Tip 2 Diyabet Mellitus'ta Öjenol ve Repaglinid Arasındaki İlaç-İlaç Etkileşimi ve Potansiyel Mekanizması

Özet

Bu çalışma, tip 2 diyabet hastalığı (T2DM) hastalarında eugenol (EUG) ile repaglinid (RPG) arasındaki potansiyel ilaç-ilaç etkileşimlerini araştırmayı amaçladı.

Özet

Bu çalışma, tip 2 diyabette (T2DM) eugenol (EUG) ile repaglinid (RPG) arasındaki potansiyel ilaç-ilaç etkileşimini (DDI) inceledi. Yüksek yağlı diyet ve streptozotosin (STZ) kullanılarak T2DM fare modeli oluşturuldu. Tek doz grubu 0,4 mg/kg RPG aldı ve birlikte uygulama grupları yedi gün boyunca EUG (50, 100, 150 mg/kg) ile ön tedavi edildi, ardından tek doz RPG (0,4 mg/kg) alındı. RPG'nin kan şekeri ve farmakokinetik parametreleri sıçanların plazma örneklerinde değerlendirildi. EUG'nin RPG metabolik stabilitesi ve sitokrom P3A (CYP3A) aktivitesi üzerindeki etkisi, fare karaciğer mikrozomlarında (RLM) değerlendirildi. T2DM sıçanlarda RPG tedavisi hipoglisemik etki gösterdi ve bu durum, EUG ortak uygulamasıyla doz bağımlı şekilde daha da desteklendi (p < 0.001). EUG ortak uygulaması, RPG'nin farmakokinetiklerini etkiledi; eğri altındaki alanı artırdı (AUC, %88,64, %164,59 ve %244,72 artış, tek RPG'ye göre %164,59 ve %244,72, p < 0,001), plazma maksimum konsantrasyonu (C_max, %18,61 %53,58 artış, tek RPG'ye göre %77,63, p <0,01), maksimum konsantrasyon (T_max, EUG ortak uygulaması için 1,0 saat vs tek RPG için 0,5 saat), yarı ömür (_{t 1/2}, uzayan %33,86, %49,61 ve %88,19, tek RPG'ye göre %88,19, p < 0,01), ortalama tutma süresi (MRT, uzun 17,62%, %26,42%, %44,04 tek RPG'ye göre, p < 0,001) ve azalan temizleme oranı (Clz/F, %48,92, %63,31 ve tek RPG'ye göre %74,10, p < 0,001) doz bağımlılığında gerçekleşti. In vitro RLM çalışmasında, EUG RPG'nin metabolik kararlılığını yarı ömrü uzatarak (44,09 ± 3,25 dakika) ve içsel boşluğu (30,55 ± 3,69 μL/m/mg protein) azaltarak iyileştirdi. EUG ayrıca 7.90 ± 1.79 μM IC₅₀ ile CYP3A'nın aktivitesini inhibe etti. EUG'nin birlikte uygulanması, RPG sistemik maruziyetini artırarak RPG'nin hipoglisemik etkisini T2DM sıçanlarında artırdı; bu da RPG metabolik stabilitesini artırarak ve potansiyel olarak RPG metabolik stabilitesini artırarak ve CYP3A aktivitesini inhibe etmiştir.

