Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Mikroglia Değişimi ve Soy Analizi İçin Yenidoğan İç Beyin Nakli

132 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/72119

⸱

28 Temmuz 2026

 ,  , 
1Department of Human Genetics, University of Utah School of Medicine, 2Department of Pathology & Laboratory Medicine, Abramson Family Cancer Research Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Bu makalede

Özet

Bu protokol, tanımlanmış mikroglia popülasyonlarının verimli yenidoğan intrasbeyin naklini sağlar, mikroglia kökeninin sağlam uzun vadeli nakil ve analizini ve çoklu donör kaynakları ile alıcı modelleri arasında in vivo entegrasyonu destekler.

Özet

Miyeloid hücre nakli yoluyla mikroglia değişimi, nörolojik süreçler ve hastalıkları incelemek için umut vadeden bir deneysel yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır. Ancak, mevcut nakil stratejileri genellikle verimsiz nakil yapma, radyasyon temelli kondisyona bağımlılık veya bağışçı ile alıcı sistemler arasında sınırlı esneklik nedeniyle sınırlandırılır. Burada, gelişmekte olan fare beynine saflaştırılmış mikroglia popülasyonlarının (Hoxb8 ve Hoxb8 olmayan mikroglia) getirilmesi için yeni doğulan intraserebral nakil protokolünü tanımlıyoruz. Bu yöntem, fizyolojik olarak izin veren koşullarda verimli donör hücre nakleti ve beyin parenximine entegrasyonunu sağlar. Önemli olarak, protokol embriyonik hematopoietik progenitörler ve doğum sonrası beyin kaynaklı mikroglia dahil olmak üzere birden fazla donör kaynağıyla uyumludur ve koşullu Csf1r eksikliği olan fareler ve Csf1rΔFIRE fareleri dahil olmak üzere azalmış veya olmayan endogen mikroglia ile farklı alıcı modellere uygulanabilir. Donör hücreler, floresans ile aktive hücre ayırmasıyla saflaştırılır ve cam mikropipetler kullanılarak iki taraflı olarak neonatal fare beyinlerine iletilir ve böylece verimli ve minimal invaziv bir şekilde ulaşılır. Alıcı fareler, donör hücrelerin mikroglia nişini genişletip doldurabilmesi için yaşlandırılır ve sonuçlar, donör hücre dağılımı ve belirteç ekspresyonunun histolojik analiziyle değerlendirilir. Bu yaklaşım, mikroglia ontogenezi ve in vivo entegrasyonun çeşitli deneysel bağlamlarda incelenmesi için sağlam ve ölçeklenebilir bir platform sağlar.

Giriş

Miyeloid hücrelerin nakli yoluyla mikroglia değişimi güçlü bir strateji ve nörolojik hastalıklar için potansiyel bir tedavi paradigması olarak ortaya çıkmıştır. Son birkaç yılda, alan merkezi sinir sisteminde yaygın mikroglia değişimi yapabilenstratejilere doğru ilerlemiştir 1. Son çalışmalar, donör kaynaklı makrofajların ve öncüllerin beyni aşılayabildiğini, mikroglia benzeri transkripsiyon programları benimseyebileceğini ve bazı durumlarda hastalıkla ilişkilifenotipler 2,3,4,5,6,7,8 iyileştirebileceğini göstermiştir. Bu bulgular, beyin makrofaj replasmanının nörolojik hastalık süreçlerini incelemek ve potansiyel olarak değiştirmek için kullanılabileceği fikrini desteklemektedir.

Mikroglia naklinde temel bir zorluk, deneysel karışıklıkları en aza indirirken sağlam bir naklet elde etmektir. Birçok yerleşik iplasman stratejisi, aşılanma, kemoterapi veya mikroglia azalma paradigmalarına dayanarak 6,9,10,11,12,13 gibi bir ennaklenebilir niş oluşturur. Etkinliklerine rağmen, bu yaklaşımlar mikroglia yaşlanmasını tetikleyebilir, kan-beyin bariyerini bozabilir ve inflamatuar sinyalleri değiştirebilir; bunların hepsi donör hücre davranışının yorumlanmasınızorlaştırabilir 9,14. Daha yakın zamanda yapılan çalışmalar, mikroglia iplasmanına yönelik koşullandırmadan bağımsız veya azaltılmış toksisiteyaklaşımlarını incelemeye başlamıştır 5,8,15.

Gelişimsel zamanlama, nakil başarısının önemli bir belirleyicisidir. Yenidoğan beyin, muhtemelen azalan yapısal engeller ve endojen mikroglia nişinin sürekli oluşması nedeniyle donör hücre genişlemesini ve uzun vadeli entegrasyonu destekleyen izin verici bir ortam sağlar. Erken doğum sonrası doğum (P0–P5) kullanılarak yapılan son nakil çalışmaları, güçlü parenkimal naklet ve mikroglia benzeri kimlik kazanımı göstererek, verimli iplasman için gelişimsel bağlamınönemini güçlendiriyor 7,8,16,17.

Hoxb8 mikrogliaları, mikroglia biyolojisine soy-sığır katkılarını incelemek için özellikle bilgilendirici bir sistem sunar. Bu hücreler, embriyonik hematopoietik öncüllerden ortaya çıkar ve işlevsiz olduğunda davranışsal sonuçlara sahip belirli bir parenkimal mikroglia alt kümesinitemsil eder 17,18,19,20,21. Son çalışmalar, birincil Hoxb8 öncülleri ile mikroglia ve östrojen reseptörü (ER)-Hoxb8 öncül sistemlerini kullanarak yapılan çalışmalar, bu hücrelerin genişlemiş, genetik olarak manipüle edilebileceği ve beyne başarılı bir şekilde aşılanabildiğini, burada mikroglia benzeri transkripsiyon profilleri ve fonksiyonel özelliklerbenimsediklerini göstermektedir 7,8,17. Bu gelişmeler, mikroglia soyu ve heterojenliği disseksiye için nakil yaklaşımlarının faydasını daha da gözler önüne sermektedir.

