Düşük Eriyen Agararoz hidrojellerinde Stabilize Edici Protein ve Protein—RNA Kondensatları Nicel Biyofiziksel Ölçümler İçin

Özet

Burada, sıvı–sıvı faz ayrılmış kondensatları gözenekli, düşük eriyen agaroz hidrojel matrisi içinde fiziksel olarak immobilize etmenin ve iç sıvı dinamiklerini bozmadan sağlam bir yöntem sunuyoruz. Bu yaklaşım, damla tortulması, birleşme ve yüzey ıslatma eserlerini en aza indirerek, saatler boyunca tekrarlanabilir görüntüleme ve nicel biyofiziksel analiz mümkün kılmaktadır.

Özet

Sıvı–sıvı faz ayrımı ile oluşan biyomoleküler kondensatlar, RNA işlemeden stres granüllerinin montajına kadar rolleri çeşitlilikte olan hücrenin temel organizasyonel birimleri olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir. Bu tür yoğunlaşmaların saflaştırılmış proteinler ve RNA kullanılarak in vitro yeniden yapılandırılması, model sistemler sağlarken, sıvı damlacıklar zamanla yüzeylerde kaba bir çöktü ve yayılarak deneysel zaman dilimlerinde nicel ölçümlerde önemli değişkenlik yaratır. Bu kondensatların, düşük eriyen agarozdan (LMA) %0,3–1,0 w/v oranında hazırlanmış, seyrek, optik olarak şeffaf ve kimyasal olarak inert bir hidrojelin içine gömülmesi, damlacıkları üç boyutta stabilize eder; böylece daha uzun ölçüm sürelerine sahip metodolojiler veya tekrarlanan ölçümlerle deneysel kurulumlar kullanılmasını mümkün kılar. Bu makale, LMA stok hazırlığı, damla oluşumu ve gömülmesi için ayrıntılı ve adım adım bir protokol sunar ve belirli sonraki biyofiziksel okumalara örnekler sunar. Ayrıca, test edilen temsil sistemlerde LMA gömmesinden sonra moleküler difüzyon gibi spesifik damla özelliklerinin korunduğunu gösteriyoruz. Yöntem, konfokal, geniş alan veya süper çözünürlüklü mikroskopi, fotobeyazlatmadan sonra floresan geri kazanımı veya nükleer manyetik rezonans spektroskopisi gibi yöntemlerle uyumlu olduğundan, sağlık ve hastalıkla ilgili biyomoleküler kondensatların nicel karakterizasyonunu destekleyebilir.

Giriş

Sıvı–sıvı faz ayrımı (LLPS), hücrelerde stres granülleri, P-cisimleri ve çekirdek 1,2,3,4,5 dahil olmak üzere membransız organeller ve biyomoleküler kondensatların oluşumunu sağlar. Bu kondensatlar, çevredeki sitoplazma veya nükleoplazma ile hızlı değişimi sürdürürken spesifik proteinleri ve nükleik asitleri yoğunlaştırır – sıvı benzeri ^{davranışın ayırt edici özelliği} 1,2,3,4,5. LLPS'nin düzensizliği, nörodejeneratif^{bozukluklar 3,6,7} gibi çeşitli hastalıklarla ilişkilendirilmiş ve ayrıca SARS-CoV-2 ^8,9,10,11,12 gibi çeşitli virüsün çoğaltılmasında da rol oynamaktadır.

Tanımlanmış tampon koşullarında saflaştırılmış proteinler ve RNA kullanılarak kondensatların in vitro yeniden yapılandırılması, LLPS mekanizmalarını incelemek için temel bir yaklaşım^{haline gelmiştir 3,4}. Ancak, bir test tüpündeki veya cam yüzeydeki damlacıklar üç ana maddeye hassastır: (i) yerçekimsel tortu, damlaların dipte birikmesine neden olur; (ii) damlaların zamanla daha az ve daha büyük yapılara birleştiği birleşme; ve (iii) yüzey ıslatması, damlaların yayılıp kısmen örtü kayağına adsorbe olduğu. Bu olaylar, nicel ölçümlerin tekrarlanabilirliğini azaltır ve fizyolojik olarak ilgili boyutlarında bireysel damlaların izini^{zorlaştırır. 13}. Bu olaylar, dakikadan saatlere kadar uzun ölçüm süreleri gerektiren yöntemlerin (örneğin, nükleer manyetik rezonans [NMR] spektroskopisi veya STORM gibi süper çözünürlüklü mikroskopi teknikleri) kullanımını daha da sınırlar ve uzun zaman didillerinde tekrar edilen ölçümleri yasaklamaktadır.

