Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Qi-fu-yin'in 5xFAD Farelerin Beyinlerinde Bilişsel Bozukluğun İyileştirilmesi ve Hücresel Yaşlanmanın Azaltılması Üzerindeki Etkileri

111 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/72118

⸱

8 Eylül 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, 5xFAD farelerinde Qi-fu-yin (QFY) tedavisini değerlendirmektedir. Bulgular, QFY uygulamasının gelişmiş öğrenme ve hafıza performansı, azalmış serebral Aβ depozisyonu ve hücresel senesans ile serebral kortekste hafifletilmiş sinaptik yapısal hasar ile ilişkili olduğunu göstermektedir.

Özet

Geleneksel bir Çin tıbbı reçetesi olan Qi-fu-yin'in (QFY) mekanizması henüz tam olarak anlaşılamamış olsa da, Alzheimer hastalığında (AD) terapötik potansiyel göstermiştir. Bu çalışma, QFY tedavisi ile 5xFAD farelerdeki bilişsel bozukluk arasındaki ilişkiyi araştırmayı amaçlamıştır. 5xFAD farelerinin beyinlerindeki Amyloid-β protein 1-42 (Aβ1-42), Aβ1-40, Büyüme ile ilişkili protein 43 (GAP-43), Sinaptofizin (SYN) ve Postsinaptik yoğunluk proteini 95 (PSD-95) seviyelerini değerlendirmek için kavrama gücü, yürüyüş, koloni yuvalama, mekik kutusu, Morris su labirenti testi ve ELISA kullandık. Korteksteki Yaşlılıkla ilişkili salgılayıcı fenotip (SASP) seviyelerini nicelleştirmek için Luminex sitokin analizi kullanılmıştır. Hayvanların beyinlerindeki Yaşlılıkla ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-Gal) miktarı, Aβ birikimi ve dendritik dikenler sırasıyla SA-β-Gal boyaması, immünohistokimya ve Golgi-Cox boyaması ile ölçülmüştür. İmmünofloresan testlere göre QFY tedavisi, 5xFAD farelerde kortikal Aβ plak yükünü dramatik şekilde azaltmış ve p21 ekspresyonunu düşürmüştür. 5xFAD farelerde QFY tedavisi öğrenme ve hafıza performansını belirgin şekilde artırmış, yaşlanmayı hafifletmiş ve farelerin korteksindeki GAP-43, PSD-95 ve SYN protein miktarlarını artırmıştır. QFY tedavisi sonrası beyinde Aβ plağı ve SA-β-Gal aktivitesinin yanı sıra hipokampusta Aβ1-42 ve Aβ1-42/Aβ1-40 seviyelerinde anlamlı bir azalma görülmüştür. 5xFAD farelerinin korteksinde IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-17A ve IFN-γ seviyeleri önemli ölçüde azalmıştır. PCA ve Pearson korelasyon analizleri, SASP sitokinleri ile sinaptik protein seviyeleri arasında güçlü bir negatif ilişki olduğunu göstermiştir. Bu bulgular, QFY tedavisinin 5xFAD farelerinde yaşa bağlı bilişsel gerileme ve hücresel senesans fenotiplerindeki iyileşmelerle birlikte sinaptik yapısal hasarın hafifletilmesi arasında bir ilişki olduğunu göstermektedir. Bu sonuçlar, QFY'nin Alzheimer hastalığı için potansiyel bir terapötik aday olarak daha fazla araştırılmasını desteklemektedir.

Giriş

Alzheimer's disease (AD)1 is the most prevalent form of dementia, characterized by amyloid-β protein (Aβ), hyperphosphorylated tau proteins (P-Tau), synaptic loss, and chronic inflammation. Currently available medications for AD have a number of side effects and are unable to stop the disease's progression2,3,4,5.

Senescence, which manifests as organism-wide disruptions across cellular and interstitial microenvironments rather than localized organ-specific alterations, is a key risk factor in AD pathogenesis. This systemic dysregulation distinguishes AD progression from single tissue-pathology models by fundamentally changing homeostatic mechanisms across biological systems6,7. Although cellular senescence initially serves as a homeostatic regulatory mechanism, the accumulation of senescent cells eventually causes progressive tissue degradation and persistent inflammatory cascades, fundamentally disrupting physiological homeostasis8. The ensuing inflammation may harm synapses and impair cognitive function9,10.

Cellular senescence is a complex cellular stress response characterized by telomere shortening, permanent cell-cycle arrest, and altered secretory activity11. Additional hallmarks include enlarged, flattened cell morphology, positive senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) staining, lipofuscin accumulation, and secretion of SASP factors12. Memory formation is affected by the notable decline in the levels of proteins associated with synaptic plasticity of axons and dendrites, which occurs with cellular senescence13,14. Because synaptic plasticity is essential for learning and memory, disruptions in synaptic proteins contribute to cognitive impairment. These proteins include GAP-43, SYN, and PSD-95. Undoubtedly, synaptic function is affected by reductions in dendritic numbers and functional abnormalities in the brains of the elderly15.