Burada, donör ve alıcı sistemler arasında çok yönlülük için optimize edilmiş bir yenidoğan intraserebral nakil platformunu tanımlıyoruz. Aşıtma veya sistemik koşullandırmaya dayanan yaklaşımların aksine, bu yöntem yenidoğan farelere doğrudan çift taraflı beyin içi teslimatı kullanır; böylece donör hücre yerleştirilmesini gelişimsel olarak izin veren beyin ortamında sağlarken sistemik bozulmayı en aza indirir. Bu teknik, embriyonik hematopoietik progenitörler ve doğum sonrası beyin kaynaklı mikroglialar dahil olmak üzere birden fazla donör kaynakla uyumludur ve indirgenik veya eksik endogen mikroglia ile farklı alıcı modellerde uygulanabilir. Büyük pratik avantajlarından biri, ince yenidoğan kafatasının cam mikropipetlerle hızlı manuel enjeksiyon yapmasına olanak sağlamasıdır; böylece delme veya stereotaksik fiksasyon ihtiyacını ortadan kaldırır ve yine de geniş parenximal nakleti sağlar.

Bu yaklaşım birlikte, mikroglia ontogenezi, heterojenlik ve in vivo entegrasyonu çeşitli deneysel bağlamlarda incelemek için sağlam, esnek ve ölçeklenebilir bir sistem sağlar. Bu durum, yenidoğan beyin içi naklini, sistemik mikroglia replasma stratejilerine tamamlayıcı ve deneysel olarak kontrollü bir alternatif olarak konumlandırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmadaki tüm yöntemler ve deneyler fareler üzerinde gerçekleştirilmiştir. Deneysel prosedürler, Utah Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC), Halk Sağlığı Hizmetleri Güvencesi #D16-00018 (A3031-01) tarafından onaylandı.

1. Donör ve alıcı yavrular için üreme çiftlerinin hazırlanması

  1. Çift çiftleri akşam aynı kafese yerleştirerek zamanlı çiftleşmeleri başlatın.
  2. Her sabah kadınlarda başarılı çiftleşmeyi doğrulamak için vajinal tıkaç olup olmadığını kontrol edin.
  3. Tıkalı dişileri erkeklerden çıkarır ve doğum sürecine kadar ayrı ayrı yerleştirir; bu yaklaşık 18–20 gün sürer.
  4. Doğumdan önce 7–10 gün önce hamile anneleri günde 5 dakika boyunca nazikçe tutarak yenidoğan bakımı stresini azaltın.
  5. Günlük işlem seansları sırasında betadin kokusu içeren pamuklu çubuklara maruz bırakın; böylece yavrular ameliyattan sonra geri döndüğünde anne stresini azaltın.
  6. Beklenen doğumdan önce hamile dişiler için yuva malzemesi içeren temiz kafesler hazırlayın.

2. Yenidoğan beyinlerinin hasat edilmesi ve işlenmesi

  1. Yenidoğan donör fareleri (P0–P4) anestezikle doğrudan temas kurmayı önlemek için bir çan kavanozu veya benzeri sahte zeminle donatılmış kapalı bir oda kullanarak izofloran aşırı dozuyla ötenaze edin.
  2. Nefes kesildiğinde ve reflekslerin olmaması doğrulandığında, hemen kafayı kesin.
  3. Tüm beyni, beyincik ve koku soğanlarını da dahil olmak üzere hasat edin. Beyinleri, buz üzerindeki plastik Petri kabına 3 mL soğuk 1× Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) yerleştirin.
  4. Steril skartel ve pensler kullanılarak beyni yaklaşık 1–2mm 3 parçaya indirin.
  5. Kıyma beyin dokusunu (her doku dissosiyasyon tüpü başına 1 beyin) üreticinin önerdiği protokole göre sinir dokusu dissosiyasyon sistemiyle birlikte sağlanan enzimatik sindirim reaktifleri içeren doku dissosiyasyon tüplerine aktarın.
  6. Tüpleri ısıtma kapasitesine sahip mekanik bir dissosiyasyon cihazına yerleştirin ve üreticinin önerdiği sinir dokusu dissosiyasyon programını kullanarak 37 °C'de 30 dakika boyunca kuluçka yapın.
  7. Ön emdirilmiş 70 μm hücre süzgeçleri 400 μL 1× HBSS ile süzgeçler.
  8. Dissosiyasyon yapmış dokuyu, buzun üzerinde 50 mL'lik konik bir tüpün üzerine yerleştirilen önceden ıslatılmış süzgeçlerden geçirin.
  9. Tüpleri 10 mL 1× HBSS ile yıkayın ve maksimum hücre geri kazanımı için filtrelerden geçirin.
  10. Filtreleri ve hücreleri 300 × g sıcaklıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca at. Üst natantı aspire edin.
  11. Hücreleri her örnek için steril ultrasaf suda 1 mL kırmızı kan hücresi lizisi tamponunda yeniden askıya alın ve 4 °C'de 10 dakika kuluçka yapın.
  12. Liz reaksiyonunu 10 mL 1× HBSS/%1 BSA/%5 FBS ile söndürün.
  13. Filtreleri ve spin hücrelerini 300 × g'de 10 dakika boyunca 4 °C'de atın. Üst natantı aspire edin.
  14. Hücre sayılarını hemositometre kullanarak belirleyin. Hücre veriminin tipik aralığı sıralamadan önce 3,2–4,0 × 106'dır .
  15. Hücreleri %5 FBS'de 1× HBSS'de istenen konsantrasyonda aşağı akış antikor boyaması için yeniden askıya alın.

