Yöntem makalesi

Çok Türlü Tardigrat RNA İzolasyon Protokolü

15 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/72120

⸱

1 Eylül 2026

 ,  , 
1Biology Department, The University of North Carolina Asheville, 2Department of Biological Sciences, Florida International University, 3Biology Department, The University of North Carolina at Chapel Hill

Bu makalede

Özet

Bu protokol, düşük miktardaki dokulardan RNA izole etmek için tasarlanmış ve RNA dizileme ile tamamlayıcı DNA sentezi gibi alt uygulamalar için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA sağlamayı amaçlayan kolon tabanlı bir RNA izolasyon kiti kullanarak, çeşitli tardigrat türlerinden RNA izolasyon prosedürlerini detaylandırmaktadır.

Özet

Tardigradlar, çevresel stres faktörlerine karşı olağanüstü toleranslarıyla bilinen mikroskobik hayvanlardır. Bu hayvanlar; kurumaya, aşırı basınca, düşük sıcaklıklara ve yüksek düzeydeki iyonlaştırıcı radyasyona karşı hayatta kalabilirler. Ancak, bu ekstremotoleran yeteneklerin temelinde yatan moleküler mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılamamıştır. RNA dizileme, RNA interferansı (RNAi) ve tardigrad genlerinin bakteriler gibi sistemlerde heterolog ekspresyonunu içeren ve bu mekanizmaları araştırmak için kullanılan moleküler yaklaşımlar, sınırlı biyolojik materyalden yüksek kaliteli haberci RNA (mRNA) izolasyonu gerektirir. Bu çalışmada, tardigradlardan toplam RNA izole etmek için (1) heterotardigrad bir tür dahil olmak üzere birden fazla türde etkili olan, (2) vücut boyutuna bağlı olarak yalnızca 25–200 hayvana ihtiyaç duyan ve (3) sonraki uygulamalar için yeterli miktarda ve kalitede RNA sağlayan tekrarlanabilir bir protokol tanımlıyoruz. Mevcut protokol, makul sayıdaki tardigradlardan verimli RNA geri kazanımını başarıyla sağlamakta ve çeşitli tardigrad türlerinde stres toleransının moleküler araştırmalarını desteklemektedir.

Giriş

Tardigradlar; kuruma, ekstrem basınçlar, ekstrem sıcaklıklar ve kemoterapötik ilaçlar ile iyonize radyasyon gibi DNA'ya zarar veren ajanlar dahil olmak üzere, diğer hayvanların dayanamayacağı ekstrem stres koşullarında hayatta kalma yetenekleriyle bilinirler1,2,3,4,5,6,7,8. Son yıllarda bilim insanları; RNA dizileme, RNA interferans (RNAi) ve tardigrad genlerinin insan hücreleri ile bakteriler dahil diğer sistemlerde heterolog ekspresyonu gibi moleküler yaklaşımlar kullanarak tardigradların ekstrem dayanıklılığının altında yatan mekanizmaları araştırmışlardır8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Uygulandığında bu yaklaşımlar, tardigradların tam olarak nasıl böyle bir ekstrem stres direncine sahip olabildiğine dair bize içgörü sağlayan güçlü bir araç olmuştur8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Bununla birlikte, tardigrad stres toleransını anlamaya yönelik tüm bu moleküler yaklaşımlar, bu küçük hayvanlardan sonraki süreçlerde kullanılmak üzere yeterli kalitede ve bol miktarda RNA izole edebilme yeteneğine dayanmaktadır.

Tardigradlardan RNA izolasyonu için kullanılan önceki bir yöntemin, Hypsibius exemplaris ile çalışan araştırmacılar için başarılı olduğu kanıtlanmıştır23. Ancak, bu protokolü H. exemplaris üzerinde tekrarlamaya çalıştığımızda, elde edilen RNA konsantrasyonu ve kalitesinin güvenilmez olduğunu tespit ettik (yayımlanmamış veriler). Fenol tabanlı alternatif bir RNA izolasyon yönteminin H. exemplaris, Ramazzottius varieornatus ve bir heterotardigrad türü için çalıştığı gösterilmiştir13,21,22,24,25,26. Bu protokolün, hem tekil hayvanlardan hem de hayvan havuzlarından (~50) sonraki süreçler için yeterli kalitede ve miktarda RNA sağladığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu protokol kullanıcının fenol içeren reaktiflerle çalışmasını gerektirir. Fenol, dikkatli kullanım gerektiren tehlikeli bir kimyasaldır ve bu protokolün hatalı uygulanması, RNA saflığını ve sonraki uygulamaları etkileyen fenol kalıntılarına yol açabilir. Tardigradlardan RNA izolasyonu için daha önce yayımlanmış bir diğer protokol, tekil hayvanlardan RNA izole edebilme yeteneğine odaklanmaktadır27. Bu, kantitatif PCR (qPCR) gibi uygulamalar için değerli bir protokol olsa da27, amacın hayvanların belirli bir stresör veya koşula nasıl tepki verdiğine dair daha bütüncül bir bakış açısı elde etmek olduğu RNA sekanslama gibi sonraki uygulamalar için daha az uygundur.

