Tripedalia cystophora'nın İzole Rhopaliumundan Görsel Olarak Uyarılan Yüzme Paketleyici Sinyallerinin Ekstraselüler Elektrofizyolojik Kaydı

Özet

Bu protokol, kutu denizanası Tripedalia cystophora'nın izole edilmiş rhopaliumundan görsel olarak uyarılmış yüzme pacemaker sinyallerinin hücre dışı elektrofizyolojik kaydını tanımlayarak; görsel bilgi işlemenin ve sensörimotor entegrasyonun kesin araştırması için engelden kaçınma davranışının kantitatif bir okumasını sağlar.

Özet

Kutu denizanası Tripedalia cystophora, görüntü oluşturan lensli gözleri ve iyi karakterize edilmiş görsel güdümlü davranışları, yaklaşık 10 nöronlu yönetilebilir bir rhopalial sinir sistemiyle birleştirerek, görsel bilgi işleme ve sensorimotor entegrasyonun sistem düzeyinde incelenmesi için gelişmekte olan bir model haline gelmektedir. Yüzme pacemaker nöronları, şemsiye kasılmalarını doğrudan kontrol eden motor komutlar üretir ve bu sinyaller, izole bir rhopaliumun epidermal sap sinirinden hücre dışı olarak kaydedilebilir; bu da görsel olarak yönlendirilen motor çıktı için kantitatif bir vekil sağlar. Pacemaker sinyal sayısı ve anlık frekanstan türetilen standardize nöronal aktivite olarak nicelleştirilen pacemaker yanıtının gücü, karar geçiş eşiğinin (DTT) üzerindeki uyaran kontrastıyla ölçeklenir ve bu durum, görsel olarak yönlendirilen sensorimotor entegrasyonun kademeli değerlendirilmesine olanak tanır. Bu protokolde; hücre dışı vakumlu elektrotların imalatını, rhopalial izolasyonunu, kayıt odası konfigürasyonunu, alt lensli göze görsel uyaran iletimini, donanım düzeyinde uyaran zamanlama doğrulamasını, epidermal sap sinirine elektrot yerleşimini ve standart laboratuvar donanımı kullanarak senkronize elektrofizyolojik ve uyaran veri edinimini kapsıyoruz.

Giriş

Sinir sistemlerinin duyusal bilgileri nasıl işlediğini ve bunu adaptif davranışlara nasıl dönüştürdüğünü anlamak, nörobilimdeki temel zorluklardan biridir. Gelişmiş görüntüleme ve devre haritalama araçlarına sahip diğer genetik olarak yönetilebilir modellerin yanı sıra, yaklaşık 200.000 nöronlu beyniyle nöral devre organizasyonunun ayrıntılı analizine olanak tanıyan Drosophila melanogaster gibi büyük ve karmaşık model organizmalarda önemli ilerlemeler kaydedilmiştir¹. Ancak, bu sistemlerin sahip olduğu yüksek karmaşıklık, duyusal girdi, nöral hesaplama ve davranışsal çıktı arasındaki ilişkiye dair eksiksiz, sistem düzeyinde bir anlayışa ulaşmayı zorlaştırmaktadır. Karmaşıklık spektrumunun diğer ucunda ise, diğer minimum nöron sayılı modellerin yanı sıra 302 nöronu içeren Caenorhabditis elegans gibi tamamen haritalanmış küçük sistemler, yönetilebilir bir boyut sunsa da görüntü oluşturan gözlere ve bunlara bağlı görsel güdümlü davranışlara sahip değildir².

Tripedalia cystophora, yani Karayip kutu denizanası (Şekil 1A), bu uç noktalar arasında belirgin bir konum işgal ederek, sistem düzeyinde görsel bilgi işleme ve sensörimotor entegrasyon için bir model sistem olarak ortaya çıkmaktadır³. Burada açıklanan protokol (Şekil 1), bu hayvanın tüm deneysel potansiyelini daha geniş nörobilim topluluğunun erişimine sunmak için tasarlanmıştır.

T. cystophora, nöral karmaşıklığına sahip bir hayvan için dikkat çekici derecede gelişmiş bir görsel sisteme sahiptir. Rhopalia adı verilen dört duyusal yapının her biri, üst lens gözü (ULE) ve alt lens gözü (LLE) olmak üzere iki görüntü oluşturucu lens gözü dahil altı göz taşır⁴ (Şekil 1B). Bunlar basit fotoreseptif organlar değildir; omurgalı gözlerinde de bulunan Matthiessen tipi dereceli kırıcılık indeksli bir lense ve LLE'de yaklaşık 600, ULE'de ise 400 fotoreseptörün doğrudan ikinci derece nöronlarla eklemlendiği dışa dönük bir retinaya sahiptirler^5,6,7. Omurgalı c-opsinleri ile homolog olan cnidops opsinleri ve ilişkili fototransdüksiyon bileşenlerini içeren fotoreseptif mekanizmanın moleküler kompozisyonu^8,9,10, bunların hiperpolarize olan fotoreseptörler olduğunu güçlü bir şekilde göstermektedir; bu da T. cystophora görsel sistemini, bağımsız evrimsel kökenine rağmen, omurgalı gözü ile aynı geniş fonksiyonel kategoriye yerleştirir.

Kritik olan nokta, bu optik yatırımların; karmaşık, deneysel olarak karakterize edilebilen ve görsel olarak yönlendirilen davranışlarla eşleşmiş olmasıdır. T. cystophora, habitat içindeki konumunu korumak için aracılık edilen uzun mesafeli navigasyon ve ışık şaftı algılamasını kullanarak optik olarak karmaşık mangrov habitatında yol alır^11,12 ve batık destek köklerinin etrafında dolaşmak için engelden kaçınma davranışı sergiler^12,13,14. Bu çalışmanın temelini oluşturan nöroetolojik çerçeve, davranışın dilsiz hayvanlarda duyusal işlemenin tek geçerli çıktısı olduğunu savunur. Hayvanlara ne algıladıklarını soramadığımız için, deneysel tasarım, hayvanın algılayabileceği ve anlayabileceği uyaranlara ve hayvanın gerçekleştirebileceği davranışlara adapte edilmelidir. Bu durum, deneysel soruların araştırmacının değil, hayvanın şartlarına göre formüle edilmesi gerektiği anlamına gelir. T. cystophora'nın engelden kaçınma davranışı bu ilkeyi örneklemektedir. Kutu denizanasının epidermisi sadece tek bir hücre tabakası kalınlığındadır, bu da batık bir destek köküyle çarpışmayı, kırılgan gövdesindeki hasar nedeniyle potansiyel olarak ölümcül kılar. İnter-ropalyal entegrasyon yalnızca halka sinir aracılığıyla aşağı akışta gerçekleştiğinden¹⁵, stereoskopik farklılıktan derinlik hesaplamak için gereken örtüşen binoküler girdiyi alan tek bir ropalyal sinir sistemi (RNS) yoktur. Bunun yerine hayvan, su altı optiğinin temel bir özelliğinden yararlanır: bir nesne ile çevredeki su arasındaki kontrast, mesafe arttıkça hızla azalır. Bu nedenle, yüksek kontrastlı bir engel yakın bir engeldir ve anlık bir tehdit oluşturur; düşük kontrastlı bir engel ise uzaktır ve henüz tehdit edici değildir. Hayvan, kontrastı mesafe için bir vekil (proxy) olarak kullanır¹⁶. Serbestçe hareket eden hayvanlarda, engelden kaçınma davranışı (OAB) bir "git/gitme" (go/no go) kararına dayanır; hayvan, kontrastı karar geçiş eşiğini (DTT) aşan bir su altı engeli algıladığında (engelin tehdit oluşturacak kadar yakın olduğu eşik) bir olay tetiklenir ve "git" yanıtı başlatılır: 3–5 hızlı çan kasılması, 120–180° dönüş ve engelden hızla uzaklaşan yüzme hareketi¹⁴ (Şekil 1C). DTT üzerindeki dereceli pacemaker yanıtı, tehdidin dereceli aciliyetini yansıtır¹⁶. Böylece OAB, sensomotor entegrasyon için oldukça yönetilebilir bir davranışsal analiz sunar: tek ve iyi tanımlanmış bir görsel parametre (kontrast), stereotipik ve ölçülebilir bir motor çıktıyı kontrol eder; bu da onu, görsel yönlendirmeli karar verme mekanizmasının nöral temelini araştırmak için ideal bir sistem haline getirir.

Şekil 1: Hücre dışı elektrofizyolojik kayıt için izole edilmiş Tripedalia cystophora rhopalium hazırlığının genel görünümü. (A) Yetişkin T. cystophora medüzası. Ölçek çubuğu: 5 mm. Kırmızı kutu, şemsiye kenarındaki bir rhopalium'un konumunu belirtmektedir. (B) İzole edilmiş bir rhopalium'un yakın çekimi. Üst lens gözü (ULE) ve alt lens gözü (LLE) görüntü oluşturan gözlerdir. Ölçek çubuğu: 100 µm. Görsel Dan-Eric Nilsson tarafından hazırlanmış olup izinle yeniden yayınlanmıştır. (C) Engelden kaçınma davranışının (OAB) şematik illüstrasyonu. Karar geçiş eşiğinin (DTT, kırmızı kesikli çizgi) altında, hayvan engele doğru yüzmeye devam eder (gitme). DTT'nin üzerinde, engelden kaçınma davranışı başlatılır (git). (D) İzole rhopalium elektrofizyoloji hazırlığının şeması. Rhopalium, eğik projeksiyon ekranına bakacak şekilde konumlandırılmıştır. Hücre dışı elektrot, epidermal sap sinirinden (EN) yüzme pacemaker sinyallerini kaydeder. RNS: rhopalial sinir sistemi; ULE: üst lens gözü; LLE: alt lens gözü; EN: epidermal sap siniri. Topraklama sembolü, banyo referans elektrodunu belirtir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu görsel işlemeyi sağlayan nöral substrat, rhopalium başına yaklaşık 1000 nöron içeren RNS'dir¹⁷. Bu sınırlı nöron sayısına rağmen, RNS mimari olarak gelişmiştir. İmmünohistokimyasal kanıtlar, RNS'nin farklı nöropeptid profilleri eksprese eden ayrı nöron kümeleri şeklinde organize olduğunu göstermektedir¹⁸; bu durum, bölmelere ayrılmış bir işlemleme mimarisiyle uyumludur. Görsel bilgilerin, her biri rhopalium üzerindeki belirli bir gözla ilişkili olan alt osilatuar kümeler (subOC'ler) aracılığıyla işlendiği ve bu kümelerin bir terminal osilatuar kümede (trmOC) birleştiği öne sürülmektedir; trmOC'nin, şemsiye kasılmalarını kontrol eden motor çıktı sinyalini üreten pacemaker hücre popülasyonuna karşılık geldiği düşünülmektedir³. trmOC'nin, subOC'lerden gelen işlenmiş duyusal bilgileri entegre ederek davranışsal motor çıktıyı yönlendiren yüzme pacemaker sinyalini ürettiğini ve subOC'ler ile trmOC arasındaki senkronizasyonun, görsel girdinin davranışsal kontrol çıktısına dönüştürülmesinin temelini oluşturduğunu öne sürüyoruz³ (Şekil 2).

Şekil 2yüzme pacemaker sinyalinin nöral devre kökeni ve elektrofizyolojik tanımlanması Tripedalia cystophora. (A) Rhopalial sinir sisteminin şeması. Görsel bilgi, münferit gözlerle ilişkili olan alt osilatuar kümeler (subOC'ler, kırmızı) aracılığıyla işlenir ve terminal osilatuar kümede (trmOC, yeşil) birleşir. trmOC'nin, subOC'lerden gelen işlenmiş duyusal bilgileri entegre ettiği ve davranışsal motor çıktıyı yönlendiren yüzme pacemaker (kalp pili) sinyalini ürettiği öngörülmektedir. Açık mavi oklar görsel bilgi işleme yolunu; koyu mavi ok ise davranışsal motor çıktıyı göstermektedir. (B) Kesilmiş epidermal sap yüzeyinin TEM mikrografı. Kesikli daireler, kayıt elektrotlarının yerleştirildiği bölgelere karşılık gelen, sapın adoral yüzeyindeki çatallı epidermal sap sinirinin iki tutunma noktasını göstermektedir. (C) Aksiyon potansiyeli benzeri sinyal. Dalga formu, yaklaşık 20 ms süreli (kırmızı kesikli çizgilerle belirtilen), keskin ve dar bir sapma ile karakterize edilir. (DtrmOC'den kaynaklanan yüzme kalp pili (pacemaker) sinyali. Dalga formu daha geniştir, yaklaşık 45 ms'lik karakteristik bir süreye sahiptir (kırmızı kesikli çizgilerle belirtilmiştir) ve birden fazla trmOC nöronunun toplam aktivitesini yansıtan karmaşık bir morfoloji sergiler. Sinyal genlikleri iki sinyal tipi arasında karşılaştırılabilir olsa da, dalga formu süresi ve morfolojisi, alt analizler için güvenilir ayırt edici kriterlerdir. Tüm elektrofizyolojik değerler amplifikasyon sonrası değerlerdir (×1000). Bielecki ve ark. izinle düzenlenmiştir.²⁴. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu mimari, olağanüstü bir deneysel fırsat yaratmaktadır. trmOC tarafından üretilen yüzme kalp pili (pacemaker) sinyali, şemsiye kasılmalarını kesin bir bire bir oranla tetikler¹⁹ ve izole edilmiş bir rhopaliumun epidermal sap sinirinden hücre dışı olarak kaydedilebilir^13,20. Bu durum, görsel olarak uyarılan motor komutların ve dolayısıyla görsel yönlendirmeli davranışsal tepkilerin, motor efektörlerin kendilerinin tamamen çıkarıldığı bir preparatta elektrofizyolojik yöntemlerle izlenebileceği anlamına gelir¹⁴. İzole rhopalium, böylece diğer sistemlerde elde edilmesi zor olan metodolojik bir orta yol sunar: uzamsal-zamansal görsel uyarıcıların hassas belirlenmesini içeren indirgenmiş bir preparatın sunduğu deneysel kontrolü sağlar ve aynı zamanda davranışla ilişkili nöral çıktının doğrudan, nicel bir okumasını korur. Rahatsız edilmemiş koşullar altında kalp pili sinyalleri 0,5–1 Hz frekansında gerçekleşirken; görsel olarak uyarılan engelden kaçınma tepkileri 2–3 Hz'e yükselişle karakterize edilir ve böylece analiz için net bir sinyal penceresi sağlar¹⁴ (Şekil 1D).

