Yöntem makalesi

Stabil Olarak Transdüse Edilmiş Nakavt HEK293 Hücrelerinde Kurtarma Deneyleri Gerçekleştirmek İçin Cas9'un Hedeflenmesi

93 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/72172

⸱

28 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Le Moyne College, 2Department of Immunology and Microbial Disease, Albany Medical College

Bu makalede

Özet

Bu protokol, stabil olarak transdukte edilmiş nakavt hücre hatlarında güçlü kurtarma deneylerini kolaylaştırmak amacıyla, genom düzenlemesinden sonra Cas9 proteinini ortadan kaldırır.

Özet

CRISPR-Cas9 gen düzenleme teknolojisi moleküler biyolojide devrim yaratmıştır. Bu teknoloji sıklıkla, ilgilenilen bir proteini kodlayan bir geni silmek için kullanılır. Ortaya çıkan fenotip, proteinin fonksiyonuna dair değerli bilgiler sağlar. Hedef proteinin fonksiyonel önemi, kaybedilen fonksiyonu geri kazandırmak için proteinin yeniden hücreye aktarılmasıyla (rescue/kurtarma) doğrulanabilir. Bu işlem tipik olarak, bir ekspresyon vektörü kullanılarak protein kodlayan cDNA'nın trans şeklinde aktarılmasıyla gerçekleştirilir. Ancak, CRISPR-Cas9 sistemini stabil olarak eksprese eden nakavt hücre hatlarında, yeni aktarılan ekspresyon plazmidi de Cas9 tarafından kesilebilir. Burada sunulan protokol, kurtarma deneyleri önündeki bu potansiyel engeli aşmak için bir strateji sunmaktadır. Bu yaklaşım, E3 ubiquitin ligaz iskelet proteini CUL4B'yi kodlayan genin CRISPR-Cas9 ile bozulduğu HEK293 hücreleri kullanılarak gösterilmiştir. Bu hücrelerin, entegre Cas9 transgenini hedefleyen bir kılavuz RNA (gRNA) ile transduksiyonu, tespit edilebilir Cas9 proteininin kaybıyla sonuçlanmıştır. Cas9 eliminasyonu, bir CUL4B ekspresyon plazmidinin aktarılmasını takiben CUL4B ekspresyonunun ve fonksiyonunun geri kazanılmasını sağlamıştır. Bu sonuçlar, kurtarma deneyleri yoluyla protein fonksiyonlarını incelemek için geniş çapta uygulanabilir bir yaklaşım için kavram kanıtı sağlamaktadır.

Giriş

CRISPR-Cas9, prokaryotların bakteriyofaj enfeksiyonlarına karşı savunma için kullandığı, doğal olarak oluşan adaptif bir bağışıklık sisteminden türetilmiş güçlü bir genom düzenleme aracıdır. Düşük maliyeti, yüksek başarı oranı ve kullanım kolaylığı sayesinde CRISPR-Cas9 teknolojisi, özellikle hücre kültüründeki hassas genetik modifikasyonlar için çinko parmak nükleazlar (ZFN'ler) ve transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleazlar (TALEN'ler) gibi diğer genom düzenleme araçlarını geride bırakmıştır. İki bileşenli sistem, bir Cas9 nükleaz ve bir kılavuz RNA'dan (gRNA) oluşur. gRNA, Watson-Crick baz eşleşmesi yoluyla Cas9'u, bir protospacer adjacent motif (PAM) ile komşu olan genomik bir hedefe yönlendirir. PAM dizisi, nükleaz aktivitesine izin veren kritik bir tanıma bölgesi görevi görür. Cas9, bu bölgede çift zincir kırığı (DSB) oluşturur. Homolog bir onarım şablonunun yokluğunda, hücre DSB'yi non-homolog uç birleştirme (NHEJ) yoluyla onarır. Bu onarım mekanizması, çerçeve kayması mutasyonlarına ve hedef genin fonksiyonel nakavtına yol açan insersiyonlar veya delesyonlar (indeller) oluşturabilir. Bu nedenle, hedef gen bozulması, Cas9'un mühendislik ürünü bir gRNA ile birlikte aktarılmasıyla gerçekleştirilir. 20 nükleotidlik gRNA dizisi, PAM ile hemen komşu olan genomik bir bölgeyle tamamlayıcıdır. Hedef genin ortaya çıkan fonksiyon kaybı, söz konusu genin hücresel süreçlerdeki spesifik rollerini ortaya çıkarır1.

Bir kurtarma deneyi veya komplementasyon analizi, gözlemlenen fenotipin tersine döndüğünü kanıtlamak için eksik proteinin geri kazandırılmasını içerir. Bu yaklaşım, 'off-target' CRISPR-Cas9 delesyonlarından kaynaklananlar gibi istenmeyen deneysel etkileri dışlamak için titiz bir kontrol görevi görür. İlgilenilen bir proteinin yeniden hücreye aktarılması için en yaygın yöntem, ekzojen bir ekspresyon vektörünün transfeksiyonu veya transduksiyonudur. Ancak, hücreye aktarılan bu DNA, endojen lokus ile aynı CRISPR-Cas9 hedeflemesine karşı hassastır. Bu risk, özellikle konstitütif Cas9 ekspresyonunun homojen ve tutarlı bir knockout popülasyonu sağlamak için antibiyotik seleksiyonuyla birleştirildiği stabil transduce edilmiş hücre hatlarında oldukça yüksektir; bu strateji, immün, hematopoetik veya nöronal soy hatlarından türetilenler gibi transfekt edilmesi veya transduce edilmesi zor olan hücre hatlarında sıklıkla gereklidir.

Vektör hedeflemesini aşmanın bir yolu, ilgilenilen proteini kodlayan ekzojen mRNA iletmek ve böylece Cas9 aracılı kesimi ve nükleer transkripsiyon ihtiyacını devre dışı bırakmaktır. Ancak, plazmid DNA ile karşılaştırıldığında, sentetik mRNA'nın üretimi daha maliyetlidir, doğası gereği daha az stabildir ve oldukça geçici bir ekspresyon sağlar. Ayrıca, sitozolik doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını tetiklemekten kaçınmak için spesifik kimyasal modifikasyonlar gerektirir2.

Ekspresyon plazmidlerinin Cas9/gRNA kompleksi tarafından hedeflenmesini önlemek için kodlama dizisinin wobble baz mühendisliği uygulanabilir. Genetik kodun dejenerasyonundan yararlanılarak, kodlanan proteinin amino asit dizisini değiştirmeden gerekli PAM dizisini ortadan kaldırmak ve/veya gRNA komplementerliğini bozmak için eş anlamlı mutasyonlar eklenebilir. Ancak, eş anlamlı mutasyonların kullanımı risksiz değildir. Bu değişiklikler, translasyon kinetiğini bozabilecek ve proteinin yanlış katlanmasına, mRNA stabilitesinin azalmasına veya RNA ikincil yapısında zararlı değişikliklere yol açabilecek suboptimal kodon kullanımına neden olabilir3,4. Daha nadir olsa da, diğer potansiyel sonuçlar arasında kriptik poliadenilasyon sinyallerinin eklenmesi, transkripsiyon sonrası düzenleyici motiflerin bozulması ve artan CpG yoğunluğu yer almaktadır5,6. Ayrıca, mühendislik ürünü diziler, ortaya çıkan mRNA yapısı ribozomal ilerlemeyi engellerse yanlışlıkla hücresel stres yanıtlarını tetikleyebilir7,8.