Mevcut RNA izolasyon protokollerindeki bu kısıtlamalar, tardigradlardan RNA izole etmek için alternatif yöntemlerin araştırılmasına yol açmıştır. Bu protokolde kullanılan kolon tabanlı RNA izolasyon kiti, az miktardaki dokulardan RNA izole etmek için pazarlanmaktadır. Bu kit daha önce, aşağı akış RNA dizileme analizleri için böcek dokularından RNA izole etmek amacıyla da kullanılmıştır; bu durum, kitin tardigradlar gibi küçük ve kütikül taşıyan diğer hayvanlardan yapılacak izolasyonlar için uygun olabileceğini göstermektedir28. Bu çalışma, tardigradlarla birlikte bu kolon tabanlı RNA izolasyon kitinin kullanımına yönelik adım adım protokolü, tardigradlarla bu protokol uygulanırken alınması gereken özel önlemlerin açıklamalarıyla birlikte özetlemektedir. Bu makale, protokolün altı tardigrad türündeki (H. exemplaris, Milnesium sp., Paramacrobiotus experimentalis, Paramacrobiotus fairbanksi, Paramacrobiotus gadabouti ve heterotardigrad Viridiscus celatus) başarısını rapor etmektedir. Çalışma, 25 kadar az sayıda hayvandan bile önemli kalitede ve miktarda RNA elde edilebileceğini doğrulamıştır. Elde edilen RNA konsantrasyonu ve kalite verilerine örnekler sunulmuş olup bunlar; RNA dizileme (minimum sapma, eksponansiyel kütüphane amplifikasyonu) ve tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi gibi aşağı akış uygulamaları için uygundur. Bu RNA izolasyon protokolü, H. exemplaris türündeki radyasyon toleransı mekanizmalarını ortaya çıkarmak için halihazırda yararlı olduğunu kanıtlamıştır8. Bu protokolün çeşitli tardigrad türlerindeki başarısı, stres tolerans mekanizmalarının, gelişimsel mekanizmaların ve evrimsel süreçlerin araştırılmasında daha geniş kapsamlı olarak uygulanabileceğini göstermektedir.

Protokol

Omurgasız hayvanlar bu gereklilikten muaf olduğundan, aşağıdaki protokol kurumsal hayvan etiği onayı gerektirmemektedir. Kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Materyaller Tablosunda listelenmiştir.

1. RNA izolasyonu için ekipmanların ve alanın hazırlanması

  1. RNA ekstraksiyonu hazırlığı için bir ısıtıcı blok veya su banyosunu 42 °C'ye ayarlayıp çalıştırın.
  2. Bir mikrosantrifüj tüp rafı, pipetler (2 µL, 20 µL, 200 µL ve 1000 µL) ve uygun boyutlarda filtreli pipet uçları temin edin.
  3. Kalıntı RNase'leri denatüre etmek için tezgah üstünü, tüp rafını, pipetleri ve uç kutularını RNase Away, seyreltilmiş çamaşır suyu çözeltisi (%10) veya %70'lik etanol ile temizleyin.
    NOT: Ekipmanlarda veya RNA izolasyonu yaptığınız alanda bulunan aşırı RNase, izolasyon sonrası degradasyon nedeniyle yetersiz RNA kalitesine yol açabilir. RNase denatüre eden kimyasallara etki etmeleri için yeterli süre tanıyarak ve işleme devam etmeden önce alanın ve ekipmanın tamamen kurumasını sağlayarak bu riski azaltın.
  4. Bu protokolün tüm adımlarında eldiven giyin ve RNA'nın RNase tarafından yıkımını önlemek için protokol boyunca eldivenleri sık sık RNase denatüre eden bir çözelti ile işleme tabi tutun.

2. RNA izolasyonu için hayvanların toplanması

  1. Cam bir kapilerle donatılmış aspiratör tüp düzenek haznesine takılı bir pipet pompası (Şekil 1A), bir Irwin halkası veya mikropipet kullanarak, non-tardigrad materyal miktarını (türe bağlı olarak algler veya nematodlar veya rotiferler gibi diğer besin kaynakları) azaltmak için 25–200 hayvanı (tür boyutuna bağlı olarak) kültür kaplarından temiz kaynak suyu bulunan bir kaba taşıyın.
  2. 1,5 mL'lik RNaz içermeyen bir tüp ve havan edinin.
  3. Cam bir kapilerle donatılmış aspiratör tüp düzenek haznesine takılı bir pipet pompası veya bir Irwin halkası kullanarak, hayvanlarla birlikte mümkün olduğunca az su aktarmaya özellikle dikkat ederek hayvanları 1,5 mL'lik RNaz içermeyen tüpün tabanına taşıyın.
  4. Tardigradları mikrofüj tüpünün tabanına çöktürmek için 4.500 g hızında 3 dk boyunca santrifüjleyin.
  5. Tardigradların çöktüğü tüpü bir diseksiyon mikroskobu altında gözlemlerken, tardigrad peletini rahatsız etmeden mümkün olduğunca fazla suyu dikkatlice uzaklaştırmak için 20 µL'lik bir pipet veya RNA'sını izole ettiğiniz tardigradlardan daha küçük bir açıklığa sahip cam kapilerle donatılmış aspiratör tüp düzenek haznesine takılı bir pipet pompası kullanın. Kalan kabul edilebilir su miktarının temsilini görmek için Şekil 1B'ye bakınız.
    NOT: Suyun uzaklaştırılması ile Ekstraksiyon Tamponu (XB) eklenmesi arasındaki kısa sürede hayvanların kurumaması için burada ince bir su tabakası bıraktığınızdan emin olun. Hayvanların kuruması, izolasyon sonrası düşük RNA kalitesine yol açabilir.
  6. Tardigradları içeren tüpe 100 µL Ekstraksiyon Tamponu (XB) ekleyin.

3. Tardigradların mekanik parçalanması ve RNA ekstraksiyonu

  1. RNase içermeyen havan eli kullanarak, havan elini tüpün tabanına yaklaşık 30 saniye boyunca nazik ama kararlı bir şekilde sürterek tardigradları parçalayın. Tardigradları parçalamak için toplam 20–30 kez ezme işlemi yeterli olacaktır.
  2. Tüpün tabanında mümkün olduğunca fazla sıvının kaldığından emin olmak için dikkatlice havan elini tüpten çıkarın.
  3. Görünen herhangi bir sağlam hayvan kalmadığından emin olmak için mikrosantrifüj tüpünün içeriğini diseksiyon mikroskobu altında kontrol edin.
  4. Karışımı, hafif sarsıntılı (300 rpm) sarsıntılı ısıtıcı blok üzerinde 42 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
    NOT: Ekstraksiyon Tamponu (XB), bu sıcaklıkta degradasyonu önlemek için RNA'yı stabilize eder.