Bu özelliklerin kombinasyonu, izole edilmiş T. cystophora rhopalium preparatını görsel işlemenin ve sensomotor entegrasyonun sistem düzeyinde incelenmesi için oldukça uygun hale getirmektedir. Bu preparat, görüntü oluşturan gözlere ve iyi tanımlanmış görsel güdümlü davranışlara⁴ sahip, yönetilebilir bir sinir sisteminde görsel işlemeyi, sensomotor entegrasyonu veya osilatuvar ağ dinamiklerini araştırmak isteyen araştırmacılar için uygundur. Standart elektrofizyoloji ekipmanı, modifiye edilmiş ticari bir projeksiyon cihazı ve bir diseksiyon mikroskobu gerektiren bu düzenek, uzmanlık gerektiren bir altyapıya sahip olmayan laboratuvarlarda da kurulabilir. Bu preparat için daha önce tanımlanmış olan¹⁴ —eş zamanlı görsel ve mekanosensör stimülasyonun ilişkisel eşleşmesi şeklinde olan— ilişkisel mekanovizüel öğrenme paradigması, burada açıklanan temel kayıt protokolünün bir uzantısı olarak uygulanabilir.

Protokol

Bu çalışma için herhangi bir hayvan etiği onayı gerekmemiştir. Tripedalia cystophora dahil olmak üzere knidaryalar, yalnızca sefalopodlar ve omurgalılar için geçerli olan bilimsel amaçlar için kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 2010/63/EU sayılı Direktif'in kapsamı dışındadır. Bu çalışmada kullanılan hayvanlar, Genetik Kaynaklara Erişim ve Fayda Paylaşımı konusunda Nagoya Protokolü'ne taraf olmayan ABD, Porto Riko, La Parguera açıklarındaki mangrov derelerinden toplanmıştır; bu nedenle önceden bilgilendirilmiş onam veya erişim ve fayda paylaşımı sözleşmesi gerekmemiştir. Tripedalia cystophora, CITES veya herhangi bir geçerli ulusal koruma mevzuatı kapsamında nesli tehlike altında olan veya korunan türler listesinde yer almamaktadır.

1. Sahne ve sinyal zinciri kurulumu

NOT: Tüm donanım bileşenleri ve bağlantıları Şekil 3'te gösterilmiştir. Bu bölüm boyunca Şekil 3'e başvurun. Bu bölümdeki tüm adımlar, hayvanla işlem yapılmadan önce tamamlanmalıdır. Kayıt odası bu aşamada deniz suyu ile doldurulmamıştır.

Şekil 3: İzole rhopalium hücre dışı elektrofizyoloji hazırlığı için bağlantı diyagramı. VI çalıştıran PC ve DAQ (üstte, gri), üç sinyal zincirinin tamamı için ortak entegrasyon merkezi görevi görür. Elektrofizyoloji zinciri (mavi): Yüzme pacemaker sinyalleri, bir vakum elektrodu (~250 kΩ serbest uç, ~1 MΩ bağlı) ve banyoya uygulanan Ag/AgCl referans pelet elektrot aracılığıyla epidermal stalk sinirinden (EN) kaydedilir; EXT-10-2F headstage (×10) ve ana amplifikatör (×100, toplam ×1000) ile yükseltilir, bant geçiren (HP: 1 Hz, LP: 500 Hz) ve 50/60 Hz notch filtrelemeden geçirilir, osiloskop üzerinden izlenir ve DAQ tarafından alınır. Görsel uyaran zinciri (kırmızı): Bir DAQ TTL darbesi, modifiye edilmiş bir PC faresi (TTL faresi) aracılığıyla uyaran slayt gösterisini ilerletir ve DLP projektörü (modifiye edilmiş, bikonveks lens), uyaranı alt lens gözünün (LLE) önündeki kayıt odasının eğimli ekran duvarına yansıtmak için sürer. Zamanlama doğrulama zinciri (yeşil): Bir fotodiyot, bilgisayar ekranındaki, uyaran başlangıcında beyazdan siyaha dönen ve bitişte tekrar beyaza dönen siyah-beyaz gösterge karesini izler; bir Arduino Uno bu sinyali, DAQ tarafından doğrulanmış uyaran penceresi olarak kaydedilen bir TTL darbesine dönüştürür. RNS: rhopalial sinir sistemi; ULE: üst lens gözü; LLE: alt lens gözü; EN: epidermal stalk siniri. Tüm genlik değerleri amplifikasyon sonrası (×1000) değerlerdir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Kayıt odası kurulumu
   1. Preparatı, tutma mikropipet ucunu ve kayıt elektrodu ucunu barındırabilecek yeterli iç boyutlara sahip bir kayıt odası tasarlayın veya 3D yazıcı ile üretin.
      NOT: Fonksiyonel açıdan kritik tasarım özellikleri; rhopalium'u örtü lam kenarında, projeksiyon ekranından 2 mm uzaklıkta konumlandıran örtü lam çıkıntısı ile alt lensli gözdeki görsel uyaranın açısal altensini (angular subtense) birlikte belirleyen ekran boyutlarıdır (16 mm × 12 mm, 60° eğimli). Burada açıklanan odanın taban alanı 30 mm × 30 mm ve duvar kalınlığı yaklaşık 5 mm'dir. Teknik çizimler Şekil 4'te sunulmuştur.
   2. Roth 20 mm × 26 mm hemositometre örtü lamını kayıt odasının örtü lam çıkıntılarına yerleştirin. Örtü lam, negatif kaldırma kuvveti sayesinde yerinde durur ve yapışkanlı sabitleme gerektirmez.
   3. Kayıt odasını M6 geçiş deliklerini kullanarak mikroskop tablasına monte edin. Projekte edilen görüntünün kayıt odasının projeksiyon ekranı duvarı üzerine hassas şekilde hizalanmasını kolaylaştırdığı için bir x-y-z translasyon tablası önerilir.
   4. Kayıt odası akış kanallarının giriş ve çıkış portlarını (Şekil 4A), 28 °C'de su sirkülasyonu yapan sıcaklık kontrollü bir su banyosuna bağlayın.
      NOT: Kayıt odası sıcaklığı deney boyunca 28–30 °C arasında tutulmalıdır.
2. Optik konfigürasyon (Şekil 3, görsel uyaran zinciri)
   DİKKAT: Projektör çıktısına, özellikle nötr yoğunluk filtreleri takılmadan önce (Bölüm 4) doğrudan bakmayın. Üreticinin lens sisteminin çıkarılması, yerleşik ışık zayıflatmasını ortadan kaldırır ve göz yaralanmasına neden olabilir.
   1. Üreticinin lens sistemini projektörden çıkarın.
   2. Projekte edilen görüntüyü kayıt odasının projeksiyon ekranı duvarına odaklamak için projektör çıkış açıklığının önüne tek bir bikonveks lens (f = 30 mm) monte edin.
   3. Projektörü, projekt edilen görüntü kayıt odasının projeksiyon ekranı duvarında odaklı olacak ve ekran boyutlarını (16 mm × 12 mm) dolduracak şekilde hizalayın.
      NOT: Nötr yoğunluk filtreleri bu aşamada yerleştirilmez. Uygun filtre gücü, Bölüm 4'teki biyolojik kalibrasyon sırasında ampirik olarak belirlenir.
3. Sinyal zinciri montajı (Şekil 3, elektrofizyoloji ve zamanlama doğrulama zincirleri)
   1. Elektrot tutucuyu EXT-10-2F amplifikatörü ile birlikte verilen kafa katı (headstage) koluna bağlayın ve kafa katı kolunu bir MM33 mikromanipülatöre sabitleyin.
   2. Kafa katını ana amplifikatöre bağlayın. Kafa katı kazancı ×10'dur. Ana amplifikatör kazancını ×100'e ayarlayarak toplamda ×1000'lik bir amplifikasyon sağlayın.
   3. Amplifikatör çıkışını bir analog-dijital dönüştürücünün (DAQ) analog giriş kanalına bağlayın.
   4. DAQ'yı USB üzerinden LabVIEW (versiyon 2018 veya benzeri) çalıştıran bilgisayara bağlayın.
   5. Arduino Uno TTL çıkışını DAQ'nın özel bir analog giriş kanalına bağlayın.
   6. Fotodiyotu bilgisayar ekranındaki siyah beyaz gösterge karesinin üzerine yerleştirin (adım 1.4.2). Fotodiyodun pozitif terminalini Arduino Uno analog giriş pini A0'a, negatif terminalini ise toprağa bağlayın. Fotodiyodu izleme ve TTL çıkış eşik mantığını uygulayan Arduino taslağı ek materyal olarak sunulmuştur (Ek Dosya 1).
4. Uyaran geometrisi tasarımı (Şekil 3, görsel uyaran zinciri)
   1. Görsel uyaranı sunum yazılımında, bir mangrov destek kökü engelini taklit eden, beyaz arka plan üzerinde hareket eden dikey gri bir çubuk olarak tasarlayın. Arka planı maksimum beyaz olarak ayarlayın.
      NOT: Çubuğun beyaz arka plana göre gri seviyesi, uyaranın kontrastını belirler ve Bölüm 4'teki ışınım karakterizasyonu sırasında saptanır. Çubuk, alt lensli gözün görsel açısının 30°'sini kapsamalı (görsel alanın merkezinde ölçülmüş) ve görsel alanın tüm genişliği boyunca 10° s^-1 hızla hareket ederek her zaman görsel alan içinde kalmalıdır. Projekt edilen bir engelin görsel açısı şu formülle belirlenebilir:
      
      burada α görsel açı, a görüntü özelliğinin genişliği ve b alt lensli gözden ekrana olan mesafedir. Çubuğun hareketi, ayrı slaytlar dizisi olarak değil, tek bir slayt içindeki çubuk nesnesine uygulanan tek bir sürekli nesne animasyonu (örneğin, Keynote'un "Taşı" efekti) şeklinde uygulanır. Bu animasyonu uygulayan temsili bir uyaran dosyası ek materyal olarak sunulmuştur (Ek Dosya 2). Çubuk genişliği ve hızı fiziksel birimler yerine görsel açıyla belirtildiğinden, sunum yazılımına animasyonun nesne boyutu ve süresi olarak girilmeden önce, kayıt odasının spesifik çalışma mesafesi ve ekran boyutlarına dayanarak yukarıdaki denklem kullanılarak milimetre ve mm/s'ye dönüştürülmelidir.
   2. Slaydın bir köşesine, çubuk hareketinin başlangıcıyla eşzamanlı olarak beyazdan siyaha dönen ve uyaran sonunda tekrar beyaza dönen küçük bir siyah beyaz gösterge karesi ekleyin. Adım 3.3'teki uyaran zamanlama doğrulaması için bu kareyi bilgisayar ekranında fotodiyodu kullanarak izleyin.
      NOT: Siyah beyaz gösterge karesi, sunum sırasında bilgisayar ekranında görünmesi için slaydın bir parçası olması gerektiğinden, zorunlu olarak kayıt odası ekranındaki projekt edilen görüntü içinde de görünür. Ancak kare, bilgisayar ekranında sadece fotodiyodun alıcı alanını dolduracak şekilde boyutlandırılmıştır. Oda ekranına projekt edildiğinde, alt lensli göz tarafından belirgin bir görsel özellik olarak çözümlenemeyecek kadar küçüktür ve genel ekran parlaklığına katkısı ihmal edilebilir düzeydedir ve ışık AÇIK/KAPALI yanıtlarını başlatmaz^4,13,20.
   3. Sunum yazılımı slaytlarını otomatik veya manuel bir tetikleyici kullanarak ilerletin.
      1. Seçenek A (otomatik): Standart bir PC faresini, DAQ çıkışından alınan kısa bir 5 V TTL darbesinin sağ tıklama sinyalinin yerini alacağı şekilde modifiye ederek bir transistör-transistör-mantık (TTL) faresi oluşturun. TTL faresini USB üzerinden sunum bilgisayarına bağlayın. Sunum yazılımını, sağ tıklama girişiyle slaytları ilerletecek şekilde yapılandırın.
      2. Seçenek B (manuel): Slayt ilerlemesini hedeflenen uyaran başlangıcında manuel olarak tetikleyin. Analiz için kesin zamanlama kaydı olarak tetikleme sinyalinin kendisi değil, Arduino ile doğrulanmış uyaran penceresi (Kanal 3) kullanıldığından (adım 6.2.1), manuel tetikleme zamanlama doğruluğunu bozmaz; ancak veri toplama sırasında operatörün hassas zamanlaması gerektirir ve otomatik seçeneğe göre daha az kullanışlıdır.