Hidrojel ağı içinde fiziksel immobilizasyon, üç artefaktı aynı anda ele alır. Agaroz, 34–38 °C altındaki sıcaklıklarda fiziksel olarak çapraz bağlı bir jel oluşturur. %0,3–1,0 w/v konsantrasyonlarda, agarozun ağ boyutu, sağlam mikrometre ölçeği damlacıkları kapsülleyecek kadar büyüktür ve damlacık içi moleküler dinamikleri engellemeyecek kadar gözeneklidir¹³. Ayrıca, agaroz matrisinin gözenekliliği, makromoleküllerin ve küçük moleküllerin gömülü damlacıklara girip dışarı yayılmasına olanak tanır. Özellikle katlanmış domainli proteinleri içeren veya üst/alt kritik çözelti sıcaklık sıcaklığı (UCST/LCST) tipi faz ayrımı takip eden sistemler için, 26–30 °C jelleşme noktasına sahip düşük eriyen agaroz (LMA) kullanılabilir. Yüzey pasivasyonu gibi alternatif ıslaklama karşıtı yaklaşımlar, kondensat yapışmasını ve dolayısıyla ıslanmasını azaltabilir, ancak genellikle özel hazırlık gerektirir ve damla tortulmasını veya birleşmesini önlemez. Buna karşılık, agaroz gömülü, kondensatları mekansal olarak immobilize etmek için basit ve geniş erişilebilir bir yöntem sunar. Önemli olarak, agarozun sarkomda birleşen (FUS) ve diğer RNA bağlayan proteinlerin damla oluşumunda %1,0 w/^{v 13} agaroz konsantrasyonuna kadar konformasyon durumunu bozmadığı doğrulanmıştır. Bu protokol, agaroz göme yaklaşımını ilgi çeken birçok faz ayıran protein veya protein-RNA sistemiyle genel kullanım için standartlaştırır ve reaktif hazırlama ile örnek hazırlama için adım adım rehberlik sağlar.

Protokol

1. Agarose stokunun hazırlanması

ÖNEMLİ: Agararoz stokunu, tampon uyumsuzluğunu önlemek için faz ayrılmış örnekleri (bundan sonra "damla tamponu" olarak adlandırılır) üretmek için kullanılan aynı tamponda hazırlayın^. Örnek: Nükleokapsid örneği, agaroz stokunun hazırlanmasında da kullanılmalı olan tampon A'da (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7.2) hazırlanır.
NOT: Nihai deneysel koşullar, tampon bileşimi, protein konsantrasyonu, katkı maddelerinin kullanımı ve nihai örnek hacimleri dahil ancak bunlarla sınırlı olmakla sınırlı olmamak üzere, incelenen belirli biyolojik sisteme ve sonraki uygulamaya büyük ölçüde bağlıdır. Benzer şekilde, alım parametreleri, cihaz kurulumu ve veri analizi büyük ölçüde numuneye ve belirli deneye bağlıdır. Örneğin, SARS-CoV-2 nükleokapsidinin poli(A) ile hazırlanması, Şekil 1A'da (konfokal floresan mikroskopisi) tanımlanmıştır.

1. Uygun miktarda LMA veya normal agarozu damla tamponu içeren 1.5 mL'lik bir tüpte tartın. Örneğin: %2 w/v stok için, 20 mg agarozu 1 mL tampon A'da çözüp çözebilirsiniz.
   NOT: Nihai agaroz stok konsantrasyonu, örnekteki istenen nihai agaroz konsantrasyonuna bağlı olarak %1–2 w/v olmalıdır. %2'nin üzerinde w/v, pipet yapmak giderek zorlaştığı için önerilmez. Pipet ucunun dar ucunu kesin, özellikle yüksek agaroz oranlarında pipetleme kolaylaşması için. Örnekler için LMA veya normal agaroz gerekip gerekmediğini belirlemek için tartışma bölümüne bakabilirsiniz.
2. Agaroz stokunu bir ısıtma bloğunda veya su banyosunda 80–90 °C'ye kadar ısıtın ve agarozu vorteksle tamamen çözüp (yaklaşık 10 dakika sürer).
   DIKKAT: Erimiş agaroz sıcaktır. Dikkatli davranın.
3. Agaroz stokunu ısıtma bloğunda veya su banyosunda 37 °C (LMA) veya 55 °C (normal agaroz) olarak dengeleyin. Bu sıcaklıkta çözeltinin berrak ve sıvı kaldığından emin olun. Gerekirse agarose stokunun sıcaklığını bir termometreyle doğrulayın.
   DURAKLAMA NOKTASI: Erimiş agaroz stokları 30–60 dakika sıcak tutulabilir.
   Agararozun su banyosunda ısıtılması, daha homojen ısıtma sağlamak ve hedef sıcaklığı yeterli hassasiyetle korumak için şiddetle tavsiye edilir. Bu özellikle LMA ile çalışırken önemlidir çünkü sıcaklıktaki küçük sapmalar erken jelleşmeye neden olabilir.
4. Numune hazırladıktan sonra (bölüm 2), kalan agaroz stoklarını +4 °C'de saklayın. Yukarıda 1.2 ve 1.3 numaralı adımları takip ederek agaroz stokunu kullanımdan önce yeniden eritin ve dengeleyin.
   NOT: Agararoz stokunun en fazla 2 hafta +4 °C'de tutulmasını ve en fazla 2–3 katılaşma/erime döngüsüne tabi tutulmasını öneriyoruz. Kontaminasyonu önlemek için iyi üretim yöntemleri kullanın. Stoklar yeniden eriyemezse veya yeniden katılaşamazsa ya da görünür bir kirlenme oluşursa daha erken atılır.

