Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Akciğer dokusunda Elastik Lif Profili Nicel Görüntüleme Analizleriyle

90 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/72114

⸱

4 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Molecular Medicine and Experimental Immunology Bonn, University of Bonn, University Hospital Bonn, 2Institute for General Pathology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz, 3TRON Translational Oncology Mainz

Bu makalede

Özet

Burada, fare akciğer dokusunda elastik lif görselleştirme ve nicel profilleme için doku hazırlığını detaylandıran bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, fizyolojik ve patolojik durumlarda doku mimarisi, mekansal lif organizasyonu ve hücre dışı matriks yeniden modellenmesinin sağlam bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.

Özet

Akciğer ekstrasellüler matriksin (ECM) yeniden şekillendirilmesi, akciğer hasarı ve hastalığının önemli bir özelliğidir. Elastik lifler, akciğer ECM'nin merkezi bir bileşenidir; normal solunum fonksiyonu için gerekli dayanıklılık ve geri tepme sağlar ve bunların bozulması, doku mekaniğinin bozulmasına katkıda bulunur. Bu protokol, fare akciğer dokusunun hazırlanması ve analizi için sağlam ve tekrarlanabilir bir iş akışını tanımlar; özellikle elastik liflerin görselleştirilmesi ve nicel profillenmesine odaklanır. Elastin yapılarını korumak ve tespit etmek için optimize edilmiş doku işleme ve histolojik boyama yöntemlerini ortaya koyar. Ayrıca, protokol akciğer içinde elastik lif bolluğu, organizasyonu ve mekansal dağılımı nicel olarak değerlendirilmesini sağlayan bir görüntü analiz boru hattını detaylandırır. İş akışı ayrıca QuPath'te leke vektör tahminini, Fiji/ImageJ'de renk dekonvolüsyonunu ve TWOMBLI tabanlı görüntü analizini de içererek elastik lif bolluğu, dallanma ve ağ karmaşıklığının nicel olarak değerlendirilmesini mümkün kılar. Tekrarlanabilirliği sağlamak ve kullanıcıya bağlı önyargıyı en aza indirmek için görüntü alımı, ilgi alanı seçimi, parametre optimizasyonu ve kalite kontrolü stratejileri dahil edilmiştir. Bu iş akışını kullanarak, obez farelerin akciğerlerinde elastik lif organizasyonu ve ağ mimarisindeki değişiklikleri başarıyla tespit ettik ve bunun hastalıkla ilişkili ECM yeniden modellemesinin tespitinde uygulanabilirliğini gösterdik. Bu yaklaşımlar birlikte, elastik lif yeniden modellemesini ve bunun fizyolojik ve patolojik durumlarda doku mimarisine katkısını incelemek için kapsamlı bir çerçeve sağlar. Bu yöntem, fibroblast kaynaklı yapısal değişikliklerin incelenmesini kolaylaştırır ve akciğer hastalığının altında yatan ECM değişikliklerine dair mekanik içgörüleri destekler.

Giriş

Elastik lifler, esas olarak elastin ve ilişkili mikrofibriller proteinlerden oluşan ve yüksek organizasyonlu, dayanıklı ağlar oluşturan akciğer ekstrasellüler matriksin (ECM) temelbileşenleridir 1. Akciğerde, elastik lifler alveolar septa ve peribronşiyal yapılar boyunca düzenlenir ve normal solunum mekaniği için gerekli elastikiyet ve geri tepmeyisağlarlar 1,2. Akciğer, aorta ve rahim gibi dokularda en bol bulunan yapısal ECM bileşenlerinden biri olarak, bütünlüğü doku uyumunu sürdürmek içinkritik öneme sahiptir 1,2. Lif yapısının bozulması, fibroz, amfizem ve kronik inflamatuar hastalıklar gibi çeşitli akciğer hastalıklarında gözlemlenmiştir; burada değişmiş lif yapısı akciğer fonksiyonu ve mekanik özelliklerin bozulmasına katkıda bulunur 2,3.