4. RNA izolasyon kolonunun koşullandırılması

  1. Ekstraksiyon inkübasyonunun son 10 dakikasında, RNA toplama ve saflaştırma için kolonu hazırlayın. Bir saflaştırma kolonunu toplama tüpüne yerleştirin ve kolonu uygun şekilde etiketleyin.
  2. Kolona doğrudan 250 µL Kondisyonlama Tamponu (CB) ekleyin.
  3. Oda sıcaklığında 5 dk inkübe edin.
  4. 16,000 × g hızında 1 dk santrifüjleyin ve akış sıvısını atın. Kolon artık bir sonraki adımdaki RNA süpernatantını almaya hazırdır.
  5. 10x DNase I Reaksiyon Tamponu ve Nükleazdan Arındırılmış Suyu, aşağıdaki 6. adıma yetişecek şekilde tamamen çözülmeleri için dondurucudan çıkarın.

5. RNA'nın kolona bağlanması

  1. Ekstraksiyon inkübasyonundan sonra, mekanik olarak parçalanmış tardigradları ve Ekstraksiyon Tamponu (XB) içeren tüpü 3,000 × g hızda 2 dk boyunca santrifüjleyin.
  2. Yeni bir RNaz-free tüp alın ve uygun şekilde etiketleyin.
  3. Filtreli uçlu 200 µL'lik bir pipet kullanarak, çökmüş tardigrad kütiküllerinden süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın. Kütikül peletini rahatsız etmemeye ve sadece süpernatanı almaya özen gösterin.
    NOT: Kütikülün sonraki adımlara aktarılması, kolonun fiziksel olarak tıkanması nedeniyle kolon RNA veriminin düşmesine yol açacaktır. Bu potansiyel hatayı önlemek için, kütikül bulunmadığından emin olmak amacıyla süpernatant içeren pipet ucunu mikroskop altında gözlemleyebilirsiniz. Herhangi bir kütikül görülürse, süpernatanı tüpe geri koyun ve santrifüj adımını tekrarlayın.
  4. Süpernatanı yeni etiketlenmiş, RNaz-free tüpünüze aktarın.
  5. RNA içeren tüpe 100 µL %70 etanol pipetleyin ve pipetle birkaç kez yukarı-aşağı çekerek iyice karıştırın. Bu adımda, etanol eklendiğinde net viskoz filamentler görülmelidir. Bu, süpernatantınızda RNA bulunduğunun iyi bir göstergesidir.
  6. Karışımın tamamını (200 µL), adım 4'te hazırladığınız kolona pipetleyin.
    NOT: Bu ve sonraki adımlarda kolona herhangi bir solüsyon pipetlerken, sıvıyı kolonun ortasına boşaltmaya dikkat edin ve pipet ucunun kolona fiziksel olarak temas etmesini önleyin. Kolonun mekanik olarak delinmesi, RNA kalitesi ve miktarı ile ilgili sonraki aşamalarda sorunlara yol açacaktır.
  7. RNA'yı kolona bağlamak için 100 × g hızda 2 dk santrifüjleyin, ardından akış sıvısını uzaklaştırmak için 16,000 × g hızda 30 sn boyunca santrifüjleyin.

6. DNase I çözeltisinin hazırlanması

  1. Çözeltiyi hazırlamadan önce 10x DNase I Reaksiyon Tamponu ve Nükleazdan Arındırılmış Suyun tamamen çözünmesini bekleyin.
  2. Her bir RNA izolasyonu için, ayrı bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde 32 µL Nükleazdan Arındırılmış Su, 4 µL 10x DNase I Reaksiyon Tamponu ve 4 µL DNase I Enziminden oluşan 40 µL'lik bir çözelti hazırlayın. Çözeltiyi, Adım 7.3'te kolona uygulamaya hazır olana kadar buz üzerinde tutun.

7. RNA'nın yıkanması ve DNase I işlemi

  1. Bağlanmış RNA içeren (adım 5.7'den) saflaştırma kolonunun üzerine doğrudan 100 µL Yıkama Tamponu 1 (W1) pipetleyin.
  2. 8,000 × g hızında 1 dk santrifüjleyin ve süzüntüyü uzaklaştırın.
  3. DNA kontaminasyonunu gidermek için Adım 6'daki DNase I çözeltisinden 40 µL'yi doğrudan saflaştırma kolonuna pipetleyin ve oda sıcaklığında 15 dk inkübe edin.
  4. Saflaştırma kolonuna 40 µL Yıkama Tamponu 1 (W1) pipetleyin ve 8,000 × g hızında 30 sn santrifüjleyin.
  5. Saflaştırma kolonuna 100 µL Yıkama Tamponu 2 (W2) pipetleyin ve 8,000 × g hızında 1 dk santrifüjleyin.
  6. Saflaştırma kolonuna 100 µL daha Yıkama Tamponu 2 (W2) pipetleyin ve 16,000 × g hızında 2 dk santrifüjleyin. Süzüntüyü atın.
  7. Kolonu kurutmak için 16,000 × g hızında 1 dk santrifüjleyin.