QFY is a traditional Chinese medicine formula derived from Jing Yue Quan Shu. It is composed of Panax ginseng C.A.Mey (Araliaceae), Polygala tenuifolia Willd (Polygalaceae), Rehmannia glutinosa (Gaertn.) Libosch. ex Fisch. & C. A. Mey (Orobanchaceae), Angelica sinensis (Oliv.) Diels (Apiaceae), Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC. (Fabaceae), Atractylodes macrocephala Koidz (Asteraceae), Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H.F. Chou (Rhamnaceae). Research has demonstrated that QFY significantly ameliorates cognitive dysfunction in rats with diabetes-induced brain injury16. Our previous study found that QFY could improve cognitive learning and memory functions impairment in 5xFAD and APP/PS1 mice. In addition, QFY demonstrated high safety in non-clinical studies, and no obvious acute, subacute, or long-term toxic reactions were observed17,18,19. Analysis of the clinical therapeutic effect of QFY showed that AD patients experienced a significant increase in their capacity for activities of daily living and MMSE scores after QFY treatment20. Following three consecutive days of QFY administration in male Sprague-Dawley rats, ten prototype QFY-derived components, including butylidenephthalide, butylphthalide, 20(S)-ginsenoside Rh1, 20(R)-ginsenoside Rh1, and zingibroside R1, were detected in cerebrospinal fluid21,22. However, the therapeutic mechanism of QFY in AD is still unclear. In this study, we investigated the association between QFY treatment, cellular senescence, and AD-related pathological changes in 5xFAD mice.

Although previous studies have demonstrated the neuroprotective effects of QFY in AD models, the specific involvement of cellular senescence in mediating these effects remains unexplored. Moreover, whether QFY confers cognitive benefits through senescence‑associated synaptic preservation, rather than solely through amyloid‑β reduction, has not been addressed. The present study was therefore designed to investigate whether QFY treatment attenuates cellular senescence and whether this attenuation is associated with improved synaptic plasticity in 5xFAD mice.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Shandong Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Deneysel Hayvan Refahı Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (SDUTCM20221101001).

İlaçlar

QFY granül kuru krem tozu, Lunan Pharmaceutical Houpu Araştırma ve Geliştirme Merkezi tarafından hazırlanmış ve test edilmiştir. Donepezil ve Memantine, Shanghai Yuanye Technology'den satın alınmıştır. Bu çalışmada, başlangıç vücut ağırlığı 19–27 g aralığında olan erkek 5xFAD fareler kullanılmıştır. QFY dozu, 43 g/d olan klinik insan dozundan türetilmiş olup, QFY granül kuru krem tozu için ayarlama yapıldıktan sonra 16,297 g/d'ye tekabül etmektedir. Mevcut deney için orta doz, klinik insan dozuna göre hesaplanmıştır (16,297 g/70 kg x 9,1 = 2,11861 g/kg/d). Yüksek doz, orta dozun iki katı (4,24 g/kg/d) ve düşük doz, orta dozun yarısı (1,06 g/kg/d) olarak belirlenmiştir. Tüm ilaç çözeltileri, 10 g vücut ağırlığı başına 0,1 mL hacminde uygulanmıştır.

Pozitif kontrol için donepezil ve memantin hidroklorürün kombine uygulaması kullanılmıştır. Dozlar, mevcut klinik uygulama dozları (sırasıyla 10 mg/gün ve 20 mg/gün) ve araştırma grubumuzdan elde edilen önceki veriler referans alınarak belirlenmiş; sonuç olarak günlük 1.0 mg/kg donepezil ile 2.8 mg/kg memantine'den oluşan, toplamda 3.8 mg/kg'lık bir kombine doz rejimi oluşturulmuştur. Donepezil–memantin karışımının nihai konsantrasyonu, 3.8 mg/kg'ın 10 g vücut ağırlığı başına 0.1 mL olan uygulama hacmine bölünmesiyle hesaplanarak 0.38 mg/mL olarak hazırlanmıştır.

Düşük, orta ve yüksek dozlarda QFY çözeltileri şu şekilde hazırlandı: 5,3 g, 10,6 g ve 21,2 g QFY kuru tozu ayrı 100 mL'lik beherlere yerleştirildi, 30 mL saflaştırılmış su ile iyice karıştırıldı, dereceli silindirlere aktarıldı ve saflaştırılmış su ile son hacmi 50 mL'ye tamamlanarak sırasıyla 0,106 g/mL, 0,212 g/mL ve 0,424 g/mL nihai kütle konsantrasyonları elde edildi. Pozitif kontrol için 5 mg donepezil ve 14 mg memantin saflaştırılmış suda çözüldü ve son hacmi 50 mL'ye ayarlandı. Her gruptaki hayvanlara ilgili ilaç çözeltisi günde bir kez oral gavage yoluyla verildi.

Hayvanlar

5xFAD transgenik fareler [B6. Cg-Tg (APPSwFlLon, PSEN1* M146L* L286V)6799Vas/Mmjax] laboratuvarda üretilmiştir. Hayvanların tamamı, Shandong Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi'nde, 22–24 oC sıcaklıkta, %50–60 nemde ve 12 saatlik ışık-karanlık döngüsüne sahip bir SPF ortamında tutulmuştur. Hayvanlara her zaman yem ve su sağlanmıştır.

2,5 aylık erkek 5xFAD fareler rastgele beş gruba ayrıldı: tedavi edilmemiş 5xFAD, donepezil artı memantin, düşük doz QFY, orta doz QFY ve yüksek doz QFY. Yaşları uyumlu erkek yabanıl tip (WT) kardeş fareler WT kontrol grubu olarak kullanıldı. Tedaviler 220 gün boyunca günde bir kez uygulandı. (Şekil 1).