2. Numune hazırlama

1. Agararozla doğrudan temas eden tüm malzemeleri (örneğin, pipet uçları, tüpler, mikroskopi slaytları) ısıtma bloğuna veya kuluçka makinesine 2–3 dakika boyunca yerleştirerek yaklaşık 37 °C'ye kadar önceden ısıtın.
2. Agarose stokunu Bölüm 1'de belirtildiği gibi hazırlayın.
3. Damla tamponu, faz ayıran bileşenler (örneğin, protein veya RNA stokları) ve diğer katkı maddeleri (örneğin, kalabalıklaştırıcı maddeler, boyalar) standart protokole uygun olarak hazırlanır. Oda sıcaklığına (RT) denge getirin. Örnek: Tampon A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7.2), nükleokapsid protein stoku (60 μM, tampon A'da), poli(A) stok (30 μM, tampon A'da).
   NOT: Foto ağartma (FRAP), konfokal floresan mikroskopisi veya stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (STORM) sonrası floresans geri kazanımı için, sırasıyla protein veya RNA stoklarına küçük bir floresan işaretli protein veya RNA bölümü ekleyin (önerilir: %<5 etiketli fraksiyon).
4. Örnek için gereken damla tamponu, agaroz stoku, faz ayıran bileşenler (örneğin, ilgi gören protein veya RNA) ve ek katkı maddeleri (örneğin, kalabalıklaştırıcı maddeler) hesaplayın. Örneğin: 6 μL tampon A, 5 μL %2 agaroz stoku (son 0,5%), 5 μL nükleokapsid protein (son 15 μM), 4 μL poli(A) (son 6 μM). Son cilt 20 μL.
   NOT: Deney için kullanılan çanak, tüp, plaka veya diğer kaplara büyük ölçüde bağlı olsa da, yaygın kullanılan hacimler 3 mm NMR tüpü için 150 μL, 6 kanallı mikroskopi slaytında mikroskopi veya FRAP deneyleri için 20 μL ve 18 delikli mikroskopi slaytlarında STORM deneyleri için 20–30 μL (bkz. Materyal Tablosu).
   1. Başlangıç değerleri olarak, standart biyofiziksel testler için nihai %0,3–0,5 w/v agaroz ve uzun vadeli stabilizasyon için %0,8–1,0 w/v (örneğin yaşlanma deneyleri) kullanın.
      NOT: Örneklerin uzun vadeli stabilizasyonu ve depolanması için, numune kurutmasını önlemek (örneğin, numune kabının mühürlenmesi, nemlendirilmiş bir odada saklamak ve buharlaşma bariyeri eklemek) ve uzun süreli kuluçkalarda tampon bileşimi ile pH'ın stabil kalmasını sağlamak için önlemler alınmalıdır.
   2. NMR örnekleri için, kilitleme için numuneye son %5 v/v D2O ekleyin.
      NOT: Diğer tüm bileşenlerin konsantrasyonu ve toplam örnek hacmi, belirli uygulama ve deneysel kuruluma büyük ölçüde bağlıdır.
5. Karşılık gelen tampon, faz ayıran bileşenler, agaroz stoku ve katkı maddelerini önceden ısıtılmış 1,5 mL bir tüpe ekleyin.
   NOT: Önce tampon ve agaroz eklemeyi, ardından ek katkı maddelerini eklemenizi öneririz. Ayrıca, kondensat oluşumunu tetiklemek için faz ayıran bileşenlerin en son eklenmesini öneririz. Ancak, optimal karıştırma sırası sisteme bağlıdır ve önceden belirlenmelidir. Bu özellikle, stoichiometry ve toplama sırasının damlacık boyutunu veya bölümlenme etkisini güçlü şekilde etkileyebildiği sistemler için önemlidir. Örnek: Nukleokapsid örneğinin karıştırma sırası, önce Tampon A, ikinci agaroz stok, üçüncü nukleokapsid proteini ve son poli(A)'dır; bu hacimler Adım 2.4'te belirtilmiştir. Bu örnekte, LLPS poli(A) eklenmesiyle tetiklenir. LLPS'nin görünür bulanıklık ürettiği sistemlerde, bulanıklık niteliksel bir kalite kontrol göstergesi olarak hizmet edebilir; Ancak, başlangıç süresi ve görünürlük sisteme bağlıdır ve anlık bulanıklık eksikliği tek başına protokol hatasını göstermez.
   1. Tüpü ısıtma bloğunda veya su banyosunda tutun ve pipetleri birkaç kez yukarı aşağı indirin. Hava kabarcıklarını sokmaktan kaçının.