8. RNA Elüsyonu

  1. Her bir RNA izolasyonu için bir adet 0.5 mL tüp (kit içerisinde mevcuttur) temin edin ve uygun şekilde etiketleyin. Bu tüp, izolasyon sonrası RNA'yı içeren tüp olacaktır.
  2. Bağlanmış ve yıkanmış RNA'nın bulunduğu kolonu, etiketlenmiş 0.5 mL tüpe aktarın. Kolon, bu tübe sıkıca oturmalıdır.
  3. Tüpe yandan bakarken, pipet ucunu doğrudan kolon membranının üzerine konumlandırın, kolonun üzerine 11 µL Elüsyon Tamponu (EB) boşaltın ve oda sıcaklığında 1 dk inkübe edin.
    NOT: Elüsyon Tamponunun (EB) doğrudan kolonun üzerine dağıtılmaması, RNA veriminin düşmesine neden olur. Kolon çevresinde sıvı damlacıkları görülmesi, Elüsyon Tamponunun (EB) kolon üzerine uygun şekilde dağıtılmadığını gösterir. Bu durumla karşılaşıldığında, Elüsyon Tamponunun (EB) doğrudan kolonun merkezine boşaltıldığından emin olarak, Adım 8.5'ten gelen akışla bu adımın tekrarlanması önerilir.
  4. Santrifüj sırasında uygun şekilde yerleşmesi için kolonun bulunduğu 0.5 mL tüpü, kit ile birlikte verilen toplama tüpünün içine yerleştirin (Şekil 2).
  5. Elüsyon Tamponunun (EB) dağılması için kolonu 1.000 × g hızda 1 dk santrifüjleyin ve ardından RNA'yı elüe etmek için 16.000 × g hızda 1 dk döndürün.
  6. RNA'yı içeren 0.5 mL tüpü derhal buz üzerine yerleştirin.

9. Mikrohacim spektrofotometre ile RNA miktarı ve kalitesinin doğrulanması

NOT: RNA miktarını ve kalitesini değerlendirmek için diğer yöntemler de kullanılabilir. Burada, mikrohacim spektrofotometre ile yapılan bir yöntem kullanılmıştır. Ayrıca bir florometre veya mikroakışkan jel elektroforez aracı da kullanılabilir29.

  1. Diğer sıvılardan temiz olduğundan emin olmak için mikrohacimli spektrofotometrenin tablasını tüy bırakmayan bir mendil ile silin.
  2. Analiz için spektrofotometrede RNA ayarını seçin.
  3. Spektrofotometreyi, Adım 8.3'te kullanılan 1 µL Elüsyon Tamponu (EB) ile sıfırlayın.
  4. Sıfırlama işleminden sonra, tabladaki Elüsyon Tamponunu (EB) tüy bırakmayan bir mendil ile silin.
  5. RNA içeren 0.5 mL tüpü buz üzerinde tutarak, spektrofotometrenin tablasına 1 µL RNA pipetleyin. İzole edilen RNA'nın miktarını belirlemek ve kalitesini değerlendirmek için numunenin absorbansını ölçmek üzere spektrofotometrenin kolunu indirin.
    NOT: Alt uygulamalar için kabul edilebilir kalite ve miktar hakkındaki ayrıntılar için lütfen aşağıdaki “Sonuçlar” bölümüne bakın.

Sonuçlar

Yukarıda belirtildiği üzere, bu protokoldeki kritik bir adım, RNA ekstraksiyonu için Ekstraksiyon Tamponu (XB) eklemeden önce toplanan tardigradlardan uygun miktarda suyun uzaklaştırılmasıdır. Çok fazla su bırakılması, Ekstraksiyon Tamponu'nun (XB) seyrelmesine ve hayvanlardan standart altı (yani RIN < 7, 260/280 oranı < 1,8, 260/230 oranı < 1,8 ve/veya konsantrasyon < 5 ng/µL) RNA ekstraksiyonuna yol açarak elüsyon sonrası RNA konsantrasyonunun ve kalitesinin düşmesine neden olur. Çok fazla suyun uzaklaştırılması ise hayvanları hızla kurutarak potansiyel olarak ölüme ve ölüm sonrası artan RNaz aktivitesi nedeniyle RNA kalitesinin düşmesine yol açar. Bu protokolün başarıyla tamamlanmasına yardımcı olmak amacıyla, Ekstraksiyon Tamponu (XB) eklemeden önce tüpteki tardigradlarla birlikte bırakılması gereken uygun su miktarını gösteren görsel bir temsil sunulmuştur (Şekil 1B).

Bugüne kadar bu protokol, bir heterotardigrad dahil olmak üzere altı farklı tardigrad türünde denenmiştir (V. celatus). Bu izolasyonlar sonucunda RNA konsantrasyonları 11 ng/µL 106,6 ng/yeµL (bir mikrohacim spektrofotometre ile doğrulanmıştır, Tablo 1) ve 9 ng/µL 113 ng/yeµL (mikroakışkan jel elektroforezi ile doğrulanmıştır, Tablo 2). RNA izolasyonu için gereken hayvan sayısı, izolasyon yaptığınız türün boyutuna bağlı olarak değişir. Şunun gibi daha büyük tardigradlar, Paramacrobiotus türler ve Milnesium sp., 25 kadar az sayıda hayvandan yeterli RNA konsantrasyonları elde edin (Tablo 1). Daha küçük türler için, örneğin H. exemplaris ve V. celatus, 100 veya daha fazla hayvandan yapılan izolasyonlar daha başarılıdır (Tablo 1). İzolasyonların çoğunluğu 2 civarında bir 260/280 oranına sahiptir, bu da RNA'nın temiz olduğunu göstermektedir30Bazı türlerden yapılan izolasyonlar (V. celatus ve H. exemplarisve Paramacrobiotus türler) bazen düşük bir 260/230 oranına yol açar; bu durum, reaktiflerden kaynaklanan kontaminasyona işaret eder30Bu durum sıklıkla daha az hayvan (100 adet) kullanıldığında meydana gelmiştir. V. celatus ve H. exemplarisve 25 tanesi şunun için Paramacrobiotus türleri), bunun son elüye edilen RNA'da reaktif kontaminasyonu riskini artırabileceğini düşündürmektedir. RNA kalitesinin değerlendirilmesi yoluyla aracılığıyla mikroakışkan jel elektroforezi ile bir RNA bütünlük numarası (RIN) hesaplanabilir. 9–10 arası bir RIN değeri, düşük düzeyde degredasyona sahip yüksek kaliteli RNA'ya işaret eder31 ve RIN değeri 7'nin altındaysa, RNA dizileme gibi alt süreçlerle devam edilmemesi genel olarak önerilir. Bazı örnek mikroakışkan jel elektroforez sonuçları sunulmuştur (Şekil 3) yüksek ve düşük/tespit edilemeyen RIN değerlerine sahip örneklerden. Bu örneklerin bazıları sonraki analizlerin dışında tutulmuştur (Tablo 2, Şekil 3A,D). Bununla birlikte, düşük veya saptanamayan RIN değerine sahip bazı örnekler, RNA dizileme için kütüphane hazırlığı aşamasına geçmek üzere seçilmiş ve yine de kaliteli RNA dizileme sonuçları vermiştir (Tablo 2, Şekil 3B,F, yayınlanmamış veriler, daha fazla bilgi için “Tartışma” bölümüne bakınız).