Sentetik mRNA kullanımı veya wobble-baz mühendisliği ile ilişkili zorlukların ötesinde, düzenleme sonrası Cas9'un konstitütif ekspresyonu, sonraki analizlerde birkaç karıştırıcı değişken ortaya çıkarır. Cas9 özgüllüğü kusurlu olabildiğinden, sürekli ekspresyon hedef dışı kesilme olasılığını artırarak zamanla istenmeyen mutasyonların kümülatif olarak kazanılmasına yol açar9,10,11. Ayrıca, kronik genomik gözetim ve tekrarlayan DSB'ler, kalıcı bir DNA hasar yanıtını tetikleyebilir ve nihayetinde hücreleri hücre döngüsü durması, yaşlanma veya apoptoza sürükleyebilir12,13. Bu konstitütif üretim aynı zamanda metabolik bir yük oluşturur ve böylece düşük ekspresyonlu hücrelerin yüksek ekspresyonlu hücrelerle rekabet ederek onları alt ettiği klonal sürüklenmeyi potansiyelleştirerek, ardışık pasajlar boyunca tutarsız transgen seviyelerine neden olur. Son olarak, büyük bir prokaryotik protein olan Cas9, doğuştan gelen bağışıklık sinyallemesi yoluyla stres tetikleyebilir veya konakçının proteostaz mekanizmasını aşırı yükleyerek katlanmamış protein yanıtını indükleyebilir14,15,16.

Bu komplikasyonları hafifletmek için, faj kaynaklı Anti-CRISPR proteinleri (Acrs)17,18, küçük molekül inhibitörleri veya PROTAC'lar gibi degron-füzyon sistemleri19,20 ve optogenetik kontrol mekanizmaları19,21 dahil olmak üzere çeşitli geçici Cas9 inhibisyon stratejileri geliştirilmiştir. Ancak bu yaklaşımlar, kurtarma (rescue) analizlerindeki kullanımlarını kısıtlayan pratik engeller ortaya çıkarmaktadır. Acrs, moleküler taklit yoluyla inhibisyon sağlar ve bu nedenle hassasiyet için stokiyometrik optimizasyon gerektirir. Ayrıca Acrs, Cas9 aşırı ekspresyonu ile ilişkili proteostatik ve immünojenik stresleri şiddetlendirebilir. Kimyasal modülasyon; farmakokinetik karmaşıklıklar, potansiyel sitotoksisite ve aşırı ligand konsantrasyonlarının paradoksal olarak üretken üçüncül kompleks oluşumunu engellediği PROTAC kaynaklı 'kanca etkileri'ni (hook effects) beraberinde getirir22. Optogenetik platformlar ise hücresel fototoksisite ve tutarlı ışık iletimini sağlamak için gereken özel donanım gereksinimi ile sınırlıdır19,21. Önemli bir nokta olarak, bu yöntemler yalnızca geçici veya geri döndürülebilir inhibisyon sağladıkları için, Cas9'un konstitütif olarak eksprese edildiği uygulamalar için genellikle yetersiz kalmaktadırlar.

Buna karşılık, kendi kendini inhibe eden CRISPR sistemleri, başarılı hedef gen düzenlemesinin hemen ardından Cas9 transgenini otonom ve kalıcı olarak bozarak kalıcı bir çözüm sunar. Kalıntı nükleaz aktivitesini ortadan kaldıran bu yaklaşım, aynı zamanda uzun vadeli proteostatik stresi ve hedef dışı genomik kaymayı azaltırken, sonraki kurtarma vektörlerini kalıcı olarak kesilmeye karşı korur. Kendini yönlendiren gRNA'lar, geçici ribonükleoprotein veya lipid tabanlı transfeksiyonlar yoluyla iletilebilse de23,24, bu yöntemler seyreltilmeye ve stokastik varyasyona eğilimlidir; bu da bazı hücrelerin inaktivasyondan kurtulduğu "mozaik" bir popülasyonla sonuçlanır25,26,27.

Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, burada açıklanan protokol, stabil hücre hattı modifikasyonu için belirgin pratik avantajlar sunan bir Cas9 kendi kendine inaktivasyon lentiviral iletim sisteminden yararlanmaktadır. Lentiviral iletim, Cas9 transgeninin ve kendi yönlendirmeli regülatörünün bağlantılı kalıtımını sağlayarak, hızla bölünen popülasyonlarda tipik olan 'seyrelme kaçışını' (dilution escape) etkili bir şekilde önler. Ayrıca, lentiviral vektörlerin genişletilmiş yük kapasitesi, homojen bir Cas9-silinmiş popülasyon sağlamak için seçim markerlarının ko-ekspresyonuna izin verirken; VSV-G psödotipleme ile sağlanan geniş tropizmleri, transfekte edilmesi zor hücre tiplerine yüksek verimli iletimi kolaylaştırır25,28,29.

Bu yöntemin bir kavram kanıtlama gösterimi olarak bu protokol, CUL4B-nakavt HEK293 hücrelerinde30 E3 ubiquitin ligaz iskele proteini CUL4B'nin fenotipik kurtarmasını kolaylaştırmak için Cas9'un kendi kendini inaktive etmesini detaylandırmaktadır.

Protokol

Bu çalışmada yerleşik ölümsüzleştirilmiş insan hücre hatları (HEK293 ve HEK293FT) kullanılmış olup, insan katılımcılar, primer insan dokuları veya hayvan deneyleri gerçekleştirilmemiştir. Bu nedenle, kurumsal etik onay gerekmemiştir.

1. Cas9-spesifik gRNA lentiviral konstrüktun oluşturulması

  1. Cas9'a özgü gRNA dizisini (Tablo 1) pLentiGuide-Puro lentiviral vektörüne yerleştirin.
  2. Antibiyotik direnç genini, stabil olarak transdukte edilmiş CRISPR-Cas9 hücre hattını seçmek için kullanılan direnç markerından farklı olan bir genle değiştirin.
  3. Vektöre özgü primerler kullanarak Sanger dizileme ile hem Cas9'a özgü gRNA'nın hem de değiştirilen antibiyotik direnç geninin başarılı bir şekilde yerleştirildiğini ve dizi sadakatini doğrulayın.
    NOT: Bu protokolde, Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro vektörünü oluşturmak için puromisin direnç (PuroR) geni, higromisin B direnç (HygroR) geni ile değiştirilmiştir. Alternatif antibiyotik direnç genleri arasında blastisidin S (BlastR), G418/Geneticin (NeoR) ve zeocin (ZeoR) yer almaktadır.