Giriş

Tip 2 diyabet (T2DM), insülin direnci veya azalmış insülin verimliliğiyle karakterize edilen kronik bir metabolik bozukluktur ve dünya çapında milyonlarca kişiyi^{etkiler. 1}. Genetik duyarlılık ve yaşam tarzı faktörleriyle karmaşık etkileşimler T2DM'de yer alır; bu da glikoz alımının bozulmasına, aşırı karaciğer glukoneogenezine ve kronik düşük dereceli iltihaba^{yol açar.} T2DM, yanlış tedavi edilirse kardiyovasküler hastalıklar, böbrek hastalığı, retinopati ve nöropati gibi ciddi komplikasyonlara yol açabilir; bu da hastaların yaşam kalitesini önemli ölçüde etkiler ve ölüm oranını artırır². T2DM'nin mevcut ilaç tedavileri arasında metformin, sülfonilurea ilaçları, GLP-1 reseptör agonistleri ve DPP-4 inhibitörleri vb. bulunmaktadır^. Repaglinitör (RPG), insülin salgısını uyararak çalışan ve doz esnekliği özelliğine sahip kısa etkili meglitinid^{türlerinden biridir 4}. Sülfonilüreylere kıyasla, glinidler prendiyal hiperglisemi üzerinde üstün kontrol sağlar, hipoglisemi gibi bazı yan etkilerin riskini azaltır ve özellikle böbrek yetmezliği olan hastalarda daha avantajlı bir güvenlik profili^{sunar 5,6}. RPG, oral uygulamadan sonra hızla emilir ve genellikle 30–60 dakika içinde plazma konsantrasyonlarının zirvesine ulaşır ve kısa yarı ömrü insülin salınımının kısa bir uyarılmasına yol açar. Klinik olarak, RPG ya monoterapi olarak ya da diğer ağızdan antihiperglisemik ajanlarla birlikte glisemik kontrolü optimize etmek için kullanılır⁷. Ancak, klinik uygulaması düşük ağız biyoyararlanımı (yaklaşık %56), hızlı karaciğer metabolizması ve hipoglisemi^{riski nedeniyle sınırlıdır} 8,9,10,11,12,13,14. Bu dezavantajlar, kapsamlı bir tedavi stratejisinin gerekliliğini vurgular.

Eugenol (EUG), kimyasal olarak 4-allyl-2-metoksifenol olarak bilinir, kimyasal formülü C₁₀H_{12O 2}¹⁵ olan organik bir bileşiktir. EUG, renksiz veya soluk sarı bir sıvıdır ve esas olarak karanfil (Eugenia caryophyllata Thunb.) ve diğer aromatik bitkilerde bulunan aktif fenolik bir bileşiktir^. EUG, antioksidan, anti-inflamatuar, antibakteriyel, analjezik ve anti-tümör aktiviteleri dahil olmak üzere çeşitli farmakolojik özellikleri nedeniyle büyük ilgi^çekmiştir 17,18,19. Son çalışmalar, EUG'nin hem in vitro hem de in vivo deneysel kanıtlar, EUG'nin insülin hassasiyetini artırdığını, periferik dokularda glikoz alımını teşvik ettiğini, karaciğer glukoneogenezini inhibe ettiğini ve pankreas β-hücre fonksiyonunu koruduğunu gösterdiğinde, T2DM için yardımcı tedavi olarak potansiyel değeri^{gösterdiğini göstermiştir 20,21}. Bu çok yönlü önlemler ve nispeten düşük toksisite²², EUG'yi geleneksel klinik ilaçların eksikliklerini tamamlayabilecek ve T2DM ile ilgili komplikasyonları sinerjik bir mekanizma yoluyla hafifletebilen son derece umut vadeden doğal ilaç adayı olarak konumlandırıyor.