Akciğer matrizomu yakın zamanda karakterize edilmiş olup, kollajen ve laminin gibi çekirdek ECM proteinleri ile sitokinler, ECM düzenleyicileri ve ECM'ye bağlı proteinler (örneğin, integrin ligandları, galektinler) gibi matrizom ile ilişkili bileşenler ortaya çıkmıştır.4,5. Yapısal destek sağlamanın yanı sıra, bu bileşenler doku fonksiyonunu aktif olarak düzenler ve yerleşik ve göç eden hücreleri destekleyen özel nişleroluşturur 6,7. Özellikle, son çalışmalar, obezite gibi metabolik hastalıkların elastik lif organizasyonunda önemli değişikliklerle ilişkili olduğunu ve sistemik metabolik düzensizliği akciğer ECM yapısı ve fibroblast fonksiyonundakideğişikliklerle ilişkilendirdiğini ortaya koymuştur 3. Bu bulgular, elastik lif yeniden modellemenin dinamik ve hastalıkla ilgili bir süreç olarak anlaşılmasının önemini vurgulamaktadır.

Elastik liflerin geleneksel değerlendirmesi genellikle niteliksel histolojik değerlendirme, yarı nicel puanlama sistemleri veya elastin bolluğu ölçümlerine dayanır; bunlar lif organizasyonu, bağlantı ve ağ karmaşıklığı hakkında sınırlı bilgisağlar 8,9. Bu yaklaşımlar elastin içeriğindeki büyük değişiklikleri tespit etmek için faydalı olsa da, doku yeniden şekillendirilmesiyle ilişkili ince mimari değişiklikleri yakalamayabilirler. Nicel görüntü tabanlı analizler, elastik fiber ağlarının nesnel ve tekrarlanabilir karakterizasyonunu mümkün kılarak ve deneysel koşullar ile çalışmalar arasında karşılaştırmaları kolaylaştırarak bu sınırlamaları aşma potansiyeline sahiptir. Bunu çözmek için, burada açıklanan protokol, özellikle elastik lif mimarisine odaklanarak pulmoner ECM organizasyonunun entegre analizini mümkün kılar. ECMkarakterizasyonu 4,5 için yerleşik yaklaşımların yanı sıra, bu iş akışı Elastica boyama ve akciğer dokusu mimarisi için optimize edilmiş TWOMBLItabanlı 10 görüntü analiz hattını da içermektedir. Elastica boyama ile nicel ağ analizini birleştirerek, bu iş akışı geleneksel histolojik değerlendirmenin ötesine geçer ve lif bolluğu, parçalanma, mekansal organizasyon ve yapısal karmaşıklığın ayrıntılı karakterizasyonunu sağlar. Protokol, özellikle fibroz, amfizema, obeziteyle ilişkili akciğer yeniden yapılandırması, inflamatuar akciğer hastalıkları, yaşlanma ve akciğerde hücre dışı matriks yeniden modellenmesiyle karakterize edilen diğer durumları araştıran çalışmalar için oldukça uygundur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Burada tanımlanan tüm fare deneyleri, Almanya'nın Kuzey Ren-Vestfalya eyaleti Hayvan Etik Komitesi'nin onayına göre gerçekleştirilmiştir (AZ: 81-02.04.2021.A221).

NOT: İşlem boyunca uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven, göz koruma) giyin.

1. Sürün akciğer dokusunun örneklenmesi ve hazırlanması

NOT: Fareler, doku toplamadan önce kurumsal ve devlet yönergelerine göre izofluran aşırı dozuyla ötenaze edildi.