2. Cas9-spesifik gRNA kodlayan lentivirüs üretimi

  1. 10 cm'lik doku kültürü işleminden geçmiş bir kaba 2,5 × 106  HEK293FT hücresi ekiniz.
    NOT: Hücreleri %10 fetal bovine serum (FBS) ile takviye edilmiş Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; yüksek glukoz) (bundan böyle cDMEM olarak anılacaktır) içerisinde tutunuz ve %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de inkübe ediniz. Diğer HEK293 türevli hücre hatlarına göre daha yüksek lentiviral titrerler ürettikleri için HEK293FT hücreleri kullanılır31.
  2. Transfeksiyondan önce hücreleri, en az %60 konfluense ulaşana kadar 12 saat boyunca inkübe ediniz.
    UYARI: Üçüncü nesil lentiviral vektörleri içeren tüm prosedürleri, Pauwels ve ark.32 tarafından tanımlandığı üzere, uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) ve onaylanmış dekontaminasyon prosedürleri (örneğin, Sınıf II biyolojik güvenlik kabini, ikincil koruma ve %70 etanol) kullanarak Biyogüvenlik Seviyesi 2 (BSL-2) koşulları altında gerçekleştiriniz.
  3. Standart bir kalsiyum fosfat (CaPhos) transfeksiyon karışımı hazırlayınız. 20 µg toplam plazmid DNA'yı steril moleküler biyoloji sınıfı su ile nihai hacim 450 µL olacak şekilde seyreltiniz. 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpünde nihai hacim 1 mL olacak şekilde 50 µL 2,5 M CaCl2 ve ardından 500 µL 2× HEPES tamponlu salin (HBS; pH 7,05) ekleyiniz.
    NOT: A260/A280 = 1,8–2,0, A260/A230 = 2,0–2,2 ve endotoksin <0,1 EU/µg kalite kriterlerini karşılayan, dizisi doğrulanmış, ağırlıklı olarak süper kıvrımlı (supercoiled) plazmid DNA kullanınız. Transfeksiyon karışımını; 5 µg Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro, 5,6 µg pLP1 (Gag/Pol), 3,8 µg pLP2 (Rev) ve 5,6 µg pLP/VSVG (veziküler stomatit virüsü glikoproteini) içeren yaklaşık ekimolar bir oran kullanarak hazırlayınız.
  4. CaPhos transfeksiyon solüsyonunu nazikçe pipetleyerek iyice karıştırınız.
  5. 1 mL CaPhos transfeksiyon karışımını HEK293FT hücre kültürüne damla damla ekleyiniz.
  6. Transfeksiyon komplekslerini eşit şekilde dağıtmak için kültür kabını nazikçe sallayınız.
  7. Hücreleri 12 saat boyunca inkübe ediniz.
    NOT: Kalsiyum fosfat transfeksiyonu genellikle standart idame antibiyotiklerinden etkilenmez33. Ancak, poliyaniyonik antibiyotikler DNA-lipid kompleks oluşumuna müdahale edebileceği için lipofeksiyon gibi daha hassas transfeksiyon yöntemleri için antibiyotiksiz bir ortam önerilir34.
  8. Kültür ortamını aspire ederek uzaklaştırınız.
  9. Hücreleri oda sıcaklığındaki 10 mL steril 1× fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir kez yıkayınız.
  10. PBS'yi aspire ederek uzaklaştırınız.
  11. 10 mL taze oda sıcaklığında cDMEM ekleyiniz.
  12. Hücreleri inkübatöre geri yerleştiriniz ve lentiviral partiküllerin kültür ortamında 36 saat boyunca birikmesine izin veriniz.
    NOT: Bu koşullar altında, konsantre edilmemiş lentiviral süpernatanın 48 saat sonra yaklaşık 1,0 × 106 transduksiyon birimi (TU)/mL vermesi tahmin edilmektedir; ancak gerçek titer, Kutner ve ark.35 veya Barde ve ark.36 tarafından açıklandığı üzere deneysel olarak belirlenmelidir. Lentiviral süpernatanı −80 °C'de 2 yıla kadar saklayınız. Viral titeri yaklaşık %55 oranında azaltabileceği için tekrarlanan dondurma-çözme döngülerinden kaçınınız37,38,39,40.

3. Cas9-özgü gRNA kodlayan lentivirüslerin hasadı ve hedef hücrelerin transduksiyonu

  1. Tohumlama 1.0 × 106 10 cm'lik doku kültürü işleminden geçmiş bir kapta adherent hedef hücreler.
  2. Lentiviral transdüksiyon öncesinde hedef hücreleri 12 saat inkübe edin.
    NOT: Hedef hücreler, stabil olarak eksprese eden HEK293 hücreleridir Streptococcus pyogenes Cas9, bir CUL4B-hedefleyen gRNA (Tablo 1), ve bir puromisin direnç (PuroR) geni. Hücreleri, içeriğinde şunlar bulunan cDMEM içerisinde muhafaza edin: 10 µg/mL puromisin ile seçin ve Cas9 kendi kendini inaktive etmeden önce CUL4B kaybını western blot analizi ile doğrulayın. Sonraki tüm deneyleri erken pasaj HEK293 hücreleri kullanarak gerçekleştirin.ΔCUL4B hücreler
  3. Hücre monotabakasını bozmamaya dikkat ederek, HEK293FT üretici hücrelerden gelen süpernatantı steril bir 15 mL'lik konik tüpe dikkatlice aktararak lentivirüs içeren ortamı toplayın.
    NOT: HEK293FT üretici hücrelerini yerleşik biyogüvenlik kılavuzlarına uygun olarak imha edin32.
  4. Toplanan süpernatantı 1.000'de santrifüj edin × g Kalıntı HEK293FT üretici hücrelerini çöktürmek için oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
  5. Önceden ekim yapılmış HEK293 hücrelerinden kültür ortamını aspire ederek uzaklaştırınΔCUL4B hücreler
  6. Berraklaştırılmış lentiviral süpernatantın 7 mL'sini, HEK293 hücreleri içeren 10 cm'lik petri kabına aktarın.ΔCUL4B hücreler. Santrifüj tüpünün dibindeki peleti rahatsız etmekten kaçının ve üretici hücrelerin taşınmasını en aza indirmek için en az 1 mL kalıntı süpernatan bırakın.
    NOT: Süpernatantı bir ... aracılığıyla filtreleyin 0.45 µm artık üretici hücreleri daha fazla ayıklamak için, istenirse filtreleyin. Kalan süpernatanı biyogüvenlik kılavuzlarına uygun olarak atın32Tahmini 1,0 titredir × 106 TU/mL; 7 mL'lik bir inokülümün, 3,5 ile 5,5 arasında bir enfeksiyon çokluğu (MOI) oluşturması beklenmektedir41.
  7. Transdükte edilmiş HEK293 hücrelerini inkübe edinΔCUL4B lentiviral transdüksiyonun ve entegrasyonun tamamlanması için hücreleri 24 saat bekletin.
  8. Viral süpernatanı aspire edin ve atın.
  9. Hücreleri, oda sıcaklığındaki 10 mL steril 1 ile bir kez yıkayın× PBS.
  10. PBS'yi aspire edin ve atın.
  11. 10 mL taze, oda sıcaklığında cDMEM ekleyin.
  12. Hücreleri inkübatöre geri yerleştirin ve transgen ekspresyonu ile Cas9 bozunumu gerçekleşmesi için dört gün boyunca kültüre edin.
    NOT: Lentiviral Cas9 gRNA vektörü floresan bir raporlayıcı kodlamıyorsa, benzer şekilde üretilmiş ve floresan bir raporlayıcı eksprese eden bir lentiviral vektör ile paralel bir sentinel kültür transduksiyonu gerçekleştirin. Transduksiyon verimliliğini ve hedef gen azalmasının zamanlamasını tahmin etmek için kalitatif floresan mikroskobisi veya kantitatif akış sitometrisi kullanarak sentinel kültürü kullanın. Bu çalışmada, GFP ekspresyonu transduksiyondan dört gün sonra floresan mikroskobisi ile kolaylıkla tespit edilmiştir.

4. Cas9-spesifik gRNA transdüktanlarının antibiyotik seçilimi

NOT: Transdüksiyondan dört gün sonra, hedef hücreler konfluense ulaşmış veya konfluense yakın olmalıdır ve daha büyük bir kültür kabına aktarılmaları gerekir. Hücre aktarımını, antibiyotik seçiliminin başlatılmasıyla eş zamanlı olarak gerçekleştirin.