Sitokrom P450 enzimleri (P450'ler), ilaç metabolizması sürecinde kritik bir rol oynar ve belirli alt tipleri inhibe ederek (DDI) aracılık eder; bu da güvenli ve etkili ilaç tedavisi için hayati öneme sahiptir²³. Özellikle, RPG esas olarak karaciğerde CYP2C8 ve CYP3A4^24,25 tarafından metabolize edilir. Quercetin (QCT) ile birlikte uygulandığında, QCT, karaciğer ilk geçiş ve sistemik metabolizmayı CYP450s²⁶ yoluyla inhibre ederek RPG'nin in vivo biyoerişilebilirliğini artırır. Ayrıca, EUG'nin 1A2, 2C9, 2D6 ve 3A4 dahil olmak üzere CYP450'lerin aktivitesini konsantrasyona bağlı olarak bastırdığı bildirilmiştir; bu, EUG'nin bu enzimler tarafından metabolize edilen ilaçlarla birlikte uygulandığında potansiyel etkileşimleri^{göstermektedir 27}. EUG'nin T2DM için yardımcı tedavi olarak umut verici potansiyeline ve RPG'nin CYP aracılı DDI'lara karşı bilinen duyarlılığına rağmen, EUG'nin RPG'nin sistemik maruziyetini, metabolik stabilitesini veya CYP3A aracılı metabolizmasını mı değiştirdiği belirsizdir. EUG ve RPG'nin klinik uygulamada veya diyet takviyesi ortamlarında birlikte uygulanma olasılığı göz önüne alındığında, aralarındaki DDI verilerinin eksikliği, RPG plazma konsantrasyonlarında istenmeyen değişiklikler riski teşkil etmektedir. Bu tür değişiklikler ya terapötik etkinliğin azalmasına ya da hipoglisemi riskinin artmasına yol açabilir. Bu nedenle, bu kanıt açığı, doğal ürünlerin geleneksel antidiyabet ilaçlarla mantıklı ve güvenli birleşmesinin önünde önemli bir engel oluşturuyor. Bu nedenle, EUG'nin RPG'nin farmakokinetik ve farmakodinamiği üzerindeki etkisini sistematik olarak değerlendirmek ve özellikle CYP3A aktivitesine odaklanarak altta yatan metabolik mekanizmayı aydınlatmak gereklidir. Yukarıdaki kanıtlar göz önüne alındığında, EUG'nin CYP450 aktivitesini değiştirerek RPG metabolizmasını etkileyebileceği tahmin edilebilir. Bu, T2DM ortamında EUG–RPG etkileşimini inceleyen ilk çalışmadır. Bulguların, kritik bir bilgi boşluğunu doldurması ve T2DM yönetiminde EUG ile RPG'nin güvenli ortak yönetiminin optimize edilmesi için mekanik bir temel sağlaması beklenmektedir. Birlikte uygulama düşünülürse, RPG maruziyetinin artma potansiyeli göz önünde bulundurulmalı ve özellikle EUG yüksek dozlarda veya yoğun bir takviye olarak alındığında hipoglisemi belirtileri izlenmelidir. Ayrıca, sıçanlar insan CYP3A4'e işlevsel olarak benzer CYP3A izoformlarını ifade etseler de, nicel bulguların doğrudan insanlara ekstrapolasyonu, enzim ifadesi ve katalitik aktivitedeki tür farklılıkları nedeniyle dikkatli olunmalıdır.

Protokol

Bu çalışma, Jilin Çin Tıp Bilimleri Akademisi Etik Komitesi tarafından (Tarih:2024.11.21/No.2024112) ARRIVE yönergelerine uygun olarak onaylanmıştır²⁸. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Hayvan barınma koşulları

Erkek Sprague-Dawley fareleri (200–250 g) laboratuvar hayvan odasında şu koşullarda tutuldu: sıcaklık: 22 °C ± 2 °C, göreli nem: %40–60 ve 12 saatlik ışık/karanlık döngü, bir haftalık alışma süresi için serbest yiyecek ve suya erişim^{sağlanıyordu 29,30}.

2. Hayvan modellemesi, tedavisi ve örnek işleme

Örneklem büyüklüğü, F-testi (G*Power 3.1.9.7) kullanılarak yapılan bir güç analizine dayanarak belirlendi. A priori güç analizi 0.6 etki boyutu, 0.05 α seviyesi ve istenen 0.8 güç ile gerçekleştirildi ve toplam örneklem büyüklüğü 55 oldu. Bu hesaplama, her grup için en az 9 fare gerektiğini gösterdi. Bu nedenle, her grup başına on fare kullanıldı ve gerçek bir güç 0.86 oldu.

T2DM modeli kurulmadan önce, tüm fareler 12 saat oruç tutuluyordu. Daha sonra rastgele iki gruba ayrıldılar: kontrol grubu (n = 10) ve T2DM grubu (n = 50). T2DM fare modelinin oluşturulması, daha önce bildirilen^{yönteme göre gerçekleştirilmiştir.} Kısaca, T2DM grubundaki farelere üst üste 4 hafta boyunca yüksek yağlı (%60 yağ içeriğiyle) beslendi ve ardından steril sitrat tamponunda (pH 4.4) çözünmüş 30 mg/kg STZ içeren tek intraperitoneal enjeksiyon yapıldı. STZ enjeksiyonundan üç gün sonra, farelerin kuyruk damarındaki kan şekeri bir kan şekeri ölçer kullanılarak ölçüldü ve kan şekeri konsantrasyonu 16,7 mmol/L'yi aşan sıçanlarda T2DM'yi başarıyla tespit ettikleri kabul edildi. Kontrol grubu için fareler normal bir diyet aldı ve T2DM grubuyla aynı dönemde %0,9 normal salin intraperitoneal enjeksiyonlar aldı.