Şekil 4: İzole rhopalium preparatı için kayıt odası. (A) Üst görünüş şeması. Kayıt odası, giriş ve çıkış portları (OD 4.2 mm, ID 2.5 mm) belirtilmiş olan su ceketli sıcaklık kontrolü için geçişli akış kanalları ile çevrelenmiştir. Lamet çıkıntıları, odanın her iki iç duvarı boyunca boylamsal olarak uzanarak hemositometre lamelini oda yüksekliğinin ortasında destekler. M6 geçiş delikleri, odanın mikroskop tablasına sabitlenmesi için montaj noktaları sağlar. Genel boyutlar: 60 mm × 60 mm. (B) Boyutların belirtildiği yan görünüş şeması. Kayıt odasının iç yüksekliği 12 mm ve üst genişliği 37 mm'dir. Odanın bir duvarı, alt lens gözünün optik ekseniyle hizalanmak için dikey düzleme göre 60° eğimli bir projeksiyon ekranı oluşturur. Lamet çıkıntısı, rhopaliumu projeksiyon ekranına bakan lamel kenarına konumlandırır. Gösterilen 2 mm'lik çalışma mesafesi, bu protokolde açıklanan spesifik oda, ekran ve projektör konfigürasyonunu yansıtmaktadır; bu tasarımı farklı donanımlara uyarlayan okuyucular, adım 1.4.1'deki denklemi kullanarak kendi kurulumları için uygun bir çalışma mesafesini yeniden hesaplamalıdır. Sıcaklık kontrolü için olan geçişli akış kanalları kayıt odası tabanı içinde yer alır ve preparatla temas etmez. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Elektrot üretimi

NOT: Hücre dışı vakum elektrotları, vakum yapışması ve elektriksel potansiyellerin kaydına uygun bir açıklık oluşturmak için uçları daraltılmış cam kılcal tüplerden oluşur. Cam kılcal tüp, yalnızca uçtaki potansiyellerin kaydedilmesini sağlayarak elektriksel izolasyon görevi görür. Kılcal tüpe yerleştirilen gümüş bir tel, amplifikatöre bağlanır. Bu konfigürasyon, banyoya yerleştirilen bir referans elektroda karşı ölçülen, elektrot ucundaki pacemaker hücre gruplarından gelen elektriksel potansiyelleri yakalayarak çoklu ünite kayıtları sağlar. Elektrotlar, kayıt oturumundan önce, kullanım gününde hazırlanmalıdır. Saklanan elektrotların uçları tıkanmaya meyillidir; bu durum deniz suyunun kılcal tüpe çekilmesini engeller ve elektrodu işlevsiz hale getirir. Çekilmiş cam kılcal tüpler keskin ve kırılgan uçlara sahiptir. Delinme yaralanmalarını önlemek için hazırlama sırasında dikkatli olunmalı ve kırılan, reddedilen veya kullanılmış kılcal tüpler uygun bir tıbbi atık (kesici-delici alet) konteynerine atılmalıdır.

1. Cam kılcal tüpün çekilmesi
   1. Bir borosilikat cam kılcal tüpü (1,16 mm ID × 2,00 mm OD × 80 mm L) mikro pipet çekicisine yerleştirin.
   2. Aşağıdaki çekme programını uygulayın: Satır 1 (×1): heat 535, pull 0, velocity 12, time 200, pressure 600, ramp 540. Satır 2–4 (×3): heat 532, pull 0, velocity 12, time 100.
      NOT: Bu parametreler kullanılan cihaza, cama ve filamanlara özgüdür; farklı bir ünitede veya filaman aşınmasından sonra ayarlanmaları gerekebilir; bunları sabit bir özellikten ziyade bir başlangıç noktası olarak değerlendirin.
   3. Çekilmiş elektrodu dikkatlice çıkarın ve mekanik hasarı önlemek için ucu yukarı bakacak şekilde saklayın.
2. Elektrot ucunun parlatılması
   1. Kılcal eksene dik, düzgün ve vakum sızdırmaz bir yüzey oluşturmak için ucu parlatın. Aşağıda sunulan iki seçeneğe bakın; Seçenek A (mikroforge) önerilir.
   2. Seçenek A: Mikroforge ile parlatma (önerilen)
      1. Çekilmiş elektrodu bir mikroforge'a monte edin.
      2. 600× büyütme altında (40× objektif, 15× oküler), ucu ısıtma filamanının yakınına konumlandırın.
      3. Açıklık yaklaşık 250 kΩ direnç (doku ile temas halindeyken ~1 MΩ'a karşılık gelir) ölçene kadar ucu ısıtın ve parlatın. 600× büyütmede bu, oküler retikül ölçeğindeki yaklaşık üç artışa karşılık gelir.
         NOT: Elektrot direncini ölçmek için, elektrot deniz suyuyla doldurulduktan sonra, BNC çekirdeği (elektrodun gümüş teline bağlı) ile banyo referans (Ag/AgCl pellet) elektrodu arasına bir multimetre bağlayın. Sinyal kalitesinin elektrot yeterliliği için birincil kriter olduğu standart görsel olarak uyarılmış kayıtlarda (adım 6.1.5) elektriksel direnç ölçümü gerekli değildir; bu işlem, hesaplanmış akım iletimi gerektiren ve bu protokolün kapsamı dışında olan ilişkisel öğrenme paradigması için bu hazırlık kullanıldığında gerekli hale gelir¹⁴.
      4. Elektrodu mikroforge'dan çıkarmadan önce tamamen soğumasını bekleyin.
   3. Seçenek B: Mikroforge olmadan manuel parlatma
      DİKKAT: Bu adımda açık alev (etanol brülörü) kullanılır. Yanıcı maddeleri alevden uzak tutun ve standart laboratuvar açık alev önlemlerini uygulayın.
      1. Cam eriyip ucu ince bir damlacık şeklinde kapatana kadar çekilmiş kılcal ucu kısaca bir etanol brülörünün alevinde tutun.
      2. Kapatılmış ucun tamamen soğumasını bekleyin.
      3. İnce bir zımpara kağıdına (1200 grit) bir damla deiyonize su damlatın ve kılcal tüpü kağıt yüzeyine dik tutun.
      4. Saat yönünde ve saat yönünün tersinde sırasıyla küçük dairesel hareketler kullanarak ucu zımparalayın.
      5. Kılcal etkiyle uçtan küçük bir miktar cam kalıntılı su çekilene kadar dikkatlice zımparalamaya devam edin.
      6. Kılcal tüpün karşı ucuna bir kauçuk tüp takın ve bunu bir şırıngaya bağlayın.
      7. Cam kalıntılarını dışarı atmak için uçtan deiyonize suyu çekmek üzere hafif bir vakum uygulayın.
      8. Kalıntılar temizlenmezse, kısa bir süre daha nazikçe zımparalayın ve yıkama adımını tekrarlayın.
         NOT: Tamamlanmış uçtan hedef akış hızı, nazikçe uygulanan vakum altında 10 saniyede yaklaşık 1 cm su sütunudur. Uç üretimi başarısı, ucun görünümüne göre değil, kayıt sonucuna (düşük gürültülü, yüksek genlikli sinyal) göre tanımlanır. Her iki parlatma seçeneği için de üretilen elektrotların yaklaşık %40'ı-50'si bu tür kayıtlar sağlar, ancak kısıtlayıcı faktör ikisi arasında farklılık gösterir. Mikroforge parlatması için (Seçenek A) başarısızlık çoğunlukla çekme adımında (adım 2.1) ortaya çıkan ve sonraki ısı parlatmasının tam olarak düzeltemediği düzensiz gözenek geometrisinden kaynaklanır. Manuel parlatma için (Seçenek B) başarı öncelikle operatör becerisine bağlıdır; en yaygın başarısızlık, aşırı zımparalamadan kaynaklanan aşırı büyük bir gözenektir. Pürüzsüz, doğru boyutlu, yuvarlak bir gözenek yüksek kaliteli bir kayıt olasılığını önemli ölçüde artırır ancak bunu garanti etmez; nihai olarak önemli olan tek kriter fonksiyonel sonuçtur.
3. Elektrodun monte edilmesi
   1. Parlatılmış kılcal tüpü, Ag/AgCl (gümüş/gümüş klorür) telinin cam kılcal içinde uzatıldığından ve kıvrılmadığından emin olarak elektrot tutucusuna yerleştirin ve EXT-10-2F amplifikatörü ile birlikte verilen headstage koluna monte edin. Headstage kolunu MM33 mikromanipülatörüne sabitleyin.
      NOT: Gümüş tel klorürlenmemişse, hem elektrodun gümüş telini hem de ayrı bir katı gümüş elektrodu, yalıtımlı kablolarla 12 V DC kaynağına bağlanmış 2 M KCl çözeltisine daldırarak elektrokimyasal olarak klorürleyin. Akımı yaklaşık 2 dakikalık aralıklarla uygulayın ve her tur arasında teli görsel olarak kontrol edin; tel görünür şekilde karardığında (genellikle toplam 5 dakika içinde) yeterince klorürlenmiş demektir. Klorürlemeden sonra deiyonize su ile iyice durulayın. Klorürlenmemiş bir tel, büyük ve kararsız bir DC ofsetine neden olabilir.
      DİKKAT: KCl çözeltisinde elektrolitik klorürleme klor ve hidrojen gazı üretir. Havalandırmalı bir alanda gerçekleştirin. Kullanılmış KCl klorürleme çözeltisini kurumsal tehlikeli atık kılavuzlarına uygun olarak bertaraf edin.
   2. Kayıttan hemen önce, iç çözelti gümüş telin yarısına ulaşana kadar dolu kayıt odasından kılcal tüpe doğrudan deniz suyu çekerek elektrodu doldurun. Doldurma prosedürü için adım 3.1'e bakın.
      NOT: Tutucu mikro pipetler, kayıt elektrotlarının optik veya elektriksel özelliklerini gerektirmez. Üretim sırasında (adım 2.2) aşırı uç çapı (direnç 250 kΩ'ın altında) veya merkez dışı uç geometrisi nedeniyle reddedilen elektrotlar bu amaç için uygundur ve saklanmalıdır. Özel tutucu mikro pipetler üretmeye gerek yoktur.

3. Sistem doğrulaması

Bu bölüm, deneysel hazırlık aşamasına geçmeden önce tüm kayıt sisteminin — elektrot, sinyal zinciri, uyarı iletimi ve zamanlama doğrulaması — doğru şekilde çalıştığını onaylar. Tüm sinyal zinciri Şekil 3'te gösterilmektedir. Devam etmeden önce tüm bağlantıların yerinde olduğunu doğrulayın.

1. Kamar dolumu ve elektrot hazırlığı
   1. Kayıt kamarasını, kültür tankından alınan 0.20 µm filtrelenmiş deniz suyu ile doldurun. Bu işlem, kültür ortamı ile kayıt kamarası arasındaki kimyasal bileşim sürekliliğini sağlayarak, rhopaliumun pacemaker aktivitesini veya preparat canlılığını etkileyebilecek yabancı bileşiklere veya su kimyasındaki değişikliklere maruz kalmasını önler.
   2. Kayıt vakum elektrodunu, iç çözelti gümüş telin yarısına ulaşana kadar deniz suyunu doğrudan kayıt kamarasından kılcal boruya çekerek doldurun. Tutucu mikropipeti, kristale vakumla yapışmayı sağlayacak miktarda kayıt kamarası deniz suyu ile doldurun.
   3. Kayıt banyosuna bir Ag/AgCl (gümüş/gümüş klorür) sinterlenmiş pelet elektrot yerleştirin ve bunu headstage'in referans girişine bağlayın.
2. Topraklama ve gürültü doğrulaması
   DİKKAT: Bu kurulum, elektrikli ekipmanları deniz suyuna çok yakın bir konumda çalıştırır. Tüm elektrik bağlantılarını ve ekipmanları kamardan ve olası dökülmelerden uzak tutun ve ıslak ortamlarda çalışma ile ilgili kurumsal elektrik güvenliği uygulamalarını takip edin.
   1. Toprak döngülerini önlemek için tüm cihazları tek bir ortak toprak noktasına bağlayın (yıldız topraklama konfigürasyonu).
   2. Sinyali osiloskop üzerinden izleyin. İşleme devam etmeden önce baz çizgisinin temiz ve gürültüsüz olduğunu doğrulayın.
      NOT: Hücre dışı kayıtlar için laboratuvarımızda genellikle Faraday kafesleri kullanılmaz; çünkü titiz bir yıldız topraklamanın, elektriksel (50/60 Hz) gürültüyü gidermede fiziksel korumadan daha etkili olduğu tutarlı bir şekilde kanıtlanmıştır.
3. Zamanlama doğrulama zinciri
   1. LabVIEW sanal cihazını (VI) (ek materyal olarak sağlanan Supplementary File 3) çalıştırın. VI'yı sistem validasyonu sırasında çalıştırın. Bu işlem, stimülasyon oluşturmayı tetiklemek için TTL faresine TTL darbesi gönderir ve deneysel preparat tanıtılmadan önce tüm kanalların —elektrofizyolojik sinyal, LabVIEW TTL ve Arduino TTL— doğru şekilde alındığını doğrulamanıza olanak tanıyan bir .txt çıktı dosyası oluşturur.
      NOT: LabVIEW tarafından kaydedilen TTL komutu ile Arduino tarafından doğrulanan stimülasyon başlangıcı arasındaki gecikme, kayıtlar arasında öngörülemez şekilde değişir ve bu aşamada çözülmez; bunun yerine analiz sırasında (adım 7.2.1) her kayıt için ayrı ayrı belirlenir ve düzeltilir.
   2. DAQ'dan gelen TTL darbesinin stimülasyon oluşturmayı doğru şekilde tetiklediğini ve görsel stimülasyonun tasarlandığı şekilde projeksiyon ekranına iletildiğini doğrulayın.
   3. Arduino Uno'nun bilgisayar ekranındaki siyah ve beyaz gösterge karesindeki değişikliği tespit ettiğini ve DAQ'ya bir TTL darbesi gönderdiğini doğrulayın.
      NOT: Arduino Uno, fotodiyot voltajını analogRead(A0) üzerinden örnekler. Örneklenen değer, ampirik olarak belirlenen bir eşiğin (bu kurulumda 0–1023 analogRead aralığının 61'i) altına düştüğünde, dijital çıkış pini 5, 5 V'a (TTL yüksek) ayarlanır; değer tekrar eşiğin üzerine çıktığında çıkış 0 V'a döner. Bu eşik kurulum bağımlıdır ve her ekran ve ortam aydınlatma konfigürasyonu için yeniden kalibre edilmelidir.
   4. Arduino Uno'dan gelen stimülasyon penceresi TTL'sinin, elektrofizyolojik kanal ve VI dijital TTL kanalı ile birlikte LabVIEW VI tarafından oluşturulan .txt dosyasına doğru şekilde kaydedildiğini onaylayın.
      NOT: Ham fotodiyot çıktısı DAQ girişi için çok gürültülü olduğundan, fotodiyot sinyali DAQ tarafından doğrudan kaydedilmez. Arduino Uno tarafından temiz bir TTL darbesine dönüştürülmesi, güvenilir ve düşük gürültülü bir zamanlama sinyali sağlar. Fotodiyot izleme ve TTL çıkışını uygulayan Arduino taslağı ek materyal olarak sağlanmıştır (Supplementary File 1). 1 kHz Arduino yenileme hızı, DAQ örnekleme hızıyla eşleşerek hiçbir zamanlama bilgisinin kaybolmamasını sağlar.
   5. Tüm kanallar doğrulandıktan sonra, Bölüm 4 hazırlığı için kayıt kamarasını boşaltın ve elektrodu kamaradan çıkarın.