Davranışsal testler

Kavrama kuvveti testi

Farelerin ön üyelerindeki iskelet kası kuvveti, bir kavrama kuvveti ölçer kullanılarak ölçülmüştür23. Deney sırasında, farenin masa yüzeyine paralel kalması sağlanarak test cihazı yatay olarak konumlandırılmıştır. Cihaz açıldıktan sonra, fare nazikçe kavrama plakasına yerleştirilmiştir. Fare plakayı güvenli bir şekilde kavradığında, fare tutuşunu bırakana kadar kuyruğu eşit kuvvetle geriye doğru çekilmiştir. Maksimum kavrama kuvveti kaydedilmiştir. Bu ölçüm üç kez tekrarlanmış ve farenin kavrama kuvvetini belirlemek için bu değerlerin ortalaması kullanılmıştır.

Yürüyüş testi

Farelerin yürüyüş düzenliliği CatWalk XT kullanılarak ölçüldü. Deney, bir eğitim dönemi ve bir test dönemi olarak ikiye ayrıldı24. Deney fareleri, yeni ortama adapte olabilmeleri için bir gün önceden deney odasına aktarıldı. Eğitim dönemi boyunca fareler başlangıç noktasına yerleştirildi ve kanal boyunca bitiş noktasına kadar koşturdular. Her fare günde üç kez eğitildi. 3 günlük eğitimin ardından (her fare kanal boyunca hızla geçebilene kadar), fareler kafeslerine geri götürüldü. Test dönemi, eğitim dönemi ile aynı şekilde gerçekleştirildi ve bilgisayar yazılımı her bir hareket yörüngesini otomatik olarak analiz etti. Yörünge uygunsa yeşil noktalar, uygun değilse turuncu noktalar görüntülendi; her fare için en az üç yeşil noktanın olması uygun kabul edildi ve bunlar CatWalkXT 10.0 yazılımı ile analiz edildi.

Mekik kutusu testi

Farelerde koşullu aktif kaçınma yeteneğini değerlendirmek için mekik kutusu testi kullanılmıştır25. Düzenek, ses yalıtımlı bir bölme içine yerleştirilmiş bir mekik kutusundan (18 cm x 18 cm) oluşmaktaydı.  Deney, 4 günlük bir öğrenme döneminin ardından 1 günlük bir test döneminden oluşmuştur.  Her öğrenme gününde, eğitim başlamadan önce farelere mekik kutusunda 120 s'lik bir adaptasyon süresi tanınmıştır. Her deneme, 6 s'lik bir koşullu uyaranla (70 dB, 1000 Hz ton ile 500 lux ışık kombinasyonu) başlamış, ardından ızgara taban aracılığıyla uygulanan 3 s'lik 0,3 mA'lik bir ayak şoku verilmiş ve 12 s'lik denemeler arası ara ile sona ermiştir. Eğer fare koşullu uyaran sırasında karşı bölmeye geçerse, şok verilmemiş ve bu yanıt aktif kaçınma olarak kaydedilmiştir. Eğer fare koşullu uyaran sırasında geçmeyip ayak şoku sırasında geçerse, bu bir pasif kaçınma yanıtı olarak kaydedilmiştir. Eğer fare deneme boyunca geçiş yapamazsa, bu bir kaçış başarısızlığı olarak kaydedilmiştir. Eğitim, günde 30 deneme olacak şekilde ardışık 4 gün boyunca tekrarlanmıştır. Test döneminde (5. gün), diğer tüm parametreler öğrenme dönemindekiyle aynı kalırken ayak şoku uygulanmamıştır. Aktif kaçınma yanıtlarının sayısı, öğrenme ve belleğin birincil ölçütü olarak kaydedilmiştir.

Morris su labirenti

Deneysel hayvanların mekansal öğrenme ve bellek yeteneklerini değerlendirmek için Morris su labirenti testi kullanılmıştır26. Deney, 120 cm çapında ve 50 cm derinliğinde bir tankta gerçekleştirilmiştir. Tank bulanık beyaz suyla doldurulmuş ve sıcaklık 21 °C'de sabit tutulmuştur. Quadrantlardan birine, su yüzeyinin 1 cm altına 10 cm çapında bir platform yerleştirilmiştir. Fareler için mekansal işaretleyiciler olarak havuzun etrafına görsel ipuçları yerleştirilmiştir. Öğrenme süreci, her günün oturumuna üç quadranttan birinde başlanarak ardışık dört gün boyunca yürütülmüştür. Başlangıç pozisyonları, dört ana yön arasında sözde rastgele olarak değiştirilmiştir. Her denemede, hayvan platforma başarıyla ulaştığında prosedür sonlandırılmıştır. Maksimum deneme süresi 60 s olarak belirlenmiştir; hayvanın bu süre zarfında platformu bulamaması durumunda, platforma dikkatle yönlendirilmiştir. Platforma ulaştıktan sonra, hayvan ev kafesine geri götürülmeden önce kısa bir 10 s mola verilmiştir. Öğrenme süreci sona erdikten 24 saat sonra test süreci başlamıştır. 5. günde fareler, platformun karşı quadrantından yerleştirilmiştir. Test sürecindeki kaçış latansı, hedef quadranttaki hareket süresi ve orijinal su altı platform alanının geçiş sayısı kaydedilmiştir.

