Bu makale, kemirgenlerde dinamik kontrastla güçlendirilmiş MRG (DCE-MRI) çalışmaları için özelleştirilmiş bir intraventriküler kanülasyon ve izleyici infüzyon protokolü sunmaktadır. Protokol, görüntüleme sırasında sürekli izleyici iletimini sağlayarak, tek bir kesintisiz görüntüleme oturumu içerisinde izleyici transportunun tüm beyin haritalamasının ve beyinden temizlenmesinin gerçekleştirilmesine olanak tanır.
Yöntem makalesi
Kontrastlı Manyetik Rezonans Görüntüleme ile Beyin Omurilik Sıvısı Transportunun Görüntülenmesi aracılığıyla Kemirgenlerde İntraventriküler İnfüzyon
Bu makalede
Özet
Özet
İntraventriküler (ICV) kanülasyon, ekzojen izleyicilerin veya terapötik ajanların, beyin omurilik sıvısı (BOS) dolaşım yolunun başlangıç noktası olan lateral ventriküle doğrudan iletilmesini sağlar. İnfüze edilen moleküller, BOS kütle akışı ile ventriküler kompartmanlar aracılığıyla subaraknoid boşluğa taşınır ve ardından beyin parankimine girer. aracılığıyla perivasküler alan. Ancak, geleneksel ICV kanülasyon yöntemlerinde genellikle MRI çalışmalarıyla uyumsuz olan ferromanyetik kanüller kullanılır; bu durum, infüzyonun tarayıcı dışında gerçekleştirilmesini ve görüntüleme öncesinde kanülün çıkarılmasını gerektirir. Hayvan nakli ve görüntüleme kurulumu için gereken süre, izleyici taşınımının başlangıçtaki ve muhtemelen en kritik olan evresinin genellikle kaçırılmasına neden olur. Burada, kemirgenler için dinamik MRI alımı sırasında tarayıcı içinde sürekli izleyici iletimini destekleyen, MRI ile uyumlu bir ICV kanülasyon ve infüzyon protokolü tanımlıyoruz. İnfüzyon hattı tamamen manyetik olmayan malzemelerden oluşturulmuştur ve tek bir oturumda kesintisiz görüntü alımına olanak tanır. Bu yaklaşım; BOS dinamiği, glimfatik taşınım, çözünen madde temizlenmesi ve intratekal ilaç iletimine yönelik dinamik kontrastla güçlendirilmiş MRI çalışmaları için oldukça uygundur.
Giriş
Beyin, normal nöral fonksiyonu sürdürmek için verimli bir şekilde temizlenmesi gereken atık ürünleri sürekli olarak üreten, vücuttaki metabolik olarak en aktif ve dinamik organlardan biridir1. Metabolik atıkların birikmesi, nörodejenerasyonun ve beyin yaşlanmasının belirgin bir özelliğidir2. Glinfatik sistem, beyin omurilik sıvısının (BOS) toplu akışı ve BOS'un interstisyel sıvı (ISF) ile değişimi aracılığıyla metabolik yan ürünlerin ve toksik atıkların uzaklaştırılmasını kolaylaştırarak bu temizleme sürecinde merkezi bir rol oynar3,4,5; bu süreç, astrositik uç ayaklarda bulunan aquaporin-4 (AQP4) su kanalları tarafından kolaylaştırılır6. Çeşitli BOS izleyicilerinin transportu incelenerek BOS dinamikleri hakkında önemli bir anlayış kazanılmıştır. Gadolinyum bazlı kontrast maddeler (GBCAs) kullanan dinamik kontrastla güçlendirilmiş MRI (DCE-MRI), izleyici transportunun beyin genelinde değerlendirilmesi için özellikle uygundur7,8. Bu yaklaşımın klinik uygunluğu, insanlardaki translasyonel çalışmalarla kanıtlanmıştır. İnsan beynindeki BOS dinamiklerini değerlendirmek için GBCAs'ların intratekal uygulaması ve ardından seri MRI kullanılmıştır9. Sonraki çalışmalar, gece boyunca gerçekleşen temizlemeyi takip eden beyin genelinde izleyici transportunu göstermiştir10. Bu yaklaşım, yakın zamanda intrakraniyal basınç-hacim rezerv kapasitesi azalmış deneklerin yanı sıra idiyopatik normal basınçlı hidrosefali hastalarında bozulmuş periarteriyel izleyici transportunu ortaya çıkarmak için uygulanmıştır11. Bu çalışmalar, BOS izleyici transportunun DCE-MRI yöntemini klinik olarak uygulanabilir bir yaklaşım olarak belirlemekte ve BOS dinamiklerinin ve atık temizliğinin düzenlenmesinin mekanistik incelemesi için titiz, tekrarlanabilir preklinik yöntemlerin geliştirilmesine teşvik etmektedir.