  1. Toraks boşluğunu orta hat kesiyle dikkatlice açın, ardından diyaframı bağlantı boyunca kesin ve akciğerleri nazikçe açığa çıkarın.
  2. Sağ ve sol lobları birlikte çıkararak tüm akciğeri çıkarın, tüm lobların sağlam kalmasına özen gösterin.
  3. Akciğer loblarını tek tek 2 mL %10 nötr tamponlu formalin içeren 5 mL'lik bir tüpte yerleştirin ve 4 °C'de 15–20 saat kuluçka yapın.
    NOT: Fiksasyon, sonraki histolojik ve elastik lif analizleri için doku mimarisini korur. Bu iş akışının birincil amacı, alveolar morfometrik analizler yerine elastik lif organizasyonunun görselleştirilmesi ve nicel değerlendirmesi olduğundan, akciğerler doku işlemeden önce şişmeye sabit değildi.
    DIKKAT: Nötr tamponlu formalin, toksik, kanserojen olan ve cilt, göz ve solunum solunumunda tahriş oluşmasına neden olabilecek formaldehit içerir. Formalini sertifikalı kimyasal duman davlumonunda kullanırken eldiven, laboratuvar önlüğü ve güvenlik gözlüğü dahil uygun kişisel koruyucu ekipman takın.
  4. Sabit akciğer dokusunu standart bir histolojik gömme protokolü kullanarak parafinegömülmek 11.
    NOT: Sonraki boyama için doku morfolojisini korumak için tam dehidrasyon ve parafin infiltrasyonunu sağlayın. Örnekler arasındaki değişkenliği en aza indirmek ve deneysel koşullar arasında uyumluluğu sağlamak için, her analiz için her zaman aynı akciğer loblarını kullanın. Histoloji için sol lobun kullanılması önerilir.
  5. FFPE akciğer dokusunu mikrotom kullanarak 5–7 μm kalınlığında kesimlere kesin ve standart cam slaytlara monte edin. Slaytları 60 °C'de 1 saat boyunca pişirin, ardından sonraki uygulamalara geçin. Slaytlar, RT'de tozsuz bir ortamda birkaç hafta veya uzun süreli depolama için 4 °C'de saklanabilir.
    NOT: Depolama sırasında nem maruziyetinden kaçının, çünkü nem parafin oksidasyonuna ve lekelenme kalitesinin zedelenmesine neden olabilir. Uzun süreli depolama gerekiyorsa slaytları, kurutucu ile kapalı plastik bir sürgü kutusunda saklayın.
    Duraklama Noktası: Sürgüleri RT veya 4 °C'de tutun, ta ki boyaya kadar.

2. Elastik lif boyama

  1. Alveolar ve damar yapılarındaki elastik lifleri görselleştirmek için 5–7 μm parafinli akciğer dokusu kesitlerinde elastika (resorsin-fuksin) boyama uygulanır.
    NOT: Örnekler arasında tutarlı boyama yoğunluğu ve tekrarlanabilirlik sağlamak için aynı anda işlenebildiği kadar çok slayt boyanmalıdır.
    1. Slaytları iki kez ksilen (karışık izomerler) içine batırarak her biri 5 dakika boyunca deparafin edilir.
      DIKKAT: Ksilen toksik ve yanıcıdır. Kimyasal bir duman davlumbazında tutun ve uygun koruyucu ekipman takın.
    2. Slaytları inen etanol serileriyle %80 etanole kadar yeniden nemlendirin.
      1. Sürgüyü RT'de %100 etanol içeren bir boyama odasında 3 dakika kuluçka yapın.
      2. Slaytı taze %100 etanole aktarın ve RT'de 3 dakika kuluçka yapın.
      3. Slaytı %95 etanole aktarın ve RT'de 3 dakika kuluçka yapın.
      4. Slaytı %80 etanole aktarın ve RT'de 3 dakika kuluçka yapın.
    3. Slaytı, Resorcin-Fuchsin çözeltisi içeren yeni bir boyama odasına aktarın ve RT'de 20–30 dakika kuluçka yapın.
      NOT: Resorcin-Fuchsin boyama çözeltisi birkaç kez kullanılabilir ve RT zamanı stabildir.
      DIKKAT: Resorcin-fuksin boyama çözeltisi potansiyel olarak tehlikeli kimyasallar içerir; bunlar konsantre asitler ve boyalar da dahil olmak üzere, cilt ve göz tahrişine neden olabilir. Çözümü iyi havalandırılan bir alanda veya duman kaputu içinde kullanın ve kurumsal güvenlik yönergelerine uygun kişisel koruyucu ekipman takın.
    4. Kaydırı, akan damıtılmış suyun altında bir boyama odasına yerleştirin ve 1 dakika yıkayın.
    5. %95–96 etanolde 15–60 saniye fark edin, mikroskop altında izleyin.
      NOT: Elastik lifler koyu mor-menekşe kaldığında ve arka plan yeterince temizlendiğinde durun. Lekeli elastik lifler koyu mor görünür. Kolajen lifleri lekesiz kalır ve genellikle soluk görünür. Aşırı leke arka planı artırabilir; doku kalınlığı ve fiksasyona göre kuluçka süresini ayarlayın.
    6. Slaytı hemen bidistile suya aktarıp 30 saniye durulayarak farklılaşmayı durdurun. İsteğe bağlı: Ek akciğer değerlendirmesi için gerekirse karşı boyama yapılabilir, ancak lif segmentasyon verimliliğini azaltabilir. Bitişik kesiklerde akciğeri değerlendirmek için H&E boyama yapılmasını öneriyoruz.
    7. Slaytları ardışık olarak %95 etanolde 1–2 dakika boyunca kurutun, ardından %100 etanol ile iki kez 1–2 dakika boyunca kurtularak kalıntı suyu alın.
    8. Ksilen içindeki kesitleri 3 dakika boyunca 2 kez temizleyin, doku optik olarak şeffaf görünene kadar.
    9. Kaplama kaymalarını ksilen uyumlu kalıcı sentetik reçine kullanarak monte edin ve sürgülerin RT'de düz kurumasına izin verin.
      NOT: Tam dehidrasyon ve temizlik, bulanıklığı önlemek ve lekelenmiş bölümlerin uzun vadeli korunmasını sağlamak için gereklidir.
      Duraklama Noktası: Boyalı montajlı kaydırakları görüntülemeye kadar RT'de sakla.