Koloni iç içe geçme testi

Deney hayvanlarının günlük aktiviteleri, koloni yuva yapma testi kullanılarak değerlendirilmiştir27. Deney, grup başına üç hayvanla 24 sa boyunca sürdürülmüştür. İlacın verildiği aynı gün yeni kafesler kurulmuş, yuva yapımı için içine 6 g yumuşak kağıt serilmiş ve 6. saat, 12. saat ile 24. saatlerde fotoğraflar çekilmiştir. Deney sonunda; kağıtlar kafesin her yerine dağılmışsa ve hiç ısırılmamışsa 1 puan verilmiştir. Kağıt parçaları kafesin kenarında toplanmış ancak gevşek haldeyse, oluşmuş bir yuva yoksa ve belirgin bir yırtılma veya katlama görülmüyorsa 2 puan verilmiştir; Kağıt parçaları toplanmış ve belirgin bir yırtılma olmaksızın oluşmuş ancak nispeten düz bir yuva haline getirilmişse 3 puan verilmiştir; Yaygın şekilde parçalanmış kağıtlardan oluşan derin bir yuvaya ise 4 puan verilmiştir.  Deney sonunda, kalan  yırtılmamış doku  (parçalanmamış veya yuvaya dahil edilmemiş, ağırlığı >0.1 g olan kağıt fragmanları olarak tanımlanmıştır) dikkatlice toplanmış, havada kurutulmuş ve elektronik bir terazi (hassasiyet: 0.01 g) kullanılarak tartılmıştır. 

Örnekleme ve örnek toplama

Yalnızca WT, 5xFAD ve QFY (2,12 g/kg/gün) gruplarından örnek topladık. CO2 asfiksiyasyonun ardından başlar kesildi, hipokampus ve korteksi ayırmak için sağ hemisfer hızla açıldı, fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulandı ve sıvı nitrojen içindeki 1,5 mL'lik dondurma tüplerine yerleştirildi. Biyokimyasal testler için -80 oC'de saklandı. Sol hemisfer, 24 saat boyunca %4 paraformaldehit içine daldırılarak sabitlendi, mutlak etanol içine daldırılarak susuzlaştırıldı, parafin mumuna gömüldü, 5 µm kalınlığında dilimlendi ve immünohistokimyasal tespit için deparafinize edildi.

Enzim bağlantılı immünosorbent assay (ELISA)

Beyin dokularındaki hedef protein düzeylerini belirlemek için ELISA'lar gerçekleştirildi. Hipokampal homojenatlardaki Aβ1–40 ve Aβ1–42 içerikleri ticari kitler kullanılarak ölçülürken; GAP-43, PSD-95 ve SYN'nin kortikal düzeyleri Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry'den temin edilen kitler kullanılarak belirlendi. Tüm prosedürler, üretici protokollerine kesinlikle uygun olarak yürütüldü. Standart serileri, kit talimatları takip edilerek seri dilüsyon ile hazırlandı. Mikroplaka düzeni; boş kuyucuklar, standart kuyucuklar, 5xFAD örnek kuyucukları, QFY ile işlem görmüş (2.12 g/kg/d) örnek kuyucukları ve yabani tip kuyucukları içeriyordu. Yüklemeden önce tüm örnekler, sağlanan dilüent ile iki kat seyreltildi. Reaktifler, pipet ucu kuyucuk tabanına dik tutularak eklendi ve ardından tam karışımı sağlamak için nazikçe çalkalandı.

Plaka mühürlemesinden sonra, ilk inkübasyon 37 °C'de 30 dk boyunca gerçekleştirildi. Bu süre zarfında, konsantre stok çözeltinin ultrapure su ile 1:29 oranında (1 mL konsantreye 29 mL su) seyreltilmesiyle yıkama tamponu hazırlandı. İnkübasyonun ardından mühürleme filmi çıkarıldı, sıvı döküldü ve plaka kurulanarak temizlendi. Daha sonra her kuyuya 200 µL yıkama tamponu eklendi, 30 s bekletildi ve boşaltıldı; bu döngü 5 kez tekrarlandı. Ardından, boşlar hariç tüm kuyucuklara enzimle işaretli reaktif (50 µL) eklendi, plaka tekrar mühürlendi ve 37 °C'de 30 dk boyunca inkübe edildi; bunu aynı beş döngülü yıkama adımı takip etti.

Renk gelişimi için, her kuyucuğa önce 50 µL kromojen çözelti A, ardından 50 µL kromojen çözelti B eklenmiş ve her ekleme sonrası nazikçe karıştırılmıştır. Plaka, karanlıkta 37 °C'de 10 dk boyunca inkübe edilmiştir. Enzimatik reaksiyon, kuyucuk başına 50 µL durdurma çözeltisi eklenerek sonlandırılmış; bu işlem mavi rengi hızla sarıya dönüştürmüştür. Absorbans (optik yoğunluk), boş kuyucuklar referans alınarak bir mikroplaka okuyucu ile 450 nm'de ölçülmüştür; tüm okumalar reaksiyon durdurulduktan sonraki 15 dk içinde gerçekleştirilmiştir.