İntra-cisterna magna (ICM) kanülasyonu, glinfatik çalışmalarda izleyici maddelerin iletimi için yaygın olarak kullanılmaktadır.12Ancak, iletilen GBCA'ların yalnızca yaklaşık %20'si aracılığıyla bu yol üzerinden beyin parankimine taşınan maddelerin çoğu doğrudan omuriliğe veya lenf sistemine boşalmaktadır8Bu yaklaşım aynı zamanda serebellum veya beyin sapına zarar verme riski taşımaktadır ve kanülün boylamsal çalışmalar için sabitlenmesi teknik olarak zorlayıcı olmaya devam etmektedir. İntraventriküler (ICV) kanülasyon, daha sağlam bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır.13,14,15Yakın zamanda yapılan bir çalışma, hayvanın serbest hareket etmesine olanak tanıyan ve boylamsal çalışmalarda tekrarlı izleyici enjeksiyonlarını destekleyen stabil kanül fiksasyonu da dahil olmak üzere, floresan izleyicilerin iletimindeki tekrarlanabilirliğini ve temel avantajlarını ortaya koymuştur.13.
Bu avantajlara rağmen, mevcut ICV kanülizasyon protokolleri MRI çalışmalarıyla doğrudan uyumlu değildir16. ICV kanülizasyonu beyin parankiminin penetrasyonunu gerektirdiğinden, tipik olarak MRI görüntülerinde şiddetli süseptibilite artefaktlarına yol açan ferromanyetik kanüller kullanılır. Sonuç olarak, izleyici infüzyonu tarayıcının dışında gerçekleştirilmeli ve hayvan görüntüleme için transfer edilmeden önce kanül çıkarılmalıdır. Tipik bir iş akışı; bir bazal tarama alınmasını, kanülizasyon ve izleyici infüzyonu için hayvanın çıkarılmasını ve ardından sonraki dinamik taramalar için hayvanın yeniden konumlandırılmasını içerir. Bu kesintili iş akışı, sürekli ve bazal referanslı veri alımını engeller ve voksel bazlı kinetik analizi yanıltabilecek yeniden konumlandırma hizalama hatalarına yol açar. Daha da önemlisi, erken tutulum fazı genellikle izleyici kinetiğinin en dinamik ancak en geçici kısmı olduğundan, bu pencere sırasında hayvan transferi ve tarayıcı kurulumunun yapılması, en bilgilendirici verilerin kaybına neden olur.
Burada, kemirgenlerde sürekli dinamik MRI alımına olanak tanıyan, tarayıcı içi kontrast madde iletim kapasitesine sahip MRI uyumlu bir ICV infüzyon hattını entegre ederek bu sınırlamaları gideren bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, tek ve kesintisiz bir görüntüleme seansında, BOS izleyici transportunun tüm beyin üzerinden kantitatif haritalanmasını sağlar. Bu protokol; beyin genelindeki BOS dinamiklerinin, glimfatik transportun ve çözünen madde temizleme kinetiklerinin incelenmesi için oldukça uygundur. Burada yetişkin sıçanlar için açıklanmış olsa da protokol, kanülasyon koordinatlarının ve infüzyon parametrelerinin uygun şekilde ayarlanmasıyla farelere uyarlanabilir15.
Protokol
Aşağıda açıklanan protokol, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ile Kamu Sağlığı Hizmetleri'nin Laboratuvar Hayvanlarının İnsancıl Bakımı ve Kullanımı Politikası'na uygun olarak Case Western Reserve Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (A-3145-01-2023-0015). Kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.
1. İnfüzyon hattının hazırlanması
- Tırtıklı makas kullanarak 30 mm'lik bir bakır kanül segmenti ve 2 m uzunluğunda polietilen (PE) tüp kesin.
- Mikroskop altında, PE tüpün bir ucunu 30 G iğne ile nazikçe genişletin, ardından bakır kanülü genişletilmiş uca yerleştirin ve bağlantı noktasını siyanoakrilat yapıştırıcı ile sabitleyin. PE tüpün karşı ucunu 30 G bir iğneye bağlayın.
NOT: Bakır oldukça sünektir; kesme işlemi sırasında lümenin çökmemesine dikkat edin. Montaj sırasında kanülün deforme olmasından veya tüpün delinmesinden kaçının. PE tüpün uzunluğu, şırınga pompasının tarayıcının saçak alanı dışına yerleştirilmesine olanak sağlamalıdır. - Kanül-tüp düzeneğini gazı alınmış izleyici çözelti ile doldurun ve 50 µL'lik bir Hamilton şırıngasına bağlayın. Sızıntıyı önlemek için şırınga ucunu politetrafloroetilen (PTFE) sızdırmazlık bandı ile sarın. Bu işlem sırasında hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin.
- Hamilton şırıngasını şırınga pompasına monte edin ve şırıngaya ek olarak 30 µL izleyici çözelti çekin.
2. Kanülasyon prosedürü
- Sıçanı tartın ve ketamin (90 mg/kg) ile ksilazin (10 mg/kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezi uygulayın. Anestezi derinliğinin yeterliliğini ayak parmağı sıkıştırma refleksi ile doğrulayın. Gerekirse başlangıç dozunun üçte biri kadar ek doz uygulayın ve işleme devam etmeden önce tekrar kontrol edin.
- Baş ve boyun bölgesini tıraş edin, gevşek tüyleri temizleyin ve açığa çıkan cildi %70 etanol pedleri ile sterilize edin.