  1. HEK293ΔCUL4B hücrelerinden kültür besiyerini aspire ederek uzaklaştırın.
  2. Hücreleri, oda sıcaklığındaki 10 mL steril 1× fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir kez yıkayın.
  3. PBS'yi aspire ederek uzaklaştırın.
  4. Kültür kabına 2 mL steril, oda sıcaklığında trypsin-EDTA çözeltisi ekleyin.
  5. Ayrılmayı teşvik etmek için hücreleri 5 dk inkübe edin.
  6. Trypsin'i nötralize etmek için 8 mL oda sıcaklığında cDMEM ekleyin.
  7. Hücre süspansiyonunu steril 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
  8. Hücre agregatlarını tamamen dağıtmak için hücre süspansiyonunu 15–20 kez tritüre edin.
  9. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dk boyunca 200 × g hızında santrifüjleyin.
  10. Hücreler santrifüjlenirken, 250 µg/mL hygromycin B ile takviye edilmiş 20 mL cDMEM içeren T150 doku kültürü işlemli bir flask hazırlayın.
    NOT: Seleksiyon için gerekli olan hygromycin B konsantrasyonu hücre tipleri arasında farklılık gösterebilir. Tüm transdükse edilmemiş hücreleri 7–10 gün içinde yok etmek için gereken minimum konsantrasyonu belirlemek amacıyla 50–500 µg/mL hygromycin B kullanarak bir öldürme eğrisi (kill curve) oluşturun. Cas9 gRNA vektöründe alternatif bir antibiyotik direnç belirteci kullanılıyorsa, 2–10 µg/mL blasticidin S, 400–800 µg/mL G418/Geneticin veya 50–400 µg/mL zeocin kullanarak öldürme eğrisi oluşturun.
  11. Hücre pelletini rahatsız etmeden süpernatantı aspire ederek uzaklaştırın.
  12. Hücre pelletini, 250 µg/mL hygromycin B ile takviye edilmiş 10 mL cDMEM içinde yeniden süspande edin.
  13. 10 mL'lik hücre süspansiyonunu, 20 mL seleksiyon besiyeri içeren hazırlanan T150 flask'ına aktarın.
  14. Hücrelerin eşit dağılması için flask'ı nazikçe sallayın.
  15. Hücreleri üç gün boyunca seleksiyon altında inkübe edin.
  16. Seleksiyonun 3. gününde, seleksiyon besiyerini aspire ederek uzaklaştırın ve yerine 250 µg/mL hygromycin B ile takviye edilmiş 30 mL taze cDMEM ekleyin.
    NOT: Seleksiyon besiyerinin değiştirilmesi, yapışmayan ölü hücreleri uzaklaştırır, besinleri yeniler ve antibiyotik aktivitesini korur.
  17. Hayatta kalan hücre monotabakası yaklaşık %90 konfluense ulaşana kadar, genellikle ek dört gün sonra, inkübasyona devam edin.

5. Cas9 temizlenmesinin doğrulanması ve in trans CUL4B kurtarma

NOT: Hücreler yaklaşık %90 konfluense ulaştığında, ilk deneylerde Cas9 ablasyonunu doğrulayın ve geri kalan hücre popülasyonunu derhal kriyoprezerve edin42. Bu yaklaşım, ikincil kompansatuar mekanizmaların gelişmesini en aza indirir.

  1. Cas9-hedefli bir gRNA'yı stabil olarak eksprese eden erken pasaj HEK293ΔCUL4B hücrelerini (bundan sonra HEK293ΔCUL4BΔcas9 olarak anılacaktır), doku kültürü ile işlem görmüş 6 kuyucuklu bir plakadaki dört kuyucuğa, kuyucuk başına 2.5 × 105 hücre yoğunluğunda ekiniz.
  2. HEK293ΔCUL4B hücrelerini ayrı bir 6 kuyucuklu plağın dört kuyucuğuna ekiniz. Kontrol olarak hizmet etmesi için parental HEK293 hücrelerini en az bir ek kuyucuğa ekiniz.
    NOT: Cas9 ve CUL4B ekspresyonları için kontroller olarak sırasıyla HEK293ΔCUL4B ve parental HEK293 kültürlerini kullanınız.
  3. Hücrelerin tamamen tutunması ve aktif proliferasyon için tüm kültürleri 12 sa boyunca inkübe ediniz.
  4. 0, 0.5, 1.0 veya 2.0 µg pCMV-FLAG-CUL4B içeren kalsiyum fosfat (CaPhos) transfeksiyon karışımları hazırlayınız. Boş bir pCMV vektörü ekleyerek her karışımı sabit 10 µg plazmid DNA toplamına ayarlayınız.
  5. Her DNA karışımını steril moleküler biyoloji sınıfı suda 180 µL son hacme seyreltiniz, 20 µL 2.5 M CaCl2 ekleyiniz ve ardından 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 400 µL son hacim elde etmek için 200 µL 2× HEPES tamponlu salin (HBS; pH 7.05) ekleyiniz.
    NOT: Güçlü promotörler (örneğin, CMV) tarafından yönlendirilen ekspresyon plazmidleri kullanıldığında, endojen ekspresiyona benzer protein ekspresyon seviyelerine ulaşmak için bir DNA titrasyonu gerçekleştiriniz. A260/A280 değerleri 1.8–2.0, A260/A230 değerleri 2.0–2.2 ve endotoksin seviyesi <0.1 EU/µg olan, sekansı doğrulanmış, ağırlıklı olarak süperkıvrımlı plazmid DNA kullanınız.
  6. Her CaPhos transfeksiyon çözeltisini nazikçe pipetleyerek iyice karıştırınız.
  7. Her transfeksiyon karışımından 200 µL'yi, HEK293ΔCUL4BΔcas9 hücreleri içeren belirlenmiş kuyucuğa damla damla ekleyiniz. Çapraz kontaminasyonu önlemek için örnekler arasında pipet uçlarını değiştiriniz.
  8. Her bir karşılık gelen transfeksiyon karışımının kalan 200 µL'sini, HEK293ΔCUL4B hücreleri içeren belirlenmiş kuyucuğa damla damla ekleyiniz.
  9. Transfekte edilen kültürleri 12 sa boyunca inkübe ediniz.
  10. Her kuyucuktaki kültür ortamını aspire ederek uzaklaştırınız.
  11. Hücreleri oda sıcaklığındaki steril 1× PBS ile bir kez yıkayınız.
  12. PBS'yi aspire ederek uzaklaştırınız.
  13. Her kuyucuğa 2 mL taze oda sıcaklığında cDMEM ekleyiniz.
  14. CUL4B ekspresyonu ve alt fonksiyonel yanıtların gerçekleşmesi için kültürleri ek 24 sa boyunca inkübe ediniz.
  15. Standart tripsinizasyon prosedürlerini kullanarak hücreleri hasat ediniz.
  16. Her hücre süspansiyonunu ayrı bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarınız.
  17. Her hücre süspansiyonunu 1× PBS ile bir kez yıkayınız.
  18. Hücreleri çöktürmek için örnekleri oda sıcaklığında 14,000 × g'de kısa süreli santrifüjleyiniz.
  19. PBS süpernatantını aspire ederek uzaklaştırınız.
    DİKKAT: β-merkaptoetanol, güçlü kokulu, uçucu bir cilt ve solunum yolu iritanıdır. Stok çözeltileri, kimyasallara dayanıklı eldivenler, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlükler dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman giyerek onaylı bir kimyasal çeker ocakta kullanınız. Kontamine uçları, tüpleri ve atıkları kurumsal tehlikeli atık yönergelerine göre bertaraf ediniz.
  20. Her hücre peletini, %5 (v/v) β-merkaptoetanol ile tamamlanmış 200 µL Laemmli örnek tamponu içinde doğrudan lizleyin.
  21. Örnekleri 95 °C'de 15 dk ısıtarak proteinleri denatüre ediniz.
  22. Şerit başına 20–40 µg toplam proteini standart sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayırınız.
  23. Ayrılan proteinleri bir poliviniliden florür (PVDF) membrana aktarınız.
  24. Membranı bloklama tamponu kullanarak oda sıcaklığında 30 dk boyunca bloklayınız.
    NOT: Bloklama tamponunu, standart yıkama tamponunda (1× Tris tamponlu salin veya 1× PBS içinde %0.1 Tween 20) çözünmüş %5 (w/v) yağsız kuru süt veya %5 (w/v) sığır serum albümini (BSA) kullanarak hazırlayınız.
  25. Membranı standart yıkama tamponu ile üç kez, her biri 10 dk olacak şekilde yıkayınız.
  26. Membranı CUL4B, Cas9, WDR5, CDC6 veya α-TUBULIN'e karşı birincil antikorlarla 4 °C'de, nazikçe sallayarak 12 sa boyunca inkübe ediniz.
    NOT: Birincil antikorları standart yıkama tamponunda 1:1,000 oranında seyreltiniz.
  27. Birincil antikor çözeltisini uzaklaştırınız ve membranı standart yıkama tamponu ile üç kez, her biri 10 dk olacak şekilde yıkayınız.
  28. Membranı uygun horseradish peroksidaz (HRP)-konjuge anti-fare veya anti-tavşan IgG ikincil antikoru ile 4 °C'de, nazikçe sallayarak 12 sa boyunca inkübe ediniz.
    NOT: İkincil antikorları bloklama tamponunda 1:3,000 oranında seyreltiniz.
  29. İkincil antikor çözeltisini uzaklaştırınız ve membranı standart yıkama tamponu ile üç kez, her biri 10 dk olacak şekilde yıkayınız.
  30. Geliştirilmiş kemilüminesans (ECL) substratını membran üzerine eşit şekilde uygulayınız ve 1 dk inkübe ediniz.
  31. Kemilüminesans sinyallerini bir dijital görüntüleme sistemi kullanarak yakalayınız.
    NOT: İstenirse, izole edilen genomik DNA'nın PCR amplifikasyonunun ardından hedeflenen genomik bölgenin Sanger sekanslaması ile başarılı gen bozulması onaylanabilir43.