3. Mikroglia popülasyonlarının FACS olarak sınıflandırılması için hücre antikor boyama

  1. Hücreleri 1 mL boyama tamponunda (%5 FBS, 1× HBSS) ve Fc reseptör bloke edici antikor içeren (saflaştırılmış CD16/32, 1:2000) yeniden askıya alın ve hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca kuluçka altına alın.
  2. Hücreleri 240 × g'de 3 dakika boyunca 4 °C'de döndürün. Üst natantı aspire edin.
  3. Floresan konjuge antikorlarla hücreleri kuluçka yapın (CD45 APC, 1:160; CD11b Alex Fluor 700, 1:160) 1 mL boyama tamponunda karanlıkta buzda 30 dakika boyunca kullanıldı.
  4. Hücreleri 240 × g'de 3 dakika boyunca 4 °C'de çevirin. Üst natantı aspire edin.
  5. Ölü hücreleri dışlamak için bir canlılık boyası (örneğin, 1× HBSS'de 3 μM DAPI) ekleyin.
  6. DAPI, GFP, tdTomato, CD45-APC ve CD11b-Alexa Fluor 700 tespiti için uygun lazerlerle donatılmış yüksek hızlı hücre ayırıcı kullanarak FACS sıralaması gerçekleştirin.
  7. Hücre canlılığını en üst düzeye çıkarmak için mümkün olduğunca düşük kılıf basınçlı 100 μm nozul kullanın. Örnek toplama tüplerini ve sıralanmış hücreleri işlem boyunca buz üzerinde tutun.
  8. Voltajları, dengelemeleri ve kapıları ayarlamak için lekesiz hücreler, tek renk telafi kontrolleri ve floresans-eksi bir kontrolleri kullanın.
  9. İlk kapı hücreleri, yan saçılma alanına karşı yan saçılma alanına göre kapı hücreleri, yani döküntüleri dışlamak için.
  10. Kapı teklileri yan saçılma yüksekliği ile yan saçılma genişliği arasında.
  11. DAPI⁻ hücrelerinde kapı ile ölü hücreleri dışlayın.
  12. Canlı singlet'lardan, CD45düşük CD11b⁺ mikroglia.
  13. CD45düşük CD11b⁺ mikroglia kapısı içinde, donör mikroglia popülasyonlarını ayırmak için GFP ve tdDomates floresansı kullanın (Hoxb8 mikrogliası: DAPI⁻ CD45düşük CD11b⁺ tdTomato⁺ GFP⁺, Hoxb8 olmayan mikroglia: DAPI⁻ CD45düşük CD11b⁺ tdTomato⁻ GFP⁺).
  14. Her popülasyonu soğuk 1x HBSS içeren steril toplama tüplerine ayırın.
  15. Sıralamadan sonra, nakil öncesinde saflık ve canlılık doğrulamak için küçük bir alikotu yeniden analiz edin.
  16. Steril 1× HBSS'de sıralanmış hücreleri toplayıp nakil yapılana kadar karanlıkta buzda tutun.
    NOT: Hoxb8 mikrogliasının tipik verimleri 3,70–4,60 x 104 hücre arasında, Hoxb8 dışı mikroglia ise 1,10–1,14 x 105 hücre arasında değişir (P0–P4), ancak verimler yaşa, genotipe ve doku işleme verimliliğine bağlı olarak değişebilir. Canlı hücreleri mümkün olan en kısa sürede, ideal olarak hücre ayırmasından sonra 60 dakika içinde nakil edin.

4. Fetal karaciğer hematopoietik öncülerinin hasat edilmesi ve işlenmesi

  1. Hamile dam hayvanları, solunum kesilene ve reflekslerin olmadığı doğrulanana kadar oksijen içinde %5 isofluran ile hassas bir buharlaştırıcı ile ötenazi.
  2. İzofloran aşırı dozunun ardından, kurumsal hayvan bakım ve kullanım kılavuzlarına uygun olarak ölümü sağlamak için servikal çıkıntı ile ikincil bir fiziksel yöntem uygulanın.
  3. Hamile farelerin rahim boynuzlarını çıkarıp plastik Petri kaplarında (60 mm × 15 mm) soğuk 3 mL 1× HBSS'ye yerleştirin.
  4. E12.5 embriyolarını rahmden ayırın ve plastik Petri kaplarına taze, soğuk 3 mL 1× HBSS koyun.
  5. Fetal karaciğerleri ince forsepsle disek edin ve onları Petri kablarında %5 FBS içeren taze 3 mL soğuk 1× HBSS içine yerleştirin.
  6. 26 G iğne ve 3 mL şırınga kullanarak birikmiş fetal karaciğer dokusunu mekanik olarak ayırın.
  7. Hücreleri 240 × g'de 5 dakika boyunca 4 °C'de döndürün. Üst natantı aspire edin.
  8. Hücreleri 1× HBSS ile yıkayın.
  9. Hücre askısını 80 μm hücre süzülcüsünden geçirin.
  10. Hücreleri 20 μL kırmızı kan hücresi lizin tamponunda (0,15 M amonyum klorür, 1 mM KHCO3) 5 dakika kuluçka edin, ardından söndürme için 13 mL 1× HBSS eklenin.
  11. Kırmızı kan hücrelerini lizize etmek için 5 dakika kuluçkaya devam edin.
  12. Hücreleri 200 × g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca döndürün.