4. Işık kalibrasyonu ve kontrast belirleme

NOT: Bu bölüm, alt lens gözünün görsel stimülasyonu için doğru optik konfigürasyonu kurar ve kontrast hesaplamaları için gerekli olan ışınım değerlerini belirler. Biyolojik kalibrasyon adımı için feda edilebilir bir rhopalium kullanılır. Işınım karakterizasyonu, oda içerisinde herhangi bir hazırlık yapılmadan gerçekleştirilir. Bu bölüm zaman alıcıdır. Biyolojik kalibrasyon, tüm gri seviyelerdeki ışınım karakterizasyonu ve kontrast hesaplamaları, kayıt gününden önce ayrı bir oturum gerektirebilir. Biyolojik kalibrasyon için kullanılan rhopalium bu bölümden sonra atılmalı ve kayıtlar için kullanılmamalıdır.

1. Biyolojik kalibrasyon
   1. Kayıt odasını, kültür tankından alınan 0.20 µm filtrelenmiş deniz suyu ile doldurun.
   2. Bölüm 5'te açıklanan prosedürü takip ederek bir rhopalium izole edin ve kayıt odasına aktarın.
   3. Tutma mikropipetini kullanarak rhopaliumu, projeksiyon ekranına bakacak şekilde lam kenarına yerleştirin (Şekil 1D).
      NOT: Rhopaliumun lam yüzeyi yerine lam kenarına yerleştirilmesi iki amaca hizmet eder: birincisi, lam kenarı projeksiyon ekranından sabit ve tekrarlanabilir bir mesafeye yerleştirilebilir, böylece tüm kayıtlar boyunca tutarlı bir çalışma mesafesi sağlanır; ikincisi, alt lens gözünün ekranı görmek için cam lamdan bakması gerekmez, böylece görsel uyaranın açısal distorsiyonu önlenir. Lam kenarının projeksiyon ekranına olan mesafesi, alt lens gözündeki tüm projeksiyon uyaranlarının açısal altensini belirler ve tüm kayıtlar boyunca sabit tutulmalıdır. Bu protokolde açıklanan odada bu mesafe 2 mm'dir.
   4. Adım 6.1'de açıklanan prosedürü takip ederek kayıt elektrodunu epidermal sap sinirine tutturun.
   5. Görsel alanın tüm genişliği boyunca hareket eden maksimum kontrastlı bir engel (c ≈ 1.0, beyaz arka plan üzerinde siyah çubuk) sunun ve pacemaker sinyal yanıtını değerlendirin (Şekil 1C; Şekil 5).
      NOT: Fotometrik ölçümler, kullanılan projeksiyon sisteminin en parlak ve en karanlık gri seviyeleri arasında elde edilebilecek maksimum kontrastın c ≈ 0.99 olduğunu doğrulamıştır; bu durum uyaran tasarımının bir sınırlamasından ziyade projektörün siyah noktasındaki kalıntı luminansı yansıtmaktadır; bu, bu protokol boyunca maksimum kontrastlı uyaranlar için kullanılan yaklaşık notasyonun (c ≈ 1.0) temelidir.
      NOT: (KRİTİK) Tatmin edici bir yanıt; engelin ön kenarı görsel alanın merkezine ulaştığında, uyaran sunumunun tamamı boyunca sürmek yerine, kısa ve zamana bağlı bir burst şeklinde ortaya çıkan, 2 Hz'in üzerinde güçlü bir pacemaker sinyal frekansı artışından oluşur ve bu burst sırasında yaklaşık 5–15 pacemaker sinyali meydana gelir (Şekil 5B). Hem frekans hem de sinyal sayısı bakımından yanıt gücü, uyaran kontrastı ile orantılıdır; bu nedenle maksimum kontrastlı bir uyarana (c ≈ 1.0) verilen yanıt mümkün olduğunca güçlü olmalıdır, çünkü bu durum doğru LLE oryantasyonunu, elektrot bağlantısını ve projektör kalibrasyonunu yansıtır ve düşük kontrast seviyelerindeki yanıtları ayırt etmek için yeterli dinamik aralığı sağlar. Bu, fotoreseptörlerin dinamik aralıkları içinde çalıştıklarını ve aşırı ışınım nedeniyle doyuma ulaşmadıklarını doğrular. 0.5–1 Hz'de spontan pacemaker aktivitesi gösteren sağlıklı bir preparasyona rağmen pacemaker frekansında herhangi bir modülasyon gözlemlenmezse, aşırı ışınım kaynaklı fotoreseptör doyumu şüphesi oluşmalıdır. Lens düzeneğine bir nötr yoğunluk filtresi (örneğin, gerektiğinde Thorlabs NE01A, optik yoğunluk = 0.1) yerleştirin ve kalibrasyonu tekrarlayın. Güçlü bir pacemaker frekans yanıtı elde edilene kadar zayıflatmayı kademeli olarak artırın. Sonraki tüm kayıtlar bu filtre konfigürasyonu yerindeyken gerçekleştirilmelidir.
   6. Tatmin edici bir biyolojik yanıt elde edildiğinde, nötr yoğunluk filtresi konfigürasyonunu kaydedin. Bu konfigürasyon, bu optik kurulumla yapılacak sonraki tüm kayıtlar için sabittir.
   7. Rhopaliumu kayıt odasından çıkarın ve atın. Biyolojik kalibrasyon için kullanılan rhopalium, kalibrasyon prosedürü sırasında geçen süre nedeniyle kayıtlar için kullanılamaz.
2. Işınım karakterizasyonu
   1. Kayıt odasını boşaltın ve projeksiyon ekranı yüzeyinin kuru olduğundan emin olun. Spektrometre fiberini doğrudan projeksiyon ekranı yüzeyine ve yüzeye dik olacak şekilde yerleştirin.
      NOT: Çoğu spektrometre optik fiberi su geçirmez değildir. Fiber ekrana yerleştirilmeden önce oda boş ve ekran yüzeyi kuru olmalıdır.
   2. Sunum yazılımını kullanarak, ölçülecek her bir gri seviyesiyle projeksiyon ekranını homojen şekilde aydınlatın ve spektrometre kullanarak ışınımı (350–700 nm) kaydedin.
      NOT: Spektrometrenin yüksek ışınım seviyelerinde aşırı pozlanma ihtimali olduğu için, maksimumdan minimum gri seviyeye (beyazdan siyaha) doğru çalışılması önerilir. Hem aşırı pozlanmayı hem de düşük pozlanmayı önlemek için gri seviye aralığının farklı noktalarında entegrasyon süresinin yeniden kalibre edilmesi gerekebilir. Tüm gri seviyeler boyunca yürütülen bu işlem zaman alıcıdır ve buna göre planlanmalıdır.
   3. Ölçülen her bir ışınım değerini, alt lens gözünde bulunan T. cystophora 500 nm opsininin absorpsiyon spektrumuna göre düzeltin^21,22.
      NOT: Opsin düzeltmesi, her dalga boyunda ölçülen ışınımın, λmax 500 nm için Govardovskii görsel pigment şablonundaki ilgili reseptans katsayısı ile çarpılması²¹, ardından tek bir opsin düzeltmeli ışınım değeri elde etmek için ölçülen dalga boyu aralığı boyunca toplanmasıyla gerçekleştirilir. Ham spektral ışınım verileri elde edildikten sonra bu hesaplama herhangi bir standart hesap tablosu yazılımında yapılabilir.
   4. Düzeltilmiş ışınım değerlerini kullanarak her bir gri seviyenin kontrastını hesaplayın:
      
      burada I_w beyaz arka planın opsin düzeltmeli ışınımı, I_g ise gri veya siyah çubuğun opsin düzeltmeli ışınımıdır. Kontrast değerleri 0 (çubuğun arka plandan ayırt edilememesi) ile 1 (maksimum kontrast, beyaz arka plan üzerinde siyah çubuk) arasında değişir.
   5. Hesaplanan kontrast değerlerinden, deneysel protokol için gerekli kontrast seviyelerine karşılık gelen gri seviyeleri belirleyin. Sunum yazılımı slayt gösterisini bu gri seviyelerle güncelleyin.
      NOT: Kontrast, ışınım değerlerinin bir oranıdır ve bu nedenle tüm gri seviyeler boyunca mutlak lamba çıkışındaki homojen değişikliklere karşı duyarsızdır. Optik konfigürasyon değişmediği sürece, kayıt oturumları arasında ışınım karakterizasyonunun tekrarlanmasına gerek yoktur. Bununla birlikte, oturumlar arasında uyaran yanıtında beklenmedik değişiklikler gözlemlenirse, kullanıcıların ışınım stabilitesini doğrulamaları önerilir.

<
Şekil 5: Tripedalia cystophora'nın izole edilmiş rhopaliumundan alınan swim pacemaker sinyallerinin temsili hücre dışı kayıtları. (A) Uzatılmış bir kayıt oturumu sırasında aşamalı elektrot sızdırmazlık kaybı örneği. Pacemaker sinyal genliği yaklaşık 200–250 s'de azalmaya başlar; bu durum elektrot ucu ile epidermal stalk siniri arasındaki elektriksel temasın bozulmasını yansıtır ve sinyal yaklaşık 580–600 s'de tamamen kaybolur. Hem sinyal genliğinin hem de arka plan gürültüsünün paralel olarak azalması, sızdırmazlık kaybının karakteristik özelliğidir. (B) DTT üzerinde görsel olarak uyarılmış bir engelden kaçınma yanıtının temsili kaydı. Gri gölgeli alan, Arduino TTL sinyali ile tanımlanan ve yüksek kontrastlı (c = 0.80) dikey bir çubuk engelin alt lens göz görsel alanının tüm genişliği boyunca hareket ettirildiği stimulus penceresini belirtir. Pacemaker sinyal frekansı, görsel olarak uyarılmış bir engelden kaçınma yanıtıyla uyumlu olarak stimulus penceresi sırasında belirgin şekilde artar ve stimulus sona erdikten sonra bazal frekansa geri döner. Stimulus penceresi dışında meydana gelen spontan pacemaker sinyalleri beklenen durumlardır ve görsel olarak uyarılmış yanıtlar teşkil etmez. Paneller arasındaki y-ekseni ölçeği farkının, gösterilen farklı kayıt kalitelerini yansıttığını ve sinyal gücünde bir fark olduğu anlamına gelmediğini unutmayın; hücre dışı elektrofizyolojide sinyal genliği, fizyolojik yanıt büyüklüğünden ziyade elektrot sızdırmazlık kalitesine bağlıdır. Tüm değerler amplifikasyon sonrası değerlerdir (×1000). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. Rhopalium izolasyonu ve transferi

NOT: Bu prosedür, her bir rhopalium gerektiğinde uygulanır: bir kez Bölüm 4'teki biyolojik kalibrasyon için kurban edilecek bir rhopalium ile ve ardından Bölüm 6'da kullanılan her bir deneysel rhopalium için. Her seferinde, hayvana dokunulmadan önce tüm donanım tamamen monte edilmeli ve doğrulanmalıdır. Deneysel rhopalia sayısı, deneysel tasarım tarafından belirlenir.