      NOT: Agararoz hâlâ sıvı iken, damlacıklar birleşebilir. Bu nedenle, jelleşmeye başlamadan önce ısıtma bloğunda veya su banyosunda kuluçka öncesi süreyi değiştirmek, farklı boyuttaki damlaları incelemek için faydalı bir araç olabilir. Agaroz olmadan önce kuluçka öncesi zaman aralığı seçilmeden önce damla büyüme kinetiklerinin karakterize edilmesi, araştırmacıların belirli bir damla boyut aralığını tekrarlanabilir şekilde hedeflemesine olanak tanır.
6. Mikroskopi / FRAP örnekleri için:
   1. Örneği tercih ettiğiniz mikroskopi slaytına hızlıca aktarmak için normal bir pipet kullanın (örneğin, kapak kaydırmalı kanal mikroskopi slaytı).
   2. RT'de 5–10 dakika boyunca jelleşmeye izin verin (tartışma bölümündeki nota bakınız).
      NOT: Bu süre boyunca mikroskopi slaytı hareket ettirmeyin. Flüoresan örnekleri ışıktan koruyun.
   3. Numuneyi standart protokole göre ölçün. Örnek: dönen disk konfokal mikroskop, 100x 1.45 plan apo yağ objektü, Cy3 boyası için uyarılma dalga boyu 561 nm, %30 lazer gücünde (Cy3) 100 ms ve %6 ışık yoğunluğunda (parlak alan) 50 ms elde et. FRAP için: Damlacı çapının 1/^10'u kadar ağartıcı bölgesi, damlanın ortasına yerleştirilen ağartıcı bölgesi, 25 ön ağartıcı çerçevesi (gecikmesiz alınma), 60 çamaşır sonrası çerçeve (1 saniye aralıklarla alınmış), 15 ms ağartma için lazer darbesi, %70 lazer gücünde. FRAP kurtarılmasını açık erişimli yazılımda tam ölçekli normalizasyon yoluyla analiz etmek; Kinetik uyum parametrelerini yalnızca montaj yapılırsa bildirin.
7. STORM örnekleri için:
   1. Örnek hızlı bir şekilde tercih ettiğiniz STORM slaytına (örneğin, örtülü tabanlı 18 kuyruklu odalı slayt) hızlı bir şekilde aktarmak için normal bir pipet kullanın. Numuneyi damla olarak dağıtın.
   2. RT'de 5–10 dakika boyunca jelleşmeye izin verin (tartışma bölümündeki nota bakınız).
      NOT: Bu süre boyunca mikroskopi slaytı hareket ettirmeyin. Flüoresan örnekleri ışıktan koruyun.
   3. Tüm kuyunu STORM tamponu ile doldurun. Kuyunu standart protokole göre mühürleyin.
   4. STORM tamponunun agaroz hidrojele yayılmasını sağlamak için numuneyi ölçümden en az 1–2 saat önce dengeleyin.
      NOT: STORM tamponunun numuneye başarılı bir şekilde difüzyonu, floresan boyalar STORM alımı sırasında yanıp sönürse kolayca doğrulanabilir. Örnek özelliklerine bağlı olarak, daha uzun denge süreleri gerekebilir.
   5. Örnek kullanılan standart protokole göre ölçün. Örnek: Ti2 ters mikroskop, SR apochromat TIRF 100x 1.49 yağ objekteferi, yüksek eğimli ince aydınlatma. Örnek başına 20.000 kare alınması, görüş alanı 64 x 64 piksel, Cy5 boyası için 125 mW 647 nm lazer ile 10 ms pozlama süresi ve uzun ömürlü karanlık durumdan temel duruma geçişi kolaylaştırmak için 20 mW 405 nm lazer kullanımı. Görüntüler, çoklu emitör uyumu ile maksimum olasılık tahmini kullanılarak işlendi. Sürüklenme düzeltmesi uygulandı ve son görselleştirmeye yalnızca 25 nm veya daha iyi lokalizasyon hassasiyetine sahip veri noktaları dahil edildi. Son görüntüler, ortalama kaydırılmış histogram yöntemiyle 20x büyütme ile (nihai görüntüde 1 piksel = 8 nm) üretilir.
8. NMR örnekleri için:
   1. Örneği NMR tüpüne hızlıca aktarmak için uzun, ince bir cam pipet (önceden ısıtılmış) kullanın. Numuneyi tüpün dibine dağıtın.
   2. RT'de 5–10 dakika boyunca jelleşmeye izin verin (tartışma bölümündeki nota bakınız).
      NOT: Bu süre boyunca NMR tüpünü sallamayın.
   3. Örnek kullanılan standart protokole göre ölçün. Örnek: PATXI oda sıcaklığında prob ile NMR 750 MHz alan gücü, 3 mm tüp, 25 °C'de alım, difüzyon (DOSY) deneyleri için standart darbe dizisi (stebpgp1s19), parametreler: 32 tarama ile 4.096 nokta, gradyan gücü 2–95%, difüzyon süresi 0.08 s, gradyan darbesi 12 ms, gevşeme gecikmesi (d1) 5 s.

