Bu çalışma, nötrofil ilişkili inflamatuar hedefleri belirlemek ve gelecekteki doğrulamalar için öngörülen kateşin etkileşimlerini tanımlamak amacıyla; kamuya açık pediatrik pnömoni transkriptomiğini, fare akciğer tek hücre RNA dizilemesini, Paeonia kaynaklı bileşik taramasını, moleküler kenetlenmeyi ve moleküler dinamik simülasyonlarını entegre etmektedir.
Araştırma makalesi
Paeonia kaynaklı Kateşinin Zatürrede Nötrofil İlişkili İnflamasyon Üzerindeki Etkileri
Bu makalede
Özet
Özet
Çocuklarda zatürre, genellikle şiddetli klinik sonuçlara yol açabilen aşırı inflamatuar yanıtlar ve bağışıklık düzensizliği ile birlikte görülür. Kateşin, birçok hastalık durumunda anti-inflamatuar aktivite göstermiştir ancak zatürredeki rolü ve moleküler mekanizmaları belirsizliğini korumaktadır. Pediyatrik zatürreye ait halka açık dökme RNA dizileme verileri (GSE261482) ve deneysel bir zatürre modelinden elde edilen halka açık fare akciğer tek hücreli RNA dizileme verileri (GSE295484); ağırlıklı gen eş-ekspresyon ağ analizi, diferansiyel ekspresyon analizi, hücre tipi anotasyonu ve gen seti zenginleştirme analizi kullanılarak incelenmiştir. Kateşin ile seçilen proteinler arasındaki etkileşimler, moleküler kenetleme ve moleküler dinamik simülasyonları ile değerlendirilmiştir. Zatürre ile ilişkili özelliklerle bağlantılı temel bir gen modülü tanımlanmış ve öncelikle inflamatuar ve bağışıklıkla ilişkili yolaklarda zenginleşmiş 18 aday gen taranmıştır. Tek hücreli analiz, bu genlerin ağırlıklı olarak nötrofillerde ve alveolar makrofajlarda zenginleştiğini ve inflamatuar koşullar altında nötrofil oranlarının arttığını göstermiştir. MMP9, PYGL ve GADD45A aday genler olarak seçilmiştir. Kenetleme ve dinamik simülasyonları, kateşin ile bu seçilen proteinler arasındaki öngörülen stabil etkileşimleri desteklemiştir. Kateşin, nötrofil ilişkili yolakları modüle ederek ve temel bağışıklıkla ilişkili proteinlerle etkileşime girerek zatürre ile ilişkili inflamatuar yolaklar ile bağlantılı olabilir. Bu çalışma, kateşinin zatürredeki etkisine sistem düzeyinde bir bakış sunmakta ve daha ileri deneysel doğrulama için potansiyel hedefleri vurgulamaktadır.
Giriş
Zatürre, çocuklarda öncelikle Mycoplasma pneumoniae gibi enfeksiyöz ajanların neden olduğu yaygın ve potansiyel olarak ağır seyreden bir solunum yolu hastalığıdır. Toplum kaynaklı zatürrenin ana bileşenlerinden birini oluşturur ve aşırı inflamatuar yanıtlar ile immün disregülasyon nedeniyle önemli morbidite ile ilişkilidir1,2. Artan kanıtlar, tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) ve interlökin-6 (IL-6) dahil olmak üzere inflamatuar sitokinlerin; immün hücre göçünü, doku hasarını ve pulmoner disfonksiyonu teşvik ederek hastalık ilerlemesinde kritik roller oynadığını göstermektedir3. Antimikrobiyal terapideki ilerlemelere rağmen, pediatrik zatürrede inflamasyonu tetikleyen moleküler mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılamamıştır4.