1. Ucu yaklaşık 8 mm çapında bir açıklık sağlayacak şekilde kesilmiş tek kullanımlık plastik bir transfer pipeti kullanarak, kültür tankından tek bir hayvanı, kültür tankından alınan 0.20 µm filtrelenmiş deniz suyu içeren 35 mm'lik bir Petri kabına aktarın.
2. Hayvan kap tabanına yapışıp hareketsiz kalana kadar, ancak kurumayacak şekilde fazla deniz suyunu uzaklaştırın.
3. İnce makaslar (Vannas makasları, 0.025 mm × 0.015 mm bıçak) kullanarak, rhopaliumu şemsiyeye bağlayan sapı, rhopalium bağlantı noktasından ölçüldüğünde sap uzunluğunun yaklaşık üçte ikisi hizasında (yani rhopaliumun distalinden) kesin. Kesme işleminden hemen sonra, Petri kabını kültür tankından alınan 0.20 µm filtrelenmiş deniz suyu ile yeniden doldurun.
   UYARI: Vannas makasları son derece keskindir. Yaralanmaları önlemek için diseksiyon sırasında dikkatle kullanın.
   NOT: Rhopalium, kesme işleminin ardından rhopalium nişinin içine çekilebilir. Petri kabının filtrelenmiş deniz suyu ile yeniden doldurulması, çoğu durumda rhopaliumu yerinden çıkaracaktır. Eğer çıkmazsa, onu nazikçe dışarı atmak için bir Pasteur pipeti kullanın.
   Bir Pasteur pipeti (150 mm) kullanarak, izole edilen rhopaliumu mikroskop tablasında konumlandırılmış elektrofizyoloji kayıt odasına aktarın. (KRİTİK) Aktarım sırasında ve sonrasında rhopaliumun her zaman deniz suyu içinde kaldığından emin olun. Havaya maruz kalmak preparasyona geri döndürülemez şekilde zarar verecektir.
4. Bir transfer pipeti kullanarak hayvanı kültür tankına geri koyun.
   NOT: Tek bir rhopaliumun kaybı, normal kutu denizanası davranışını önemli ölçüde bozmaz; sadece bir rhopaliumu kalan hayvanlar normal beslenme ve ışık huzmesi etkileşim davranışlarını sergilemeye devam eder. Rhopalialar ayrıca, çıkarıldıktan sonraki iki hafta içinde pacemaker sinyalleşmesinin ve normal fotoreseptör yanıtlarının geri kazanımı da dahil olmak üzere tam işlevselliğe yeniden kavuşurlar²³. Hayvan, hiç rhopalium kalmayana kadar sonraki oturumlarda tekrar kullanılabilir. Dört rhopaliumun tamamı çıkarıldığında, hayvan artık yüzme pacemaker sinyalleri veya şemsiye kasılmaları oluşturamaz ve rhopalium dokusunun bertaraf edilmesiyle (adım 6.2.5) uyumlu olarak standart laboratuvar lavabosu yoluyla insani şekilde imha edilir.

6. Kayıt

1. Rhopalium konumlandırma ve elektrot takılması
   1. Kayıt vakum elektrodunu, kayıt odasından doğrudan kapiler içine deniz suyu çekerek, iç çözelti gümüş telin yarısına ulaşana kadar doldurun. Tutucu mikropipeti, kristale vakumla yapışmayı sağlayacak miktarda kayıt odasından deniz suyu ile doldurun.
   2. Tutucu mikropipeti bir mikromanipülatöre yerleştirin. Bağlı bir Luer-lock şırınga aracılığıyla hafif vakum uygulayarak, tutucu mikropipetin ucunu rhopaliumun distal ucundaki kalsiyum sülfat (CaSO₄) kristaline sabitleyin. Kristal, nöral dokuya zarar vermeden sağlam bir mekanik sabitleme noktası sağlar.
   3. Tutucu mikropipeti kullanarak rhopaliumu, projeksiyon ekranına bakan lamel kenarına konumlandırın (Şekil 1D).
      NOT: (KRİTİK) Alt lens gözündeki projeksiyona yansıyan görüntü özelliklerinin açısal alt genişliği (kabul açısı) aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanacağı için, alt lens gözü ile projeksiyon ekranı arasındaki mesafe ölçülmeli ve kaydedilmelidir:
      
      burada α görsel açıyı, a görüntü özelliğinin genişliğini ve b alt lens gözünden ekrana olan mesafeyi temsil eder. 2 mm'lik bir çalışma mesafesinde, 16 mm × 12 mm (g × y) boyutlarındaki bir projeksiyon görüntüsü, alt lens gözünün 170°'lik dairesel görsel alanının yatayda yaklaşık 150°'sini ve dikeyde 120°'sini kaplar. Çalışma mesafesi tüm kayıtlar boyunca sabit tutulmalıdır; çünkü herhangi bir sapma, sunulan uyaranlar için yapılan açısal hesaplamaları geçersiz kılar ve kayıtlar arasında doğrudan karşılaştırma yapmayı engeller.
   4. Rhopalium konumu tutucu mikropipet ile korunurken, ikinci bir mikromanipülatör kullanarak kayıt elektrodunu sapın kesilmiş yüzeyine doğru ilerletin.
      NOT: Epidermal sap siniri, rhopalium bağlantı noktasından halka sinire kadar sapın tüm uzunluğu boyunca boylamasına uzanır¹⁵. Kesilmiş yüzeyde, çatallı epidermal sap sinirinin sinir uçları açığa çıkar ve sapın adoral yüzeyinde —lens gözlerine bakan tarafta— elektrot temasına uygundur (Şekil 2B).
   5. Kararlı bir sinyal elde edilene kadar Luer-lock şırınga ile hafif vakum uygulayın.
      NOT: Sinir uçları kesilmiş yüzeyde her zaman görsel olarak ayırt edilemez. Elektrot ucunu, anatomik işaretçilere dayanarak epidermal sap sinirinin olması beklenen bölgeye yerleştirin ve hafif vakum uygulayın. Uygun elektrot bağlantısı, 0,5–1 Hz beklenen frekansta, tutarlı bir dalga formuna sahip, geniş ve net çözünürlüklü pacemaker sinyallerinin görünmesiyle anlaşılır (Şekil 5). Pacemaker sinyalleri, dalga formu süresi ve morfolojisi temelinde aksiyon potansiyeli benzeri sinyallerden ayırt edilir (Şekil 2C,D)^13,20,24. Sabit pacemaker sinyallerinin görülmesi, sinir temasının görsel onayı değil, doğru elektrot yerleşimi için kesin kriterdir. Sinyal alınamazsa vakumu serbest bırakın, elektrot ucunu kesilmiş yüzeyde hafifçe yeniden konumlandırın ve tekrar uygulayın. Aşırı vakum, ucun doku kalıntılarıyla tıkanması veya sinir ucunun mekanik olarak zarar görmesi riskini taşır. Kayıt sırasında sinyal genliğinin kademeli kaybı ve arka plan gürültüsü, elektrot sızdırmazlığının kaybına işaret eder (Şekil 5A).
   6. Kayıtlara başlamadan önce, elektrot takıldıktan sonra preparasyonun en az 10 dk boyunca uyum sağlamasına izin verin. Bu süre zarfında projeksiyon ekranını beyaz arka planla aydınlatılmış tutun ve gri çubuğu görsel alanın merkezinin dışında, bir kenarda sabit tutun.
      NOT: Uyum sürecine başlamadan önce, tek bir maksimum kontrastlı uyaran (c ≈ 1,0) sunarak preparasyonun yanıt verme yeteneğini doğrulayın; yanıt vermeyen rhopalia veri setinden hariç tutulur. Uyum süreci, elektrot takılmasının neden olduğu mekanik rahatsızlık sonrası preparasyonun stabilize olmasını sağlar. Beyaz ekranın sabit bir çubukla korunması, fotoreseptörlerin görsel stimülasyon sırasında hakim olacak temel koşullara ışık-adapte olmasını ve ilk uyaran sunulmadan önce başlangıç pacemaker bazal frekansının sabitlenmesini sağlar. Bu, uyaran kontrolü için sunum yazılımı kullanmanın ek bir pratik avantajıdır. Uyum sırasında ve kayıtlar arasında ekran içeriği doğrudan görünürdür ve ek programlama gerektirmeden tamamen kontrol edilebilir.
   7. Kararlı bir pacemaker sinyali kurulduğunda, sinyal-gürültü oranını maksimize etmek, sinyal genliğini ve dalga formu morfolojisini korumak için ekstraselüler amplifikatördeki bandpass filtre ayarlarını optimize edin ve etkiyi osiloskop ekranından izleyin. Başlangıç olarak şu ayarları kullanın: yüksek geçiren (highpass) 1 Hz ve düşük geçiren (lowpass) 500 Hz; 50/60 Hz çentik (notch) filtreyi (EXT-10-2F entegre eklentisi) devreye alın. Gözlenen sinyale göre gerektiği gibi ayarlayın.
      NOT: Yüksek geçiren kesim frekansının 1 Hz'in üzerine çıkarılması, pacemaker sinyalinin düşük frekanslı bileşenlerini kademeli olarak zayıflatacak, genliğini azaltacak ve potansiyel olarak sinyal tespitini tehlikeye atacaktır. Temiz ve kolayca tanımlanabilir pacemaker sinyalleri için hedef amplifikasyon sonrası sinyal genliği, maksimum yaklaşık 1 V olmak üzere 400–600 mV'dur.
2. Veri toplama
   1. VI'yı (ek materyal olarak sağlanan Supplementary File 3), DAQ üzerinden aşağıdaki kanalları 1 kHz örnekleme hızıyla eş zamanlı olarak toplayacak şekilde yapılandırın:
      Kanal 1: Elektrofizyolojik sinyal (EXT-10-2F'den gelen amplifiye edilmiş ve filtrelenmiş pacemaker sinyali)
      Kanal 2: LabVIEW tarafından üretilen TTL fareye giden analog TTL çıkışı)
      Kanal 3: Arduino Uno analog TTL zaman damgası (bilgisayar ekranındaki siyah beyaz gösterge kareyi izleyen fotodiyot tarafından tespit edilen —TTL'nin yükselmesiyle başlayan, TTL'nin tekrar düşmesiyle sona eren— doğrulanmış uyaran penceresini kaydeder).
      ​NOT: Kanal 2 hedeflenen uyaran iletim zamanını, Kanal 3 ise doğrulanmış gerçek uyaran penceresini kaydeder. Tüm analizler için kesin uyaran zamanlama kaydı olarak Kanal 3 kullanılmalıdır.
   2. Kayıt süresini deneysel protokole göre ayarlayın. 30 s'lik uyaran öncesi bazal süre, yaklaşık 15 s'lik görsel stimülasyon ve 35 s'lik uyaran sonrası dönemden oluşan standart bir uyaran sunum sekansı için toplam kayıt süresini 80 s olarak ayarlayın.
      NOT: Bu protokol, yanıt gücünü değerlendirmek için, Bielecki ve ark. (2023)¹⁴ ile uyumlu olarak, tercihen 10 farklı hayvandan elde edilmiş 10 biyolojik replika (rhopalia) kullanır. Tek bir preparasyonda, izole edilmiş aynı rhopalium, en düşükten en yükseğe doğru sıralı olarak sunulan tüm görsel uyaran protokolünü alır; bu sıralama, hayvanın yüksek kontrasta rağmen aversif bir sonuç olmamasına alışmasını önler, çünkü bu durum daha sonra sunulan düşük kontrastlı uyaranlara karşı yanıt verme yeteneğini azaltabilir. Ardışık kayıtlar 2 dakikalık sabit aralıklarla başlatılır ve bir uyaran döneminin sonu ile bir sonrakinin başlangıcı arasında 105 s'lik bir aralık oluşur (bu süre, bir sonraki uyarandan önce pacemaker frekansının bazala dönmesi için yeterlidir). Teknik replika yapılmaz; her rhopalium, kendi uyaran sekansı içindeki her kontrast seviyesi için tek bir sunum alır.
   3. LabVIEW VI (ek materyal olarak sağlanan Supplementary File 3), kayıt sekansının uygun zaman noktasında DAQ'dan TTL faresine otomatik olarak bir TTL darbesi göndererek slaydı ilerletir ve görsel uyaran başlangıcını başlatır. Toplanan verileri sekmeyle ayrılmış bir .txt dosyası olarak kaydedin. Sağlanan VI kullanılırken, kayıt üst verileri (metadata) kaydetme sırasında dosya adına manuel olarak kodlanır.
      NOT: Kullanıcıların kayıtlar başlamadan önce tutarlı bir dosya adlandırma kuralı belirlemeleri önerilir. Preparasyon tanımlayıcısı, belirli bir kaydın geldiği spesifik rhopalium ve deneysel oturuma kadar takip edilmesini sağlayan benzersiz bir koddur (örneğin, bir hayvan veya oturum numarası). Adlandırma şeması, sistematik olduğu ve herhangi bir kaydın karşılık gelen preparasyona belirsizliğe yer vermeden geri izlenebildiği sürece araştırmacının tercihine bırakılmıştır — örneğin, bir dosya adı kayıt tarihini ve saatini ilgili uyaran parametreleriyle (örneğin, kontrast seviyesi, çubuk boyutları ve hızı) birleştirebilir.
   4. Belirli bir rhopalium için tüm kayıtlar tamamlandıktan sonra, rhopalium dokusunu standart laboratuvar lavabo imhası yoluyla atın.
      NOT: Kullanıcıların kayıtlar başlamadan önce tutarlı bir dosya adlandırma kuralı belirlemeleri önerilir. Tarih, preparasyon tanımlayıcısı ve uyaran koşulunu içeren sistematik bir dosya adı, sonraki analizler için yeterlidir. LabVIEW tarafından üretilen görsel uyaranlar yerine sunum yazılımının tercih edilmesinin iki pratik nedeni vardır: birincisi, kayıtlar arasında alt lens gözüne yansıtılan görüntünün her an bilinmesini ve kontrol edilmesini sağlayarak yazılım arayüzlerinden veya sistem ekranlarından gelebilecek istenmeyen görsel stimülasyonları önlemesidir; ikincisi, kayıt oturumları arasında ekranın kararma riskini ortadan kaldırarak, fotoreseptörlerde ışık-KAPALI (light-OFF) yanıtı oluşturmasını ve sonraki bazal döneme yapay pacemaker aktivitesi girmesini engellemesidir. Çubuğun algılanan açısal boyutu ve hızı, lens gözünün geometrisi nedeniyle görsel alan boyunca doğrusal olmayan bir şekilde değişecektir. Bu doğrusal olmama durumu iki nedenden dolayı düzeltilmez: birincisi, serbestçe yüzen hayvanlar engellere sabit hız veya yönde yaklaşmazlar, bu da açısal düzeltmenin doğal gerçekçilik açısından sınırlı bir önem taşımasına neden olur; ikincisi, açısal boyut için düzeltme yapmak, genel ekran parlaklığında değişiklikler gerektirecektir ve bu da mangrove ışık süzülmelerini algılamada rol oynayan ışık AÇIK/KAPALI (light ON/OFF) yanıtını tetikleyecektir.

