyin.
    5. "Alveol" ve "peribronşiyal bölge" sınıflarını, annotasyon panelinde Sınıf listesinin yanındaki "+" butonuna tıklayarak sınıf listesine ekleyin.
    6. Her bir açıklamayı uygun sınıfa atayın. Bir açıklama seçin, ilgili sınıfı seçin ve Seçildi'ye tıklayın. Açıklama rengi değişir ve atanan sınıf ("alveoller" veya "peribronşiyal alan") annotasyon özellikleri panelinde gösterilir.
    7. İlgili betiği açın ve çalıştırın. Tamamlandığında, bir mesaj gelir getiricilerinin başarıyla oluşturulduğunu gösterir. Yeni oluşturulan ROI'lar, orijinal sınıf tanımlayıcı açıklamanın alt açıklamaları olarak annotasyon hiyerarşisinde görünecektir.
    8. ROI'ları dışa aktarmak için onları seçin ve Orijinal Pikselleri Dosya → Dışa Aktar Görüntüleri → Dışı Sayfalarına gidin. Dışa aktarılan ROI'ları TIFF dosyaları olarak kaydedin.
      NOT: Yazı yazıları yalnızca "alveol" ve "peribronşiyal bölge" sınıf isimlerini tanıyacak şekilde tasarlanmıştır. Bu isimler tam olarak belirtildiği şekilde girilmelidir. Varsayılan olarak, scriptler her annotasyon içinde 100 μm × 100 μm ölçüsünde beş örtüşmeyen kare ROI üretir. Aday ROI'ları yalnızca köşeleri ve merkezleri annotasyon sınırları içinde tamamen yer aldığında kabul edilir; böylece seçilen bölgede tam dahil olma sağlanır. ROI'ların hem sayısı hem de boyutları, belirli deneysel gereksinimlere uygun olarak script içinde değiştirilebilir. Analiz için en az üç biyolojik kopya ve en az beş ROI/örnek önerilmektedir.
  6. TWOMBLI analizi
    1. Tüm elastik liflerin ROI Görüntülerini analiz için özel bir klasöre kaydedin.
    2. Çalışma dizininde iki alt klasör oluşturun: a. Mask klasörü – TWOMBLI tarafından oluşturulan ikili maskeler için. b. HDM klasörü – TWOMBLI tarafından üretilen Yüksek Yoğunluklu Matris (HDM) görüntüleri için.
    3. TWOMBLI eklentisini çalıştırın: Fiji'yi açın ve TWOMBLI'yi başlatın (Eklentiler -> Makrolar -> Çalıştır).
    4. Uygun analiz parametre dosyasını seçin. Aşağıdaki TWOMBLI parametreleri, elastik lif analizi için kullanılmıştır ve Tablo 1'de listelenmiştir.
      NOT: Bu parametreler boyama yoğunluğuna bağlı olarak değişebilir. Parametreler, standart koşullarda boyanmış akciğer dokusu kesitlerinden elde edilen birden fazla temsil edici görüntü kullanılarak ampirik olarak optimize edildi. Optimizasyon, üretilen maskelerin orijinal boyama deseniyle karşılaştırılması ve segmentli maske ile altındaki elastik fiber ağı arasında en iyi örtüşmeyi sağlayan ayarların seçilmesiyle gerçekleştirildi. Oluşturulduktan sonra, aynı parametreler veri kümesindeki tüm görüntülere uygulandı.
    5. "Açık arka plan yerine koyu lifler" seçeneğini seçin.
    6. Mask klasöründe ikili maskeler oluşturun ve kaydedin.
    7. HDM klasöründe ikili görüntüler oluşturup kaydedin.
    8. Fiber uzunluğu, dal noktaları, eğrilik, yoğunluk ve hizalama gibi niceliksel ağ parametrelerini çıkarın.
      NOT: TWOMBLI analizi keskin, yüksek çözünürlüklü görüntüler (>1 piksel/μm) gerektirir. Kötü renk dekonvolüsyonu, odak dışı bölgeler veya görüntü sıkıştırması, fiber ağ niceliklerinin doğruluğunu zayıflatabilir.
  7. Nicel ve istatistiksel analiz
    1. TWOMBLI ağ parametrelerini CSV dosyası olarak dışa aktarın.
    2. Ham CSV verilerini istatistiksel analiz ve görselleştirme için GraphPad Prism'e aktarın.
      NOT: Aşağıdaki parametre önerilir: Maske Toplam Uzunluğu, bu da yatırım getirisi içindeki toplam elastik lif miktarını yansıtır ve lif bolluğu ile kaybının nicelendirilmesini sağlar. Fiber Uç Noktaları, fiber parçalanma derecesini gösterir; Son noktaların artan sayısı, bozulmuş veya kırık liflerin olduğunu gösteriyor. Fiber Branchpoints, fiberlerin birbirine ne kadar bağlı olduğunu ölçür ve ECM ağının yapısal karmaşıklığını ve bütünlüğünü yansıtır. Daha fazla dal noktası daha karmaşık ve iç içe geçmiş bir ağı gösterir. Lakunarlık, yatırım getirisi üzerindeki lif dağılımının homojenliğini nicelikle ölçür. Düşük boşluk, benzer büyüklükte boşluklara sahip tekdüze bir ağı gösterirken, yüksek boşluk değişken boşluklara sahip heterojen bir ağı yansıtır ve bu daha karmaşık bir yapıyı tanımlar. Box Counting-Fractal Dimension, fiber mimarisinin karmaşıklığını yakalar. Daha yüksek fraktal boyut değerleri daha karmaşık ve detaylı ağları gösterirken, daha düşük değerler daha basit veya bozuk yapıları yansıtır.
    3. Her nicelendirilmiş ağ parametresi için ortalama ± SEM gösteren sütun grafikleri oluşturun (örneğin, fiber uzunluğu, dallanma, eğrilik ve yoğunluk).
    4. Shapiro-Wilk testi kullanılarak veri normalliğini test edin. Parametrik veriler için, çiftsiz iki kuyruklu Öğrenci t-testini uygulayın. Parametrik olmayan veriler için Mann-Whitney U testi uygulanır. İkiden fazla deneysel grubu içeren karşılaştırmalar için, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından uygun bir sonradan çoklu karşılaştırma testi veya parametrik olmayan veriler için Kruskal–Wallis testi uygulanmalıdır.
      NOT: Tüm ham CSV dosyalarını değiştirilmeden tutun, böylece tekrarlanabilirlik ve veri izlenebilirliği sağlanır. Her durum için analiz edilen ROI ve biyolojik kopya sayısını şekil efsanelerinde bildirin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, farklı akciğer bölgeleri ve deneysel koşullar arasında elastik fiber ağının nicel parametrelerini sağlar. Daha önce açıklandığı gibi, TWOMBLI analizi, hücre dışı matris değerlendirmesi için lif uzunluğu, dallanma yoğunluğu, boşluk ve fraktal boyut gibi parametreler verir. Bu çerçeve üzerine inşa edilen yaklaşımımız, hem fizyolojik hem de patolojik akciğer dokularında lif bolluğu, bağlantı, uniformlik ve yapısal karmaşıklıktaki değişikliklerin değerlendirilmesini sağlayan elastik lif organizasyonunun kapsamlı bir karakterizasyonunu mümkün kılar.