Sonuçlar

Deneysel rekonstitüsyon için Cas9-ablate knockout hatları oluşturmak amacıyla, Cas9'u hedefleyen bir gRNA kodlayan lentivirüs (Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro), standart paketleme plazmidleri (pLP1, pLP2 ve pLP/VSVG) kullanılarak HEK293FT hücrelerinde üretilmiştir. Elde edilen viral süpernatan toplanmış ve hedef hücreleri transduksiyon yapmak için kullanılmıştır. Higromisin B seleksiyonu sırasındaki sağkalım, lentiviral transduksiyonun başarılı olduğunu doğrulamış ve ardından yapılan western blot analizi Cas9 ablasyonunu onaylamıştır (Şekil 1).

CUL4B proteini, parental HEK293 hücrelerinde kolaylıkla tespit edilirken, boş vektör transfekte edilmiş HEK293ΔCUL4B ve HEK293ΔCUL4BΔcas9 hücrelerinde bulunmamaktaydı. CUL4B kaybı ile uyumlu olarak, WDR5 ve CDC6'nın durağan durum ekspresyonlarında sırasıyla beklenen artış ve azalmalar görülmüş, bu da CUL4B fonksiyonunun bozulduğunu doğrulamıştır. Cas9 proteini HEK293ΔCUL4B hücrelerinde tespit edilmiş ancak parental HEK293 ve HEK293ΔCUL4BΔcas9 hücrelerinde tespit edilememiştir; bu durum Cas9 ablasyonunun başarılı olduğunu onaylamıştır. Beklendiği üzere, CUL4B ekspresyon plazmidinin HEK293ΔCUL4B hücrelerine transfeksiyonu, CUL4B protein ekspresyonunun yalnızca minimal düzeyde geri kazanımıyla sonuçlanmıştır. Buna karşılık, HEK293ΔCUL4BΔcas9 hücrelerinin transfeksiyonunu takiben güçlü bir CUL4B ekspresyonu gözlemlenmiş ve buna paralel olarak, azalan WDR5 ve artan CDC6 seviyeleriyle kanıtlandığı üzere, downstream protein ekspresyonu yeniden sağlanmıştır. Birlikte ele alındığında bu bulgular, Cas9 ablasyonunun, kurtarma plazmidinin Cas9 aracılı kesilmesini önleyerek CUL4B ekspresyonu ve fonksiyonunun verimli bir şekilde geri kazanılmasını sağladığını göstermektedir (Şekil 2).

figure-results-1
Şekil 1: Cas9'un stratejik ablasyonu ve CUL4B kurtarma doğrulaması için deneysel iş akışı. Bu iş akışı; HEK293FT üretici hücrelerin pLP1, pLP2, pLP/VSVG ve bir Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro konstrüktü ile kalsiyum fosfat transfeksiyonu yoluyla ko-transfekte edilmesiyle Cas9-ablate CRISPR nakavt hücrelerinin oluşturulmasını özetlemektedir. Elde edilen lentiviral süpernatan toplanır, kalıntı üretici hücreleri temizlemek için santrifüj edilir ve hedef hücreleri transduse etmek için kullanılır. Seleksiyonun ardından, deneysel CUL4B rekonstitüsyonuna hazır temiz bir nakavt hücre hattı oluşturmak için başarılı Cas9 ablasyonu western blot analizi ile doğrulanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: CRISPR-Cas9 ile düzenlenmiş HEK293 hücrelerinde CUL4B ekspresyonunun ve fonksiyonunun geri kazanımı. (A) Transfeksiyon iş akışının deneysel şeması. HEK293ΔCUL4B   ve HEK293ΔCUL4BΔcas9 hücreleri, boş bir vektör veya artan miktarlarda pCMV-FLAG-CUL4B ile transfekte edildi. Hücreler transfeksiyondan 36 h sonra toplandı ve lizat proteinleri SDS-PAGE ile ayrıştırıldı. (B) Kurtarma verimliliğinin ve aşağı akış fonksiyonel kontrollerinin Western blot analizi. Belirtilen proteinler Western blot ile görselleştirildi. WDR5 ve CDC6, CUL4B fonksiyonu için kontrol olarak kullanıldı. α-TUBULIN yükleme kontrolü olarak kullanıldı. Ebeveyn HEK293 hücreleri, bazal ekspresyon için kontrol olarak kullanıldı. Blotlar, tekrarlanan deneyleri (n = 2) temsil etmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Hedef GengRNA Dizisi (5′→3′)PAM (5′→3′)Hedef KonumuHedef Açıklaması
CUL4BATCAAACCCTACAAACTCCAAGGXq24 Ekson 3Çerçeve kayması nakavtı (frame-shift knockout) için insan CUL4B ORF'sinin N-terminal bölgesi
cas9CGTGATCACCGACGAGTACAAGGORF (hSpCas9)Kendi kendini inaktive eden indelleri tetiklemek için cas9 transgeninin korunmuş iç bölgesi

Tablo 1: CRISPR-Cas9 kılavuz RNA dizileri ve genomik hedef spesifikasyonları.

Tartışma

Bu protokol, düzenleme sonrası Cas9'un ortadan kaldırıldığı CRISPR-Cas9 ile düzenlenmiş nakavt hücre hatlarında, hedef protein ekspresyonunun ve fonksiyonunun sağlam bir şekilde geri kazandırılmasını sağlamıştır. Bu çalışmadan elde edilen dikkat çekici bir gözlem, konstitütif Cas9 ekspresyonunun, plazmid kaynaklı transgen ekspresyonunu önemli ölçüde baskılamasıdır. Bu protokolün gücü, hem kaybedilen proteini hem de onunla ilişkili fenotipi kurtarma yeteneğinde yatmaktadır. Bu yöntem ayrıca, çok çeşitli protein değişikliklerinin fenotipik keşfi için bir çerçeve oluşturmaktadır. Örneğin, fosfomimetik (örneğin, serinden aspartik aside) bir varyantınlendirilmesi, doğal proteinin karıştırıcı etkisi olmadan, söz konusu post-translasyonel modifikasyonun rolüne dair değerli bilgiler sağlayabilir.