Flavonoidler, anti-inflamatuar ve antioksidan özellikleri nedeniyle önemli ölçüde dikkat çekmişlerdir5. Çayda ve bitki kaynaklı gıdalarda yaygın olarak bulunan doğal bir polifenol olan kateşin'in, çeşitli hastalık modellerinde oksidatif stresi ve inflamatuar yanıtları hafiflettiği bildirilmiştir6. Önceki çalışmalar, kateşinin MAPK ve NF-κB yolakları dahil olmak üzere pro-inflamatuar sinyal kaskadlarını baskılayabildiğini ve sitokin ekspresyonunu düzenleyerek inflamasyonu ve metabolik disfonksiyonu hafifletebildiğini göstermiştir7. Bununla birlikte, mevcut çalışmaların çoğu metabolik veya kardiyovasküler hastalıklara odaklanırken, kateşinin solunum yolu inflamatuar hastalıklarındaki, özellikle de pnömonideki rolü yeterince araştırılmamıştır. Ayrıca, pnömonide kateşin aracılı korumanın altında yatan moleküler hedefler ve mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır.
Bu çalışma, kateşinin pnömonideki potansiyel moleküler mekanizmalarını araştırmayı amaçlamıştır. Kateşinin, immün regülasyonda yer alan temel proteinler ve sinyal yolakları ile etkileşime girerek inflamatuar yanıtları hafifletebileceği hipotezi kurulmuştur. Bu hipotezi test etmek için; aday genleri sistematik olarak belirlemek ve bunların kateşin ile etkileşimlerini değerlendirmek amacıyla ağ farmakolojisi, moleküler kenetleme, moleküler dinamik simülasyonu ve tek hücreli RNA sekanslama analizleri entegre edilmiştir. Nötrofillerin ve makrofajların hastalık ilerlemesindeki rolünü araştırmak için immün hücre dağılımı ve gen ekspresyon paternleri ayrıca analiz edilmiştir.
Sonuçlar, kateşin ile PYGL, MMP9 ve GADD45A dahil olmak üzere seçilen proteinler arasında stabil öngörülen bağlanmaları göstermiş ve moleküler dinamik simülasyonları boyunca yapısal stabilite korunmuştur. Ayrıca, tek hücre analizi, inflamatuar koşullar altında özellikle nötrofiller başta olmak üzere bağışıklık hücresi oranlarında önemli değişiklikler ortaya koymuştur. Bu bulgular, kateşinin bağışıklık hücresi fonksiyonlarını ve temel sinyal yolaklarını içeren anti-inflamatuar mekanizmalarla ilişkili olabileceğini göstermektedir. Bu çalışma, zatürrede potansiyel kateşin ilişkili mekanizmalara sistem düzeyinde bir bakış sunmakta ve kateşinin inflamatuar solunum yolu hastalığı araştırmaları için aday bir bileşik olarak daha fazla doğrulanmasını desteklemektedir.
Protokol
Bu çalışma, Gene Expression Omnibus veri tabanından alınan, kamuya açık ve kimliksizleştirilmiş veri setlerinin ikincil analizini içermektedir. Bu çalışma için yeni insan katılımcılar, hayvan deneyleri veya klinik örnekler alınmamış, toplanmamış veya oluşturulmamıştır. Orijinal veri setleri için etik onay ve bilgilendirilmiş onam süreci, verileri orijinal olarak oluşturan çalışmaların sorumluluğundaydı. Bu nedenle, mevcut ikincil analiz için ek bir etik kurul onayı gerekmemiştir.
Veri toplama ve ön işleme
Toplu RNA dizileme (RNA-seq) verileri, Gene Expression Omnibus (GEO) veri seti GSE2614828'den elde edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan ekspresyon matrisi, 139 pediatrik pnömoni örneği ve 38 sağlıklı kontrol örneği olmak üzere toplam 177 tüm kan örneği içermekteydi. Mevcut meta veriler arasında cinsiyet, etiyolojik sınıflandırma, toplama tüpü, seri ve hastalık durumu yer alıyordu. Pnömoni örnekleri, orijinal veri seti anotasyonuna göre kesin bakteriyel (DB), kesin viral (DV), olası bakteriyel (PB), olası viral (PV) veya bilinmeyen (U) olarak sınıflandırılmıştır.
Tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq) verileri, deneysel bir pnömoni modelindeki C57BL/6 yabanıl tip farelerin akciğer dokularından elde edilen GEO veri seti GSE2954849'den alınmıştır. Veri seti; oda havasına, PBS'ye veya E. coli'ye maruz bırakılan ve aspirasyondan 48 sa veya 96 sa sonra toplanan neonatal fareleri (PND05) ve jüvenil fareleri (PND12) içermektedir.
Ağırlıklı gen eş-ifade ağ analizi (WGCNA)
Eş-ifade ağının oluşturulması için, ifade matrisi önce düşük ifadeye sahip genleri kaldırmak amacıyla filtrelenmiştir. Düşük ifadeye sahip genler kaldırıldıktan sonra, değişkenlik medyan mutlak sapma (MAD) kullanılarak değerlendirilmiştir. En yüksek MAD değerlerine sahip 5.000 gen, R programında ağırlıklı gen eş-ifade ağ analizi (WGCNA) için seçilmiştir. R2> 0.8 ölçeksiz topoloji kriterini karşıladığı için 15'lik bir yumuşak eşikleme gücü uygulanmıştır. Bu eşik, daha sonra topolojik örtüşme matrisine (TOM) dönüştürülen ağırlıklı komşuluk matrisini oluşturmak için kullanılmıştır. Gen modülleri daha sonra TOM tabanlı hiyerarşik kümeleme ağacından tespit edilmiştir. Zatürre ile ilişkili özelliklerle bağlantılı modülleri belirlemek için, modül özgenleri (eigengenes) hesaplanmış ve hastalık durumu ile etiyoloji ile korelasyonları test edilmiştir.
Diferansiyel ekspresyon analizi
Diferansiyel ekspresyon gösteren genleri belirlemek için pnömoni ve sağlıklı kontrol grupları limma R paketi kullanılarak karşılaştırılmıştır. Çoklu test düzeltmesi Benjamini-Hochberg yöntemi kullanılarak yapılmıştır. Genler, yalnızca her iki eşik değer de karşılandığında diferansiyel ekspresyon gösteren genler olarak kabul edilmiştir: |log2 fold change| > 1 ve düzeltilmiş p-değeri < 0.05.
Paeonia kaynaklı aktif bileşiklerin tanımlanması ve hedef tahmini
Paeonia'daki biyoaktif bileşikleri ve bunların potansiyel biyolojik hedeflerini sistematik olarak tanımlamak için, yerleşik ağ farmakolojisi çerçeveleri izlenerek güvenilirlik ve kapsamlılığı sağlamak amacıyla çoklu veritabanı entegrasyon stratejisi uygulanmıştır. İlk olarak, Paeonia'nın aktif bileşikleri Geleneksel Çin Tıbbı Sistemler Farmakolojisi Veritabanı'ndan (TCMSP, https://tcmsp-e.com) ve ETCM ile literatür kaynakları da dahil olmak üzere diğer kamuya açık veritabanlarından alınmıştır. Aday biyoaktif içerikleri belirlemek için bileşikler, oral biyoyararlanım (OB ≥ 30%) ve ilaç benzerliği (DL ≥ 0.18) dahil olmak üzere farmakokinetik parametrelere göre taranmıştır.