figure-results-1
Şekil 1: RNA izolasyon düzeneği. Hayvanların hareket ettirilmesi ve suyun uzaklaştırılması için cam bir kapiler ile donatılmış aspiratör tüp tertibatı haznesine takılı bir pipet pompası görüntüsü (A) ve Paramacrobiotus tardigradlarına Ekstraksiyon Tamponu (XB) eklemeden önce kalan kabul edilebilir su miktarının gösterimi (B). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Final elüsyon için elüsyon tüpü düzeneği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: H. exemplaris ve P. gadabouti için temsili mikroakışkan jel elektroforez sonuçları. (A) İyonize radyasyona maruz bırakılmış H. exemplaris RNA jeli. (B) Kontrol koşulları altındaki P. gadabouti ve H. exemplaris RNA jeli. (C–F) Yüksek kaliteli bir H. exemplaris RNA örneğinden (C), kalitesi şüpheli bir H. exemplaris örneğinden (D), iyi kaliteli bir P. gadabouti örneğinden (E) ve belirgin degradasyon gösteren bir H. exemplaris örneğinden (147 bp'de pik) (F) alınan temsili pik profilleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Mikrohacim spektrofotometre ile toplanan çeşitli tardigrad türlerine ait temsili RNA konsantrasyonları ve kalite bilgileri. *Mikrohacim spektrofotometre ile tespit edilen 20 ng/µL altındaki konsantrasyonlar, hatalı absorbans oranlarına yol açabilir. **Düşük 260/230 oranı, Adım 5.7'deki yanlış santrifüj hızından kaynaklanmıştır. Lütfen bu Tabloyu indirmek için buraya tıklayın.

Tablo 2: Mikroakışkan jel elektroforez sistemi ile toplanan iki tardigrat türünden elde edilen temsili RNA konsantrasyonları ve kalite bilgileri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Bu protokolün amacı, tardigradların stres toleransı araştırmalarını kolaylaştıran alt uygulamalar için yeterli miktarda ve kalitede RNA izolasyonunu sağlamaktır. Burada sunulan protokol; Ekstraksiyon Tamponu (XB) eklemeden önce yeterince suyun uzaklaştırılması (Adım 2.5), tardigrad gövdelerinin parçalanması (Adım 3.1–3.3), süpernatantın saflaştırma için kolona aktarılması (Adım 5.3) ve RNA'nın elüe edilmesi (Adım 8.3) dahil olmak üzere kullanıcıların sorun yaşayabileceği alanları ana hatlarıyla belirtmiştir. Bu adımların herhangi birindeki hatalar, elde edilen RNA'nın konsantrasyonunda veya kalitesinde azalmaya neden olabilir. Eğer elde edilen RNA konsantrasyonu (bir mikrohacimli spektrofotometre ile doğrulandığında) 5 ng/µL'den düşükse, kullanıcı RNA izolasyonunu (1) daha fazla başlangıç hayvanıyla (küçük türler için >100 veya büyük türler için >50) yeniden yapmayı veya (2) su uzaklaştırma, tardigrad parçalama ve elüsyon adımlarına özel dikkat göstererek protokolü tekrarlamayı düşünebilir.