Sonuçlar

Protokol, FUS N-terminal domaini (FUS NTD) veya SARS-CoV-2 nükleokapsid (N) proteini ve poli(A) veya s2m RNA ile oluşan kondensatlara uygulandı; bu örnekler hem sadece protein hem de protein-RNA damlalarının temsilci örnekleridir. Test edilen koşullarda agarozun kondensatın oluşumunu algılanabilir şekilde etkileyip etkilemediğini değerlendirmek için, %0,5 w/v LMA varlığı ve yokluğunda N protein ve poli(A) içeren damlacıklar oluşturduk. LMA, RT'de yaklaşık 5 dakika sonra katılaştığı için, bu zaman noktasında floresans mikroskopik görüntüler kaydettik ve damlaların her iki durumda da yaklaşık aynı boyutta olduğunu gözlemledik (Şekil 1A,B). Agarozun damla ıslatma ve füzyon üzerindeki önleyici etkisini göstermek için, örnek hazırlandıktan 60 dakika sonra başka bir görüntü seti kaydettik. Agaroz gömülü damlacıkların boyutları değişmese de, LMA yokken kondensatlar füzyon ve yüzey ıslanması nedeniyle büyük bir boyut artışı göstermiştir (Şekil 1A,B). Damlacıkları çekirdeklenmeden sonra nispeten erken yerleştirmiş olsak da, farklı boyutlarda damlalar gömüleme öncesi kuluçka süresini değiştirerek gömülebilir. Damlacıklar agaroz hidrojele gömülmesine rağmen, ölçülen yoğunlaşma dinamikleri algılanabilir şekilde değişmedi. FRAP geri kazanımı ve dolayısıyla görünür damla difüzyonu LMA ile ve olmadan da çok benzerdi (Şekil 1C). Ayrıca, FUS NTD kondensatlarıyla yapılan önceki difüzyon sıralı NMR spektroskopisi (DOSY) deneyleri, difüzyon oranlarının en azından %0,25–1 w/v aralığında agaroz konsantrasyonu tarafından tespit edilebilir şekilde etkilenmediğini göstermiştir (Şekil 1D) (Emmanouilidis ve ^ark.13'ten uyarlanmıştır). Bu sonuçlar, bir agaroz hidrojelin, faz ayrımlı kondensatları uzay ve zamanda yakalamak için uygun olduğunu ve uzun zaman dilimleri boyunca tekrar edilen ölçümlerin yapılmasını sağladığını göstermektedir.

Hem mikroskopi hem de FRAP ölçümleri kaydetmek oldukça hızlı (saniyeler ile dakikalar) olsa da, bazı deneyler birkaç dakika (örneğin, STORM, 1D ¹H NMR) veya hatta saat (örneğin, 2D [¹⁵N ¹H] HSQC NMR) gerektirir. Bu tür deneyler için, damlaların alım boyunca sabit kalması ve zamanla tortult oluşmaması çok önemlidir. Burada, LMA'da N protein + s2m RNA damlacıklarını STORM görüntüleri elde edecek kadar uzun süre stabilize ettiğimizi gösteriyoruz (Şekil 1E). Ayrıca, agarozun varlığı ve yokluğunda FUS NTD damlacıklarının NMR spektrumları karşılaştırılabilir çizgi genişliğine sahipti; bu da bu koşullar altında agaroz hidrojelleri ile protein arasında tespit edilebilir bir etkileşim olmadığını gösteriyor (Şekil 1F) (Emmanouilidis ve ^ark.13'ten uyarlanmıştır). Buna karşılık, agaroza gömülü kondensatların spektrumları daha yüksek sinyal yoğunluğu göstermiştir; muhtemelen stabilize edilmemiş damlacıkların alım sırasında NMR tüpünde birikmesi ve böylece artık ölçüme uygun olmaması nedeniyle (Şekil 1F) (Emmanouilidis ve ^ark.13'ten uyarlanmıştır). Sonuç olarak, agaroz hidrojellerindeki kondensatların stabilizasyonu sadece zaman süreci deneylerini mümkün kılmakla kalmaz, aynı zamanda testlenen temsil sistemlerde ölçülen damla özelliklerini korurken uzun alım sürelerine sahip metodolojilerin kullanılmasına da olanak tanır.