3. Elastik fiber görüntüleme ve ağ analizi

  1. Görüntü edinimi
    1. 40× hedefli bir slayt tarayıcı kullanarak akciğer dokusu kesitlerinin yüksek çözünürlüklü parlak alan görüntülerini elde edin. Tüm örneklerde tutarlı pozlama ve beyaz dengesi ayarlarını sağla.
      NOT: Çalışma boyunca görüntüler, büyütme, mekansal çözünürlük (0,25 μm/piksel), aydınlatma ve pozlama dahil olmak üzere aynı tarayıcı ayarlarıyla alındı.
    2. Tarama sırasında tam kapsamı sağlamak için tüm akciğer dokusu bölümünü kapsayan bir ilgi alanı (ROI) çizin.
    3. Görüntü analizi sırasında arka plan yoğunluğunu ölçmek ve çıkarmak için doku olmadan bir arka plan referans alanı tanımlayın.
    4. Tarayıcının otomatik odak algılamasını, doku boyunca optimal sayıda odak noktası atamak için kullanarak, eşit keskinlik ve görüntü kalitesi sağlanır.
    5. Görüntüyü eşit aydınlatma ve pozlama ayarlarıyla elde edin.
      NOT: Yoğun veya düzensiz bölgelerde otomatik odaklama başarısız olursa, tüm doku yapılarının, alveolar ve damar alanlar dahil, keskin şekilde yakalandığından emin olmak için manuel ince odak ayarı kullanın.
  2. Görüntü Dekonvolüsyonu: QuPath12'de leke vektör tahmini. Boyama vektörleri, her histolojik boyanın spesifik RGB absorbans değerlerini temsil eder ve renk dekonvolüsyasyonu sırasında üst üste düşen boyaların ayrılmasına olanak tanır.
    NOT: Bu protokolde, resorsin-fuksin için önceden tanımlanmış boyama vektörleri Fiji'de bulunmadığı için boyama vektörleri QuPath'te tanımlanmıştır.
    1. QuPath'te görüntüyü açın ve parlak alan görüntü türünü seçin.
      NOT: Yanlılığı en aza indirmek için, veri setinden temsil görüntülerle leke vektörleri hesaplayın ve tüm görüntülere aynı değerleri uygulayın.
    2. İlk leke bileşenini tanımlamak için ağırlıklı olarak elastik lifler içeren bir ilgi alanı (ROI) çizin.
    3. Görüntü sekmesinde Boyama vektör bölümlerine gidin.
    4. Boyama 1'e tıklayın, ardından ROI'den leke vektörü ayarlayarak elastik lifler (genellikle mor-mor) için renk vektörü tanımlanabilir.
    5. Elastik olmayan doku içeren bir ROI (örneğin arka plan veya kollajen) seçin ve boyama 2'ye tıklayın, ardından ROI'den leke vektörünü ikincil renk bileşenini belirlemek için ayarlayın.
    6. QuPath, arka plana karşılık gelen Leke 3'ü otomatik olarak hesaplar.
    7. Fiji'de hesaplanan ve uygulanan vektörler için bir örnek: Resorcin-Fuchsin R:0.6201225, G:0.6541292, B:0.43308553; Belirsiz sinyal R:0.31585205; G:0.815618; B:0.48477295; Arka plan R:-0.105005614, G:-0.4780256, B:0.87204665.
      NOT: Bu değerler yalnızca resorcin-fuksin ile boyanmış görüntüler için boyanmıştır. Karşı boya varsa, yeni leke vektörleri hesaplanmalıdır.
    8. Bunları özel boyama vektörleri olarak kaydedin ve tüm örneklerde tutarlı renk dekonvolüsyonunu sağlamak için uygulayın.
      NOT: Temsilci bölgelerden özel boyama vektörlerinin tanımlanması, özellikle elastin ve arka plan renklerinin partiler arasında değişebileceği resorcin-fuchsin boyama için renk dekonvolüsyon doğruluğunu artırır.
  3. Fiji'de Görüntü Renk Dekonvolüsasyonu13,14.