Bu makale, RNA dizileme için uygun veya uygunsuz kabul edilen RNA kalite değerlendirmelerine (RIN, 260/280 oranı, 260/230 oranı) dair örnekler sunmaktadır (Tablo 1, Tablo 2, Şekil 3). Bu protokolü kullanan bazı RNA izolasyonlarında bazen düşük (<1.0) 260/230 oranları gözlemlenmiş olup (Tablo 1), bu durum kalıntı organik bileşiklerin varlığına işaret etmektedir. Bu durum genellikle düşük hayvan sayılarıyla ilişkilendirilmiştir. Eğer hayvan girdisini artırmak bir seçenek değilse veya kullanıcılar sürekli düşük 260/230 oranıyla karşılaşıyorsa, bu kontaminanların uzaklaştırılmasını sağlamak için Yıkama Tamponu 2 (W2) ile ek bir yıkama adımının eklenmesi (Adım 7.6'nın tekrarlanması) ve/veya Adım 7.7'deki kuru-santrifüj süresinin uzatılması önerilir. Ek olarak, düşük 260/230 oranına sahip temsili bir H. exemplaris izolasyonunun (Tablo 1), protokolü ilk kez kullanan bir lisans öğrencisi tarafından gerçekleştirildiği ve öğrencinin geriye dönük olarak Adım 5.7'nin (RNA'yı kolona bağladıktan sonra etanolü uzaklaştırmak için santrifüjleme) yanlış santrifüj hızında (çok yavaş) yapıldığını fark ettiği belirtilmelidir. Bu durum muhtemelen etanolün kolonda kalmasına ve protokol boyunca taşınmasına yol açarak düşük 260/230 oranına neden olmuştur. Bu kullanıcının sonraki izolasyonları, makul bir aralıkta (1.5'ten düşük olmayan) 260/230 değerleri ile sonuçlanmıştır. Bu nedenle, tüm kullanıcılar, özellikle de ilk kez kullananlar, bu potansiyel sorunlardan kaçınmak için protokolü uygularken santrifüj hızlarına çok dikkat etmelidir. H. exemplaris türünde zaman zaman görülen düşük 260/230 oranlarına veya düşük RIN değerlerine rağmen, benzer kalite okumalarına sahip RNA'lar, iyonize radyasyona veya diğer stres faktörlerine maruz kalma sonrası diferansiyel gen ekspresyonunu incelemek amacıyla alt RNA dizileme işlemleri için hala kullanılabilmektedir8 (Tablo 1, Tablo 2 ve yayınlanmamış veriler). Benzer şekilde, bu protokol ile P. gadabouti türünden izole edilen RNA, yüksek RNA konsantrasyonu ve kalitesi ile sonuçlanmış (RIN ile doğrulanmıştır, Tablo 2, Şekil 3) ve anlamlı RNA dizileme verileri sağlamıştır (yayınlanmamış veriler). Anekdot olarak, bu çalışmada düşük konsantrasyonlu (5–9 ng/µL) H. exemplaris RNA'sı, H. exemplaris genlerinin başarılı alt klonlamaları için cDNA üretmek amacıyla başarıyla kullanılmıştır8. H. exemplaris RNA'sının düşük/tespit edilemeyen konsantrasyon ve RIN (mikroakışkan jel elektroforezi ile ölçülen) değerleri vermesi durumunda, RNA dizileme için kütüphane hazırlığına geçmeden önce bu işlem için RNA yeniden izole edilmiştir (Tablo 2, Figure 3A,D). Bu örnek için RNA izolasyonunun tekrarlanma kararı (Şekil 3A,D), tespit edilemeyen RIN değerine sahip diğer H. exemplaris örneklerinde yapıldığı gibi dizilemeye devam etmek yerine (Şekil 3B,F), mikroakışkan jeldeki net bantların eksikliğine dayanarak verilmiştir; bu durum yükleme hatasının, degrade olmuş RNA'nın veya yetersiz RNA konsantrasyonunun göstergesi olabilir. Buna karşılık, H. exemplaris türünden izole edilen RNA nispeten düşük bir konsantrasyona, tespit edilemeyen bir RIN değerine ve küçük boyutlu RNA'nın daha yüksek seviyeleriyle belirtilen bazı RNA degradasyon kanıtlarına sahip olduğunda, kütüphane hazırlığından sonra kullanılabilir RNA dizileme verileri sağlamıştır (yayınlanmamış veriler, Tablo 2, Şekil 3B,F). Bu nedenle, RNA örneklerinin alt uygulamalar için uygun olup olmadığını belirlemek için burada bazı kılavuzlar sunulmuş olsa da, kullanıcı kendi takdirini kullanmalı ve RNA'nın kalitesinin ve miktarının ilerlemek için yeterli olup olmadığını değerlendirirken spesifik alt uygulamasını göz önünde bulundurmalıdır.

Tardigradlardan RNA izole etmek isteyen bilim insanlarının, amaçlarına en uygun protokolün hangisi olduğunu belirlerken göz önünde bulundurmaları gereken birden fazla husus vardır. Daha önce rapor edilen tüm RNA izolasyon yöntemleri (burada rapor edilen yöntem dahil), RNA sekanslama, cDNA sentezi ve qPCR8,12,13,17,21,22,25,27 gibi sonraki uygulamaları desteklemek için yeterli miktarda ve kalitede RNA sağlamıştır. Maliyet, özellikle küçük bütçeli araştırma laboratuvarları veya eğitim laboratuvarları için sıklıkla bir değerlendirme konusudur. Burada rapor edilen protokol, izolasyon reaksiyonu başına daha önce rapor edilen protokollerden daha pahalıdır. Ancak, maliyet artışının daha önce rapor edilen protokollere kıyasla faydalar sağladığını savunmaktayız. Diğer kolon bazlı RNA izolasyon protokolleriyle23 karşılaştırıldığında, burada rapor edilen RNA izolasyon protokolü, daha küçük miktardaki girdi materyalinden (daha az hayvandan) yeterli kalitede ve bol miktarda RNA üretebilir. Ayrıca, Giriş bölümünde belirtildiği gibi, daha önce rapor edilen kolon bazlı RNA izolasyon protokolü bizim uygulamalarımızda tutarsız çalışmış ve sıklıkla sonraki işlemler için yetersiz olan aşırı düşük RNA verimleri ile sonuçlanmıştır (yayımlanmamış veri). Burada rapor edilen protokol, kullanıcıların çeker ocak gerektiren tehlikeli kimyasallarla çalışmasını gerektirmediği için, fenol bazlı bir RNA izolasyon yaklaşımına kıyasla oldukça daha güvenlidir. Ayrıca, fenol bazlı RNA ekstraksiyon protokollerinde sık karşılaşılan bir kullanıcı sorunu, RNA saflığını etkileyen ve sonraki uygulamaları bozabilen fenol kalıntısıdır. Bu sorunlar, fenol bazlı RNA ekstraksiyonunu lisans öğrencileri için (ister araştırma laboratuvarlarında ister sınıflarda olsun) daha az erişilebilir kılmaktadır. Bununla birlikte, fenol bazlı yöntem en uygun maliyetli olanıdır. Burada rapor edilen protokol, tek bir hayvanın transkriptomik yanıtlarını değerlendirmek amacıyla tek bir hayvandan RNA izole etmek için uygun değildir (Kirk et al. tarafından yayımlandığı gibi), ancak bunun yerine bir stresöre yanıt olarak bireyler arasındaki ortak değişiklikleri incelemek için değerlidir ve stres yanıtlarının daha bütünsel bir görünümünü sunar. Bu nedenle kullanıcılar, hangi protokolün ihtiyaçlarına en iyi şekilde cevap vereceğini belirlemek için maliyetin, hayvan mevcudiyetinin ve mevcut protokollerin kullanıcı erişilebilirliğinin önemini tartmalıdır.