Luminex

Kortikal SASP faktör seviyeleri, tüm prosedürler üretici talimatlarına uygun olarak gerçekleştirilmek suretiyle Bio‑Plex Pro Mouse Cytokine 23‑plex Assay kiti kullanılarak ölçülmüştür. Reaktifler 4 °C'lik depolama alanından çıkarılmış ve kullanımdan önce 30 dk boyunca oda sıcaklığına dengelenmeye bırakılmıştır. Kit protokolüne göre, yedi noktalı bir standart eğri ve bir boş kuyucuk oluşturmak için standart stoklar seri olarak dilüe edilmiştir. Manyetik boncuklar önceden karıştırılmış ve önerilen çalışma konsantrasyonuna dilüe edilmiş; deteksiyon antikorları çalışma çözeltileri olarak hazırlanmış ve yıkama tamponu konsantresi deiyonize su ile 1x olacak şekilde dilüe edilmiştir. PE‑streptavidin konjuge, sağlanan dilüsyon tamponu kullanılarak 1x olacak şekilde dilüe edilmiştir.

Analiz için; boncuk süspansiyonu, standartlar, kalite kontrolleri ve dilüe edilmiş doku örnekleri (5.6 µg/µL), plaka düzenine göre belirlenen kuyucuklara sırasıyla 50 µL eklenmiştir. Ardından plaka kapatılmış ve 800 rpm orbital çalkalama ile 4 °C'de gece boyunca inkübe edilmiştir. İnkübasyonun ardından, boncuklar her kuyucuğa 200 µL yıkama tamponu eklenerek üç kez yıkanmıştır. Sonrasında, her kuyucuğa 50 µL hazırlanan deteksiyon antikoru eklenmiş ve plaka, 800 rpm çalkalama ile oda sıcaklığında 1 sa boyunca inkübe edilmiştir. Üç yıkama döngüsünden sonra 50 µL PE‑streptavidin çalışma çözeltisi eklenmiş ve plaka, aynı çalkalama koşulları altında oda sıcaklığında 30 dk daha inkübe edilmiştir. Son bir yıkama aşaması gerçekleştirilmiş (üç kez 200 µL yıkama tamponu ile), ardından her kuyucuğa 150 µL yıkama tamponu eklenmiş ve plaka, Bio‑Plex cihazında okunmadan önce oda sıcaklığında 800 rpm ile 2 dk boyunca çalkalanmıştır.

SA-β-Gal boyaması ve immünohistokimya

SA-β-Gal boyaması, Senescence β-Galactosidase Staining Kit talimatlarına uygun olarak gerçekleştirildi. SA-β-Gal boyamasının ardından, kesitler sitrat tamponunda (pH 6.0) ısıtılarak antijen geri kazanım işlemine tabi tutuldu. Endojen peroksidaz aktivitesi, kesitlerin oda sıcaklığında 10 dk boyunca peroksidaz bloklama solüsyonu içinde inkübe edilmesiyle engellendi. Ardından kesitler, tavşan monoklonal anti‑Aβ₁-₄₂ antikoru (1:400) ile 4 °C'de gece boyunca inkübe edildi. Yıkama işleminden sonra kesitler, oda sıcaklığında 20 dk boyunca anti‑tavşan/fare IgG sekonder antikoru ile inkübe edildi. Tekrar yıkama işleminin ardından, immünoreaktivite DAB ile 2 dk boyunca görselleştirildi. Son olarak kesitler, mikroskobik inceleme için dehidre edildi, şeffaflaştırıldı ve nötr rezin ile lam üzerine monte edildi.

İmmünofloresan

İmmünofloresan boyama için, parafin kesitler ksilen ile deparafimize edildi (3 x 15 dk) ve dereceli bir etanol serisi ile (100%, 95% ve 75%; her biri 2 x 5 dk) yeniden hidrate edildi. Antijen geri kazanımı, kesitlerin 1x sodyum sitrat tamponu içerisinde 95 °C'de 30 dk boyunca bekletilmesi ve ardından oda sıcaklığına kadar kademeli olarak soğutulmasıyla gerçekleştirildi. Tween 20 içeren fosfat tamponlu salin (PBST) ile üç kez durulandıktan sonra (her biri 5 dk), kesitler %0,3 Triton X‑100 içeren %10 normal keçi serumu ile oda sıcaklığında 90 dk boyunca permeabilize edildi ve bloklandı. Kesitler daha sonra p21/CIP1/CDKN1A (1:200) ve Aβ₁‑₄₂ (1:400) primer antikorları ile 37 °C'de 2 saat boyunca inkübe edildi. PBST ile dört yıkama işleminin (her biri 5 dk) ardından, kesitler türe uygun Alexa Fluor-konjuge sekonder antikorlar (1:500) ile karanlıkta 37 °C'de 2 saat boyunca inkübe edildi. Ek yıkama işlemlerinden sonra (PBST ile 4 x 5 dk), kesitler DAPI içeren antifade montaj ortamı ile kapatıldı ve floresan mikroskobu kullanılarak görüntülemesi yapıldı.