- Sıçanı stereotaksik çerçeveye sabitleyin ve hayvanın altına emici kağıtla kaplı bir ısıtma pedi yerleştirin. Kornea kurumasını önlemek için her iki göze oftalmik pomad uygulayın.
- Kafatasını düzlemek için burun kıskacını ayarlayın. Orta hat boyunca bir insizyon yapın ve bregma ile lambdayı açığa çıkarmak için cildi dört hemostat klipsi ile geri çekin. Kalan periostu temizlemek ve referans noktalarının görünürlüğünü artırmak için kafatasına %3 hidrojen peroksit uygulayın.
NOT: Tekrarlanabilir kanül yerleşimi için kafatasının doğru şekilde düzlenmesi kritiktir. Pratik bir kalite kontrol önlemi olarak, bregma ve lambdadaki mediolateral (ML) ve dorsoventral (DV) koordinatları karşılaştırın: kafatası düzgün şekilde hizalandıysa, iki referans noktası arasındaki fark ML veya DV ekseninin her ikisinde de 0,2 mm'yi geçmemelidir. - İnce bir matkap ucu takılı olan elektrikli matkabı stereotaksik kola monte edin ve kolun sıkıca kilitlendiğinden emin olun.
- Matkap ucunu bregma noktasına konumlandırın, ardından 0,7 mm posterior ve sağa doğru 1,4 mm lateral hareket ettirin. Matkap ucu kafatası yüzeyine temas edene kadar indirin ve DV koordinatını kaydedin.
- Mikroskop gözlemi altında, matkabı 0,1 mm'lik artışlarla ilerletin. Kafatası delindiği anda işlemi hemen durdurun (yetişkin sıçanlarda tipik kafatası kalınlığı 0,3–0,4 mm'dir).
- Stereotaksik kol üzerindeki matkabı, önceden yüklenmiş kanül ile değiştirin. Sıvı yolunun açık olduğunu doğrulamak için, kanül ucundan sıvı çıkana kadar infüzyon pompasını kısa süreliğine çalıştırın.
- Kanülün kafatası yüzeyine dik olarak monte edildiğinden emin olun, ardından kanülü delik üzerine hizalayın. Kanülü 0,1 mm/s hızla, dural yüzeyin 3,5 mm altına, nihai hedef derinliğe kadar ilerletin.
- Kanül-kafatası ara yüzeyine bir damla doku yapıştırıcısı uygulayın. Yapıştırıcı kuruduktan sonra, kafa derisi insizyonunu sütürlerle kapatın ve MRI bobini ile teması önlemek için bakır kanülü kafatası yüzeyine paralel olacak şekilde hafifçe bükün.
3. MRI kurulumu ve dinamik görüntüleme
- Hacim iletim bobinini tarayıcının izosenterine yerleştirin.
- Hayvanı, MRI uyumlu bir beşiğe prone (yüzüstü) pozisyonda transfer edin. Solunum sensörü ve rektal sıcaklık probu dahil olmak üzere fizyolojik izleme sistemini bağlayın. Vücut sıcaklığını ~37 °C seviyesinde tutmak için sirkülasyonlu sıcak su banyosunu çalıştırın.
- Burun konisi aracılığıyla verilen ek izofluran kullanarak tarama oturumu boyunca uygun anesteziyi sürdürün. 50–70 nefes/dak solunum hızını korumak için izofluran konsantrasyonunu %0,25 ile %1,0 arasında ayarlayın.
NOT: Kanülasyon cerrahisinden önce uygulanan ketamin-ksilazin anestezisi, MRI beşiğine yapılan ilk transfer sırasında kalıntı sedasyon sağlayacaktır. İzofluranı kademeli olarak başlatın ve tarama sırasında solunum hızını sürekli izleyin.
DİKKAT: İzofluran, inhalasyon tehlikesi oluşturan uçucu bir ajandır; aktif tahliye sistemi kullanın ve personelin maruziyetini en aza indirin. - İnfüzyon pompasını mıknatıs saçak alanının dışına yerleştirin, infüzyon hızını 1 µL/min ve infüzyon süresini, toplam 20 µL infüzyon hacmine karşılık gelecek şekilde 20 dk olarak ayarlayın. Gerilme ve yer değiştirmeyi önlemek için infüzyon hattını beşik boyunca dikkatlice düzenleyin ve sabitleyin.
DİKKAT: Ferromanyetik nesneler, bir MRI tarayıcısının yakınına yerleştirildiğinde tehlikeli mermilere dönüşebilir. MRI ile uyumsuz tüm ekipmanları saçak alanının dışında tutun. - Yüzey dizi bobinini, beyin merkezli olacak şekilde doğrudan dorsal kafatasının üzerine monte edin. Yara sızıntısını emmek için bobin ile insizyon bölgesi arasına küçük bir parça emici kağıt yerleştirin.
- Beyin izosenterde olana kadar beşiği mıknatısın içine ilerletin. İnfüzyon hattının ve fizyolojik izleme kablolarının engellenmediğini doğrulayın.
- İlk tarayıcı kurulumunu gerçekleştirin ve başarılı kanül yerleşimini onaylamak için anatomik görüntüler elde edin.