5. Hematopoietik öncül hücrelerin FACS sıralaması için hücre antikor boyama

  1. Fetal karaciğer hücrelerini floresan konjuge antikorlarla kuluçka yapın (Ter119 PerCP-Cy5.5, 1:50; Kit PE-Cy7, 1:100) ile %5 FBS/%1 BSA ile 1× HBSS, karanlıkta buzda 30 dakika boyunca oynadım.
  2. Hücreleri 1× HBSS ile yıkayın ve 240 × g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca spin yapın.
  3. Ölü hücreleri dışlamak için bir canlılık boyası (örneğin, 1× HBSS'de 3 μM DAPI) ekleyin.
  4. DAPI, Ter119 PerCP-Cy5.5, Kit PE-Cy7, tdTomato ve GFP tespiti için uygun lazerler ve filtrelerle donatılmış yüksek hızlı hücre ayırıcı kullanarak FACS sıralaması gerçekleştirin.
  5. Hücre canlılığını en üst düzeye çıkarmak için mümkün olduğunca düşük kılıf basınçlı 100 μm nozul kullanın. Örnek toplama tüplerini ve sıralanmış hücreleri işlem boyunca buz üzerinde tutun.
  6. Voltajları, dengelemeleri ve kapıları ayarlamak için lekesiz hücreler, tek renk telafi kontrolleri ve floresans-eksi bir kontrolleri kullanın.
  7. İlk olarak kapı hücreleri, enkaz dışlamak için ön saçılım alanı ile yan saçılma alanı kullanır.
  8. Kapı teklileri öne saçılma yüksekliği ile ileri saçılım genişliği arasında, ardından yan saçılma yüksekliği ile yan saçılım genişliği kullanılır.
  9. DAPI⁻ hücrelerinde kapı ile ölü hücreleri dışlayın.
  10. Canlı teklelerden, Ter119⁻ hücrelerinde kapı ile eritroid soy hücrelerini dışlayın.
  11. Ter119⁻ popülasyonu içinde, Kityüksek hematopoietik adil hücreler kapalıdır.
  12. DAPI⁻ Ter119⁻ Kityüksek popülasyonu içinde, Hoxb8 soy-pozitif adıları tdTomato⁺ hücrelerinde kapı ile izole edilir.
  13. Eğer donör hattı aynı zamanda Cx3cr1-GFP raporlayıcısını taşıyorsa, bu aşamada sıralanmış fetal karaciğer öncül popülasyonunun GFP⁻ veya GFPdüşük olduğunu doğrulamak için GFP floresansı kullanın; böylece aprogenitör hücreler farklılaşmış Cx3cr1-ekspresyon edilen miyeloid hücrelerden ayrılır.
  14. Son DAPI⁻ Ter119⁻ Kityüksek tdTomato⁺ GFP popülasyonunu soğuk 1× HBSS içeren steril toplama tüplerine ayırın.
  15. Sıralamadan sonra, nakil öncesinde saflık ve canlılık doğrulamak için küçük bir alikotu yeniden analiz edin.
  16. Steril 1× HBSS'de sıralanmış hücreleri toplayıp nakil yapılana kadar karanlıkta buzda tutun.
    NOT: Tipik verimler yaklaşık 5.0–7.0 arasında değişir × embriyo büyüklüğü ve ayırma etkinliğine bağlı olarak E12.5 fetal karaciğer hazırlığı başına 104 Hoxb8 hematopoietik öncülüdür. Canlı hücreleri mümkün olan en kısa sürede, ideal olarak ayıklamadan 60 dakika içinde nakil edin.

6. Enjeksiyon iğnelerinin hazırlanması

  1. Borosilikat cam kapilyarları (1,0 mm dış çap, 0,58 mm iç çap, filamentle) mikropipet çekiciye yükleyin.
  2. Yenidoğan intraserebral nakil için uygun uzun konik iğneler üretmek üzere optimize edilmiş iki hatlı çekme programı kullanarak çekme kapillarları.
    1. Tipik ayarlar şunlardır: Isı = 645, Çekme = 30, Hız = 120, Gecikme = KAPALı ve Basınç = 200. Son ayarları belirli cam türü, çevresel koşullar ve çekici kalibrasyonu için optimize edin. Daha sonra, ortaya çıkan iğneleri kesin ve eğimleyerek nihai dış uç çapı yaklaşık 30 μm elde edilir.
  3. Çekilen iğneleri, uçları zarar görmezden korumak için büyük plastik bir Petri kabının içine iki macun şeridine yerleştirin, sonra kesip eğimle.
  4. Çekilen iğneyi yaklaşık 10×–20× büyütme derecesinde disseksiya stereo mikroskobunun altına yerleştirin ve yumuşak bir destek ile destekleyin.
    NOT: Uç denetimi sırasında doğru konik oluşumunu doğrulamak ve kesme ile eğimlenmeden önce herhangi bir kusuru tespit etmek için daha yüksek büyütme (20×–40×) kullanılabilir.
  5. İğne ucunu steril bir tıraş bıçağı kullanarak yaklaşık 30 μm dış çapı elde edin.
  6. Kesilen iğneyi mikro öğütücü tutucuya sabitleyin.
  7. Eğim açısını 30°–35° olarak ayarlayın.
  8. Öğütücüyü ve aydınlatmayı açın.
  9. Damıtılmış suyun öğütme taşına yaklaşık her 4–5 saniyede bir damlalama sabit bir hızda damlamasına izin verin.
  10. İğne ucunu dönen öğütme taşına nazikçe temas haline getirerek kenar eğimli bir kenar oluşana kadar yapın.
  11. Eğimli ucların dış çapını mevcut olduğunda bir uç ölçüm cihazı ile ölçün.
  12. Nakil için dış çapı yaklaşık 30 μm olan iğneleri seçin.
  13. İğneyi steril tampon ile doldurun ve ucu açık ve engellemesiz olduğundan emin olmak için sıvıyı nazikçe dışarı atın.