7. Veri analizi

1. Igor Pro'da pacemaker sinyal ayrımı
   NOT: Frekans analizinden önce, ham elektrofizyolojik izdeki yüzme pacemaker sinyalleri, aksiyon potansiyeli benzeri sinyallerden ayırt edilir. İki sinyal tipi kayıtta eş zamanlı olarak ortaya çıkabilir ve pacemaker zamanlama verileri çıkarılmadan önce birbirinden ayırt edilmelidir. Her iki sinyal tipinin temsilci örnekleri ve ayırt edici dalga formu özellikleri Şekil 2C,D'de verilmiştir.
   1. Neuromatic eklentisini (versiyon 2.00) kullanarak .txt veri dosyasını Igor Pro'ya (versiyon 6.37 veya sonrası) aktarın.
   2. Sinyal süresi ve dalga formu morfolojisine dayanarak yüzme pacemaker sinyallerini aksiyon potansiyeli benzeri sinyallerden ayırt edin.
      NOT: Yüzme pacemaker sinyalleri yaklaşık 45 ms'lik karakteristik bir süreye ve birden fazla pacemaker nöronun toplanmış aktivitesini yansıtan bileşik bir dalga formu morfolojisine sahiptir. Aksiyon potansiyeli benzeri sinyaller yaklaşık 10 ms'lik daha kısa bir süreye ve daha keskin, üniter bir dalga formuna sahiptir. İki sinyal tipi benzer genliklere ulaşabildiği için²⁴ (Şekil 2C,D), sadece sinyal genliği güvenilir bir ayırt etme kriteri değildir. Yüzme pacemaker sinyallerinin ve aksiyon potansiyeli benzeri sinyallerin ayırt edici dalga formu özelliklerini gösteren temsilci bir figür sunulmuştur (Şekil 2C,D). Hatalı tanımlama pacemaker frekans tahmininde hatalara yol açacağından, kullanıcıların analizden önce her iki sinyal tipine de aşina olmaları önerilir. Sinyal dalga formu özellikleri belirli bir preparasyon içinde tutarlıdır ancak preparasyonlar arasında bir miktar farklılık gösterebilir; bu nedenle ayırt etme kriterleri, yukarıda açıklanan dalga formu özellikleri sabit evrensel eşikler olarak değil, genel bir rehber olarak kullanılarak her preparasyon için ayrı ayrı değerlendirilmelidir. Güvenle sınıflandırılamayan belirsiz veya ara dalga formları için, sonucun görünür gücünü yapay olarak artırmaktan kaçınmak amacıyla, belirsizliği beklenen veya hipotez edilen sonucun tersi yönünde çözün — örneğin, daha yüksek bir sinyal sayısının test edilen hipotezi destekleyeceği durumda belirsiz bir olayı hariç tutun veya daha düşük bir sayının destekleyeceği durumda dahil edin.
   3. Her kayıt için pacemaker olaylarının bir zaman serisini elde etmek üzere tanımlanan her bir yüzme pacemaker sinyalinin zaman damgasını çıkarın ve bu zaman damgalarını sonraki istatistiksel analizler için (örneğin, bir hesap tablosuna veya .csv dosyasına) aktarın.
2. Frekans analizi
   1. Pacemaker sinyal frekansını, kayıt boyunca sinyaller arası aralığın tersi olarak hesaplayın.
      1. LabVIEW tarafından kaydedilen TTL komutu (Kanal 2) ile Arduino tarafından doğrulanan stimulus başlangıcı (Kanal 3) arasındaki gecikme için düzeltilmiş pacemaker sinyal zaman damgalarını kullanarak; stimulus öncesi bazal dönem, stimulus dönemi ve stimulus sonrası dönemdeki pacemaker frekanslarını karşılaştırarak görsel stimulusun etkisini değerlendirin.
         NOT: Alt lens gözü, stimulusa yazılım tarafından kaydedilen komutla değil, doğrulanan TTL zamanlamısıyla yanıt verir; bu nedenle her kaydın doğrulanmış başlangıç zamanı, ham pacemaker ve TTL zaman damgalarıyla birlikte bir hesap tablosuna (Ek Tablo 1) aktarılır ve SAS analiz betiği tarafından her bir pacemaker sinyalini stimulus öncesi, stimulus veya stimulus sonrası penceresine sınıflandırmak için doğrudan kullanılır (Şekil 6); hesap tablosu aşamasında herhangi bir zaman damgası değeri değiştirilmez. Rahatsız edilmeyen bazal koşullar altında, pacemaker sinyal frekansı 0.5–1 Hz'dir. DTT'nin üzerindeki görsel olarak uyarılmış engel kaçınma yanıtları, pacemaker frekansının 2–3 Hz'e yükselmesiyle karakterizedir. Fizyolojik maksimum, 250–280 ms'lik bir minimum sinyaller arası aralığa karşılık gelen yaklaşık 4 Hz'dir²⁵. Bazal pacemaker frekansı preparasyonlar arasında farklılık gösterdiğinden, her kayıt için frekans değerleri, stimulus öncesi ve stimulus sonrası dönemlerden (stimulus döneminin kendisi hariç) hesaplanan kendi ortalama frekansına göre standardize edilir. Bu normalizasyon, yanıt büyüklüğünün bazal pacemaker hızındaki farklılıklardan bağımsız olarak preparasyonlar arasında karşılaştırılmasını sağlar. Bazal, stimulus ve stimulus sonrası dönemleri karşılaştırmak için kullanılan doğrusal olmayan model dahil olmak üzere yanıt anlamlılığını değerlendirmek için kullanılan tüm istatistiksel prosedürler Bielecki et al. (2023)'de¹⁴ açıklanmıştır; ilgili SAS analiz kodu doi: 10.17632/csgymw8kjk.1 adresinde mevcuttur. Ham sinyalden ayrıma, frekans hesaplamasına ve standardizasyondan nihai yanıt metriğine kadar olan temsilci bir analiz iş akışı Şekil 7'de sunulmuştur.

Şekil 6: Stimülasyonla doğrulanmış zamanlama için pacemaker zaman damgası düzeltmesinin temsili gösterimi. VI tarafından kaydedilen TTL komutu ile Arduino tarafından doğrulanmış stimülasyon başlangıcı arasındaki gecikmeyi gösteren örnek kayıt; her kayıt için Arduino/fotodiyot zamanlama zinciri üzerinden ayrı ayrı doğrulanmış ve SAS analiz betiğinin her pacemaker sinyal zaman damgasını stimülasyon öncesi, stimülasyon veya stimülasyon sonrası penceresine sınıflandırmada doğrudan kullanması için bir hesap tablosuna (Ek Tablo 1) aktarılmıştır. Siyah iz (sol y ekseni): elektrofizyolojik sinyal (mV). Kırmızı iz (sağ y ekseni): TTL genliği (V). Gri gölgeli bölge, yazılım tarafından kaydedilen TTL komutuyla zaman damgası vurulmuş nominal stimülasyon penceresini belirtir. İç resim: TTL başlangıcının genişletilmiş görünümü. Siyah ok ucu, LabVIEW tarafından kaydedilen TTL gönderim zamanını (t = 30.000 s, Kanal 2) işaret eder; beyaz ok ucu, Arduino/fotodiyot zinciri aracılığıyla tespit edilen doğrulanmış stimülasyon başlangıcını (t = 30.016 s, Kanal 3) işaret eder. Gösterilen 16 ms'lik aralık, otomatik TTL-fare tetiklemesi için bildirilen <20 ms aralığındaki temsili bir örnektir (Sonuçlar). Bu gecikme belirli bir kayıt içinde sabit olduğundan, ilgili ofset geçişi bağımsız olarak gösterilmemiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7: Ham kayıttan nihai yanıt metriğine kadar olan temsili analiz iş akışı. Pacemaker sinyali ve TTL zaman damgaları Igor Pro/Neuromatic olaylar tablosundan çıkarılır: pacemaker sinyali olayları süre ve dalga formu morfolojisi ile tanımlanır (adım 7.1.2) ve Arduino ile doğrulanmış stimülasyon başlangıcı (InitStim, Kanal 3), her kayıt için hesaplanmış bir gecikme olarak değil, mutlak bir zaman damgası olarak çıkarılır. Bu zaman damgaları, her pacemaker sinyali olayı için spike arası aralık (Intval) ve orta nokta zaman damgası (MidTime) hesaplanarak SAS analizi için hazırlanan bir hesap çizelgesine (Ek Tablo 1) kopyalanır. SAS, hazırlanan hesap çizelgesini içe aktarır ve nihai yanıt metriğini (.docx özeti, .xlsx veri tabloları) üretmek için, her kaydın doğrulanmış stimülasyon başlangıcına göre sınıflandırılan stimülasyon öncesi, stimülasyon ve stimülasyon sonrası dönemler boyunca pacemaker frekansını karşılaştıran doğrusal olmayan bir istatistiksel model (Bielecki et al., 2023¹⁴) uygular. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Sonuçlar

Sinyal kalitesi ve spontan pacemaker aktivitesi

Transekte epidermal sap sinirine elektrotların başarılı bir şekilde takılmasının ardından, spontan pacemaker sinyalleri osiloskopta hemen görülmelidir. Yüksek kaliteli bir kayıt, düşük gürültülü bir temel çizgi üzerinde (sıfırın her iki tarafında yaklaşık 10–15 mV tepe sapmasıyla, hedef genlik aralığında yaklaşık 27–40:1'lik bir sinyal-gürültü oranına karşılık gelir), amplifikasyon sonrası 40–60 mV genliğe sahip, büyük ve net şekilde çözümlenmiş pacemaker sinyallerinin 0,5–1 Hz'lik stabil bir spontan frekansta meydana gelmesiyle karakterize edilir (Şekil 5B). 10 mV kadar düşük sinyal genliğine sahip kayıtlar analiz edilebilir, ancak bunlar Igor Pro'da sinyal ayırt etme süresini önemli ölçüde artır ve özellikle deneyimsiz operatörler için önerilmez. Birden fazla trmOC nöronunun toplam aktivitesini yansıtan pacemaker sinyalinin bileşik dalga formu morfolojisi, onu kayıtta mevcut olabilecek daha kısa ve daha keskin aksiyon potansiyeli benzeri sinyallerden ayır²⁴ (Şekil 2C,D). Adım 7.1'de açıklandığı üzere, bu iki sinyal tipi, analizden önce sinyal süresi (pacemaker sinyalleri için ~45 ms'ye karşı aksiyon potansiyeli benzeri sinyaller için ~10 ms) ve dalga formu morfolojisi temelinde ayırt edilmelidir. Yalnızca genlik, güvenilir bir ayırt etme kriteri değildir. Bu protokoldeki sinyal ayırt etme işlemi tek bir deneyimli operatör tarafından gerçekleştirilmiştir; bu nedenle resmi değerlendiriciler arası güvenilirlik istatistikleri hesaplanmamıştır (bkz. Tartışma, Kısıtlamalar).

Görsel olarak uyarılan pacemaker yanıtı

Sağlıklı ve duyarlı bir preparatta, alt lensli göze DTT'nin üzerinde hareketli bir dikey çubuk stimulusu sunulması, net ve zamanla kilitli bir pacemaker yanıtı üretir. Pacemaker sinyal frekansı, engelin ön kenarının görsel alanın merkezinden geçişiyle eş zamanlı olarak 2–3 Hz'e yükselir ve stimulus sonlandığında bazal frekansa geri döner¹⁴ (Şekil 5B). Stimulus başlangıç zamanlaması, LabVIEW'in kendi bildirdiği zaman damgasına güvenmek yerine Arduino/fotodiyot zamanlama zinciri (adım 3.3) kullanılarak doğrulanmıştır. Sunum yazılımını ilerletmek için TTL fare kullanıldığında doğrulanan aralık <20 ms; manuel tetikleme (bir operatörün istenen başlangıca göre zamanlanmış modifiye edilmemiş bir fareye tıklaması) kullanıldığında doğrulanan aralık 10–150 ms'dir. Yanıt analizi, yazılım tarafından bildirilen tetikleyici (Kanal 2) yerine doğrulanan başlangıcı (Kanal 3) kullandığı için, bu aralık tetikleme yönteminden bağımsız olarak yanıt nicelendirmesini etkilemez. Bu frekans artışı, serbestçe yüzen hayvanlarda gözlemlenen engel kaçınma davranışının elektrofizyolojik karşılığını oluşturur ve varlığı hem preparatın canlılığını hem de alt lensli gözün projeksiyon ekranıyla doğru optik hizalamasını doğrular.