- Bazal görüntüler elde edildikten sonra, infüzyon pompasını ve dinamik taramayı eş zamanlı olarak başlatın ve toplam 3 sa boyunca görüntüleme işlemine devam edin (görüntüleme ayrıntıları için Tablo 1'e bakınız).
Sonuçlar
Cerrahi iş istasyonu, matkabın lateral ventrikülü hedefleyecek şekilde hassas konumlandırılmasına izin verecek şekilde yapılandırılmıştır (bregmanın 0.7 mm posterioru ve 1.4 mm laterali; Şekil 1A,D). İnfüzyon hattı; 30 mm'lik bir bakır kanül, 2 m'lik bir PE tüp segmenti ve bir Hamilton şırıngasına bağlı 30 G iğneden oluşur (Şekil 1B). Uzatılmış tüp uzunluğu, şırınga pompasının tarayıcının saçak alanı dışına yerleştirilmesine olanak tanır. Trepanasyon delikleri açıldıktan sonra, önceden yüklenmiş infüzyon hattı stereotaksik kola monte edilir ve kanül, dural yüzeyin 3.5 mm altına kadar lateral ventriküle ilerletilir (Şekil 1C). Sabitlendikten sonra kanül, MRI bobini ile teması önlemek için kafatası yüzeyine paralel olarak bükülür (Şekil 1E).
Başarılı ICV kanülasyonu, ventriküler sistemi ve kanül yolunu net bir şekilde çözümleyen; kanül ucunun ventriküler lümen içindeki konumunun hem sagital (Şekil 2A) hem de aksiyel (Şekil 2B) görünümlerde doğrudan görselleştirilmesine olanak tanıyan anatomik görüntülerden teyit edilebilir. Bu görüntüler aynı zamanda, ucun corpus callosum içinde sonlandığı yetersiz yerleştirme ve ucun thalamus'a kadar uzandığı aşırı yerleştirme dahil olmak üzere, kanülün hedef dışı yerleştirildiği hayvanların DCE-MRI taramalarından hariç tutulmasını sağlar. DCE-MRI taramalarındaki işaretleyicinin spatiotemporal dağılımı, doğru kanül yerleşimine dair ek onay sağlayabilir; çünkü hedef dışı yerleşimler işaretleyiciyi beyin parenkimine ileterek ventriküler işaretleyici yayılımıyla tutarsız kinetikler oluşturur.
DCE-MRI taramaları için, kontrast maddelerin ICV infüzyonu bazal görüntüleme sonrası başlatılır ve dinamik görüntü alımı 3 saate kadar veya daha uzun sürebilir (Şekil 2C). Şekil 2D, kontrast madde infüzyonunu takiben farklı zaman noktalarında elde edilen temsili 3D T1-ağırlıklı görüntüleri göstermektedir. 20 dakikalık infüzyonun sonunda, izleyicinin ventriküler-subaraknoid yol boyunca hızlı kütle akışı yayılımını yansıtacak şekilde, infüzyon yapılan (ipsilateral) lateral ventrikül, üçüncü ve dördüncü ventriküller ile cisterna magna içinde kontrastlanma halihazırda belirgindir. Sinyal artışı, ipsilateral lateral ventrikülü çevreleyen parenkimde de gözlemlenmekte olup, bu durum izleyicinin ependimal membran üzerinden periventriküler dokuya taşındığını göstermektedir.
Kontrast madde taşınımının daha kantitatif değerlendirmesi, manyetik rezonans parmak izi yöntemi (MRF; Şekil 3) kullanılarak yapılan T1 ve T2 haritalama gibi parametrik haritalama teknikleri ile elde edilebilir. İntratekal kompartmanlar boyunca T1, infüzyon sırasında ipsilateral lateral ventrikülden üçüncü ve dördüncü ventriküllere yayılarak hızla azalırken, cisterna magna'da T1 kısalmasının başlangıcında hafif bir gecikme görülür. ICV yoluyla uygulanan kontrast maddeler ayrıca beyin parankimine geniş bir penetrasyon gösterir; periventriküler bölgelerde (proksimal) daha erken ve daha belirgin T1 azalması görülürken, daha distal bölgelerde gecikmiş ve azalmış bir T1 azalması izlenir. 3 saatlik bir tarama protokolü ile kontrast maddenin beyin parankiminden temizlenmesi, T1 geri kazanım kinetiğinden de değerlendirilebilir. Birlikte ele alındığında bu protokol; hızlı ventriküler dağılım, intratekal yayılım, parankimal tutulum ve ardından gelen temizlenme dahil olmak üzere BOS izleyici taşınımının ana evrelerinin, tek bir sürekli MRI seansı içinde dinamik olarak izlenmesini destekler.