Golgi-Cox boyama

Golgi‑Cox boyaması, üretici talimatlarına uygun olarak ticari bir kit kullanılarak gerçekleştirilmiştir. A ve B çözeltileri, deneyden 24 saat önce karıştırılmıştır. Fareler ötanize edildikten sonra beyin dokuları hızla çıkarılmış, PBS ile durulanmış ve A ve B çözeltileri karışımına daldırılmıştır. Dokular, oda sıcaklığında karanlıkta 6 saat boyunca bekletilmiş; ardından impregnasyon çözeltisi taze çözeltiyle değiştirilmiş ve inkübasyon oda sıcaklığında karanlıkta 2 hafta daha devam ettirilmiştir (beyin dokusu başına en az 2 mL impregnasyon çözeltisi). Ardından dokular C Çözeltisine aktarılarak 24 saat inkübe edilmiş, sonrasında taze C Çözeltisi ile değiştirilerek oda sıcaklığında karanlıkta 7 gün daha inkübe edilmiştir. Beyin dokuları, bir vibratom kullanılarak 100 µm kalınlığında kesilmiştir. Kesitler jelatin kaplı lamlara yerleştirilmiş ve oda sıcaklığında 3 gün kurumaya bırakılmıştır. Lamlar distile su ile iki kez durulanmış (her biri 5 dk), ardından D Çözeltisi, E Çözeltisi ve distile su karışımına (1:1:2 oranı) 15 dakika daldırılmıştır. Distile su ile yapılan iki ek durulamanın ardından (her biri 5 dk), kesitler dereceli etanol çözeltileriyle (%50, %75 ve %95; her biri 5 dk) dehydre edilmiş, ardından mutlak etanolde dört kez (her biri 4 dk) ve ksilenle üç kez (her biri 5 dk) durulanmıştır. Son olarak, kesitler kapatma medyumu ile lamellenmiştir. Görüntüler bir mikroskopla alınmış ve dendritik diken yoğunluğu ImageJ kullanılarak nicelendirilmiştir.

İstatistiksel analiz

Tüm sonuçlar ortalama ± SD olarak rapor edilmiştir. Veriler GraphPad Prism 8.1.0 kullanılarak analiz edilmiş ve grafikleştirilmiştir. İki grubun karşılaştırılması için Student’s t-testi kullanılmıştır. Birden fazla grubu içeren karşılaştırmalar için tek yönlü ANOVA kullanılmış ve ikili karşılaştırmalar Dunnett testi ile gerçekleştirilmiştir. İstatistiksel anlamlılık p < 0.05 olarak belirlenmiştir.

Çok değişkenli ve korelasyon analizleri

WT, 5xFAD ve QFY (2,12 g/kg/gün) grupları arasındaki (n = grup başına 8) SASP faktörlerinin (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-17A, IFN-γ, CCL3, CCL4 ve CCL5) grup bazlı kümelenmesini görselleştirmek için GraphPad Prism 8.0.1 kullanılarak temel bileşen analizi (PCA) gerçekleştirildi. Skor grafiği, ilk iki temel bileşene göre oluşturuldu. PCA öncesinde herhangi bir veri dönüşümü uygulanmadı. SASP faktörleri ile sinaptik proteinler (PSD-95, GAP-43 ve SYN) ve ayrıca Aβ₁₋₄₀, Aβ₁₋₄₂ ve Aβ₁₋₄₂/Aβ₁₋₄₀ oranı arasındaki doğrusal ilişkileri değerlendirmek için Pearson korelasyon analizi yapıldı. Analiz, iki kuyruklu anlamlılık eşiği p < 0,05 olacak şekilde GraphPad Prism kullanılarak gerçekleştirildi. İlişkilerin gücünü ve yönünü görselleştirmek için korelasyon matrisleri ve bir ısı haritası oluşturuldu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Administration of QFY enhances learning and memory in 5xFAD mice