    1. Fiji'yi açın (ImageJ) ve lekeli doku kesitinin parlak alan görüntüsünü yükleyin.
    2. Isteğe bağlı: Görüntü zaten RGB formatında değilse (örneğin 8-bit görüntüler) görüntüyü RGB formatına (Görüntü → Tip → RGB Color) dönüştürebilirsiniz. Bu adım yeni bir görüntü penceresi açar; Orijinal ham veriyi korumak için kaydedin.
    3. Renk dekonvolüsyonunu Görsel > Renk > Renk Dekonvolüsyonu > Kullanıcı Değerleri seçerek gerçekleştirin.
    4. QuPath'ten daha önce elde edilen özel leke vektörünü girin.
    5. Eklentiyi çalıştırın, elastik lifler, elastik lifler hariç doku ve arka plana karşılık gelen üç ayrı gri tonlu görüntü üretin.
    6. Resimleri doğrudan TWOMBLI için ek ön işleme olmadan kullanın. TWOMBLI, yeterli çözünürlüklü keskin görüntüler gerektirir; Yapısal detayları korumak için düzgünleştirme (örneğin, Gauss bulanıklığı) kaçınılmalıdır.
      NOT: QuPath'te vektör tahmini için seçilen bölgelerin tipik boyama özelliklerini temsil ettiğinden emin olun; çünkü bu özel vektörler tutarlı karşılaştırma için tüm görüntülere eşit şekilde uygulanacaktır.
    7. Elastik fiber kanalı, sonraki nicelleştirme ve analiz için TIFF dosyası olarak saklanın.
  4. Fiber Analizi İçin Yatırım Getirisi Seçimi
    1. Her akciğer bölümü için, alveolar bölgede beş tarafsız kare ROI ve peribronşiolar bölgede beş ROI (her biri 100 μm x 100 μm) seçin.
    2. Orijinal veriyi korumak için ham görüntüdeki her yatırım getirisini (Görüntü > Tekrarlayıcı) çoğaltın.
    3. Aynı yatırım getirisi dekonstrüklü elastik lif analizinde de tekrarlanın.
    4. Tüm tekrarlanan ROI'ları aşağı akış analizi için ayrı ayrı TIFF dosyaları olarak kaydedin.
      NOT: Doku kıvrımları, kesitleme artefaktları, yırtıklar, büyük kan damarları veya kötü korunmuş alveolar mimari içeren bölgeler analizden hariç tutuldu. TWOMBLI analizi için sadece dekonvolved elastik fiber yatırım getirisi girdi olarak kullanıldı; ilgili ham görüntü kopyaları ise kalite kontrolü ve görsel inceleme için referans dosyası olarak tutuldu. İlgi alanları (ROI'lar), dokunun tarafsız temsili için sistematik rastgele seçme yöntemiyle seçilmelidir. Operatör yanlılığını daha da en aza indirmek için, QuPath ile uyumlu otomatik bir ROI seçim betiği Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2'de sağlanmakta olup, uygulaması Bölüm 3.5'te açıklanmıştır.
  5. QuPath'te otomatik ROI seçimini otomatik bir ROI seçim betiği kullanarak uygulamak.
    1. QuPath'te görüntüyü açın ve görüntü tipini Brightfield olarak ayarlayın.
    2. Araçlar menüsünden, ilk açıklamaları oluşturmak için istediğiniz açıklama aracını seçin. Kare açıklamalar önerilir.
    3. Akciğer dokusu içinde kare notasyonlar çizin. Her annotasyon, analiz için yalnızca bir ilgi alanı (ROI) kapsamalıdır; ya alveolar bölge ya da peribronşiyal bölge.
    4. Açıklamalar oluşturulduktan sonra, Annotations'a gidin ve Lock annotations'u seçin; böylece yanlışlıkla hareket veya değişiklik yapılmasını önleyin.
    5. "Alveol" ve "peribronşiyal bölge" sınıflarını, annotasyon panelinde Sınıf listesinin yanındaki "+" butonuna tıklayarak sınıf listesine ekleyin.