Şekil 1: MRI uyumlu ICV kanülasyonu için cerrahi kurulum ve infüzyon hattı düzeneği. (A) Cerrahi çalışma istasyonu. Matkap deliği açmak için operasyon alanının üzerine bir elektrikli matkap yerleştirilmiştir. (B) 30 G iğne (kırmızı ok), 2-m polietilen tüp segmenti (yeşil ok) ve 30-mm bakır kanülden (mavi ok) oluşan kurulu infüzyon hattı. (C) Kanül implantasyonu için stereotaksik kola monte edilmiş önceden yüklenmiş infüzyon hattı. (D) Kanül implantasyonu için koordinatlar. (E) Kapatma öncesi son görünüm; bakır kanül, MRI bobini ile teması önlemek için kafatası yüzeyine paralel olarak bükülmüştür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: ICV infüzyonunu takiben kanül yerleşimi ve kontrast madde transportunun dinamik izlemi. (A,B) Kanül yerleşiminin (kırmızı oklar) sırasıyla sagital ve aksiyel görünümlerdeki anatomik görüntülerdeki görselleştirmesi. (C) Görüntüleme protokolünün şeması. (D) Sagital (üst), aksiyel (orta) ve koronal (alt) görünümlerde seçilen zaman noktalarındaki temsili 3D T1-ağırlıklı görüntüler. Ölçek çubukları, 5 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3Manyetik rezonans parmak iziyleme (MRF) ile izleyici taşınımının kantitatif değerlendirmesi. (A) T1 (üst) ve T2 (alt) ICV infüzyonunu takip eden seçilmiş zaman noktalarında 3D MRF verilerinden yeniden oluşturulmuş haritalar. Ölçek çubuğu, 5 mm. (B) Ortalama T1 ipsilateral lateral ventrikül (LV), üçüncü ventrikül (V3), dördüncü ventrikül (V4) ve cisterna magna (CM) dahil olmak üzere intratekal kompartmanlardaki zaman seyirleri. Gri gölgeli bölge 20 dakikalık infüzyon süresini belirtmektedir. (C) Ortalama T1 V4 ve ipsilateral LV'nin proksimal ve distalindeki parankimal dokularda zaman seyirleri. Zaman seyirleri için ROI konumları ( şeklinde gösterilmiştir.A). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4ICV infüzyonunu takiben BOS izleyicisi transportunun şemaları. (A) İzleyici infüzyonunu gösteren sagital görünüm aracılığıyla ICV kanülü ve ardından ventriküler sistem aracılığıyla subaraknoid boşluğa gerçekleşen kütle akış dağılımı (kırmızı oklar) ile ependimal membran boyunca geçerek komşu beyin parankimine taşınımı (mavi oklar). LV: lateral ventrikül; V3: üçüncü ventrikül; V3v: ventral üçüncü ventrikül; V4: dördüncü ventrikül; CM: cisterna magna.B( ) içindeki kutulu alanın büyütülmüş şemasıA) BOS-İSF değişim yolunu tasvir etmektedir. BOS, astrositik uç ayaklarda eksprese edilen akuaporin-4 su kanalları (AQP4) aracılığıyla para-arteriyel boşluk boyunca parenkime girer, interstisyel boşluk boyunca konvektif akışla hareket eder ve çıkar aracılığıyla paravenöz boşluktan drenaj venine. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Parametreler | DCE-MRI (3D FLASH) | 3B MRF |
| Sekans tipi | T1 ağırlıklı 3D FLASH | 3B MRF (spiral yığınları) |
| TR / TE (ms) | 20.0 / 2.7 | 10.0 / 2.0 |
| Flip açısı | 10° | Değişken (değişken-evirme-açısı programı) |
| Manyetizasyon hazırlığı | Lütfen çevrilmesini istediğiniz kaynak metni sağlayın. | İnversiyon veya T2 hazırlığı (8 segmentten 6'sı) |
| Görüş alanı | 36 × 24 × 24 mm³ | 60 × 60 mm² (düzlem içi); 15 mm (düzlem dışı) |
| Matris boyutu | 144 × 96 × 96 | 300 × 300 (düzlem içi); 30 (düzlem dışı) |
| Uzamsal çözünürlük | 0,25 mm izotropik | 0.2 × 0,2 mm² (düzlem içi); 0,5 mm (düzlem dışı) |
| Zamansal çözünürlük | Kare başına 3 dk | kare başına 7 dk |
| k-uzayı yörüngesi | Kartezyen | Sarmal yığın yörüngeleri; tam örnekleme için 48 ara katman |
| Hızlanma | Yok (tek ortalama) | 48 kat (24× düzlem içi, 2× düzlem dışı) |
| Not | Tüm görüntüleme deneyleri, ParaVision 360 v3.4 platformunda çalışan 9.4 T Bruker BioSpin sisteminde gerçekleştirilmiştir. Verici olarak 86 mm'lik bir kuadratür hacim bobini, alıcı olarak ise 4 kanallı bir yüzey dizi bobini kullanılmıştır. | |
Tablo 1: MRI edinim parametreleri.