Bu rapor, söz konusu protokolün Heterotardigrada'dan temsilci bir tür dahil olmak üzere altı farklı tardigrat türünden yeterli miktarda ve kalitede RNA ürettiğini doğrulamıştır. Ayrıca, bu RNA izolasyon yöntemi, makul sayıda hayvandan (tür boyutuna bağlı olarak 25–200 arası) yeterli RNA sağlamaktadır. Bu RNA izolasyon protokolünün birden fazla türde doğrulanması, tardigrat biyolojisinin büyüleyici yönlerinin anlaşılmasının önünü açmaktadır. Bu durum, yalnızca stres toleransı araştırmalarıyla sınırlı kalmayıp, aynı zamanda bu hayvanların evrimini, direnç mekanizmalarının evrimini ve gelişimini anlamayı da kapsamaktadır. Bu protokol, özellikle biyokütlenin sınırlı olduğu ve standart RNA izolasyon yöntemlerinin eksik olduğu, model olmayan ve sahadan toplanan tardigrat türleri için oldukça kullanışlıdır. Son olarak, bu protokol araştırmacılar için erişilebilirdir ve lisans öğrencisi araştırmacılar tarafından tekrarlanabilir şekilde uygulanabilir; bu da onu öncelikle lisans eğitimi veren kurumlardaki eğitim veya araştırma laboratuvarları için değerli bir kaynak haline getirir.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, UNC Asheville'den sağlanan başlangıç fonları (CCH'ye) ve Jason Pienaar'a (PK'nın doktora sonrası danışmanı) verilen NSF 2225683 numaralı hibe ile desteklenmiştir. Teknik destekleri için UNC High Throughput Sequencing Facility'ye teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL Mikrofüj TüpleriUSA Scientific1615-5500Seal-Rite 1.5 mL dereceli mikrocentrifüj tüpü, doğal, polipropilen, 500/paket
%70 EtanolVWR71001-654Tezgahların/ekipmanların temizliği için
Arcturis PicoPure RNA İzolasyon KitiFisherKIT0204Bu makalede açıklanan izolasyon protokolü için bileşenleri içeren kit
SantrifüjEppendorf5405000441Centrifuge 5425, döner düğmeli, soğutmasız, Rotor FA-24x2 ile, 120 V/50-60 Hz (US)
Deer Park Kaynak SuyuHerhangi bir MarketN/ATardigrad kültürleri için besiyeri olarak ve RNA izolasyonu öncesinde tardigradları durulamak için kullanılır
Diseksiyon MikroskobuZeissN/AZeiss Stemi 305, 5:1 zoom oranı ve 8x-40x toplam büyütme, M LED transilüminasyon ünitesi ile
DNase IFisherFEREN0521Thermo Scientific DNase I, RNase-free (1 U/uL)
Filtreli Pipet Uçları 10 uLVWR76322-528Herhangi bir filtreli pipet ucu uygundur
Filtreli Pipet Uçları 1000 uLVWR76322-154Herhangi bir filtreli pipet ucu uygundur
Filtreli Pipet Uçları 20 uLVWR76322-134Herhangi bir filtreli pipet ucu uygundur
Filtreli Pipet Uçları 200 uLVWR76322-150Herhangi bir filtreli pipet ucu uygundur
Cam KılcallarFisher50-821-811World Precision Instrument Standart Cam Kılcallar - 1B120-6 (6 inç, OD 1.2 mm, filamentsiz). Bunlar bir alev üzerinde uçları daraltılarak iki cam kılcal haline getirilir ve ardından seçilen tardigrad türlerini ağız pipetiyle almak için uygun çapta kırılır.
Isıtma BloğuEppendorf5382000023Eppendorf ThermoMixer C, termobloksuz temel cihaz, 100-130 V/50-60 Hz (US/JP/Güney Amerika/TW)
High Sensitivity RNA Screen Tape LadderAgilent5067-5581TapeStation Sistemlerinde toplam RNA'nın yüksek hassasiyetli analizi için ladder
High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579TapeStation Sistemlerinde toplam RNA'nın yüksek hassasiyetli analizi için
High Sensitivity RNA ScreenTape Örnek TamponuAgilent5067-5580TapeStation Sistemlerinde toplam RNA'nın yüksek hassasiyetli analizi için tampon
Mikroakışkan Jel ElektroforeziAgilentG2991BAAgilent 4200 TapeStation Sistemi
Mikrohacim SpektrofotometreFisher13400607Thermo Scientific NanoDrop UltraC FL, Detektör Tipi: 2048-elementli, CMOS Doğrusal Görüntü Sensörü, Ekran: 10 inç Yüksek Çözünürlüklü Renkli Ekran, Diller: Çince, İngilizce, Fransızca, Japonca, Almanca, Işık Kaynağı: Ksenon Flaş, Spektral Bant Genişliği: 1.8 nm veya daha az (Hg 254 nm'de FWHM), Voltaj: 12 VDC
Ağız PipetiMillipore SigmaA5177Kalibre edilmiş mikrokapiler pipetler için aspiratör tüp düzenekleri
Nükleaz İçermeyen SuFisherFERR0581Thermo Scientific Water, nuclease-free
Pipetler (2.5 uL, 20 uL, 200 uL ve 1000 uL)Eppendorf2231300004Eppendorf Research plus, 4'lü paket
RNase AwayFisher21-402-178Thermo Scientific RNase AWAY Yüzey Dekontaminantı
RNase-Free Tüp ve Havanda TokmağıFisher12-141-368RNA izolasyonu için RNase-free tüpler ve havanda tokmakları