Sağlıklı akciğer dokusunda elastik lifler, alveolar septa ve peribronşiyal yapılar boyunca uzun, sürekli ve iyi hizalanmış ağlar oluşturur. Buna karşılık, obez farelerden çıkanlar gibi patolojik veya metabolik olarak değişen akciğerler, genellikle artan dallanma ve daha büyük ağ karmaşıklığı gösterir; bu da elastik lif organizasyonundaki değişiklikleriyansıtır 3. İkili maskeler ve nicel parametreler dahil olmak üzere temsil çıktılar Şekil 1A, B'de gösterilmiştir. Bu çıktılar, ECM bütünlüğünü ve yeniden modellemenin kapsamını değerlendirmek için histolojik ve moleküler analizlerle entegre edilebilir 3. ECM organizasyonundaki farklılıkları görselleştirmek için sağlıklı akciğer dokusunda boşluk ve boşluk dolgusu örneklenmiştir (Şekil 1C). Diğer nicel metriklerle birleşince, bu parametreler ağ karmaşıklığını yakalar ve ECM yeniden organizasyonu tarafından yönlendirilen doku mimarisindeki değişiklikleri ortaya koyar; bu da elastik fiber ağı içindeki yapısal yeniden yapısal yeniden yapılanma desenlerine dair içgörüler sağlar.