Şekil 1: Ölçülen damlacık özelliklerini algılanabilir şekilde bozmadan agaroz gömületiyle kondensat stabilizasyonu. (A) 15 μM nükleokapsid proteinin, 6 μM Cy3-poly(A) (%5 etiketli) ile tampon A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7.2) floresans mikroskopisi; %0,5 w/v LMA varlığı veya yokluğu (+ agaroz) varken veya yokluğunda (agaroz yok). Görüntüler, karıştırma / agaroz gömülmesinden 5 dakika veya 60 dakika sonra alındı. Görüntüler, n = 2 bağımsız deneyde elde edilen 7 görüntüyü temsil eder. Ölçek çubuğu = 5 μm. (B) (A)'da gösterilen yoğunlaşmaların damla yarıçaplarının nicelendirilmesi. Veriler kutu grafikleri olarak gösterilir (kutu = çeyreklerarası aralık, merkez çizgisi = median, bıyıklar = kalan veri aralığı, nokta = aykırılar). Ortalama yarıçap± standart sapma (sd) ve her durumda analiz edilen damlacık sayısı doğrudan grafikte gösterilmiştir. Veriler normal bir dağılımdan oluşur. Bireysel damlacıklar, istatistiksel çıkarım için bağımsız biyolojik kopyalar olarak ele alınmadı. İstatistiksel bir test yapılmadı; dağılımlar betimleyici olarak gösterilir. (C) (A)'da gösterilen damlaların FRAP'ı, zaman noktası 5 dakika. Fotobeyazlama ise 561 nm lazer (Cy3) ile gerçekleştirildi. Veriler, normalize edilmiş yoğunluğu (ortalama ± sd n = 3 bağımsız tekrar) gösterir; bu, ağartılmış sinyalin ağartıcı öncesi değerlere, aynı örnekten ağarmamış bir alana ve arka plan floresansına normalleştirilmesiyle elde edilir. (D) Tampon B'de 200 μM FUS NTD proteininin (30 mM HEPES, 200 mM KCl, 600 mM urea, pH 7.3) 0.25, 0.5 veya %1.0 w/v düzenli agaroz varlığında 200 μM FUS NTD proteininin donunmamış DOSY sinyali. N = 1. (E) 15 μM Cy5-nukleokapsid proteininin (%5 etiketlenmiş) konfokal floresan mikroskopisi ve STORM görüntüleri, tampon A'da %0,5 w/v LMA içeren 6 μM viral s2m RNA ile STORM görüntüleri. n = 3 bağımsız deneyin temsilcisi. Her iki görüntüde de ölçek çubuğu = 1 μm. (F) 1D ¹H NMR spektrumları (solda) ve 2D [¹⁵N ¹H] HSQC NMR spektrumları (sağda) tampon B'de %0,5 w/v düzenli agaroz varlığı veya yokluğunda 200 μM FUS NTD. N = 1. Paneller (D) ve (F) Emmanouilidis ve ^ark.13'ten kopyalanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Biyomoleküler kondensatların agaroz gömülmesinin başarısı birkaç faktöre bağlıdır. İlk olarak, agaroz, erken jelleşmeyi önleyecek kadar yüksek ve aynı zamanda biyomoleküler yapıları veya etkileşimleri bozmayacak kadar düşük sıcaklıklarda tutulmalıdır. Düşük erime agarozunun jelleşme noktası 26–30 °C ve erime noktası 60–65 °C iken, normal agarozun jelleşme noktası 34–38 °C ve erime noktası 90–95 °C civarındadır. İkinci olarak, hızlı karıştırma ve nihai reaksiyon kabına (örneğin NMR tüpü) aktarma kritik öneme sahiptir; çünkü zamanlama veya sıcaklıktaki küçük sapmalar eşit olmayan gömülmeye ve dolayısıyla tekrarlanabilirliğe yol açabilir.

Bu kritik noktalara rağmen, yöntem farklı deneysel ihtiyaçlara kolayca uyarlanabilir. Faz ayıran sistemlerde, içsel olarak düzensiz proteinlere sahip veya ısı denatürasyonuna yatkın olmayan sistemler için, maliyetten tasarruf etmek için LMA yerine normal agaroz kullanılabilir. Katlanmış domenli proteinler veya ısı denatürasyonuna yatkın diğer sıcaklık duyarlı (biyo-)moleküller içeren örnekler hazırlanırken, denatürasyonu önlemek için LMA kullanılmalıdır. Sadece ısılı/agarozsuz kontrol örneği hazırlanabilir; bu da agaroz gömülüşünün etkilerini geçici örnek ısınmasının etkilerinden ayırmak için hazırlanabilir. Bu sıcaklığa bağlı denatürasyon etkilerinin riskini azaltmak için, düşük eriyen agaroz özellikle sıcaklığa duyarlı örnekler için uygundur; agaroz konsantrasyonu ise mesh boyutunu ve mekanik hapsetme derecesini modüle edecek şekilde ayarlanabilir. Son derece hassas difüzyon ölçümlerinde, örneğin yakın zamanda geliştirilen NMR yöntemi olan LLPS REDIFINE ^15,16 için, tortulmayı önleyen en düşük agaroz konsantrasyonu genellikle tercih edilir; genellikle %0,3–0,5 w/v. Haftalar ile aylar süregelen stabilite gerektiren olgunlaşma deneyleri için %0,8–1 w/v tercih edilir. Bu parametreler, yoğun morfolojisi veya dinamikleri algılanabilir şekilde değiştirmeden etkili stabilizasyonu sağlamak için optimize edilmeli ve her zaman belirli sisteme uyarlanmalıdır. Bu doğrulama, agaroz gömülü ve olmayan örneklerin karşılaştırılmasını (ve aksi takdirde aynı koşullar) veya farklı agaroz konsantrasyonlarının karşılaştırılmasını (konsantrasyona bağlı mesh etkilerini dışlamak için) gerektirir; örneğin, damla morfolojisini mikroskopi kullanmak, difüzyonu değerlendirmek için FRAP kullanmak veya araştırmacı için önemli damla özelliklerini değerlendirmek için uygun başka yöntemler kullanılmak.