T2DM fareleri ayrıca her grupta 10 fare bulunan dört gruba ayrıldı: T2DM + RPG grubu (tek RPG), T2DM + RPG + EUG (50 mg/kg) grubu (co-RPG+EUG 50 mg/kg), T2DM + RPG + EUG (100 mg/kg) grubu (co-RPG+EUG 100 mg/kg) ve T2DM + RPG + EUG (150 mg/kg) grubu (co-RPG+EUG 150 mg/kg). 12 saat oruç tuttuktan sonra, tek RPG grubundaki farelere oral olarak 0.4 mg/kg RPG (normal salin içinde askılı) gavage ^{iğnesi 26} ile verildi. Ko-RPG+EUG gruplarındaki fareler, sırasıyla yedi gün boyunca günde bir kez 50, 100 ve 150 mg/kg EUG ağızdan alındı ve sekizinci gün, ek 12 saatlik oruç döneminden sonra, ortak uygulama grubuna intragastrik garaj yoluyla 0,4 mg/kg RPG verildi. Daha sonra, kan şekeri parametreleri kuyruk veninden alınan kan örnekleri kullanılarak değerlendirildi.

Farmakokinetik analiz için, kan örneği (0,2 mL) sıçanların arka orbital venöz pleksusundan heparinize mikrosantrifüj tüplerine çeşitli zaman noktalarında (0,25 saat, 0,5 saat, 1 saat, 2 saat, 4 saat, 6 saat ve 8 saat dozdan sonra) toplanmıştır. Toplandıktan sonra, örnekler santrifüjlenerek (1500 × g, 10 dakika, 4 °C) plazmayı ayırmak için (soluk sarı, berrak) ve analiz edilene kadar -80 °C sıcaklıkta saklandı. Plazma örnekleri, 4. adımda tanımlanan HPLC yöntemiyle RPG konsantrasyonu açısından analiz edildi.

3. Biriktirilmiş fare karaciğeri mikrozomlarında metabolizma çalışması

In vivo farmakokinetik değişikliklerin altında yatan mekanizmayı incelemek için, EUG'nin RPG metabolik stabilitesi ve CYP3A aktivitesi üzerindeki etkisi RLM'de değerlendirildi. RPG (3 μM), RLM (0,5 mg/mL mikrozomal protein) ve NADPH rejenerasyon sistemi (1,3 mM NADP, 3,54 mM glukoz 6-fosfat, 0,4 U/mL glukoz 6-fosfat, 0,4 U/mL glukoz 6-fosfat dehidrojenaz ve 3,3 mM MgCl₂) dahil olmak üzere PBS tamponunda EUG ile veya olmadan kuluçka edildi. NADPH olmadan 37 °C'de 5 dakikalık ön kuluçkadan sonra, reaksiyon NADPH rejenerasyon sistemi eklenerek başlatıldı. Karışım daha sonra 37 °C'de sallanan su banyosunda kuluçka yapıldı. Farklı kuluçka zaman noktalarında (0 dakika, 5 dakika, 15 dakika, 30 dakika, 45 dakika, 60 dakika) 30 μL örnekler toplanıp reaksiyonu sonlandırmak için buz gibi asetonitrile birlikte mikrosantrifüj tüpüne aktarıldı. Örnekler, süpernatan (şeffaf) elde etmek için santrifüjlendi (12000 × g boyunca 4 °C'de 10 dakika). Ortaya çıkan süpernatantlar, 4. adımda detaylandırılan aynı HPLC yöntemiyle RPG konsantrasyonu açısından analiz edildi.

4. HPLC analizi

Plazmadaki RPG konsantrasyonu (2. adımdan) ve mikrozomal kuluçkalarda (3. adımdan) Kim ve ark. ²⁶ tarafından bildirilen HPLC yöntemiyle analiz edilmiştir. Özel işlem adımları şöyledir: örnekler (120 μL) 300 μL asetonitril içeren ketokonazol (dahili standart, 100 ng/mL) ile karıştırıldı ve protein çökeltmesi sağlandı. Daha sonra karışım 15000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca vorteksle yapıldı ve santrifüjlendi. Süpernatant, mikrokolonlu santrifüj tüpüne aktarıldı ve azot atmosferi altında 25 °C'de buharlaştırıldı. Kuruduktan sonra kalıntı 50 μL mobil faz ile yeniden çözülür, ardından girdablandırılır ve santrifüjlenirdi. Daha sonra, süpernattan 40 μL HPLC kolonuna enjekte edildi (250 mm × 4,6 mm, parçacık boyutu 5 μm). Kolon, 10 mM fosfat tamponu (pH 6.0) ve asetonitril (hacim oranı 46.4: 53.6) ile izokratik elülasyon modunda 25 °C'de 1 mL/dakika akış hızıyla elüasyon edildi. Eluent, 240 nm uyarılma dalga boyuna sahip bir floresans dedektörü kullanılarak izlendi.