Bu nicel çıktıların doğru yorumlanması, kritik olarak yüksek kaliteli görüntü alımı ve işlemeye bağlıdır. Kötü odak, tutarsız aydınlatma veya yanlış leke vektör tahmini gibi optimal olmayan görüntüleme veya işleme koşulları, parçalanmış veya gürültülü maskelere ve buna da güvenilmez nicel çıktılara yol açabilir (Şekil 1D). Bu nedenle, ham görüntülerin ve segmentasyon sonuçlarının dikkatli görsel incelenmesi, yorumdan önce veri kalitesinin sağlanması için gereklidir. Optimal olmayan maskeler genellikle sürekli liflerin aşırı parçalanması, kesintisiz veya eksik segmentasyon, arka plan gürültüsünün lif yapılarına dahil edilmesi veya orijinal boyama deseni ile oluşturulan maske arasında zayıf örtüşme ile tanınabilir; bu da görüntü alımı, leke vektör tahmini veya segmentasyon parametrelerinin yeniden değerlendirilmesi gerektiğini gösterir. Bu özellikleri göstermek için, karşı boyama içeren bölümler kasıtlı olarak analiz edilmiştir; bu da elastik lif tanımlamasını engeller ve optimal olmayan segmentasyona yol açar. Böyle düşük kaliteli bir maskeye bir örnek Şekil 1E'de gösterilmiştir. İş akışının sağlamlığını ve tekrarlanabilirliğini daha iyi değerlendirmek için, görüntü veri setleri aynı optimize edilmiş analiz parametreleri kullanılarak iki araştırmacı tarafından bağımsız olarak analiz edildi (Şekil 2A). Ayrıca, biyolojik değişkenliği değerlendirmek için bağımsız hayvanlardan alınan örnekler dahil edilmiştir (Şekil 2B). Operatörler ve biyolojik kopyalar arasında karşılaştırılabilir nicel çıktılar elde edildi; bu da önerilen görüntü analiz hattının tekrarlanabilirliğini ve kullanıcıdan bağımsızlığını destekledi. Bu analizler birlikte, iş akışının elastik lif organizasyonunun sağlam bir şekilde değerlendirilmesini sağladığını ve fizyolojik ile patolojik durumlar arasında karşılaştırmaları kolaylaştırdığını göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1. Elastika Boyama Analizi İş Akışı. (A) Temsil eden ham görüntü, görüntü dekonvolüsyonuyla elde edilen izole elastik fiber sinyali, TWOMBLI kullanılarak oluşturulan ikili maske ve orijinal elastik liflerin ilgili maske ile üst üste binmesi, doğru segmentasyonu gösterir. (B) TWOMBLI analiziyle oluşturulan temsili nicel parametreler. (C) Sağlıklı fare akciğer dokusunda boşluk ve boşluk doldurma analizlerine örnekler, ekstraselüler matriks organizasyonundaki farklılıkları göstermek. (D) Optimal olmayan görüntü alımı veya görüntü işleme sonucu oluşan parçalanmış ve gürültülü maskelerin illüstrasyonu. (E) Hematoksilin ve eozin ile karşı boyama yapılmış doku kesiti, elastik lif tanımının bozulduğunu ve maske üretiminin optimal olmadığını göstermektedir. Orijinal boyama deseni ile oluşturulan maske arasında kötü uyum gösteren alanlar gösterilmiştir. Ölçek çubuğu A, D = 100 μm, E = 50 μm. Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2. Elastik lif analizi iş akışının tekrarlanabilirliği ve sağlamlığı. (A) Görüntü veri setleri, iki araştırmacı tarafından TWOMBLI analiz parametreleri kullanılarak bağımsız olarak analiz edilip, operatörler arası tekrarlanabilirliği değerlendirildi. TWOMBLI'dan türetilen nicel metrikler gösterilmiştir. A ve B, iki bağımsız operatörü gösterir. (B) Bağımsız hayvanlardan alınan örnekler analiz edilip biyolojik değişkenlik değerlendirildi. TWOMBLI'den türetilen nicel metrikler gösterilir; biyolojik kopyalar arasında karşılaştırılabilir çıktılar gösterilir ve analiz sürecinin sağlamlığını destekler. M1, M2 ve M3 bireysel sağlıklı hayvanları gösterir. n = 3, İstatistiksel analiz tek yönlü ANOVA kullanılarak yapıldı ve ardından Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi yapıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