Pacemaker yanıt büyüklüğü, ardışık pacemaker olayları arasındaki sinyaller arası aralığın tersi olarak hesaplanan anlık sinyal frekansı kullanılarak değerlendirilir. Bu yaklaşım, bir frekans değeri belirlemek için en az iki ardışık pacemaker sinyali gerektirir ve böylece tekil izole sinyallerden kaynaklanan yanlış pozitif yanıt tespitine karşı doğal bir koruma sağlar.

Hareketli çubuk stimülüsünün kontrastı, uyarılan yanıtın büyüklüğünü belirler. Bielecki ve ark. (2023)¹⁴ çalışmasında, bir f-stop aralıkla yerleştirilmiş üç kontrast seviyesi (c = 0.20, 0.40 ve 0.80) kullanılmıştır. Bu spesifik kontrast değerleri, toplam protokol süresini yaklaşık 1 h olan uygulanabilir kayıt penceresi içinde tutmak için seçilmiştir. Alt lens gözünün kontrast hassasiyeti sınırlarını veya diğer spesifik görsel yanıt özelliklerini araştıran araştırmacılar, bu değerleri kural olarak benimsemek yerine deneysel sorularına uygun kontrast seviyeleri seçmelidir.

Optimal olmayan kayıtlar ve hata modları

Uygulamada, aklimasyon canlılık kriterini (adım 6.1.6) karşılayan preparatların yaklaşık %90'ı (10'da 9), stabil spontan aktivite ve ölçülebilir bir görsel uyaranlı yanıt vermektedir; bu oran, operatör deneyimine güçlü bir şekilde bağımlıdır. Geriye kalan preparatlar çoğunlukla şu nedenlerden biri nedeniyle başarısız olur: En yaygın başarısızlık modu, kayıt oturumu sırasında elektrot sızdırmazlığının kademeli olarak kaybolmasıdır. Bu durum, elektrot ucu ile sinir ucu arasındaki elektriksel temasın bozulmasını yansıtacak şekilde, hem pacemaker sinyal genliğinde hem de arka plan gürültü seviyesinde kademeli bir azalma olarak kendini gösterir.Şekil 5A). Bu patern gözlemlenirse, vakum serbest bırakılmalı ve elektrot ucu kesilmiş sap yüzeyinde hafifçe yeniden konumlandırıldıktan sonra vakum tekrar uygulanmalıdır. Sinyal genliği düzelmezse, spontan pacemaker aktivitesi kontrol edilerek preparatın canlılığı değerlendirilmelidir. 1 saatten fazla süre izole edilmiş bir preparatta, yeniden bağlantı girişimlerinin ardından sinyalin tamamen yokluğu, elektrot hatasından ziyade büyük olasılıkla preparatın bozulmasını yansıtır ve taze bir preparat kullanılmalıdır.

İkinci bir hata modu, stabil spontan kalp pili aktivitesine rağmen görsel olarak uyarılmış bir yanıtın yokluğudur. Bu durum, preparatın yanıtsız olduğu sonucuna varmadan önce optik konfigürasyonun yeniden değerlendirilmesini gerektirir. En yaygın nedenler, alt lens gözünün projeksiyon ekranına göre hizasız olması ve aşırı ışınım nedeniyle fotoreseptör doygunluğudur. Adım 4.1.5'te açıklanan biyolojik kalibrasyon prosedürü tekrarlanmalı ve gerekirse nötr yoğunluk filtresi zayıflatması artırılmalıdır. Ayrıca, hareketli çubuk uyarısının hareketi boyunca görsel alan içinde kaldığı doğrulanmalıdır; çünkü uyarının görsel alandan çıkması bir ışık-KAPALI (light-OFF) yanıtı uyandıracak ve kayda yanıltıcı kalp pili aktivitesi ekleyecektir.

Üçüncü bir örüntü olan ve kalp pili sinyallerini maskeleyen yüksek arka plan gürültüsü, çoğunlukla bir topraklama sorununu veya şebeke girişimini yansıtır. Adım 3.2.1'de açıklanan yıldız topraklama konfigürasyonu doğrulanmalı ve 50/60 Hz çentik filtrenin aktif olduğu teyit edilmelidir.

Ek Dosya 1: Arduino taslağı. Fotodiyot tabanlı uyaran başlangıç tespitini uygular: Arduino Uno, sunum ekranındaki siyah-beyaz gösterge karesini (adım 1.4.2) 1 kHz hızında örnekleyerek fotodiyotu izler, ham analog sinyali eşik karşılaştırması yoluyla temiz bir dijital TTL darbesine dönüştür ve bu darbeyi doğrulanmış uyaran zamanlama sinyali (Kanal 3, adım 6.2.1) olarak çıkış verir.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Temsili uyaran dosyası. Hareketli çubuk görsel uyaranını tek bir sürekli nesne animasyonu ve siyah-beyaz zamanlama doğrulama göstergesi karesi (adım 1.4) olarak uygulayan örnek sunum yazılımı dosyası (Keynote). Kendi uyaran dizilerini tasarlayan okuyucular, her uyaran başlangıcından önce ekranın yeterli bir akomodasyon süresi boyunca sabit kaldığından emin olmalıdır; fotodiyot/Arduino geri bildirim döngüsü (adım 3.3), kullanılan özel sunum yazılımından veya slayt tasarımından bağımsız olarak gerçek uyaran zamanlamasını doğrular.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: LabVIEW Sanal Enstrümanı (VI). NI USB-6343 DAQ'yı iki analog giriş kanalı — AI0 (amplifikatörden gelen elektrofizyolojik sinyal) ve AI1 (Arduino ile doğrulanmış uyarım başlangıç TTL'si, fotodiyot geri bildirim sinyali) — ve sunum yazılımı slaytını ilerletmek için programlanmış uyarım zamanında TTL faresine bir TTL darbesi ileten bir analog çıkış kanalı, AO0 ile yapılandırın. Oluşan .txt çıktı dosyası üç sütunu kaydeder: elektrofizyolojik sinyal (AI0), AO0 tetikleme komutunun LabVIEW tarafından kaydedilen zaman damgası (yeniden elde edilmiş bir sinyal değil, bir yazılım kaydı) ve Arduino ile doğrulanmış TTL (AI1).Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: SAS giriş dosyası formatı. İstatistiksel analiz için SAS'a yüklenen hesap çizelgesi için sütun tanımlamaları ve çalışılmış bir örnek (adım 7.2.1). Temsili bir kayıttan alınan ardışık dört kalp pili sinyal zaman damgası, frekans hesaplamasında kullanılan spike arası aralığın (Intval) ve orta nokta zaman damgasının (MidTime) türetilmesini göstermektedir; listedeki son olayın, aralığı tamamlayacak sonraki bir zaman damgası bulunmadığı için Intval/MidTime değeri yoktur.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokoldeki birkaç adım, güvenilir kayıtlar elde etmek için kritik öneme sahiptir. Bunların arasında en belirleyici olanı, vakum elektrodunun yapımı ve hazırlanmasıdır. Standart görsel olarak uyarılmış kalp pili kayıtları için sinyal-gürültü oranını optimize eden herhangi bir elektrot kabul edilebilir olsa da, preparatın elektriksel koşullandırılmamış uyaran verilmesi için kullanıldığı durumlarda, iletilen akımı hesaplamak için gerekli olduğundan yaklaşık 1 MΩ'luk bir bağlantı direnci özellikle kritik hale gelir¹⁴. Sadece kayıt amaçlı kullanımlarda ise temel kriter, belirli bir direnç değerinden ziyade sinyal kalitesidir.

Kayıtlara başlamadan önce optik sistemin biyolojik kalibrasyonu da aynı derecede kritiktir (adım 4.1.5). Projektör çıkışı, lens yapılandırması ve ekran yansıtıcılığı, alt lens gözündeki etkili ışınımı belirlemek için etkileşim içinde olduğundan, evrensel olarak uygulanabilir bir ışınım değeri belirtilemez. Biyolojik kalibrasyon (fotoreseptör dinamik aralığı için kriter olarak maksimum kontrast uyarısına karşı kalp pili frekans yanıtını kullanarak), uygun uyaran yoğunluğunu belirlemek için donanımdan bağımsız ve kendi kendini doğrulayan bir yöntem sunar. Aşırı ışınım nedeniyle meydana gelen fotoreseptör doygunluğu, görsel olarak uyarılan kalp pili yanıtlarını ortadan kaldıracağı ve yanıt vermeyen bir preparat ile karıştırılabileceği için bu adım atlanmamalıdır.

İzolasyon ve transfer boyunca rhopalium'un su altında tutulması kritik öneme sahiptir. Rhopalial sinir sistemi kurumaya karşı son derece hassastır ve havayla kısa süreli temas bile hazırlığa geri dönülemez şekilde zarar verebilir. Tüm transfer adımları deniz suyu varlığında gerçekleştirilmeli ve rhopalium yerleştirilmeden önce kayıt odası 0.20 µm filtrelenmiş kültür tankı deniz suyu ile doldurulmalıdır.

Son olarak, kesilmiş sap yüzeyine elektrot yerleştirme işlemi sabır gerektirir. Epidermal sap sinir uçları her zaman görsel olarak tanımlanamaz ve doğru yerleşim, osiloskopta spontan pacemaker sinyallerinin görülmesiyle doğrulanmalıdır.

Kayıt başarısızlığının en yaygın nedeni, oturum sırasında elektrot sızdırmazlığının kaybolmasıdır. Bu riski en aza indirmek için tüm protokoller, rhopalium izolasyonundan sonra bir saat içinde tamamlanmalıdır. Burada önerilen bir saatlik süre, pacemaker aktivitesi devam etse bile, hayvanın geri kalanından ayrılmış izole bir nöral preparatın bozulmamış fizyolojik fonksiyonu süresiz olarak tam olarak temsil edebileceğinin varsayılamayacağı yönündeki genel beklentiyi yansıtan muhafazakâr ve pratik bir seçimdir. İzole rhopalia, tespit edilebilir pacemaker sinyalleri üretme anlamında, bu protokolde kullanılan kayıt penceresinden çok daha uzun süre, izolasyon sonrası yaklaşık 5 h boyunca canlı kalır; ancak bu pencerenin geç safhalarında kaydedilen yanıtların bozulmamış bir preparatı tam olarak temsil edip etmediği sistematik olarak tanımlanmamıştır ve 1 h sınırı kesin olarak tanımlanmış bir eşikten ziyade muhafazakâr bir tampon olarak kullanılır. Elektrot sızdırmazlığının kademeli olarak kaybı, kolayca tanımlanabilen ayrı bir teknik hata modudur ve tek bir kayıt oturumu içindeki sinyal kaybının en yaygın nedenidir (aşağıya bakınız), ancak bu durum, preparat durumunun zamanla duyarlılıkta meydana gelen daha belirgin olmayan değişikliklere katkıda bulunma olasılığını dışlamaz. Bir kayıt sırasında sızdırmazlık kaybı meydana gelirse, vakum bırakılabilir, elektrot kesilmiş sap yüzeyine yeniden konumlandırılabilir ve vakum tekrar uygulanabilir. Bununla birlikte, preparat bir saatten fazla süredir izole edilmişse, kötüye giden bir preparatla sorun gidermeye zaman harcamak yerine yeni bir preparatla başlamak tavsiye edilir.

Filtre ayarları, sabit parametrelerden ziyade başlangıç noktaları olarak değerlendirilmelidir. Bu protokolde belirtilen bant geçiren filtre değerleri (yüksek geçiren 1 Hz, düşük geçiren 50 Hz, 50/60 Hz çentik), yazarların kayıt ortamındaki sinyal-gürültü oranını optimize eden değerlerdir. Farklı düzeylerde elektriksel girişime sahip olan veya farklı amplifikatör modelleri kullanan laboratuvarların, her oturumun başında osiloskop ekranından sinyali izleyerek bu ayarları amplifikatör kontrolleri üzerinden ampirik olarak düzenlemesi gerekebilir.

Elektrot takıldıktan sonra spontan pacemaker aktivitesi görülmezse, elektrottaki sorunları gidermeden önce preparasyon değerlendirilmelidir. Sağlıklı, izole edilmiş bir rhopalium, elektrot takılmasından sonraki birkaç dakika içinde 0.5–1 Hz hızında spontan pacemaker sinyalleri gösterecektir. Spontan aktivitenin olmaması, genellikle elektrot arızasından ziyade izolasyon veya transfer sırasında preparasyonun hasar görmesini yansıtır. Aksine, spontan aktivite mevcutsa ancak görsel olarak uyarılan bir yanıt alınamıyorsa, preparasyonun yanıt vermediği sonucuna varmadan önce optik kalibrasyon tekrarlanmalıdır.

Bu protokolü farklı donanımlara uyarlayan laboratuvarlar için, adım 3.3'te açıklanan TTL fare ve Arduino Uno zamanlama doğrulama zinciri, elektrofizyolojik izle senkronize olarak elde edilen, donanım düzeyinde ve yazılımdan bağımsız bir uyaran penceresi kaydı sağlayan herhangi bir sistemle değiştirilebilir. Burada açıklanan spesifik uygulama, bir PC üzerindeki LabVIEW veri toplama ortamı ile ayrı bir bilgisayardaki sunum yazılımı arasında köprü kurmak için geliştirilmiştir ve yaygın bir platformlar arası entegrasyon zorluğuna yönelik pratik bir mühendislik çözümünü yansıtmaktadır. Yazılım tetikleyicilerinin tek başına hassas uyaran-yanıt zamanlama analizi için yetersiz olduğu temel ilkesi, kullanılan spesifik donanım platformından bağımsız olarak geçerlidir.