Sonuç olarak, bu protokol standart adherent (örneğin, HeLa, A549) ve süspansiyon (örneğin, Jurkat, THP-1) hücre hatları için geniş ölçüde uygulanabilirdir. Ancak, bu ardışık seçim çerçevesi primer veya bölünmeyen hücreler (örneğin, primer nöronlar veya makrofajlar) için kullanışsız olabilir. Bu hassas sistemlerde, transduksiyonu gerçekleşmemiş bystander hücrelerin hızla temizlenmesi, ortak mikroortama sitotoksik döküntüler ve pro-apoptotik stres sinyalleri salarak dolaylı toksisiteye yol açar46,47. Benzer şekilde, hızlı kromozomal yeniden düzenlemeler veya mevcut dirençli klonların hızla seçilmesi yoluyla CRISPR aracılı fenotiplerden kaçmaya meyilli olan, yüksek derecede adapte olabilir aneuploid kanser hatlarında (örneğin, U87 glioblastoma veya A375 melanoma) başarısız olabilir48,49. Nihayetinde uygunluk; bir hücre hattının çift vektör ekspresyonunun metabolik yükünü tolere etme, bu dolaylı seçim baskılarına dayanma ve çok haftalık protokol boyunca stabil büyüme kinetiğini koruma kapasitesine bağlıdır.

Bu yaklaşım çoğu hücre hattı için çok yönlü bir kavram kanıtı görevi görse de, uygulanması iletim verimliliği ile genomik bütünlük arasında dikkatli bir denge kurulmasını gerektirir. Belirtildiği üzere, 'kendi kendine' yönlendirilmiş gRNA için lentiviral iletimin kullanılması, özellikle transfeksiyonu zor hücrelerde, homojen bir Cas9-ablated popülasyon sağlar. Ancak, yarı rastgele entegrasyondan kaynaklanan insersiyonel mutajenez riski bir endişe kaynağı olmaya devam etmektedir. Bu riskler, MOI optimize edilerek yönetilebilir. HEK293 gibi permisif hatlarda, 1–5 arası bir MOI, entegrasyon kaynaklı mutajenezi ve sitotoksisiteyi minimize ederken yüksek saturasyona ulaşır41. Buna karşılık, refrakter immün veya nöronal hücreler tipik olarak 10–50 arası MOI gerektirir ve benzer verimliliklere ulaşmak için genellikle polybrene ve/veya spinokülasyon gibi güçlendiricilere ihtiyaç duyarlar50,51,52,53,54,55.

Bu teknik ödünleşim, poliklonal ve monoklonal seçilmiş popülasyonlar arasındaki tercihe kadar uzanır. Burada oluşturulan HEK293ΔCUL4BΔcas9 hücreleri poliklonaldir; bu tercih, tek hücreli alt klonlama için gereken haftalarca süren genişletme aşamasını atlayarak deneysel takvimleri hızlandırır. Ayrıca, poliklonal bir havuz kültürün ortalama fenotipini yakalayarak, klonal artefaktlara veya bölgeye özgü entegrasyon sorunlarına karşı etkili bir tampon oluşturur. Monoklonal hatların genetik homojenlik nedeniyle tutarlı sonuçlar verme olasılığı daha yüksek olsa da, burada sunulan sonuçlar, hız ve popülasyon temsilinin öncelikli olduğu durumlarda poliklonal seçimin uygulanabilir ve genellikle daha iyi bir alternatif olduğunu göstermektedir.

Ortaya çıkan fenotipin zamansal stabilitesi de kritik bir değişken olabilir. Burada sunulan sistemde, CUL4B'nin WDR5 ve CDC6 üzerindeki düzenleyici etkisi, nakavt hücre hatlarının ardışık pasajları boyunca azalmış olup, bu durum paralog CUL4A'nın kompanzatuar yukarı regülasyonu ile korelasyon göstermiştir (veriler gösterilmemiştir). Bu durum, CUL4A'nın CUL4B eksikliğindeki hücrelerde CUL4B fonksiyonunu kısmen geri kazanabildiğini gösteren Nakagawa ve ark.'nın bulgularıyla örtüşmektedir44. Bu tür homeostatik kompanzasyon, özellikle diğer hücresel proteinlerle yüksek yapısal homolojiye ve fonksiyonel redundansa sahip bir protein hedeflendiğinde, hücre biyolojisinde yaygın olarak görülür.

Bu ikincil kompanse edici mekanizmalarla başa çıkmak için, deneysel hedeflere ve kullanılan hücre hattına bağlı olarak iki farklı stratejik yaklaşım uygulanabilir. Verimliliğe öncelik veren veya yüksek adaptasyon yeteneğine sahip hücre hatlarıyla çalışan araştırmacılar için sıkıştırılmış bir deneysel zaman çizelgesi esastır. Bu strateji, hedef protein kaybının, ideal olarak seleksiyon sonrası kültür %90 konfluense ulaştığında hemen doğrulanmasını ve bunu hızla takip eden kendi kendini inaktive eden Cas9 hedeflemesi ve fonksiyonel analizleri içerir. Bu hızlandırılmış iş akışının benimsenmesiyle, hücresel homeostatik mekanizmaların redundant paralogları yukarı regüle etmesi veya ortaya çıkan fenotipi başka şekillerde karıştırması için yeterli zaman bulmasından önce, nakavt işleminin birincil biyolojik sonuçlarının yakalanma olasılığı artar.

Alternatif olarak, uzun süreli stabilite veya yüksek hassasiyetli kurtarma deneyleri gerektiren çalışmalar için, özellikle immun ve nöronal hücreler gibi transfeksiyona dirençli modellerde, tetrasiklin kontrollü (Tet-On/Off) sistem uygulanabilir bir çözüm sunar56,57. Bu indüklenebilir çerçevenin uygulanması ek lentiviral transduksiyon turları ve farklı antibiyotik direnç belirteçlerinin kullanımını gerektirse de, geçici doksisiklin aracılı 'kayıp ve kurtarma' olaylarını tetiklemeden önce hücresel ortamı stabilize etmek amacıyla hedef proteinin sürekli restorasyonu için bir mekanizma sağlar57.