7. Enjeksiyon cihazının hazırlanması

  1. Esnek boru, ağızlık parçası, hat içi filtre ve kapiller tutucudan oluşan manuel ağız kontrollü bir pipet monte edin.
    NOT: Ağızdan kontrol edilen pipetleme cihazına kontaminasyonu önlemek için bir hat içi filtre entegre edilmiştir.
  2. İğneyi her 2 mm'de bir işaretleyin (her iğne için en fazla 2 işaret). Her 2 mm ~2 μL'ye karşılık gelir.
  3. Hazırlanan cam enjeksiyon iğnesini ~1,5 cm derinden kapiller tutucuya yerleştirin ve montajın güvenli ve hava geçirmez olduğundan emin olun.
  4. Ağızlıktan nazik bir emici uygulayarak hava akışının engellenmediğini ve doğru direnci kontrol edin.
  5. Sistemin donör hücreleri yüklemeden önce aspirasyon ve enjeksiyonun sorunsuz kontrolünü sağladığını doğrulayın.
  6. Cam enjeksiyon iğnesini hazırlanmış donör hücre süspansiyonu (toplam 4,5 μl) ile ince bir pipet ucu kullanarak doldurun.
    NOT: Nakile başlamadan önce iğnede hava kabarcıklarının kalmadığından emin olun. Her fare için bir iğne kullanın.

8. Yenidoğan alıcıların anestezi edilmesi ve cerrahi alanın hazırlanması

  1. Yenidoğan faresi, ameliyat masasında sırtüstü pozisyona yerleştirin ve hassas bir buharlaştırıcı aracılığıyla oksijenle %2,0–%5,0 isofluran ile anestezi başlatın.
  2. Fare burnunu bir burun konisinin içine yerleştirerek işlem boyunca izofluran ve oksijenin sürekli olarak sağlanmasını sağlayın.
  3. Anestezi indüksiyonu için yaklaşık 1 dakika bekleyin ve solunum izlenin.
  4. Uzuvlara nazikçe dokunun ve yeterli anestezi alındığından emin olmak için yoksunluk refleksinin olmadığını doğrulayın.
  5. Uygun bir anestezik düzlemi sağlandıktan sonra, izofluran konsantrasyonunu bakım için %0,5–%2,0'a indirin ve nakil işlemi sırasında anestezi 10 dakikaya kadar devam ettirin.
  6. Ameliyat masasının altına yerleştirilen bir ısı pediyle yeni doğan fareyi yaklaşık 38 °C'de tutun.
  7. Enjeksiyon bölgesini steril pamuklu çubuklarla betadin ve %70 etanol uygulamalarıyla dönüşümlü olarak temizleyin.
  8. Son bir betadin tabakası uygulayın ve enjeksiyondan önce cildin kurumasına izin verin.
    DIKKAT: İzofluran tehlikeli bir anestezi maddesidir. Uygun anestezik temizleyici sistemleri kullanın ve kurumsal güvenlik yönergelerine uygun olarak yeterli oda havalandırmasını sağlasın.

9. Yenidoğan beyin içi nakil yapmak

  1. Enjeksiyon sırasında hareketi en aza indirmek için başı eldivenli parmaklar veya yumuşak bir destek kullanarak nazikçe stabilize edin.
    NOT: Alıcı fareler P1 ile P4 arasında nakledilir.
  2. Ön dorsal telensefalonda (gelecekteki frontal korteks bölgesi) iki taraflı enjeksiyon noktalarını tespit edin; bu bölge sagittal orta hattın yaklaşık 1–2 mm lateral ve hemen koku soğanlarına kuyruksal konumda yer alır. Enjeksiyon bölgelerini her yarımkürede simetrik olarak konumlandırın, görünür yüzey damarlarından kaçının.
    NOT: Yenidoğan farelerin ince kafatası ve küçük boyutu nedeniyle, enjeksiyonlar stereotaksik koordinatlar yerine görsel anatomik işaretler kullanılarak yapılır.
  3. Kafatasını görsel olarak inceleyin ve iğneyi görünür kan damarlarına sokmaktan kaçının.
  4. Eğimli cam mikropipetini deri ve gelişen kafatası boyunca nazikçe ilerletin.
  5. İğneyi kafatası yüzeyinin yaklaşık 1–2 mm altına frontal yarımküreye yönlendirin.
  6. Donör hücreleri, ağızdan kontrol edilen pipet cihazı aracılığıyla kontrollü manuel basınçla teslim edin.
    NOT: Saflaştırılmış hematopoietik progenitorlar veya yenidoğan mikroglia nakledilirken, her yarımküre 2–3 μL enjekte edilir; bu enjeksiyon başına yaklaşık 2,5 ×10-4 hücreye karşılık gelir. Bu, fare beyni başına yaklaşık 5 ×10-4 hücre sağlar.
  7. Mikropipeti yavaşça beyinden çekerek enjekte edilen hücrelerin reflüsünü en aza indirin ve doku hasarını azaltın.
  8. Kontralateral enjeksiyon yapın.
    NOT: Fareler arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için fare başına bir iğne kullanın.