ParametrelerDeğerler
Kontrast doygunluğu0.75
Minimum çizgi genişliği5
Maksimum hat genişliği10
Minimun eğrilik penceresi20
Maximun eğrilik penceresi80
Minimum dal uzunluğu10
Maximun HDM ekran175
Minimum boşluk çapı0

Tablo 1: TWOMBLI'den türetilen nicel parametrelerin özeti. TWOMBLI tarafından oluşturulan parametrelerin genel görünümü ve akciğer dokusunda elastik lif mimarisinin değerlendirilmesi için yorumları. Metrikler arasında fiber bolluğu, dallanma, hizalanma, bağlantı ve ağ organizasyonu ölçümleri yer alır.

Ek Dosya 1: Tarafsız ROI alveolisi Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Tarafsız ROI peribronşiyal bölge Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, özellikle fibroblast kaynaklı elastik lif yeniden yapılanmasına odaklanarak, fare akciğer ekstrasellüler matriks (ECM) mimarisinin incelenmesi için sağlam ve tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar. Elastik lifler, akciğer uyumu ve geri tepme için gereklidir ve bozulmaları, fibroz, akciğer hasarı, yaşlanma ve metabolik bozukluklar dahil olmak üzere birçok akciğer hastalığının ayırt ediciözelliğidir. Temel fonksiyonel rollerine rağmen, elastik lif organizasyonu ve montajının nicel değerlendirmesi sınırlı kalmıştır. İş akışı, elastik fiber ağ mimarisinin sistematik ve nicel karakterizasyonunu mümkün kılarak bu boşluğu kapatır.

Bu yöntemin en büyük gücü, nicel görüntüleme iş akışını yapısal histoloji analiziyle entegre etmektir. Geleneksel yaklaşımlar genellikle ECM bileşimini veya histolojik özellikleri ayrı ayrı değerlendirirken, bu protokol elastik lif organizasyonunun, fiber uzunluğu, dallanma ve ağ karmaşıklığı dahil olmak üzere nesnel nicelendirilmesini sağlar. Bu, fizyolojik ve patolojik durumlar arasında doğrudan karşılaştırma imkanı sağlar ve fibroblast aracılı ECM yeniden şekillendirilmesine dair içgörülersağlar 3.

Ancak, deneysel tutarlılık ve veri kalitesi için birkaç teknik unsur kritik öneme sahiptir. Resorsin–fuksin boyama, fiksasyon süresi, kesit kalınlığı ve reaktif tutarlılığı gibi değişkenlere duyarlıdır, bu da tekrarlanabilirlik için standartlaştırmayı zorunlu kılar. TWOMBLI'den alınan nicel çıktılar, görüntü kalitesine, çözünürlüğe ve tutarlı ilgi alanı seçimine bağlıdır; bu nedenle histolojik değerlendirmeyle birlikte yorumlanmalı ve birden fazla örneklem arasında doğrulanmalıdır. Ayrıca, lif yoğunluğu ve morfolojisi alveolar ve peribronşiyal bölgeler arasında farklılık gösterir ve bölgeye özgü optimizasyon gerektirir. Bu yaklaşım, elastik fiber ağın küresel organizasyonunu iki boyutta yakalar ve elektronik mikroskopi gibi daha yüksek çözünürlüklü teknikler gerektiren ultrastruktural özellikleri çözmez. Konfokal veya çoklu foton mikroskopisi dahil olmak üzere üç boyutlu görüntüleme yöntemleri, fiber geometrisi ve bağlantı analizini daha da geliştirebilir.