Açıklamalar

Yazarlar, teknik terminolojiyi geliştirmek ve taslağı düzenlemek için Google Gemini'den yararlanmışlardır. Yapay zeka, dilsel iyileştirme için bir araç olarak kullanılmış olup verilerin orijinal sentezine, çalışmanın kavramsal tasarımına veya metnin temel taslağının oluşturulmasına katkıda bulunmamıştır. Yazarlar, çıktıları gözden geçirip düzenlemişlerdir ve nihai taslağın içeriği için tüm sorumluluğu üstlenmektedirler. Yazarlar, herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma; Le Moyne College tarafından sağlanan başlangıç fonları, Le Moyne College Araştırma ve Geliştirme Komitesi, Le Moyne College Öğrenci Araştırma Komitesi, Walter L. '66 ve MaryAnne Poland Cizvit Araştırma ve Öğretim İnovasyonu Merkezi Fonu ve Le Moyne College Biyolojik ve Çevresel Bilimler Bölümü tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, grafiksel illüstrasyonların hazırlanmasında BioRender.com'un kullanımını belirtmektedir. Şekil 1 BioRender'da oluşturulmuştur (Sharifi, J., 2026; https://BioRender.com/72u0wl3) ve Şekil 2'nin üst paneli BioRender'da oluşturulmuştur (Sharifi, J., 2026; https://BioRender.com/lc6o2lu).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
anti-Cas9 antikoruCell Signaling65832Bu fare monoklonal antikoru, insan lizatlarında S. pyogenes Cas9'un spesifik tespitini sağlar ve bu özelliğiyle kendi kendine yönlendirilmiş gRNA aracılı Cas9 temizliğinin doğrulanması için idealdir.
anti-CDC6 antikoruCell Signaling3387Bu tavşan monoklonal antikoru, insan CDC6'nın spesifik tespitini sağlar ve bu özelliğiyle CUL4B'nin aşağı akış fonksiyonel etkilerinin izlenmesi için idealdir.
anti-CUL4B antikoruSigma-AldrichC9995Bu afinite saflaştırılmış tavşan poliklonal antikoru, yakından ilişkili paralogu CUL4A ile çapraz reaksiyona girmeden insan CUL4B'nin spesifik tespitini sağlar.
anti-fare IgG, HRP-bağlı sekonder antikoruCell Signaling7076Bu at anti-fare IgG antikoru, horseradish peroksidaz (HRP) ile konjugatlenmiştir ve fare monoklonal primer antikorların kemilüminesans tespiti için optimize edilmiştir.
anti-tavşan IgG, HRP-bağlı sekonder antikoruCell Signaling7074Bu keçi anti-tavşan IgG antikoru, horseradish peroksidaz (HRP) ile konjugatlenmiştir ve tavşan poliklonal ve monoklonal primer antikorların kemilüminesans tespiti için optimize edilmiştir.
anti-WDR5 antikoruCell Signaling13105Bu tavşan monoklonal antikoru, insan WDR5'in spesifik tespitini sağlar ve bu özelliğiyle CUL4B'nin aşağı akış fonksiyonel etkilerinin izlenmesi için idealdir.
anti-α-TUBULIN antikoruCell Signaling3873Bu fare monoklonal antikoru, insan alfa-tübülini hedefler ve western blot analizinde normalizasyon için tekdüze bir yükleme kontrolü olarak idealdir.
Kalsiyum Fosfat Transfeksiyon KitiThermoFisher ScientificK278001Bu kit, adherent HEK293FT üretici hücrelerde lentiviral vektörlerin ölçeklenebilir ve maliyet etkin üretimi için optimize edilmiş verimli geçici transfeksiyon reaktifleri sağlar.
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-HygroGenScript Biotech Corporation özel sentezcas9 gRNA dizisi: CGTGATCACCGACGAGTACA, PAM dizisi: AGG
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-PuroGenScript Biotech Corporation özel sentezcas9 gRNA dizisi: CGTGATCACCGACGAGTACA, PAM dizisi: AGG
Dulbecco's Modified Eagle Medium GibcoD5796L-glutamin ve sodyum piruvat ile desteklenmiş bu yüksek glukozlu besiyeri, hızlı çoğalan memeli hücre hatlarında (örneğin, HEK293FT) büyümeyi, canlılığı ve metabolik stabiliteyi sürdürmek için optimize edilmiştir.
Fetal Bovine Serum, Premium (Isı Inaktive)Corning35-016-CVBu premium sınıf, ısı inaktive serum, memeli hücre hatları için kompleman aracılı sitotoksisiteyi minimize ederken temel büyüme faktörlerini ve hormonları sağlar.
HEK293American Type Culture CollectionCRL-1573İyi karakterize edilmiş bu insan embriyonik böbrek hücre hattı, yüksek derecede transfekte edilebilir olup gen nakavt fenotiplerini ve protein kurtarma çerçevelerini araştırmak için sağlam, standart bir model görevi görür.
HEK293FT hücreleri ThermoFisher ScientificR70007İnsan embriyonik böbrek hattının bu hızlı büyüyen ve yüksek derecede transfekte edilebilir varyantı, SV40 büyük T antijenini stabil olarak eksprese eder ve bu sayede lentiviral vektör üretimi sırasında viral titreleri maksimize etmek için optimize edilmiştir.
Hygromycin BsigmaaldrichH7772Bu aminonükleozid antibiyotiği, higromisin direnç belirtecini eksprese eden stabil transduktantları izole etmek için memeli hücre kültüründe bir seçici ajan olarak kullanılır.
pCLIP-All-hCMV-Puro plazmidi (CUL4B gRNA)Skyang Bio LLCsgRNA3:1019408_bCUL4B gRNA dizisi: ATCAAACCCTACAAACTCCA, PAM dizisi: AGG
pCMV-FLAGCUL4BN/AN/ABu memeli ekspresyon plazmidi, FLAG etiketli bir Cullin 4B proteininin (CUL4B) konstitütif ekspresyonunu sağlamak için bir sitomegalovirüs (CMV) promotörü kullanır ve Jianping Jin'den bir hediyedir.
pCMV-M1 Memeli Ekspresyon VektörüAddgene23007Boş ekspresyon vektörü kontrolü (Linda Wordeman'dan bir hediye)
pLentiGuide-PuroAddgene52963Bu lentiviral transfer vektörü, Cas9 eksprese eden hücrelerde CRISPR hedeflemesi için özelleştirilebilir bir gRNA'nın insan U6-promotörü ekspresyonunu, EF-alfa-promotörü tarafından yönlendirilen bir puromisin direnç belirteci ile birlikte sağlar ve Feng Zhang'dan bir hediyedir.
pLX302 EGFP-V5Addgene141348 Transdüksiyon verimliliğini değerlendirmek için GFP kodlayan lentiviral vektör (Kevin Janes'den bir hediye)
PuromycinSigma-AldrichP8833Bu aminonükleozid antibiyotiği, puromisin direnç belirtecini eksprese eden stabil transduktantları izole etmek için memeli hücre kültüründe bir seçici ajan olarak kullanılır.
Steril Fosfat Tamponlu Salin (PBS)Corning21-040-CVBu standart dengeli tuz çözeltisi, osmotik basıncı veya hücre canlılığını bozmadan eser kültür besiyerlerini, serum proteinlerini veya enzimleri etkili bir şekilde uzaklaştırmak için hücre monotabakalarının yıkanmasında kullanılır.
Trypsin EDTA 1XCorning25-051-CIBu standart enzimatik disosiasyon çözeltisi, peptit bağlarını kopararak adherent memeli hücreleri kültür kaplarından ayırmak için kullanılırken, EDTA hücreler arası adezyonu bozmak için divalent katyonları şelatlar.
ViraPower Lentiviral Paketleme KarışımıThermoFisher ScientificK497500Paketleme plazmidlerinin (pLP1, pLP2 ve pLP/VSVG) bu optimize edilmiş karışımı, lentiviral ekspresyon vektörlerinin yüksek titreli montajını ve replikasyon yeteneği olmayan üretimini kolaylaştırmak amacıyla üretici hücrelere ko-transfeksiyon için kullanılır.