Potansiyel protein hedefleri, tamamlayıcı ligand tabanlı yaklaşımlar kullanılarak öngörülmüştür. Bileşik yapılarını bilinen aktiviteye sahip ligandlarla karşılaştırarak olası insan hedeflerini belirlemek için SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch) kullanılmış ve yalnızca olasılığı ≥ 0.1 olan öngörüler tutulmuştur. Hedef kapsamını genişletmek amacıyla, kanonik hedef öngörüleri tarafından yakalanamayan etkileşimler de dahil olmak üzere, protein aileleri genelindeki olası hedef dışı ilişkilere yönelik tarama yapmak için Benzerlik Topluluk Yaklaşımı (SEA, http://sea.bkslab.org) da kullanılmıştır. Ligand tabanlı öngörüleri daha da tamamlamak için, kapsamlı bir insan protein veritabanına karşı ters farmakofor haritalama yapmak amacıyla PharmMapper Sunucusu (http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/) kullanılmış ve normalize edilmiş uyum skorları ≥ 0.7 olan hedefler seçilmiştir. Ayrıca, hedef belirlemenin güvenilirliğini artırmak için DrugBank ve BindingDB dahil olmak üzere halka açık veritabanlarından deneysel olarak doğrulanmış bileşik-hedef etkileşimleri toplanmıştır. Öngörülen tüm hedefler daha sonra UniProt veritabanı (https://www.uniprot.org) kullanılarak, organizma “Homo sapiens” ile sınırlandırılmak kaydıyla resmi gen sembollerine standart hale getirilmiştir. Veri doğruluğunu sağlamak için yinelenen girişler kaldırılmıştır. Entegre hedef seti, Paeonia için öngörülen ve doğrulanan tüm hedeflerin birleşimi olarak tanımlanmış olup, bitkinin farmakolojik etkilerinin potansiyel moleküler temelini temsil etmektedir. Kateşin, Paeonia kaynaklı aktif bileşiklerden biri olarak tanımlandığı ve iyi belgelenmiş anti-inflamatuar aktiviteye sahip olduğu için, sonraki moleküler kenetleme ve moleküler dinamik simülasyonları için temsilci bileşik olarak seçilmiştir.
Fonksiyonel zenginleştirme analizi
Fonksiyonel zenginleştirme, clusterProfiler R paketi kullanılarak Gen Ontolojisi (GO) biyolojik süreçleri ve Kyoto Gen ve Genom Ansiklopedisi (KEGG) yolları için değerlendirilmiştir. Yanlış keşif oranı (FDR) < 0.05 olduğunda zenginleşmiş terimler tutulmuştur.
Tek hücreli RNA dizileme analizi ve alt analizler
Tek hücreli RNA dizileme verileri Seurat ile işlenmiştir. Alt analizler için işlenmiş GSE295484 matrisi kullanılmış ve içe aktarma işleminden sonra hücre düzeyinde ek bir filtreleme uygulanmamıştır. İşlenmiş matris 90.883 hücre ve 26.511 gen içermektedir. Kalite kontrol grafikleri için hücre başına saptanan 200 ve 8.000 gen ile %1.4 mitokondriyal okuma referans eşikleri kullanılmıştır. Veriler normalize edilmiş, ölçeklendirilmiş ve temel bileşen analizine (PCA) tabi tutulmuştur. Ardından hücre kümelemesi gerçekleştirilmiş ve hücre popülasyonlarını düşük boyutlu uzayda görselleştirmek için tekdüze manifold yaklaşımı ve izdüşümü (UMAP) kullanılmıştır. Hücre kimlikleri, kanonik belirteç genlerine göre atanmıştır. Belirteç genleri, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25 ve logfc.threshold = 0.25 parametreleri kullanılarak FindAllMarkers ile belirlenmiştir.
Aday gen setlerinin tek hücre düzeyindeki aktivitesini değerlendirmek için AUCell R paketi kullanılarak AUCell analizi gerçekleştirilmiştir. Hücreler, önceden tanımlanmış gen imzalarının ekspresyonuna göre puanlanmış ve zenginleşme paternleri UMAP grafikleri üzerinde görselleştirilmiştir. GSE295484 için alveolar makrofajlar ve nötrofiller dahil olmak üzere immün hücre popülasyonlarının oranları; aspirasyondan sonraki 48. ve 96. saatlerde oda havası, PBS ve E. coli grupları genelinde hesaplanmıştır. Gruplar arasındaki farklar non-parametrik istatistiksel testler kullanılarak değerlendirilmiştir. Nötrofil marker genleri tek hücre veri setinden belirlenmiş ve daha ileri analizler için temel nötrofil ilişkili genleri elde etmek amacıyla önceden tanımlanmış aday genlerle kesiştirilmiştir.