10. Nakledilmiş yeni doğulanların iyileşmesi

  1. İşlemden hemen sonra her yavruyu bir ısıtma pedine yerleştirin.
  2. Yavru köpekleri normal vücut rengi, kendiliğinden hareket ve genel aktivite geri dönene kadar izleyin.
    NOT: İyileşme süresi 5 dakika ile 10 dakika arasında değişiyor.
  3. Yavruları baraja geri gönderin.
  4. Her yavruyu ev kafesi yatak ve yuva malzemesiyle iyice ovalayın.
  5. Yavruları barajın yanına kafese geri yerleştir.
  6. Barajın geri getirilen yavruları alıp kabul ettiğini doğrulayın.

11. Ameliyat sonrası sağlığın izlenmesi

  1. Yavruları nakildən sonraki ilk 3 gün boyunca her gün 10 dakika boyunca gözlemleyin.
  2. Yavru köpekleri normal aktivite, emzirme davranışı ve anne ile etkileşim açısından değerlendirin.
    NOT: Bu süre zarfında fare kafeslerini rahatsız etmeyin. Bu durum baraj üzerindeki stresi artırabilir.
  3. Yavru köpekleri ilk 3 günlük dönemden sonra sütten kesilene kadar her iki günde bir takip etmeye devam edin.
  4. Yavru köpeklerin normal gelişimi, beslenme davranışı, aktivite seviyesi ve anne bakımı açısından değerlendirin.
  5. Ameliyat sonrası erken dönemde vücut ağırlığınızı her gün ölçün ve kaydedin.
  6. Yavru köpeklerde sıkıntı belirtileri, anormal duruş, halsizlik veya beslenme bozukluğu belirtileri değerlendirin.
  7. Kurumsal hayvan bakım kılavuzlarına uygun olarak gerektiğinde insancıl ötenazi gerçekleştirin.
    1. Yenidoğan farelerde, anestezikle doğrudan teması önlemek için bir çan kavanozu veya benzeri sahte zeminle donatılmış kapalı bir oda kullanılarak izofluran aşırı dozuyla ötenazi. Nefes kesildiğinde ve reflekslerin olmaması doğrulandığında, hemen kafayı kesin.
    2. Yetişkin farelerde, solunum kesilene ve reflekslerin olmadığı doğrulanana kadar oksijenle verilen %5 isofluran ile hassas buharlaştırıcı ile ötenazi, ardından ölümü sağlamak için ikincil fiziksel yöntem olarak servikal dislokasyon uygulanır.
      NOT: Ameliyat sonrası ölüm oranı veya deneysel son noktada tespit edilebilir donör hücre nakleti eksikliği gösteren hayvanlar analizden hariç tutuldu. Ameliyat sonrası analjezi uygulanmadı çünkü yenidoğan intraserebral nakli minimal invaziv olarak kabul edildi.

12. Kriyobölümleme ve immünofluoresans boyama için beyin dokularının toplanması

  1. Beyni dikkatlice çıkarın ve donmuş bölüm analizine hazırlayın.
  2. Kriyoseksiyon için doğum sonrası beyin dokusunu işleyerek daha önce açıklanan prosedürlere göre kriyostat kullanarak koronal kesitleri kesin.
    NOT: Her fare için, somatosensorik korteksi kapsayan 9–12 koronal kesit analiz edilir.
  3. Bölümleri mikroskop slaytlarına monte edin ve -20 °C sıcaklıkta boyalana kadar saklayın.
  4. %0,2 Triton X-100 ve %1 sodyum deoksikolat içeren permeabilizasyon tamponunda kısa süreliğine kesitleri inkübe edin.
  5. Birincil antikorlar hazırlayın (tavuk anti-GFP, 1:500; Gine domuzu anti-tdDomates antikoru, 1:250; tavşan anti-Iba1; 1:500) uygun antikor seyreltme tamponunda seyreltilmiştir.
  6. Birincil antikorlarla 4 °C'de gece boyunca doku kesitlerini inkübe edin.
  7. Bölümleri fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla yıkayarak bağlanmamış birincil antikorları çıkarın.
  8. Florofor-konjuge ikincil antikorlarla (keçi anti-tavşan Alexa Fluor 647, 1:500; keçi anti-kobayı Alexa Fluor 555, 1:500; keçi anti-tavuk Alexa Fluor 488, 1:500) ile inkübe kesitleri oda sıcaklığında, karanlıkta 2 saat boyunca kullanın.
  9. Hücre çekirdeklerini görselleştirmek için DAPI ile kesitler karşı boyama yapın.
  10. Bölümleri bir antifade montaj ortamı kullanarak monte edin ve cam kaplama klayın.