Tartışma
Burada açıklanan protokol, ICV kanülasyonunu tarayıcı içi infüzyon ve dinamik MRI alımıyla entegre ederek, tek bir görüntüleme oturumunda CSF izleyicilerinin taşınmasının kantitatif tüm beyin değerlendirmesini sağlar. ICV infüzyonunun değerleri ve sınırlamaları, ICM infüzyonu ile karşılaştırılarak en iyi şekilde değerlendirilir. ICM infüzyonu, trans-parenkimal kanülasyonu önler ve bu nedenle daha az invazivdir. Ancak, cisterna magna CSF dolaşım yolunun orta akımında yer aldığı için, özellikle yüksek infüzyon hızlarında ICM infüzyonu, CSF dolaşımını yönlendiren basınç gradyanının geçici bir tersine dönmesine neden olabilir17. Daha da önemlisi, ICM yoluyla verilen izleyiciler alt akımdaki subaraknoid boşluğa ve ardından perivasküler boşluğa hızla dağılır. Astrositlerin uç ayaklarındaki AQP4 kanalları CSF-ISF değişimini kolaylaştırsa da, bu kanallar büyük moleküler boyutları nedeniyle GBCA'lar için geçirgen değildir. Sonuç olarak, ICM yoluyla verilen izleyiciler, ICV infüzyonuna kıyasla parenkimde anlamlı derecede azalmış kontrast artışı gösterir15; bu da ICM infüzyonunu beyinden çözünen maddelerin temizlenmesini incelemek için daha az uygun hale getirir. ICV infüzyonu, izleyicileri endojen CSF üretim bölgelerinin yakınına ileterek bu sınırlamaları giderir13,14. Ayrıca, ICV infüzyonu sırasındaki basınç ve konsantrasyon gradyanları, izleyicilerin ependimal tabaka boyunca doğrudan taşınmasını destekleyerek13,14,15, bu izleyicilerin atık temizliği için markerlar olarak kullanılmasına olanak tanır (Şekil 4).
Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için bazı teknik detaylar kritik öneme sahiptir. Ventrikülün küçük boyutu nedeniyle kanül yerleşimindeki hata payı çok düşük olduğundan, lateral ventrikülün tutarlı bir şekilde hedeflenmesi için kafatasının doğru şekilde düzlenmesi esastır. Tıkanıklık ve sızıntı olmayan bir infüzyon hattının kurulması da aynı derecede önemlidir. Hava kabarcıkları veya kısmi tıkanmalar infüzyon profilini değiştirebilir ve erken faz kinetiğinin yorumlanmasını tehlikeye atabilir; en kötü senaryoda, büyük bir kabarcık hattı tamamen tıkayarak deneyin başarısız olmasına yol açabilir. MRI kurulumu sırasında karşılaşılan yaygın sorunlar arasında, PTFE sızdırmazlık bandı ile giderilebilen şırınga-iğne birleşimindeki sızıntılar ve beşik yerleştirme sırasında infüzyon hattındaki gerginlik yer alır; bu gerginlik, çekilme veya bükülmeyi önlemek için boru hattının beşik boyunca sabitlenmesiyle önlenebilir.
Burada sunulan hedef koordinatlar ve yerleştirme derinliği 12 haftalık Wistar sıçanları için optimize edilmiştir ve diğer yaşlar ile suşlar için ayarlamalar gerektirebilir. ICV infüzyonu, daha düşük vücut ağırlığı ve ventrikül boyutlarını hesaba katacak uygun modifikasyonlarla farelerde de gerçekleştirilebilir15. İnfüzyon hızı ve toplam hacim; moleküler boyut ve relaksivite dahil olmak üzere izleyicinin fizikokimyasal özelliklerine göre ayarlanabilir; ancak ventriküler kompartmanların küçük hacmi göz önüne alındığında, yüksek infüzyon hızları ventrikül basıncını önemli ölçüde artırabilir ve bu nedenle dikkatli kullanılmalıdır. Ek olarak, mevcut çalışmada kullanılan bakır kanül, durayı penetre etmek ve parankimi tek bir düz geçişle aşmak için gereken kolon direncini sağlar. Sünek özellikleri aynı zamanda kolayca bükülmesini sağlar ki bu durum, alanın sınırlı olduğu bobin konfigürasyonlarında avantajlıdır18. Kanülün gömülü uzunluğunun kısa olması nedeniyle RF kaynaklı ısınma minimumdur. Ancak, bakırın aşırı derecede bozunması, nörotoksisiteye yol açan serbest bakır iyonlarını salabilir; bu nedenle, bakır kanül kronik implantasyon için muhtemelen uygun değildir. Çıkıntılı bir kanülü barındırabilen bobin konfigürasyonları için, silika veya PEEK kateterler, bu toksisite endişelerinden kaçınırken yerleştirme için yeterli mekanik dayanımı sağlar14,19,20.
Burada kullanılan kontrast madde (Gd-DOTA), 558.65 Da moleküler ağırlığa sahiptir; bu değer laktat (90 Da) ve glukoz (180 Da) gibi endojen metabolik çözünenlerden birkaç kat daha büyük, ancak nörodejenerasyonda ilgi odağı olan amiloid-β monomerleri (~4.5 kDa) veya tau (~45–65 kDa) gibi daha büyük protein tabanlı agregatlardan çok daha küçüktür. Bu durum, GBCA'ları küçük moleküllü çözünen temizlenme kinetiği için makul vekiller haline getirir, ancak bulgular daha büyük makromoleküler çözünenlerin temizlenmesine doğrudan genellenmemelidir. Ayrıca, AQP4 su kanalları GBCA'lara geçirgen olmadığından, bulgular AQP4'ler tarafından kolaylaştırılan BOS-İSF değişimine doğrudan genellenemez.