After QFY administration, a shuttle box test was conducted to assess the conditional active avoidance response of mice (Figure 2A–C). The results showed the number of active avoidances on days 1-4 (Figure 2A, p < 0.05) and the area under the curve (AUC) of active avoidance (Figure 2B, p ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Nöral sinaptik plastisite, bilişsel işlevde kilit bir rol oynar. AD hastalarının beyinlerinde, Aβ birikintileri farklı bölgelere yayılır; bu durum doğrudan sinaptik yapısal hasara, eksitatör sinaps kaybına ve bilişsel gerilemeye neden olur28. GAP-43 (presinaptik bir membran proteini)29, PSD-95 (postsinaptik membranda yer alan bir iskele proteini)30 ve SYN (sinaptik veziküllerle ilişkili bir fosfoprotein)31, sinaptik yapı plast...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (82205078, 82374062), Shandong Eyaleti Doğal Bilim Vakfı (ZR2026MS1293, ZR2021QH157), Shandong Eyaleti Geleneksel Çin Tıbbı Bilim ve Teknoloji Projesi (M20251730), Çin Xizang Özerk Bölgesi Bilim ve Teknoloji Projeleri (XZ202601ZY0167) ve Shandong Eyaleti Teknoloji İnovasyon Rehberlik Programı (Merkezi Hükümet Rehberliğindeki Yerel Bilim ve Teknoloji Geliştirme Fonu) (YDZX2023137) tarafından, 'Sınıf 1 Yeni Geleneksel Çin Tıbbı olarak Tongli Enterik Kaplı Kapsüllerin Geliştirilmesi ve Endüstriyelleştirme Araştırması' başlıklı proje kapsamında desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İlaçlar
DonepezilShanghai Yuanye Technologylot.J15HB188725
MemantinShanghai Yuanye Technologylot. J21HB189391
Qi-fu-yinLunan Pharmaceutical Houpu Araştırma ve Geliştirme Merkezilot. 2209001
Davranışsal testler
CatWalk XTNoldusCatWalkXT 10.0 yazılımı
El kavrama kuvveti ölçerBileadbiosciBLD-ZL-20
Morris su labirentiShanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd120 cm
Mekik kutusuShanghai Xinruan Information Technology Co., LtdXR-XC404
Antikorlar
Anti-Aβ1-42 antikorAbcamKatalog No ab201061
Anti-p21/CIP1/CDKN1A antikoruNovus BiologicalsKat# NBP3-15661
Analiz Kitleri
Aβ1-40 ELISA kitiThermo Fisher ScientificKatalog No KHB3482
Aβ1-42 ELISA kitiThermo Fisher ScientificKat# KHB3442
Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Analiz kitiR&D SistemleriKat# LXLBM23-1
GAP-43 ELISA kitiJiangsu Enzim İmmünassay EndüstrisiKat# MM-47506M1
Golgi-Cox boyama kitiBeiJing Biolead Biology Sci & Tech CoKatalog No PK401
PSD-95 ELISA kitiJiangsu Enzim İmmünosay EndüstrisiKat# MM-45953M1
Hücresel yaşlanma β-Galaktosidaz Boyama kitiBeyotimeKat# C0602
Sinaptofizin (SYN) ELISA kitiJiangsu Enzim İmmünanaliz EndüstrisiKatalog No MM-46504M1
Kimyasallar & Reaktifler
Tavşan ve fare IgG karşıtı (sekonder antikor)BaşlangıçKat# S0C1001
DAB kromojeniBaşlangıçKatalog No S0C1001
Yazılım
CatWalk XTNoldus Bilgi TeknolojileriSürüm 10.0
ImageJUlusal Sağlık Enstitüleri (NIH)Versiyon 1.53