    6. Her bir açıklamayı uygun sınıfa atayın. Bir açıklama seçin, ilgili sınıfı seçin ve Seçildi'ye tıklayın. Açıklama rengi değişir ve atanan sınıf ("alveoller" veya "peribronşiyal alan") annotasyon özellikleri panelinde gösterilir.
    7. İlgili betiği açın ve çalıştırın. Tamamlandığında, bir mesaj gelir getiricilerinin başarıyla oluşturulduğunu gösterir. Yeni oluşturulan ROI'lar, orijinal sınıf tanımlayıcı açıklamanın alt açıklamaları olarak annotasyon hiyerarşisinde görünecektir.
    8. ROI'ları dışa aktarmak için onları seçin ve Orijinal Pikselleri Dosya → Dışa Aktar Görüntüleri → Dışı Sayfalarına gidin. Dışa aktarılan ROI'ları TIFF dosyaları olarak kaydedin.
      NOT: Yazı yazıları yalnızca "alveol" ve "peribronşiyal bölge" sınıf isimlerini tanıyacak şekilde tasarlanmıştır. Bu isimler tam olarak belirtildiği şekilde girilmelidir. Varsayılan olarak, scriptler her annotasyon içinde 100 μm × 100 μm ölçüsünde beş örtüşmeyen kare ROI üretir. Aday ROI'ları yalnızca köşeleri ve merkezleri annotasyon sınırları içinde tamamen yer aldığında kabul edilir; böylece seçilen bölgede tam dahil olma sağlanır. ROI'ların hem sayısı hem de boyutları, belirli deneysel gereksinimlere uygun olarak script içinde değiştirilebilir. Analiz için en az üç biyolojik kopya ve en az beş ROI/örnek önerilmektedir.
  6. TWOMBLI analizi
    1. Tüm elastik liflerin ROI Görüntülerini analiz için özel bir klasöre kaydedin.
    2. Çalışma dizininde iki alt klasör oluşturun: a. Mask klasörü – TWOMBLI tarafından oluşturulan ikili maskeler için. b. HDM klasörü – TWOMBLI tarafından üretilen Yüksek Yoğunluklu Matris (HDM) görüntüleri için.
    3. TWOMBLI eklentisini çalıştırın: Fiji'yi açın ve TWOMBLI'yi başlatın (Eklentiler -> Makrolar -> Çalıştır).
    4. Uygun analiz parametre dosyasını seçin. Aşağıdaki TWOMBLI parametreleri, elastik lif analizi için kullanılmıştır ve Tablo 1'de listelenmiştir.
      NOT: Bu parametreler boyama yoğunluğuna bağlı olarak değişebilir. Parametreler, standart koşullarda boyanmış akciğer dokusu kesitlerinden elde edilen birden fazla temsil edici görüntü kullanılarak ampirik olarak optimize edildi. Optimizasyon, üretilen maskelerin orijinal boyama deseniyle karşılaştırılması ve segmentli maske ile altındaki elastik fiber ağı arasında en iyi örtüşmeyi sağlayan ayarların seçilmesiyle gerçekleştirildi. Oluşturulduktan sonra, aynı parametreler veri kümesindeki tüm görüntülere uygulandı.
    5. "Açık arka plan yerine koyu lifler" seçeneğini seçin.
    6. Mask klasöründe ikili maskeler oluşturun ve kaydedin.
    7. HDM klasöründe ikili görüntüler oluşturup kaydedin.
    8. Fiber uzunluğu, dal noktaları, eğrilik, yoğunluk ve hizalama gibi niceliksel ağ parametrelerini çıkarın.
      NOT: TWOMBLI analizi keskin, yüksek çözünürlüklü görüntüler (>1 piksel/μm) gerektirir. Kötü renk dekonvolüsyonu, odak dışı bölgeler veya görüntü sıkıştırması, fiber ağ niceliklerinin doğruluğunu zayıflatabilir.
  7. Nicel ve istatistiksel analiz
    1. TWOMBLI ağ parametrelerini CSV dosyası olarak dışa aktarın.