Mevcut çalışmada, uygulanabilirliği kanıtlamak amacıyla kanülasyon prosedürünü hemen ardından bir görüntüleme oturumu takip etmiştir. Kanül implantasyonunun, glimfatik fonksiyonu baskılayabilen bir inflamatuar yanıtı tetikleyebileceği13 ve 24 saatlik bir bekleme süresinin glimfatik fonksiyonun bazal seviyelere dönmesine izin vereceği21 unutulmamalıdır. Araştırmacılar, glimfatik fonksiyonu incelemeyi amaçlayan çalışmalar tasarlarken bu faktörü dikkate almalıdır. Ayrıca, önceki bir çalışma, BOS akışının ketamin/ksilazin altında izofluran anestezisine göre daha yüksek olduğunu bildirmiştir18. Buna göre, mevcut protokol ilk indüksiyon için ketamin/ksilazin kullanmaktadır. Ancak, tek bir doz ketamin/ksilazin, birleştirilmiş kanülasyon ve görüntüleme protokolünün tüm süresi boyunca stabil anesteziyi sürdürmek için yetersizdir. Burada kullanılan anestezi rejimi, düşük doz izofluran ile dexmedetomidine kullanan önceki bir çalışmadan22 uyarlanmıştır. Bu yaklaşım, uzatılmış bir protokol boyunca fizyolojik stabiliteyi korumak ile anesteziye bağlı glimfatik fonksiyon baskılanmasını en aza indirmek arasında bir dengeyi temsil etmektedir.
Avantajlarına rağmen, ICV infüzyonunun bazı sınırlamaları vardır. Kranyal BOS'un küçük hacmi (~300 µL)23 göz önüne alındığında, yalnızca sınırlı miktarda izleyici madde infüze edilebilir. Ayrıca, infüzyon hızı (1 µL/min), BOS üretim hızıyla (~1.6 µL/min)23,24 kıyaslanabilir düzeydedir; bu nedenle, infüzyon sırasında ventriküler basınçta geçici bir artış beklenir. İnfüzyon hacminin veya hızının azaltılması bu sorunu kısmen hafifletebilir; ancak, daha küçük bir izleyici hacmi tespit hassasiyetini tehlikeye atabilirken, daha yavaş bir infüzyon hızı basınç artışını tamamen ortadan kaldırmadan toplam infüzyon süresini uzatır. Bu nedenle, söz konusu sınırlama sonraki dağılım ve temizlenme evrelerinin güvenilir şekilde karakterize edilmesini engellemese de, infüzyon süresince izleyici taşıma dinamikleri yorumlanırken dikkatli olunmalıdır. Toplamda, bu MRI uyumlu ICV infüzyon protokolü, BOS izleyici taşımasının in vivo tam zaman çizelgesini yakalamak için pratik ve uyarlanabilir bir platform sunarak BOS dinamiklerinin, çözünen madde temizlenmesinin ve bunların hastalıklardaki bozulmalarının incelenmesi için yeni yollar açmaktadır.
Açıklamalar
Yazarların beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, R01NS124206 ve RF1AG094791 ödül numaraları kapsamında National Institutes of Health tarafından desteklenmiştir. İçerik tamamen yazarların sorumluluğundadır ve National Institutes of Health'in resmi görüşlerini yansıtmayabilir. Şekil 4, BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 30 G x 1 in. Plastik Göbekli Hipodermik İğne | Exel | 26439 | |
| 50 µL, Gaz Sızdırmaz Şırınga, Luer Uç (LT) | Hamilton | 80901 | |
| Anatomik Dar Pens | Fine Science Tools | 11003-12 | |
| Yapay BOS | TOCRIS | 3525 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Bakır Kapiler Tüp 0.32 mm OD × 0.16 mm ID | Nippon Tokushukan Mfg. Co., Ltd. | C1220-11-109 | |
| Bakır Klips | IEUYO | FEBA 1801 | |
| Pamuklu Çubuk | Puritan | 868-WCS | |
| Dotarem (gadoterate meglumine) Enjeksiyonu, 0.5 mmol/mL | Guerbet | NDC 67684-2001-1 | |
| Matkap | Foredom | Model SR | |
| Matkap Ucu | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Matkap Tutucu | Stoelting | 51630 | |
| Dumont Medikal Pens | Fine Science Tools | 11252-00, 11253-20 | |
| Göz Pomadı | Rugby | NDC 0536 | |
| E-Z Anestezi EZ-7000 Klasik Sistem | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Graefe Pensi | Fine Science Tools | 11052-10,11152-10 | |
| Isıtma Pedi | Braintree Scientific | 5381 | |
| Yüksek Sıcaklık Koter Kiti | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| KWIK-SIL Silikon Yapıştırıcı, Düşük Toksisite, Kit | World Precision Instruments | KWIK-SIL | |
| İğne 5/8 in. tek kullanımlık, steril, 26 G | BD | 305115 | |
| Polietilen Tüp 0.61 mm OD × 0.28 mm ID | Scandidact | SKU252 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazine) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Neşter Uçları | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Makas | Fine Science Tools | 91460-11, 14007-14 | |
| Spatula | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| Stereotaksik Çerçeve | Stoelting | 51600U | |
| Cerrahi İğne Tutucu | AgnTho’s | 12502-12 | |
| Şırınga Pompası | New era pump system | NE-4000 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocaine) | AstraZeneca | 158543 |
Kaynaklar
- Balasubramanian V. Brain power. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118:e2107022118.