Kaynaklar

  1. Joe E, Ringman JM. Cognitive symptoms of Alzheimer's disease: clinical management and prevention. BMJ. 2019;367:l6217.
  2. Scheff SW, et al. Synaptic alterations in CA1 in mild Alzheimer disease and mild cognitive impairment. Neurology. 2007;68(18):1501-8.
  3. Muralidar S, et al. Role of tau protein in Alzheimer's disease: the prime pathological player. Int J Biol Macromol. 2020;163:1599-617.
  4. Hardy JA, Higgins GA. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 1992;256(5054):184-5.
  5. Calsolaro V, Edison P. Neuroinflammation in Alzheimer's disease: current evidence and future directions. Alzheimers Dement. 2016;12(6):719-32.
  6. Campisi J. Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors. Cell. 2005;120(4):513-22.
  7. Yao R. An in-silico assessment suggests the potential effects of goji (fruit of Lycium barbarum L.) against aging-related diseases. Food Med Homol. 2025;2(2):9420036.
  8. Campisi J, d'Adda di Fagagna F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8(9):729-40.
  9. Salminen A, Kaarniranta K, Kauppinen A. ER stress activates immunosuppressive network: implications for aging and Alzheimer's disease. J Mol Med (Berl). 2020;98(5):633-50.
  10. Mirabella F, et al. Prenatal interleukin 6 elevation increases glutamatergic synapse density and disrupts hippocampal connectivity in offspring. Immunity. 2021;54(11):2611-31.e8.
  11. Baker DJ, Petersen RC. Cellular senescence in brain aging and neurodegenerative diseases: evidence and perspectives. J Clin Invest. 2018;128(4):1208-16.
  12. Lucas V, Cavadas C, Aveleira CA, Hook V. Cellular senescence: from mechanisms to current biomarkers and senotherapies. Pharmacol Rev. 2023;75(4):675-713.
  13. Bloss EB, et al. Evidence for reduced experience-dependent dendritic spine plasticity in the aging prefrontal cortex. J Neurosci. 2011;31(21):7831-9.
  14. Ye XS, et al. The food and medicine homologous Chinese medicine from Leguminosae species: a comprehensive review on bioactive constituents with neuroprotective effects on nervous system. Food Med Homol. 2025;2(2):9420033.
  15. Dickstein DL, Weaver CM, Luebke JI, Hof PR. Dendritic spine changes associated with normal aging. Neuroscience. 2013;251:21-32.
  16. Wang SY, et al. Qifu-Yin attenuates AGEs-induced Alzheimer-like pathophysiological changes through the RAGE/NF-kappaB pathway. Chin J Nat Med. 2014;12(12):920-8.
  17. Yang X, et al. Qi-fu-yin attenuated cognitive disorders in 5xFAD mice of Alzheimer's disease animal model by regulating immunity. Front Neurol. 2023;14:1183764.
  18. Xiao QY, et al. Effects of Qi-Fu-Yin on aging of APP/PS1 transgenic mice by regulating the intestinal microbiome. Front Cell Infect Microbiol. 2023;12:1048513.
  19. Chen K, et al. Safety and toxicity of Qi-Fu Yin, a classical traditional Chinese medicine prescription: a nonclinical research. J Appl Toxicol. 2025;45(9):1811-38.
  20. Wang L, Qiao P, Yue L, Sun R. Is Qi Fu Yin effective in clinical treatment of dementia? A meta-analysis of 697 patients. Medicine (Baltimore). 2021;100(5):e24526.
  21. Li H, et al. Identification of chemical components of Qi-Fu-Yin and its prototype components and metabolites in rat plasma and cerebrospinal fluid via UPLC-Q-TOF-MS. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:1995766.
  22. Lei X, et al. Integrating network pharmacology and component analysis to study the potential mechanisms of Qi-Fu-Yin Decoction in treating Alzheimer's disease. Drug Des Devel Ther. 2023;17:2841-58. doi:10.2147/DDDT.S402624.
  23. Takeshita H, et al. Modified forelimb grip strength test detects aging-associated physiological decline in skeletal muscle function in male mice. Sci Rep. 2017;7:42323.
  24. Caggiano V, et al. Midbrain circuits that set locomotor speed and gait selection. Nature. 2018;553(7689):455-60.
  25. Ehret B, et al. Population-level coding of avoidance learning in medial prefrontal cortex. Nat Neurosci. 2024;27(9):1805-15.
  26. Curdt N, et al. Search strategy analysis of Tg4-42 Alzheimer mice in the Morris water maze reveals early spatial navigation deficits. Sci Rep. 2022;12:5451.
  27. Deacon RMJ. Assessing nest building in mice. Nat Protoc. 2006;1(3):1117-9.
  28. Tu S, Okamoto SI, Lipton SA, Xu H. Oligomeric Aβ-induced synaptic dysfunction in Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 2014;9:48.
  29. Benowitz LI, Routtenberg A. GAP-43: an intrinsic determinant of neuronal development and plasticity. Trends Neurosci. 1997;20(2):84-91.
  30. Dore K, et al. PSD-95 protects synapses from β-amyloid. Cell Rep. 2021;35(9):109194.
  31. Kokotos AC, et al. Synaptophysin sustains presynaptic performance by preserving vesicular synaptobrevin-II levels. J Neurochem. 2019;151(1):28-37.
  32. Martin SB, et al. Synaptophysin and Synaptojanin-1 in Down syndrome are differentially affected by Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 2014;42(3):767-75.
  33. Namioka N, et al. Oxidative stress and inflammation are associated with physical frailty in patients with Alzheimer's disease. Geriatr Gerontol Int. 2016;17(6):913-8.
  34. Kojima G, Liljas A, Iliffe S, Walters K. Prevalence of frailty in mild to moderate Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. Curr Alzheimer Res. 2017;14(12):1256-63.
  35. Dimri GP, et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995;92(20):9363-7.
  36. Baker DJ, et al. Naturally occurring p16Ink4a-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 2016;530(7589):184-9.
  37. Zhang P, et al. Senolytic therapy alleviates Abeta-associated oligodendrocyte progenitor cell senescence and cognitive deficits in an Alzheimer's disease model. Nat Neurosci. 2019;22(5):719-28.
  38. Ota H, Ogawa S, Ouchi Y, Akishita M. Protective effects of NMDA receptor antagonist, memantine, against senescence of PC12 cells: a possible role of nNOS and combined effects with donepezil. Exp Gerontol. 2015;72:109-16.
  39. Herdy JR, et al. Increased post-mitotic senescence in aged human neurons is a pathological feature of Alzheimer's disease. Cell Stem Cell. 2022;29(12):1637-52.e6.
  40. Hu Y, et al. Replicative senescence dictates the emergence of disease-associated microglia and contributes to Abeta pathology. Cell Rep. 2021;35(10):109228.
  41. Tchkonia T, et al. Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities. J Clin Invest. 2013;123(3):966-72.
  42. Guerrero A, De Strooper B, Arancibia-Cárcamo IL. Cellular senescence at the crossroads of inflammation and Alzheimer's disease. Trends Neurosci. 2021;44(9):714-27.
  43. Acosta JC, et al. A complex secretory program orchestrated by the inflammasome controls paracrine senescence. Nat Cell Biol. 2013;15(8):978-90.
  44. Wang B, Han J, Elisseeff JH, Demaria M. The senescence-associated secretory phenotype and its physiological and pathological implications. Nat Rev Mol Cell Biol. 2024;25(12):958-78.
  45. Gaikwad S, Senapati S, Haque MA, Kayed R. Senescence, brain inflammation, and oligomeric tau drive cognitive decline in Alzheimer's disease: evidence from clinical and preclinical studies. Alzheimers Dement. 2024;20(1):709-27.
  46. Si Z, Sun L, Wang X. Evidence and perspectives of cell senescence in neurodegenerative diseases. Biomed Pharmacother. 2021;137:111327.
  47. Chen X, et al. Senescence-like changes induced by expression of p21Waf1/Cip1 in NIH3T3 cell line. Cell Res. 2002;12(3-4):229-33.
  48. Engeland K. Cell cycle regulation: p53-p21-RB signaling. Cell Death Differ. 2022;29(5):946-60.
  49. Choi I, et al. Autophagy enables microglia to engage amyloid plaques and prevents microglial senescence. Nat Cell Biol. 2023;25(7):963-74.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

5xFAD FareleriAlzheimer HastalığıAmiloid BetaSinaptik ProteinlerMorris Su LabirentiSenesansla İlişkili Sekresyon Fenotipiİmmünohistokimya
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.