Kaynaklar

  1. Doudna JA, Charpentier E. Genome editing: The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014;346(6213):1258096.
  2. Leonhardt C, et al. Single-cell mRNA transfection studies: Delivery, kinetics and statistics by numbers. Nanomedicine. 2014;10(4):679-688.
  3. Liu Y, Yang Q, Zhao F. Synonymous but not silent: The codon usage code for gene expression and protein folding. Annu Rev Biochem. 2021;90:375-401.
  4. Chamary JV, Hurst LD. Evidence for selection on synonymous mutations affecting stability of mRNA secondary structure in mammals. Genome Biol. 2005;6(9):R75.
  5. Mauro VP, Chappell SA. A critical analysis of codon optimization in human therapeutics. Trends Mol Med. 2014;20(11):604-613.
  6. Bauer AP, et al. The impact of intragenic CpG content on gene expression. Nucleic Acids Res. 2010;38(12):3891-3908.
  7. Kudla G, Murray AW, Tollervey D, Plotkin JB. Coding-sequence determinants of gene expression in Escherichia coli. Science. 2009;324(5924):255-258.
  8. Simms CL, Yan LL, Zaher HS. Ribosome collision is critical for quality control during no-go decay. Mol Cell. 2017;68(2):361-373.e5.
  9. Fu Y, et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2013;31(9):822-826.
  10. Babu K, et al. Bridge helix of Cas9 modulates target DNA cleavage and mismatch tolerance. Biochemistry. 2019;58(14):1905-1917.
  11. Hsu PD, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 2013;31(9):827-832.
  12. Ihry RJ, et al. p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells. Nat Med. 2018;24(7):939-946.
  13. Haapaniemi E, Botla S, Persson J, Schmierer B, Taipale J. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nat Med. 2018;24(7):927-930.
  14. Yang S, Li S, Li XJ. Shortening the half-life of Cas9 maintains its gene editing ability and reduces neuronal toxicity. Cell Rep. 2018;25(10):2653-2659.e3.
  15. Kafri M, Metzl-Raz E, Jona G, Barkai N. The cost of protein production. Cell Rep. 2016;14(1):22-31.
  16. Mehta A, Merkel OM. Immunogenicity of Cas9 protein. J Pharm Sci. 2020;109(1):62-67.
  17. Liu Q, Zhang H, Huang X. Anti-CRISPR proteins targeting the CRISPR-Cas system enrich the toolkit for genetic engineering. FEBS J. 2020;287(4):626-644.
  18. Marino ND, Pinilla-Redondo R, Csörgő B, Bondy-Denomy J. Anti-CRISPR protein applications: Natural brakes for CRISPR-Cas technologies. Nat Methods. 2020;17(5):471-479.
  19. Gangopadhyay SA, et al. Precision control of CRISPR-Cas9 using small molecules and light. Biochemistry. 2019;58(4):234-244.
  20. Pandit B, et al. Bio-orthogonal chemistry-based strategy to turn off CRISPR-Cas9 activity in solution and live cells. NAR Mol Med. 2026;3(1):ugag008. Available from: https://doi.org/10.1093/narmme/ugag008
  21. Bubeck F, et al. Engineered anti-CRISPR proteins for optogenetic control of CRISPR-Cas9. Nat Methods. 2018;15(11):924-927.
  22. Kostic M, Jones LH. Critical assessment of targeted protein degradation as a research tool and pharmacological modality. Trends Pharmacol Sci. 2020;41(5):305-317.
  23. Kim S, Kim D, Cho SW, Kim J, Kim JS. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 2014;24(6):1012-1019.
  24. Hendel A, et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat Biotechnol. 2015;33(9):985-989.
  25. Merienne N, et al. The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes. Cell Rep. 2017;20(12):2980-2991.
  26. Kelkar A, et al. Doxycycline-dependent self-inactivation of CRISPR-Cas9 to temporally regulate on- and off-target editing. Mol Ther. 2020;28(1):29-41.
  27. Dai Y, et al. Self-inactivating AAV-CRISPR at different ages enables sustained amelioration of Huntington's disease deficits in BAC226Q mice. Sci Adv. 2026;12(12):eaea8052.
  28. Sanjana NE, Shalem O, Zhang F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods. 2014;11:783-784.
  29. Parr-Brownlie LC, et al. Lentiviral vectors as tools to understand central nervous system biology in mammalian model organisms. Front Mol Neurosci. 2015;8:14.
  30. Dobransky A, Root M, Hafner N, Marcum M, Sharifi HJ. CRL4-DCAF1 ubiquitin ligase-dependent functions of HIV viral protein R and viral protein X. Viruses. 2024;16(8)1313.
  31. Thermo Fisher Scientific. ViraPower Lentiviral Expression Systems User Guide. 2026. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/virapower_lentiviral_system_man.pdf
  32. Pauwels K, et al. State-of-the-art lentiviral vectors for research use: Risk assessment and biosafety recommendations. Curr Gene Ther. 2009;9(6):459-474.
  33. Guo L, et al. Optimizing conditions for calcium phosphate-mediated transient transfection. Saudi J Biol Sci. 2017;24(3):622-629.
  34. Thermo Fisher Scientific. Cationic Lipid Transfection. 2026. Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/methods/cationic-lipid-transfection.html
  35. Kutner RH, Zhang XY, Reiser J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nat Protoc. 2009;4(4):495-505. Available from: https://doi.org/10.1038/nprot.2009.22
  36. Barde I, Salmon P, Trono D. Production and titration of lentiviral vectors. Curr Protoc Neurosci. 2010;53(1):4.21.1-4.21.23. Available from: https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/0471142301.ns0421s53
  37. Kumru OS, et al. Physical characterization and stabilization of a lentiviral vector against adsorption and freeze-thaw. J Pharm Sci. 2018;107(11):2764-2774.
  38. American Type Culture Collection. Lentiviral Vector Reference Material Information Sheet. 2026. Available from: https://www.atcc.org/-/media/product-assets/documents/protocols/virology/lentiviral-vector-reference-material-information-sheet.pdf?rev=a934bd06c07f4969b0aafec16506cd44
  39. Higashikawa F, Chang L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 2001;280(1):124-131.
  40. Kowolik CM, Yee JK. Preferential transduction of human hepatocytes with lentiviral vectors pseudotyped by Sendai virus F protein. Mol Ther. 2002;5(6):762-769.
  41. Pichavant C, Tremblay JP. Generation of lentiviral vectors for use in skeletal muscle research. In: DiMario JX, editor. Myogenesis: Methods and Protocols. Humana Press; Totowa, NJ; 2012. p. 285-295.
  42. Stacey GN, Masters JR. Cryopreservation and banking of mammalian cell lines. Nat Protoc. 2008;3(12):1981-1989.
  43. Bauer DE, Canver MC, Orkin SH. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. J Vis Exp. 2015;(95):e52118.
  44. Nakagawa T, Xiong Y. X-linked mental retardation gene CUL4B targets ubiquitylation of H3K4 methyltransferase component WDR5 and regulates neuronal gene expression. Mol Cell. 2011;43(3):381-391.
  45. Zou Y, et al. CUL4B promotes replication licensing by up-regulating the CDK2-CDC6 cascade. J Cell Biol. 2013;200(6):743-756.
  46. Dachs GU, Hunt MA, Syddall S, Singleton DC, Patterson AV. Bystander or no bystander for gene-directed enzyme prodrug therapy. Molecules. 2009;14(11):4517-4545.
  47. Prise KM, O'Sullivan JM. Radiation-induced bystander signalling in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 2009;9(5):351-360.
  48. Clark MJ, et al. U87MG decoded: The genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 2010;6(1):e1000832.
  49. Cormier JN, et al. Heterogeneous expression of melanoma-associated antigens and HLA-A2 in metastatic melanoma in vivo. Int J Cancer. 1998;75(4):517-524.
  50. Sigma-Aldrich. Successful Transduction Using Lentivirus. Darmstadt, Germany; 2023. Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/technical-article/genomics/advanced-gene-editing/successful-transduction-lentivirus
  51. Swainson L, Mongellaz C, Adjali O, Vicente R, Taylor N. Lentiviral transduction of immune cells. Methods Mol Biol. 2008;415:301-320.
  52. Davis HE, Morgan JR, Yarmush ML. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 2002;97(2-3):159-172.
  53. Denning W, et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: Effect of sera and polycations. Mol Biotechnol. 2013;53(3):308-314.
  54. O'Doherty U, Swiggard WJ, Malim MH. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. J Virol. 2000;74(21):10074-10080.
  55. Sano S, et al. Lentiviral CRISPR/Cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models. J Vis Exp. 2019;(152):e59977.
  56. Gossen M, Bujard H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89(12):5547-5551.
  57. Gossen M, et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 1995;268(5218):1766-1769.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

BiologyCRISPRCas9KnockoutLentivirusTransductionStableSelectionRescueRestorationTransgeneTransfectionPlasmid
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.