    2. Ham CSV verilerini istatistiksel analiz ve görselleştirme için GraphPad Prism'e aktarın.
      NOT: Aşağıdaki parametre önerilir: Maske Toplam Uzunluğu, bu da yatırım getirisi içindeki toplam elastik lif miktarını yansıtır ve lif bolluğu ile kaybının nicelendirilmesini sağlar. Fiber Uç Noktaları, fiber parçalanma derecesini gösterir; Son noktaların artan sayısı, bozulmuş veya kırık liflerin olduğunu gösteriyor. Fiber Branchpoints, fiberlerin birbirine ne kadar bağlı olduğunu ölçür ve ECM ağının yapısal karmaşıklığını ve bütünlüğünü yansıtır. Daha fazla dal noktası daha karmaşık ve iç içe geçmiş bir ağı gösterir. Lakunarlık, yatırım getirisi üzerindeki lif dağılımının homojenliğini nicelikle ölçür. Düşük boşluk, benzer büyüklükte boşluklara sahip tekdüze bir ağı gösterirken, yüksek boşluk değişken boşluklara sahip heterojen bir ağı yansıtır ve bu daha karmaşık bir yapıyı tanımlar. Box Counting-Fractal Dimension, fiber mimarisinin karmaşıklığını yakalar. Daha yüksek fraktal boyut değerleri daha karmaşık ve detaylı ağları gösterirken, daha düşük değerler daha basit veya bozuk yapıları yansıtır.
    3. Her nicelendirilmiş ağ parametresi için ortalama ± SEM gösteren sütun grafikleri oluşturun (örneğin, fiber uzunluğu, dallanma, eğrilik ve yoğunluk).
    4. Shapiro-Wilk testi kullanılarak veri normalliğini test edin. Parametrik veriler için, çiftsiz iki kuyruklu Öğrenci t-testini uygulayın. Parametrik olmayan veriler için Mann-Whitney U testi uygulanır. İkiden fazla deneysel grubu içeren karşılaştırmalar için, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından uygun bir sonradan çoklu karşılaştırma testi veya parametrik olmayan veriler için Kruskal–Wallis testi uygulanmalıdır.
      NOT: Tüm ham CSV dosyalarını değiştirilmeden tutun, böylece tekrarlanabilirlik ve veri izlenebilirliği sağlanır. Her durum için analiz edilen ROI ve biyolojik kopya sayısını şekil efsanelerinde bildirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol, farklı akciğer bölgeleri ve deneysel koşullar arasında elastik fiber ağının nicel parametrelerini sağlar. Daha önce açıklandığı gibi, TWOMBLI analizi, hücre dışı matris değerlendirmesi için lif uzunluğu, dallanma yoğunluğu, boşluk ve fraktal boyut gibi parametreler verir. Bu çerçeve üzerine inşa edilen yaklaşımımız, hem fizyolojik hem de patolojik akciğer dokularında lif bolluğu, bağlantı, uniformlik ve yapısal karmaşıklıktaki değişikliklerin değerlen...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, özellikle fibroblast kaynaklı elastik lif yeniden yapılanmasına odaklanarak, fare akciğer ekstrasellüler matriks (ECM) mimarisinin incelenmesi için sağlam ve tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar. Elastik lifler, akciğer uyumu ve geri tepme için gereklidir ve bozulmaları, fibroz, akciğer hasarı, yaşlanma ve metabolik bozukluklar dahil olmak üzere birçok akciğer hastalığının ayırt ediciözelliğidir. Temel fonksiyonel rollerine rağmen, elastik lif organiza...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.