- Mattson MP, Arumugam TV. Hallmarks of brain aging: adaptive and pathological modification by metabolic states. Cell Metab. 2018;27:1176-1199.
- Iliff JJ, Wang M, Liao Y, Plogg BA, Peng W, Gundersen GA, et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci Transl Med. 2012;4. doi:10.1126/scitranslmed.3003748.
- Nedergaard M. Garbage truck of the brain. Science. 2013;340:1529-1530.
- Benveniste H, Lee H, Volkow ND. The glymphatic pathway: waste removal from the CNS via. cerebrospinal fluid transport. Neuroscientist. 2017;23:454-465.
- Mestre H, Hablitz LM, Xavier AL, Feng W, Zou W, Pu T, et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. eLife. 2018;7:e40070.
- Iliff JJ, Lee H, Yu M, Feng T, Logan J, Nedergaard M, et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J Clin Invest. 2013;123:1299-1309.
- Benveniste H, Lee H, Ozturk B, Chen X, Koundal S, Vaska P, et al. Glymphatic cerebrospinal fluid and solute transport quantified by MRI and PET imaging. Neuroscience. 2021;474:63-79.
- Eide PK, Ringstad G. MRI with intrathecal MRI gadolinium contrast medium administration: a possible method to assess glymphatic function in human brain. Acta Radiol Open. 2015;4:2058460115609635.
- Ringstad G, Valnes LM, Dale AM, Pripp AH, Vatnehol SAS, Emblem KE, et al. Brain-wide glymphatic enhancement and clearance in humans assessed with MRI. JCI Insight. 2018;3:e121537.
- Eide PK, Ringstad G. Functional analysis of the human perivascular subarachnoid space. Nat Commun. 2024;15:2001.
- Xavier ALR, Hauglund NL, von Holstein-Rathlou S, Li Q, Sanggaard S, Lou N, et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. J Vis Exp. 2018;(135):57378.
- Gahn-Martinez D, Giannetto MJ, Chang E, Beam N, Tobin P, Plá V, et al. Chronic intraventricular cannulation for the study of glymphatic transport. eNeuro. 2025;12:ENEURO.0537-24.2025.
- Decker Y, Müller A, Proulx ST. Contrast agent clearance dynamics and diffusion in the mouse brain after ventricular administration. Adv Sci (Weinh). 2025;12:2501502.
- Zhu Y, Zhu J, Ni C, Chen A, Li L, Gao Y, et al. Impact of infusion conditions and anesthesia on CSF tracer dynamics in mouse brain. Fluids Barriers CNS. 2026;23:23.
- DeVos SL, Miller TM. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. J Vis Exp. 2013;(75):50326.
- Ding G, Chopp M, Li L, Zhang L, Davoodi-Bojd E, Li Q, et al. MRI investigation of glymphatic responses to Gd-DTPA infusion rates. J Neurosci Res. 2018;96:1876-1886.
- Stanton EH, Persson NDÅ, Gomolka RS, Lilius T, Sigurðsson B, Lee H, et al. Mapping of CSF transport using high spatiotemporal resolution dynamic contrast-enhanced MRI in mice: effect of anesthesia. Magn Reson Med. 2021;85:3326-3342.
- Berger ML, Reither H, Schmid RW, Lassmann H. Manufacture and use of fused silica cannulas for intracerebral injections in freely moving rats. J Neurosci Methods. 1989;27:225-234.
- Zhang J, Tian W, Chen J, Yu J, Zhang J, Chen J. The application of polyetheretherketone (PEEK) implants in cranioplasty. Brain Res Bull. 2019;153:143-149.
- Plá V, Bork P, Harnpramukkul A, Olveda G, Ladrón-de-Guevara A, Giannetto MJ, et al. A real-time in vivo. clearance assay for quantification of glymphatic efflux. Cell Rep. 2022;40:111320.
- Benveniste H, Lee H, Ding F, Sun Q, Al-Bizri E, Makaryus R, et al. Anesthesia with dexmedetomidine and low-dose isoflurane increases solute transport via. the glymphatic pathway in rat brain when compared with high-dose isoflurane. Anesthesiology. 2017;127:976-988.
- Chiu C, Miller MC, Caralopoulos IN, Worden MS, Brinker T, Gordon ZN, et al. Temporal course of cerebrospinal fluid dynamics and amyloid accumulation in the aging rat brain from three to thirty months. Fluids Barriers CNS. 2012;9:3.
- Karimy JK, Kahle KT, Kurland DB, Yu E, Gerzanich V, Simard JM. A novel method to study cerebrospinal fluid dynamics in rats. J Neurosci Methods. 2015;241:78-84.
Yeniden basım ve izinler
Bu makale yayımlandı
Video yakında