5. İstatistiksel analiz

Farmakokinetik analiz yazılımı, AUC, C_max, T_max, t_1/2, MRT ve clearance gibi farmakokinetik parametreleri hesaplamak için kullanıldı. Şekil üretimi ve veri analizi için istatistiksel analiz ve grafik yazılımı kullanıldı. Tüm veriler ortalama ± standart sapma olarak sunuldu. Gruplar arasındaki farklar, uygun duruma göre tek yönlü ANOVA (glikoz seviyesi karşılaştırmaları için) veya iki yönlü ANOVA (farmakokinetik parametre karşılaştırmaları için) kullanılarak analiz edildi, ardından çoklu karşılaştırmalar için Tukey'nin sonradan yaptığı test yapıldı. EUG'nin CYP3A aktivitesi üzerindeki etkisi, doğrusal olmayan regresyon analiziyle değerlendirildi. P < değeri 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

RLM'de RPG metabolik stabilitesinde EUG'nin yarı ömrü şu şekilde hesaplandı:
t_1/2 (min) = 0.693/ln(C_t/_{C 0} × 100).

İçsel temizlenme oranı (μL/min/mg protein) = v × 0.693/_{t 1/2};
v (μL/mg) = kuluçka hacmi/protein konsantrasyonu.

Sonuçlar

EUG, T2DM sıçanlarında RPG'nin hipoglisemik etkisini teşvik etti
T2DM grubundaki farelerin kan şekeri seviyesi, kontrol grubuna kıyasla (p < 0.001, %95 GA: -13.90~-11.32) kontrol grubuna kıyasla artmış ve bu da T2DM modelinin başarılı iletimini göstermiştir (Şekil 1A). Tek bir RPG uygulaması, T2DM sıçanlarında kan şekeri seviyesini baskıladı (p < 0.001, %95 GA: 5.26~7.84). RPG ve EUG'nin birlikte uygulanması, T2DM sıçanl...

Tartışma

T2DM, uzun süreli tedavi gerektiren kronik bir metabolik hastalıktır ve hastalar genellikle kardiyovasküler hastalık ve böbrek hastalığı gibi altta yatan hastalıklar nedeniyle birden fazla ilaç almak zorunda^kalır. DDI'ların riski, ilaç birlikte uygulandığında önemli ölçüde artar; çünkü hipoglisemik ilaçların emilim, metabolizması veya etkinliğini etkileyebilir; bu da hipoglisemik koma ve kontrolsüz kan şekeri^{seviyeleri gibi akut risklere yol açab...}

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
asetonitril	Merck, Almanya	34851	≥99.9%
kromatografik kolon	Phenomenex, ABD	00G-4041-E0	250 mm × 4.6 mm, partikül boyutu 5 μm
DAS	Beijing Bozhiyin, Çin	-	3.0
EUG	MUST Biyoteknoloji, Çin	A0074	saflık ≥99%
GraphPad Prism	GraphPad Software, ABD	-	9.0.0
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi	Shimadzu Corporation, Japonya	228-45147-42	RF-20A
ketokonazol	Merck, Almanya	K1003	Saflığı 99.0-101.0%
Erkek Sprague-Dawley sıçanları	Shanghai Hayvan Merkezi, Çin	-	200–250 g
NADPH	Merck, Almanya	10107824001	97% (kuru ağırlık)
OneTouch Ultra2 kan şekeri ölçer	Life Scan Inc., ABD	https://shop.onetouch.com/onetouch-sup-reg-sup-ultra-sup-reg-sup-2-meter/product/OTSUS05_0019	-
PBS	Merck, Almanya	P4474	pH 7.4
RLM	Merck, Almanya	M9066	-
RPG	Merck, Almanya	R9028	saflık ≥98%
STZ	Merck, Almanya	S0130	≥98% (HPLC)
EUG, eugenol; RPG, repaglinid; RLM, sıçan karaciğer mikrozomları; NADPH, β-Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat; STZ, streptozotosin; PBS, fosfat tamponlu salin.