Teşekkürler

Bonn Üniversitesi Tıp Fakültesi'nin Histoloji Çekirdek Tesisi'ne teşekkür etmek isteriz. Ayrıca, Daniela Kraus ve tüm ekibin iFET hayvan tesisindeki destekleyici çalışmalarını takdir ediyoruz. V.L.K., Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) tarafından Almanya'nın Mükemmeliyet Stratejisi – EXC 2151 – 390873048 kapsamında finanse edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Axio CS2 Slayt Tarayıcı Carl Zeiss
Coplin Cam Boyama kavanozuSigma-AldrichS6016
DPX Montaj maddesiSigma-Aldrich6522
Histoloji için Etanol (%100)Carl Roth9065.4
Fijihttps://imagej.net/software/fiji/sürüm 1.54t
Nötr tamponlu formalin çözeltisi, %10SigmaHT501128
Dokular İçin İşleme/Gömü Kaseleri HISTOSETTE ISigma-AldrichH0542
mikrotomThermo Fischer ScientificHM355S
Mikroskop SlaytlarıVWR631-0108
Fare: C57BL/6JThe Jackson LaboratoryRRID: IMSR_JAX:000664Suş #:000664 
Parafin gömme sistemiEpredia HistoStar gömme modülü
Prismhttps://www.graphpad.com sürüm 11
Qupathhttps://qupath.github.iosürüm 0.7.0
Resorsin-FuşenWaldeck2.00E-30
TWOMBLI eklentisihttps://github.com/wershofe/TWOMBLI
KsilenApplichem GmBH14020172

Kaynaklar

  1. Schmelzer CEH, Duca L. Elastic fibers: formation, function, and fate during aging and disease. FEBS J. 2022;289:3704-3730.
  2. Heinz A. Elastic fibers during aging and disease. Ageing Res Rev. 2021;66:101255.
  3. Rottmann S, et al. Global matrisome changes in obese lung are linked to fibroblastic stroma and premature aging. Cell Rep. 2025;44:116285.
  4. Naba A, et al. The matrisome: in silico definition and in vivo characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol Cell Proteomics. 2012;11:M111 014647.
  5. Schiller HB, Fernandez IE, Burgstaller G, et al. Time- and compartment-resolved proteome profiling of the extracellular niche in lung injury and repair. Mol Syst Biol 2015;11:819.
  6. Hynes RO. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 2009;326:1216-9.
  7. Sutherland TE, Dyer DP, Allen JE. The extracellular matrix and the immune system: A mutually dependent relationship. Science. 2023;379:eabp8964.
  8. Kozel BA, Mecham RP. Elastic fiber ultrastructure and assembly. Matrix Biol. 2019;84:31-40.
  9. Schlatmann TJ, Becker AE. Histologic changes in the normal aging aorta: implications for dissecting aortic aneurysm. Am J Cardiol. 1977;39:13-20.
  10. Wershof E, et al. A FIJI macro for quantifying pattern in extracellular matrix. Life Sci Alliance. 2021;4.
  11. Fischer AH, et al. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008;2008:pdb prot4986.
  12. Bankhead P, et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 2017;7:16878.
  13. Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol. 2001;23:291-9.
  14. Schindelin J, et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 2012;9:676-82.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

T pSay 234Say 234Saymatrizom

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.