13. Konfokal mikroskopik görüntülerin alınması

  1. 10× veya 20× hedefli konfokal mikroskopla floresan görüntüleri alın.
  2. 200–400 Hz tarama hızlarıyla 512 × 1024 × 1024 piksel çözünürlükte görüntüler elde edin.
  3. Doku boyunca 2–5 μm z-adım aralıklarıyla optik kesitler toplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Temizlenmiş mikroglia popülasyonlarının neonatal intraserebral nakli, alıcı beyin parenkiminde donör kaynaklı hücrelerin uzun süreli hayatta kalma ve yaygın şekilde aşılanmasına yol açar. Saflaştırılmış donör mikroglia popülasyonları, nakil öncesinde floresan soy raporlayıcıları (Hoxb8 mikroglia: tdTomato⁺ GFP⁺; Hoxb8 dışı mikroglia: tdTomato⁻ GFP⁺) kullanılarak floresans-aktive hücre sıralamasıyla izole edildi (Şekil 1A). Neonatal intraser...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Temizlenmiş mikrogliyal öncüllerin veya tanımlanmış mikrogliyal alt popülasyonların neonatal intraserebral nakli, mikroglial bölmenin in vivo yeniden inşası ve beyin makrofajlarının soy-sığıra özgü özelliklerinin incelenmesi için sağlam bir yaklaşım sunar. Bu yöntem, genetik olarak tanımlanmış donör hücreler kullanılarak seçici yeniden yapılandırılmayı sağlar ve beyin ortamında donör hücre nakleti ve olgunlaşmanın doğrudan değerlendirilmesini sağlar.

...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarlar belirtmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 MH093595) (M.R.C.), Dauten Ailesi Vakfı ve Utah Üniversitesi Akış Sitometri Tesisi tarafından desteklenmiştir. Csf1rΔFIRE fareleri Utah Üniversitesi'nden Dr. Ben Xu tarafından üretilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Bell jarÇeşitliN/AÖtenazi için kullanılır
Filamentli borosilikat cam kılcal damarlarSutter InstrumentBF100-78-15Enjeksiyon iğneleri için kullanılır
Bovin serum albümini (BSA)Sigma AldrichA8806PB tamponun hazırlanmasında kullanılır. Çeşitli markalar mevcuttur. Burada listelenen sadece bir örnektir.
CD11b Alexa Fluor 700BioLegend101222Miyeloid hücreler
CD45 APCBioLegend103112Hematopoietik hücreler
Hücre süzgeçleri (70 &mikron)Falcon352350Tek hücreli süspansiyonların oluşturulmasında kullanılır. Çeşitli markalar mevcuttur. Burada listelenen sadece bir örnektir.
Tavuk anti-GFP antikoruAves LabsGFP-1020İmmünofloresan boyama
c-Kit PE-Cy7 antikoruBioLegend105814Hematopoietik progenitörler
Konfokal mikroskopLeicaTCS SP5Floresan görüntülemede kullanılır
Konik tüpler (15 mL/ 50 mL)Eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/Lab-Consumables/Lab-Tubes/Eppendorf-Tubes-BioBased-p-PF-4440301Dokunun/hücrenin işlenmesi. Çeşitli markalar mevcuttur. Burada listelenen sadece bir örnektir.
Cryostat makinesiLeicahttps://www.leicabiosystems.com/en-de/histology-equipment/cryostats/Dondurulmuş doku kesimlerinin oluşturulmasında kullanılır. Çeşitli markalar mevcuttur. Burada listelenen sadece bir örnektir.
DAPI nükleer boyasıThermo Fisher ScientificD1306Canlılık ve nükleer boyama için kullanılır
Diseksiyon mikroskobuLeicahttps://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/Enjeksiyon iğnelerinin kesimi ve hazırlanmasında kullanılır. Çeşitli markalar mevcuttur. Burada listelenen sadece bir örnektir.
FACSAria Akış Sitometri SırtlayıcısıBD BioscienceFACSAria Hücre saflaştırması
Fc blok (saf CD16/32)Biolegend101302Fc reseptörlerini eksprese eden fare hücrelerine antikorun istenmeyen bağlanmasını engeller
Fetal boğa serumu (FBS)ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/fbs.htmlHücre preparasyon tamponlarında kullanılır. Çeşitli markalar mevcuttur. Burada listelenen sadece bir örnektir.
Ağız pipeti için esnek boruÇeşitliN/AManuel enjeksiyon aparatının bir bileşeni
Akış sitometri analiz yazılımıFlowJov10.8.1FACS veri analizi için kullanılır
Akış sitometri hücre sırtlayıcıBD BiosciencesFACSAriaHücre saflaştırması için kullanılır
Isıtıcılı gentleMACS Octo DissociatorMiltenyi Biotec130-096-427Beyin dokusu disosiasyonu için kullanılır
Tavuk anti-Alexa Fluor 488
ikincil antikoru		Thermo Fisher ScientificA-11039İkincil antikor
Gine domuzu anti-Alexa Fluor
555 ikincil antikoru		Thermo Fisher ScientificA-21428İkincil antikor
Tavşan anti-Alexa Fluor 647
ikincil antikoru		Thermo Fisher ScientificA-21245İkincil antikor
Sıçan anti-Alexa Fluor 647
ikincil antikoru		Thermo Fisher ScientificA-48265İkincil antikor
Gine domuzu anti-tdTomato antikoruFrontier InstituteAB_2631185İmmünofloresan boyama
Hanks' dengeli tuz solüsyonu
(HBSS)		Gibco14175-079Hücre hazırlanması sırasında kullanılır
HemositometrÇeşitliN/AHücre sayımı
Ağız pipeti için sıralı filtreÇeşitliN/AKontaminasyonu önler
Mikro öğütücüNarishigeEG-400Cam enjeksiyon iğnelerin kenarlarını kesmek için kullanılır
Mikropipet çekiciSutter InstrumentP-1000İnce enjeksiyon iğnelerinin üretilmesinde kullanılır
Ağız pipeti ağzı parçasıÇeşitliN/AEnjeksiyonun manuel kontrolü için kullanılır
Nöral Doku Disosiasyon Kiti (P)Miltenyi Biotec130-092-628Beyin dokusunun enzimatik disosiasyonunda kullanılır
Petri kabıThermo Fisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/search/browse/category/us/en/90111022Çekme iğneleri veya doku hasadının saklanmasında kullanılır. Çeşitli markalar mevcuttur. Burada listelenen sadece bir örnektir.
Tavşan anti-Iba1 antikoruWako019-19741Mikroglia markörü
Tavşan anti-TMEM119 antikoruAbcam209064Mikroglia-spesifik markör
Sıçan anti-CD206 antikoruBioLegend141712Makrofaj popülasyonlarının tanımlanmasında kullanılır
Sıçan anti-P2RY12 antikoruBioLegend848002Mikroglia markörü
Jester bıçakları/neşterlerÇeşitliN/Aİğne uç