Gelleşme süresi bir diğer önemli bir faktördür. Agarozun katılaşma süresi, tampon türü, pH, nihai agaroz konsantrasyonu, başlangıç sıcaklığı ve düşük erime veya normal agarozun kullanılıp kullanılmadığı gibi birkaç faktöre bağlıdır. Genellikle agaroz 5–10 dakika içinde katılaşır. Agararoz stokunun jelleşmesi, numunenin jelleşmesi için bir gösterge olarak kullanılabilir. Benzer şekilde, agaroz gömülmesinden önceki kuluçka öncesi sürelerin değiştirilmesi, farklı damla boyutlarının tekrarlanabilir karakterizasyonunu mümkün kılar. Tampon seçimi de kritik¹⁴. Agararoz stokunun, örnekleri hazırlamak için kullanılan aynı tamponda hazırlanması hayati önemdedir; böylece tampon uyumsuzluğunu önler. Buffer, sistemin faz ayrılığı olarak bilindiği bir nokta olmalıdır.

Her sistem için sıcaklık hassasiyeti dikkate alınmalıdır. Birçok faz ayıran sistem, UCST/LCST tipi LLPS olarak bilinen termo-tersinable faz davranışı sergiler. Bu nedenle, agaroz karıştırma sırasında kısa süreli hafif yüksek sıcaklıklara maruz kalmak, faz davranışını veya ölçülen damla özelliklerini bozmadığından emin olmak için doğrulanmalıdır. Sorunlar ortaya çıkarsa, genellikle sıcaklık koşullarının iyileştirilmesi, kullanım süresinin en aza indirilmesi veya agaroz konsantrasyonunun ayarlanmasıyla çözülebilir. Örneğin, LMA hissesi ideal olarak 37 °C'ye ısıtılmış olsa da, LMA hisseleri 33–35 °C arasında likit kalmaya devam eder.

Sorun giderme önemlidir çünkü örnek ve deneysel kuruluma bağlı olarak farklı arıza modları ortaya çıkabilir. Damlacıklar agarozla karıştığında çözünürse, bu LMA'nın çok sıcak olmasından veya tampon uyumsuzluğundan kaynaklanabilir. Bu durumda, LMA stoku hedef sıcaklığın tam olarak veya birkaç derece altında tutulmalı ve ilgilenilen protein/RNA ile aynı tamponda hazırlanmalıdır. Pipet ucunda erken jelleşme meydana geliyorsa, bunun nedeni LMA'nın çok soğuk olması veya uçların önceden ısıtılmış olmaması olabilir. Bunu önlemek için, uçlar ve tüpler 37 °C'ye kadar önceden ısıtılmalıdır, operatör hızlı çalışmalı ve ısıtma bloğu hedef sıcaklıkta tutulmalıdır. Zamanla ıslanma, birleşme veya tortulma gerçekleşiyorsa, bunun nedeni jelin çok seyrek olması veya düz jelleşme olmasıdır. Bu durumda LMA konsantrasyonu artırılabilir ve oda sıcaklığında jelleşme bile sağlanmalıdır. Eğer agaroz çözeltisi görünür parçacıklar içeriyorsa, bu tam agaroz çözünmezliğinden kaynaklanabilir. Bu durumda, agaroz tamamen şeffaf olana kadar ısıtılmış ve kullanımdan önce iyice karıştırılmalıdır (örneğin, girdap haline getirilmiştir). Karıştırma veya pipet yaparken hava kabarcıkları girerse, bunlar görüntülemeyi engelleyebilir ve eşit olmayan yoğunlaşmaya yol açabilir. Baloncuk oluşumunu en aza indirmek için, çözeltiler yavaşça yukarı ve aşağı pipetle karıştırılmalıdır. Heterojen jelleşme veya düzensiz yoğuşma dağılımı gözlemlenirse, bunun nedeni jelleşme sırasında yetersiz karıştırma veya yerel sıcaklık gradyanlarından kaynaklanabilir. Bu durumda, örnekler tüm bileşenler eklenene kadar ısıtma bloğunda (veya su banyosu) üzerinde tutulmalı, hemen ama nazikçe karıştırılmış ve eşit sıcaklık koşullarında katılaşmasına izin verilmelidir. Dik sıcaklık gradyanlarından kaçınılmalıdır; Oda sıcaklığında katılaşma önerilir (ve buzdolabında katılıklaştırmadan kaçınılmalıdır). Uzun vadeli deneylerde, örnek buharlaştırılması çözünen konsantrasyonlarını ve kondensat özelliklerini değiştirebilir. Buharlaşmayı en aza indirmek için, örnekler uygun şekilde kapatılmalı ve mümkün olduğunda nem kontrollü bir ortamda tutulmalıdır.

Paraformaldehit fiksasyonu gibi yöntemlerin aksine, agaroz gömülü örnekleri kimyasal olarak sabitlemez. Bu nedenle, kondensatlar dinamik kalır; bu fonksiyonel çalışmalar için avantajlıdır ancak uzun vadeli depolamayı sınırlar. Uzun deneysel zaman dilimleri için, buharlaşma ve pH kaymaları gibi tampon değişikliklerini önlemek için önlemler alınmalıdır. Ayrıca, agaroz genellikle bu testlerde düşük etkileşimli olsa da, difüzyon veya yerel çevre üzerindeki dolaylı etkiler de dikkate alınmalıdır. Eğer agaroz-biyomolekül etkileşimlerinden şüpheleniyorsa, örneğin proteinin agaroza spesifik olmayan bağlanması, foto-çapraz bağlı polietilen glikol diakrilat (PEG-DA) gibi alternatif hidrojel matrisleri ve ağ boyutu ve gözenekliliği göz önünde bulundurulabilir. Etkileşimlerin yokluğu, matrisin varlığı ve yokluğunda FRAP ölçülmesiyle doğrulanmalıdır.