İş akışında birkaç adım, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için özellikle kritiktir. Doku fiksasyonu, kesitleme kalitesi ve tutarlı resorsin-fuksin boyama, elastik lif görselleştirmesini önemli ölçüde etkiler ve bu nedenle dikkatlice standartlaştırılmalıdır.  Düşük boyama yoğunluğu, dengesiz boyama veya yüksek arka plan değişken reaktif kalitesi, tutarsız boyama koşulları veya yetersiz doku korumasından kaynaklanabilir. Ayrıca, sağlıklı ve hasta akciğer dokularının, teknik boyama kontrollerinin ve deneysel partiler arasında işlenmiş referans örneklerinin dahil edilmesi, boyama tutarlılığını ve analitik dayanıklılığını izlemek için önerilir. Elastik liflerle zengin dokular, görüntü alımı ve segmentasyon prosedürlerini doğrulamak için pozitif kontrol görevi de görebilir. Görüntü dekonvolüsyonunda doğru boya vektör tahmini bir diğer önemli adımdır; çünkü uygunsuz vektör seçimi eksik lif çıkarımı ve parçalanmış maskelere yol açabilir. Deneysel soruya bağlı olarak, iş akışı ROI boyutu ve sayısı ayarlanarak, görüntü işleme parametrelerine uyarlanarak veya üç boyutlu görüntüleme yaklaşımlarının entegre edilerek elastik lif organizasyonunu daha fazla araştırarak değiştirilebilir.

Genel olarak, bu yöntem ECM yeniden modellenmesini hem fizyolojik hem de patolojik bağlamlarda incelemek için çok yönlü bir platform sunar. Elastik lif bütünlüğü akciğer uyumu ve mekanik fonksiyonla doğrudan bağlantılı olduğundan, bu yaklaşım özellikle ECM'deki yapısal değişikliklerin pulmoner fonksiyondaki değişikliklere nasıl dönüştüğünü anlamak için önemlidir. Fibroblast kaynaklı yapısal değişiklikleri araştırmak için oldukça uygundur ve ECM yeniden modellenmesini ve hastalığın ilerlemesi ile doku fonksiyonuna katkısını daha iyi anlamak için yeni fırsatlar sunar. Yaklaşım, kardiyovasküler dokular, deri, rahim, bağ dokusu bozuklukları, fibrotik organlar ve insan örnekleri gibi diğer dokulara da genişletilebilir veya gelişmiş mekansal ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleriyle birleştirilerek uygulanabilirliğini daha da genişletebilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bonn Üniversitesi Tıp Fakültesi'nin Histoloji Çekirdek Tesisi'ne teşekkür etmek isteriz. Ayrıca, Daniela Kraus ve tüm ekibin iFET hayvan tesisindeki destekleyici çalışmalarını takdir ediyoruz. V.L.K., Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) tarafından Almanya'nın Mükemmeliyet Stratejisi – EXC 2151 – 390873048 kapsamında finanse edilmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Axio CS2 Slayt Tarayıcı Carl Zeiss
Coplin Cam Boyama kavanozuSigma-AldrichS6016
DPX Montaj maddesiSigma-Aldrich6522
Histoloji için Etanol (%100)Carl Roth9065.4
Fijihttps://imagej.net/software/fiji/sürüm 1.54t
Nötr tamponlu formalin çözeltisi, %10SigmaHT501128
Dokular İçin İşleme/Gömü Kaseleri HISTOSETTE ISigma-AldrichH0542
mikrotomThermo Fischer ScientificHM355S
Mikroskop SlaytlarıVWR631-0108
Fare: C57BL/6JThe Jackson LaboratoryRRID: IMSR_JAX:000664Suş #:000664 
Parafin gömme sistemiEpredia HistoStar gömme modülü
Prismhttps://www.graphpad.com sürüm 11
Qupathhttps://qupath.github.iosürüm 0.7.0
Resorsin-FuşenWaldeck2.00E-30
TWOMBLI eklentisihttps://github.com/wershofe/TWOMBLI
KsilenApplichem GmBH14020172

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

MedicineLungmatrisomeelastic fiber
Video yakında

İlgili makaleler