İzole rhopalium preparasyonunun temel kısıtlaması, tek bir rhopaliumdan izole olarak kayıt yapmasıdır. Bütün haldeki hayvanda, dört rhopalium halka sinir yoluyla birbirine bağlıdır¹⁵ ve çıktıları, koordineli yüzme davranışını üretmek için entegre edilir. Rhopalia arası iletişim bu preparasyonda erişilebilir değildir. Bununla birlikte, tek bir rhopalium sinir sistemi içindeki görsel bilgi işlemenin araştırılması amacıyla, bu izolasyon bir zayıflıktan ziyade bir avantajdır. Diğer rhopalia'lardan gelen girdilerin karıştırıcı etkisini ortadan kaldırır ve tek bir RNS'nin görsel yanıt özelliklerinin tam olarak karakterize edilmesine olanak tanır.

Rhopaliumun izole edilmesi, aynı zamanda rhopaliumun ötesindeki multimodal duyusal bağlamı da dışlar; yüzeyinde anatomik olarak tanımlanan varsayımsal kemoreseptörlerin¹⁷ pacemaker yanıtı ile fonksiyonel bir bağlantısı kurulmamıştır, bu nedenle sinyal makul bir şekilde, görsel olmayan girdilerle büyük ölçüde karmaşıklaşmamış bir görsel işleme çıktısı olarak yorumlanabilir. Daha temel bir kısıtlama ise, hücre dışı stalk siniri kaydının yalnızca entegre trmOC motor çıktı sinyalini yakalamasıdır. Görsel işlemeye yönelik bireysel subOC katkıları elektrofizyolojik olarak çözümlenemez; bu durum, uzamsal olarak çözümlenmiş in vivo görüntüleme yaklaşımlarını gerektirir. Bu nedenle, burada açıklanan elektrofizyolojik yöntem, RNS içindeki ara işleme basamaklarının değil, nihai entegre motor komutun bir ölçümüdür.

Bunun önemli bir pratik sonucu vardır: izole rhopalium elektrofizyoloji protokolü tek başına kullanılan bir yöntem değildir. Bell kasılma frekansını değiştiren davranışları hangi görsel uyaranların tetiklediğini belirlemek amacıyla, izole rhopalium deneyleri tasarlanmadan önce bütün hayvan davranış analizlerinin yapılması zorunludur. pacemaker sinyal frekansında bir değişikliğe yol açmayan davranışlar bu yaklaşım kullanılarak değerlendirilemez. Elektrofizyolojik okuma, spesifik olarak yüzme motor çıktısının bir ölçümüdür ve seçilen uyaranların bu çıktıyı harekete geçirdiğinden emin olmak için deneysel tasarımlar, önceden yapılan davranışsal karakterizasyona dayandırılmalıdır.

Kayıt başarısı ve sinyal sınıflandırması, operatör deneyimine bağlıdır. Alıştırma canlılık kriterini (adım 6.1.6) karşılayan preparasyonların yaklaşık %90'ı, deneyimli bir operatörün elinde stabil spontan aktivite ve ölçülebilir bir görsel olarak uyarılan yanıt verir; öğrenme eğrisinin erken aşamalarında bu oranın daha düşük olması beklenir. Pacemaker ve aksiyon potansiyeli benzeri dalga formları arasındaki sinyal ayrımı (adım 7.1.2), bu çalışmada tek bir deneyimli operatör tarafından gerçekleştirilmiştir; resmi değerlendiriciler arası güvenilirlik testi birden fazla bağımsız gözlemci gerektirdiğinden, bir değerlendiriciler arası uyum istatistiği hesaplamak mümkün olmamıştır. Bunun yerine iç tutarlılık, belirsiz dalga formlarının aynı kayıt içerisindeki kimliği bilinen bir sinyalle, genellikle maksimum kontrastlı uyarılan yanıtla karşılaştırılması yoluyla sağlanmıştır.

Bu protokoldeki donanım ve yazılım seçimleri — modifiye edilmiş bir projeksiyon lensi, özel bir TTL fare, Arduino zamanlama zinciri ve LabVIEW/Igor Pro/SAS — yöntemin gerekliliklerinden ziyade yazarların laboratuvarında halihazırda mevcut olan ekipmanları ve uzmanlığı yansıtmaktadır. Standart konfigürasyon kurulum gereksinimlerini karşılamadığı için projeksiyon lensi modifiye edilmiştir. TTL fare, stimulus bilgisayarı ile veri toplama bilgisayarı arasında köprü kurar: LabVIEW fareye bir TTL darbesi gönderir ve gönderim zamanını kaydeder (Kanal 2) ve farenin tıklaması USB üzerinden stimulus oluşturmayı tetikler. Kaydedilen bu tetikleyici ile gerçek ekran değişimi arasındaki gecikme değişken olduğundan, bağımsız bir fotodiyot/Arduino zinciri gerçek stimulus başlangıcını doğrular ve DAQ'ye ikinci bir TTL geri beslemesi sağlar (Kanal 3); farenin ticari bir alternatifi olabilir ancak yazarlar tarafından bilinmemektedir. Bu donanımların hiçbiri özel üretim becerisi veya yüksek maliyet gerektirmez ve herhangi bir alternatif veri toplama sisteminin yalnızca aynı 1 kHz senkronize çok kanallı örnekleme gereksinimini ve bunun gerektirdiği elektronik veya programlama uzmanlığını karşılaması yeterlidir. Bir istisna dışında: uygun bir analog amplifikatörün özelleştirilmesi, okuyucunun sahip olduğu varsayılmayan düşük gürültülü devre tasarımı uzmanlığı gerektirir.

T. cystophora, Drosophila ve zebra balığı gibi genetik olarak yönetilebilir sistemlerin görsel karmaşıklığını, C. elegans gibi sayısal olarak basit sistemlerin devre düzeyindeki yönetilebilirliği ile birleştirir: rhopalial sinir sistemi, Drosophila beynindeki yaklaşık 20.0¹ ve tüm C. elegans sinir sistemindeki 302 nörona² kıyasla yaklaşık 10 nöron içerir. Bu sistemin bir diğer avantajı ise duyusal hiyerarşisidir: T. cystophora, görmenin yanı sıra mekanoreseptörler (ilişkisel öğrenmede fonksiyonel olarak rol oynayan¹⁴) ve varsayılan kemoreseptörler (anatomik olarak tanımlanmış ancak fonksiyonel olarak kanıtlanmamış¹⁷) dahil olmak üzere birden fazla duyusal modaliteye sahiptir. Ancak, izole rhopalium preparatında, bu protokol ile değerlendirilen pacemaker yanıtını tetiklediği fonksiyonel olarak yalnızca görme yoluyla kanıtlanmıştır; bu durum, birden fazla eşzamanlı aktif duyunun davranışsal yanıtı ortaklaşa şekillendirmesinden kaynaklanan yorumlama karmaşıklığı olmaksızın, sinyalin görsel işlemenin nispeten karışıklıklardan arındırılmış bir çıktısı olarak yorumlanmasına olanak tanır. Görsel uyaranlar mekan, zaman ve kontrast açısından hassas bir şekilde belirlenebilirken, pacemaker sinyali, tüm hayvan davranışı ile ilgili olan ve görme tarafından yönlendirilen motor çıktının kantitatif bir vekili olarak kullanılabilir¹⁴.

Görsel elektrofizyolojinin ötesinde, izole rhopalium preparatı, banyo uygulamalı nörotransmitter ve nöromodülatör analizleri aracılığıyla RNS'nin farmakolojik incelemesinde başarıyla uygulanmış ve pacemaker çıktısını modüle eden transmitter sistemlerinin tanımlanmasına olanak sağlamıştır²⁴. Preparat ayrıca kalsiyum ve voltaj görüntüleme yaklaşımlarına da uygundur. Yazarların laboratuvarında, hücre geçirgen kalsiyum indikatörü kullanılarak yapılan ön yayınlanmamış çalışmalar, bu preparatta kalsiyum görüntülemenin uygulanabilirliğini desteklemektedir; voltaj görüntüleme henüz test edilmemiştir. Bu tür yaklaşımlar, halen bir çalışma modeli olan subOC–trmOC ağ mimarisinin kendisini doğrudan test edebilir ve görsel stimülasyon sırasında subOC ve trmOC aktivitesini bağımsız olarak sorgulamak için gereken uzamsal çözünürlüğü sağlayabilir; bu, yalnızca hücre dışı kayıtla elde edilemeyecek bir yetenektir. Birlikte, bu tamamlayıcı yaklaşımlar, T. cystophora izole rhopaliumunu, tanımlanmış ve sınırlı karmaşıklığa sahip bir sinir sisteminde görsel işlemenin ve sensörimotor entegrasyonun sistem düzeyindeki incelemesi için oldukça elverişli bir preparat olarak konumlandırmaktadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
35 mm Petri kabı	Nunc	153066	Uygun herhangi bir eşdeğer petri kabı
Arduino Uno	Arduino	—	Uyaran zamanlama doğrulaması için fotodiyot sinyalini TTL'ye dönüştür; 1 kHz yenileme hızı
Bikonveks mercek f = 30 mm	Linos	G063-02-0	Üretici lensinin yerine kullanılmıştır; görüntüyü kayıt odasının projeksiyon ekranı duvarına odaklar
Borosilikat cam kapiler tüp, 1,16 mm iç çap × 2,0 mm dış çap × 80 mm L	Bilimsel Ürünler	GB20-8P	Vakum elektrodu üretimi için
Tek kullanımlık transfer pipeti	Sarstedt	86.1171	Hayvan transferi için uç, ~8 mm açıklık olacak şekilde kesin
Elektrot tutucu PPH-OP-BNCPC	ALA Scientific Instruments	PPH-OP-BNCPC	emme portlu BNC tipi tutucu; ~0,25 mm Ag tel ile birlikte sağlanır
EXT-10-2F Hücre Dışı Amplifikatör	NPI Elektronik	—	Diferansiyel AC-kuplajlı amplifikatör; kafa katı ×10, ana amplifikatör ×10, toplam kazanç ×10; entegre bant geçiren filtre: yüksek geçiren 1 Hz, düşük geçiren 50 Hz; 50/60 Hz çentik filtre eklentisi aktif; kafa katı (headstage) kolu ile birlikte tedarik edilmiştir
Hemositometre lameli 20 mm × 26 mm	Carl Roth	L 189	Negatif kaldırma kuvveti sayesinde lamel kenarlarına oturur; standart lamellerden daha dayanıklıdır
Igor Pro 6.37	WaveMetrics Inc.	Sürüm 6.37	Lake Oswego, OR, ABD; kalp pili sinyal analizi için
LabVIEW 2016	National Instruments	Versiyon 2016	Veri toplama ve uyaran kontrol yazılımı; ek materyal olarak sağlanan VI
Luer-lock şırınga	—	—	Genel; uygun olan herhangi bir standart laboratuvar Luer-lock şırıngası
Microforge MF-2	Narishige	—	Elektrot uç parlatma için (Seçenek A)
Mikromanipülatör MM3	MärzhäKullanıcı Wetzlar	0-42-101-0 (sağ) / 0-42-102-00 (sol)	Manuel üç eksenli; iki adet gereklidir (pipeti tutan ve kayıt elektrodunu tutan)
Mikropipet çekici, Flaming/Brown P-100	Sutter Instrument	P-100	Çekme programı: Satır 1×1: ısıtma 535, çekme 0, hız 12, süre 20, basınç 60, rampa 540; Hatlar 2–4 × 3: ısıtma 532, çekme 0, hız 12, süre 10
Neuromatic eklentisi v2.0	—	Sürüm 2.0	Igor Pro için; kalp pili sinyali ayrıştırma ve zaman damgası çıkarma
Nötr yoğunluk filtresi	Thorlabs	NE10A	%10 geçirgenlik; zayıflatmanın biyolojik kalibrasyonla (adım 4.1) ampirik olarak doğrulanması gerekir
NI USB-6343 Veri Toplama (DAQ) Sistemi	National Instruments	781438-01	16-bit çok fonksiyonlu DAQ; elektrofizyoloji veri toplama, TTL fare stimülasyon iletimi, Arduino TTL girişi; örnekleme hızı 1 kHz
Optoma ML750 DLP projektör	Optoma	ML750	Üretici lens sistemi çıkarıldı; yerine f = 30 mm'lik tek bir bikonveks lens yerleştirildi
Osiloskop DS102E	Rigol	DS102E	Elektrot yerleşimi ve filtre optimizasyonu sırasında gerçek zamanlı sinyal izleme için
Pasteur pipeti 150 mm	Carl Roth	4518	Rhopalium transferi için
Fotodiyot BRW21	OSRAM	BRW21	Silikon fotodiyot; bilgisayar ekranındaki siyah ve beyaz gösterge karesini izler
SAS	SAS Institute Inc.	doi: 10.17632/csgymw8kjk.1	Cary, NC, ABD; kalp pili yanıtının istatistiksel analizi; kod şu adreste mevcuttur: doi: 10.17632/csgymw8kjk.1
Silikon hortum	Erich Eydam KG	9205000	Elektrot tutucu ile şırınga arasındaki vakum bağlantısı için
Filtropur S şırınga filtresi, 0.20 µm PES	Sarstedt	83.1826.001	Kayıt odası ve hazırlık kapları için kültür tankı deniz suyunun filtrelenmesi için
Vannas makası	World Precision Instruments	500086	0,025 mm × 0,015 mm bıçak; rhopalial sap kesisi için
WTE var 3185	Asistan	—	Su banyosu sıcaklık kontrolörü