Kimyasal fiksasyonun yanı sıra, BSA-, PEG- veya yüzey aktif kaplı yüzeyler ve desteklenen lipid çift katmanları gibi yüzey pasifasyon stratejileri yoğunlaşma yapışmasını ve ıslanmasını azaltmak için yaygın olarak kullanılır. Bu yaklaşımlar yüzey etkileşimlerini etkili bir şekilde en az tutarken, yoğuşma hareketini, tortulmayı veya füzyonu engellemezler. Bu nedenle, agaroz gömülü, kondensat dinamiklerini korurken fiziksel immobilizasyon sağlayarak bu yöntemleri tamamlar; bu da özellikle uzun süreli deneyler, üç boyutlu görüntüleme ve kararlı örnek konumlandırması gerektiren nicel ölçümler için faydalı hale getirir. Bu nedenle yöntem seçimi deneysel amaç tarafından yönlendirilmelidir.

Genel olarak, agaroz hidrojeller, yoğunlaştırmaları üç boyutta stabilize etmek için basit ama etkili bir yöntem sunar. Bu, test edilen temsil sistemlerde ölçülen içsel özellikleri tespit edilebilir şekilde bozmadan damla ıslatma ve füzyonu önler; böylece zaman akışı deneyleri ve uzun alım süreleri gerektiren teknikler, örneğin NMR^{spektroskopisi 15} mümkün kılar. Bu yöntem, çeşitli nedenlerle tüm faz ayıran sistemler için uygun olmayabilir, ancak burada sunulan yöntem birkaç biyomoleküler kondensatın incelenmesine uygulanabilir ve özellikle nörodejeneratif hastalık mekanizmalarıyla ilgili olgunlaşma süreçlerini incelemek için faydalı^{olabilir 17}.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1.5 mL tüpler	herhangi bir marka uygundur	N/A
18 kuyucuklu oda slaytları	ibidi	81816	STORM için
düşük jellendirilme sıcaklığı agaroz	Sigma-Aldrich	A9414	moleküler biyoloji sınıfı
agaroz, ultra saf	Invitrogen	16500500
kanal slaytları	ibidi	80606	mikroskopi için
konfokal mikroskop	Nikon	N/A
Cy5 boya, NHS kimyası	Jena Biosciences	FP-201-CY5	protein etiketleme için
D2O (deuteryum oksit)	Sigma-Aldrich	151882
easyFRAP	Koulouras et al. 2018	N/A	https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29901776/
Everspark 2.0 dSTORM tamponu	idylle	KMO|ETE+
FUS NTD proteini	N/A	N/A	laboratuvarımızda referans 13'te tarif edildiği şekilde rekombinant olarak ifade edilmiştir (Emmanouilidis et al. Nat Chem Biol 2021)
ısıtma bloğu veya su banyosu	herhangi bir marka uygundur	N/A	herhangi bir marka veya model yeterlidir
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
görüntü analiz yazılımı	Fiji	N/A	https://fiji.sc/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NMR spektrometresi	Bruker	N/A	750 MHz, PATXI oda sıcaklığı probu, daha fazla bilgi için referans 13'e bakın (Emmanouilodis et al. Nat Chem Biol 2021)
NMR tüpü	Bruker	N/A	3 mm, cam
P10, P20, P200 ve P1000 pipetler	herhangi bir marka uygundur	N/A
pCp-Cy3 boya	Jena Biosciences	NU-1706-CY3	RNA etiketleme için
poli(A) RNA	N/A	N/A	laboratuvarımızda sentezlenmiş in vitro, uzunluk yaklaşık 50 nükleotitler, Kathe et al. Mol Biol Cell 2024'te açıklandığı gibi
s2m RNA	N/A	N/A	laboratuvarımızda sentezlenmiş in vitro, uzunluk 45 nükleotitler, dizi: 5'-GGUUCACCGAGGCCACGCGGAGU ACGAUCGAGUGUACAGUGAACC-3', Kathe et al. Mol Biol Cell 2024'te açıklandığı gibi
SARS-CoV-2 nukleokapsid proteini	N/A	N/A	laboratuvarımızda rekombinant olarak ifade edilmiştir, Kathe et al. Mol Biol Cell 2024'te açıklandığı gibi
çizim yazılımı (ör. R)	R-Project	Sürüm 4.2.1	https://www.r-project.org/
STORM mikroskop	Nikon N-STORM	N/A
ThunderSTORM eklentisi	Ovesny et al. 2014	N/A	https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4207427/
kullanılan pipetler için uçlar	herhangi bir marka uygundur	N/A
TopSpin	Bruker	Sürüm 3.2 ve 4.1
üre	Sigma-Aldrich	U5128