Moleküler kenetleme
Moleküler kenetleme AutoDock Vina kullanılarak gerçekleştirilmiş; reseptör ve ligand hazırlıkları ise AutoDock Tools ile yapılmıştır. Hedef proteinlerin kristal yapıları, GADD45A (PDB ID: 2KG4), MMP9 (PDB ID: 6ESM) ve PYGL (PDB ID: 3DDS) dahil olmak üzere Protein Veri Bankası'ndan (PDB) elde edilmiştir. Protein yapıları, su molekülleri ve birlikte kristalleşmiş ligandlar silinerek kenetleme öncesinde işlenmiştir. Ardından polar hidrojen atomları eklenmiş ve Gasteiger yükleri atanmıştır.
Kateşinin üç boyutlu yapısı PubChem'den temin edilmiş ve AutoDock Tools ile hazırlanmıştır. Ardından, kateşinin her bir hedef proteinle kenetlenmesi, öngörülen bağlanma afinitesinin ve etkileşim paterninin değerlendirilmesi için AutoDock Vina kullanılmıştır. Kenetlenme ızgara kutusu parametreleri şu şekildedir: GADD45A-kateşin, center_x = 0.131, center_y = -0.002, center_z = -0.018, size_x = 47.25, size_y = 47.25, size_z = 47.25; MMP9-kateşin, center_x = -0.434, center_y = 43.036, center_z = 14.868, size_x = 47.25, size_y = 47.25, size_z = 47.25; PYGL-kateşin, center_x = 88.408, center_y = -80.795, center_z = 105.959, size_x = 100.45, size_y = 100.45, size_z = 100.45.
Moleküler dinamik simülasyonu
Protein bileşenleri için AMBER14SB kuvvet alanı kullanılmıştır. Ligand parametreleri, sobtop_1.0 (dev3.1) aracılığıyla GAFF2 kuvvet alanı ile oluşturulmuş ve RESP yükleri atanmıştır. Her bir protein-ligand kompleksini kübik bir simülasyon kutusunda çözünür hale getirmek için TIP3P su kullanılmıştır. Na⁺ ve Cl⁻ iyonlarının eklenmesi, sistemin nötralize edilmesine ve 0.15 M iyonik konsantrasyonun sağlanmasına yardımcı olmuştur. Uzun menzilli elektrostatik etkileşimler için 1 nm kesme mesafesiyle parçacık ağ Ewald (PME) yöntemi kullanılmıştır. Bağ kısıtlamaları LINCS algoritması kullanılarak uygulanmıştır. Sterik çakışmaları gidermek için en dik iniş ve eşlenik gradyan yöntemleri kullanılarak enerji minimizasyonu gerçekleştirilmiştir.
Dengeleme işleminden sonra, üretim MD simülasyonları 310 K ve 1 bar'da, Nosé–Hoover termostat ve Parrinello–Rahman barostat tarafından kontrol edilen NPT koşulları altında gerçekleştirilmiştir. Her bir simülasyon, 2 fs zaman adımıyla 100 ns boyunca çalıştırılmıştır.
İstatistiksel analiz
Tüm istatistiksel analizler R yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Korelasyon analizleri, uygunluğa göre Pearson veya Spearman yöntemleri kullanılarak yürütülmüştür. Grup karşılaştırmaları, Kruskal–Wallis testi dahil olmak üzere non-parametrik testler kullanılarak yapılmıştır. p-değeri < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.