Kaynaklar

  1. Møbjerg N, Neves RC. New insights into survival strategies of tardigrades. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2021;254:110890.
  2. Møbjerg N, Halberg KA, Jørgensen A, Persson D, Bjørn M, Ramløv H, et al. Survival in extreme environments—on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiol (Oxf). 2011;202(3):409-420.
  3. Hibshman JD, Clegg JS, Goldstein B. Mechanisms of desiccation tolerance: themes and variations in brine shrimp, roundworms, and tardigrades. Front Physiol. 2020;11:592016.
  4. Hengherr S, Schill RO. Environmental adaptations: cryobiosis. In: Schill RO, editor. Water Bears: The Biology of Tardigrades. Cham: Springer; 2018. p. 295-310.
  5. Schill RO, Hengherr S. Environmental adaptations: desiccation tolerance. In: Schill RO, editor. Water Bears: The Biology of Tardigrades. Cham: Springer; 2018. p. 273-293.
  6. Guidetti R, Rizzo AM, Altiero T, Rebecchi L. What can we learn from the toughest animals of the Earth? Water bears (tardigrades) as multicellular model organisms in order to perform scientific preparations for lunar exploration. Planet Space Sci. 2012;74(1):97-102.
  7. Jönsson KI. Radiation tolerance in tardigrades: current knowledge and potential applications in medicine. Cancers (Basel). 2019;11(9):1333.
  8. Clark-Hachtel CM, Hibshman JD, De Buysscher T, Stair ER, Hicks LM, Goldstein B. The tardigrade Hypsibius exemplaris dramatically upregulates DNA repair pathway genes in response to ionizing radiation. Curr Biol. 2024;34(9):1819-1830.e6.
  9. Hashimoto T, Kunieda T. DNA protection protein, a novel mechanism of radiation tolerance: lessons from tardigrades. Life (Basel). 2017;7(2):26.
  10. Chavez C, Cruz-Becerra G, Fei J, Kassavetis GA, Kadonaga JT. The tardigrade damage suppressor protein binds to nucleosomes and protects DNA from hydroxyl radicals. Elife. 2019;8:e47682.
  11. Kamilari M, Jørgensen A, Schiøtt M, Møbjerg N. Comparative transcriptomics suggest unique molecular adaptations within tardigrade lineages. BMC Genomics. 2019;20(1):607.
  12. Boothby TC, Tapia H, Brozena AH, Piszkiewicz S, Smith AE, Giovannini I, et al. Tardigrades use intrinsically disordered proteins to survive desiccation. Mol Cell. 2017;65(6):975-984.e5.
  13. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. Time-series transcriptomic screening of factors contributing to the cross-tolerance to UV radiation and anhydrobiosis in tardigrades. BMC Genomics. 2022;23(1):405.
  14. Anoud M, et al. Comparative transcriptomics reveal a novel tardigrade-specific DNA-binding protein induced in response to ionizing radiation. Elife. 2024;13:RP92621.
  15. Förster F, Liang C, Shkumatov AV, et al. Transcriptome analysis in tardigrade species reveals specific molecular pathways for stress adaptations. Bioinform Biol Insights. 2012;6:69-96.
  16. Horikawa DD, Sakashita T, Katagiri C, et al. Analysis of DNA repair and protection in the tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 2013;8(6):e64793.
  17. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 2021;36:107111.
  18. Li L, et al. Multi-omics landscape and molecular basis of radiation tolerance in a tardigrade. Science. 2024;386(6720):eadl0799.
  19. Hibshman JD, Clark-Hachtel CM, Bloom KS, Goldstein B. A bacterial expression cloning screen reveals single-stranded DNA-binding proteins as potent desicco-protectants. Cell Rep. 2024;43(11):114956.
  20. Hashimoto T, Horikawa DD, Saito Y, et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nat Commun. 2016;7:12808.
  21. Yoshida Y, Hirayama A, Arakawa K. Transcriptome analysis of the tardigrade Hypsibius exemplaris exposed to the DNA-damaging agent bleomycin. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2024;100(7):414-28.
  22. Murai Y, et al. Multiomics study of a heterotardigrade, Echiniscus testudo, suggests the possibility of convergent evolution of abundant heat-soluble proteins in Tardigrada. BMC Genomics. 2021;22(1):813.
  23. Boothby TC. Total RNA extraction from tardigrades. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(11):prot102376.
  24. Arakawa K, Yoshida Y, Tomita M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Sci Data. 2016;3:160063.
  25. Yoshida Y, Sugiura K, Tomita M, Matsumoto M, Arakawa K. Comparison of the transcriptomes of two tardigrades with different hatching coordination. BMC Dev Biol. 2019;19(1):20.
  26. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 2021;36:107111.
  27. Kirk MJ, Xu C, Paules J, Rothman JH. Single-animal, single-tube RNA extraction for comparison of relative transcript levels via qRT-PCR in the tardigrade Hypsibius exemplaris. J Vis Exp. 2025;(215):e66935. doi:10.3791/66935.  
  28. Linz DM, Hara Y, Deem KD, Kuraku S, Hayashi S, Tomoyasu Y. Transcriptomic exploration of the coleopteran wings reveals insight into the evolution of novel structures associated with the beetle elytron. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 2023;340(2):197-213.
  29. Agilent Technologies Inc. RNA ScreenTape Assay for TapeStation Systems. Part No. G2991-90121 Rev. D. Santa Clara (CA): Agilent Technologies; 2018.
  30. Manchester KL. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. Biotechniques. 1996;20(6):968-70.
  31. Imbeaud S, et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 2005;33(6):e56.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

ok T rl ProtokolMessenger RNARNA DizilemeRNA nterferansStres ToleransHeterolog Ekspresyonevresel StresMolek ler Mekanizmalar
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.