Kaynaklar

  1. Rao Y, Bai Y, Li X, Du B, Peng B. The evolution of microglia replacement: A new paradigm for CNS disease therapy. Cell Stem Cell. 2025;32(12):1807-1832.
  2. Wu J, et al. Microglia replacement halts the progression of microgliopathy in mice and humans. Science. 2025;389(6756):eadr1015.
  3. Capotondo A, et al. Intracerebroventricular delivery of hematopoietic progenitors results in rapid and robust engraftment of microglia-like cells. Sci Adv. 2017;3(12):e1701211.
  4. Shibuya Y, et al. Treatment of a genetic brain disease by CNS-wide microglia replacement. Sci Transl Med. 2022;14(636):eabl9945.
  5. Mishra P, et al. Rescue of Alzheimer’s disease phenotype in a mouse model by transplantation of wild-type hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Rep. 2023;42(8):112956.
  6. Colella P, et al. CNS-wide repopulation by hematopoietic-derived microglia-like cells corrects progranulin deficiency in mice. Nat Commun. 2024;15(1):5654.
  7. Nemec KM, et al. Microglia replacement by ER-Hoxb8 conditionally immortalized macrophages provides insight into Aicardi-Goutières syndrome neuropathology. eLife. 2026;14:RP102900.
  8. Van Deren DA, et al. Defective Hoxb8 microglia are causative for both chronic anxiety and pathological overgrooming in mice. Mol Psychiatry. 2026;31(2):915-928.
  9. Sailor KA, et al. Hematopoietic stem cell transplantation chemotherapy causes microglia senescence and peripheral macrophage engraftment in the brain. Nat Med. 2022;28(3):517-527.
  10. Priller J, et al. Targeting gene-modified hematopoietic cells to the central nervous system: Use of green fluorescent protein uncovers microglial engraftment. Nat Med. 2001;7(12):1356-1361.
  11. Elmore MRP, et al. Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain. Neuron. 2014;82(2):380-397.
  12. Wilkinson FL, et al. Busulfan conditioning enhances engraftment of hematopoietic donor-derived cells in the brain compared with irradiation. Mol Ther. 2013;21(4):868-876.
  13. Mildner A, et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat Neurosci. 2007;10(12):1544-1553.
  14. Monje ML, Mizumatsu S, Fike JR, Palmer TD. Irradiation induces neural precursor-cell dysfunction. Nat Med. 2002;8(9):955-962.
  15. Lombroso SI, et al. Microglia replacement by peripheral delivery of CSF1R inhibitor-resistant hematopoietic cells. Mol Ther. 2026;34(2):850-866.
  16. Bennett FC, et al. A combination of ontogeny and CNS environment establishes microglial identity. Neuron. 2018;98(6):1170-1183.e8.
  17. De S, et al. Two distinct ontogenies confer heterogeneity to mouse brain microglia. Development. 2018;145(13):dev152306.
  18. Van Deren DA, et al. Defining the Hoxb8 cell lineage during murine definitive hematopoiesis. Development. 2022;149(8):dev200200.
  19. Nagarajan N, Capecchi MR. Optogenetic stimulation of mouse Hoxb8 microglia in specific regions of the brain induces anxiety, grooming, or both. Mol Psychiatry. 2024;29(6):1726-1740.
  20. Tränkner D, et al. A microglia sublineage protects from sex-linked anxiety symptoms and obsessive compulsion. Cell Rep. 2019;29(4):791-799.e3.
  21. Chen SK, et al. Hematopoietic origin of pathological grooming in Hoxb8 mutant mice. Cell. 2010;141(5):775-785.
  22. Foran DR, Peterson AC. Myelin acquisition in the central nervous system of the mouse revealed by an MBP-Lac Z transgene. J Neurosci. 1992;12(12):4890-4897.
  23. Dangata YY, Kaufman MH. Myelinogenesis in the optic nerve of (C57BL CBA) F1 hybrid mice: A morphometric analysis. Eur J Morphol. 1997;35(1):3-18.
  24. Rojo R, et al. Deletion of a Csf1r enhancer selectively impacts CSF1R expression and development of tissue macrophage populations. Nat Commun. 2019;10(1):3215.
  25. Askew K, et al. Coupled proliferation and apoptosis maintain the rapid turnover of microglia in the adult brain. Cell Rep. 2017;18(2):391-405.
  26. Lund H, et al. Competitive repopulation of an empty microglial niche yields functionally distinct subsets of microglia-like cells. Nat Commun. 2018;9(1):4845.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

SinirbilimSay 233Say 233Bo De erSayHoxb8 mikroglialarnon Hoxb8 mikroglialarbeyinobsesif kompulsif bozuklukkronik anksiyete
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.