Sonuçlar
WGCNA ile pediatrik pnömoni ile ilişkili anahtar bir gen modülünün belirlenmesi
Pediatrik pnömoni ile ilişkili gen modüllerini belirlemek için, pnömonili hastaların ve sağlıklı kontrollerin tüm kan transkriptomik verileri üzerinde WGCNA gerçekleştirilmiştir. Örnek kümeleme analizi, sonraki analizler için veri kalitesinin iyi olduğunu gösteren belirgin bir aykırı değer ortaya çıkarmamıştır (Şekil 1A). PCA, pnömoni ve sağlıklı gruplar arasında net bir ayrılma eğilimi sergileyerek, durumlar arasında belirgin transkriptomik profiller olduğunu göstermiştir (Şekil 1B). Ölçeksiz bir ağ oluşturmak için genler, medyan mutlak sapmaya göre sıralanmış, ağ kurulumu için ilk 5.000 gen seçilmiş ve nispeten düşük ortalama bağlantı korunurken ölçeksiz topoloji uyum indeksi kriterine (R2 > 0,8) dayanarak yumuşak eşikleme gücü 15 olarak belirlenmiştir (Şekil 1C). Bu eşik kullanılarak yapılan hiyerarşik kümeleme, farklı ekspresyon modellerine sahip birden fazla gen modülü tanımlamıştır (Şekil 1D). Modül-özellik ilişkisi analizi, birkaç modülün klinik fenotiplerle anlamlı düzeyde ilişkili olduğunu ortaya koymuştur. Özellikle mavi modül, hem hastalık durumu (pnömoni ve sağlıklı) hem de etiyolojik sınıflandırma ile güçlü bir korelasyon göstermiş, bu da hastalık seyri ve konak yanıtındaki potansiyel rolüne işaret etmiştir (Şekil 1E).
Ayrıca, mavi modül içindeki modül üyeliği ile gen anlamlılığının saçılım grafiği analizi, güçlü bir pozitif korelasyon (cor = 0.6, p = 2.1e−35) göstermiş olup, modül içinde yüksek düzeyde bağlantılı olan genlerin klinik özellik ile de güçlü bir şekilde ilişkili olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 1F).
Mavi modülün bakteriyel pnömoni etiyolojisi ile ilişkisi
Pnömoni etiyolojileri arasındaki gen ekspresyon farklarını daha detaylı incelemek için; kontroller (C), kesin bakteriyel (DB), kesin viral (DV), olası bakteriyel (PB), olası viral (PV) ve bilinmeyen (U) gruplarını içeren çoklu klinik sınıflandırmalar kullanılarak WGCNA gerçekleştirildi. Modül-özellik ilişkisi analizi, birkaç modülün belirli etiyolojik alt tiplerle anlamlı korelasyonlar sergilediğini ortaya koydu. Özellikle mavi modül, DB grubu ile en güçlü pozitif korelasyonu göstererek, bakteriyel enfeksiyona özgü konak yanıtlarında potansiyel bir rolü olduğunu düşündürdü (Şekil 2A).
Gen kümeleme dendrogramı ve buna karşılık gelen modül ataması, modül oluşturmanın sağlamlığını ve gen kümelerinin net ayrımını daha da doğrulamıştır (Şekil 2B). Mavi modül içerisinde, modül üyeliği ile gen anlamlılığı arasındaki analiz, anlamlı bir pozitif korelasyon göstermiş (cor = 0.41, p = 7.8e−14), bu durum bu modül içindeki yüksek bağlantılı genlerin aynı zamanda etiyolojik özellik ile güçlü bir şekilde ilişkili olduğunu göstermiştir (Şekil 2C).
Ayrıca, farklı etiyolojik gruplar arasında modül özgen (eigengene) ekspresyonunun karşılaştırılması, mavi modülde anlamlı farklılıklar olduğunu ortaya koymuştur (Kruskal–Wallis testi, p = 1.5e−13). Özellikle mavi modül, diğer etiyolojik kategorilerle karşılaştırıldığında, bakteriyel pnömoni gruplarında ve özellikle DB alt grubunda yüksek ekspresyon göstermiştir (Şekil 2D).
İntegrasyon analizi ile pediatrik pnömoni ile ilişkili Paeonia kaynaklı bileşiklerle ilgili on sekiz aday gen belirlendi
Pediatrik pnömoni ile ilişkili aday genleri ve potansiyel Paeonia ilişkili hedefleri belirlemek için öncelikle pnömoni hastaları ile sağlıklı kontroller arasında diferansiyel ekspresyon analizi gerçekleştirildi. Bu kriterler kullanılarak, pnömoni ve sağlıklı kontrol örnekleri arasında 524'ü yukarı regüle ve 586'sı aşağı regüle olmak üzere toplam 1.110 diferansiyel eksprese gen (DEG) belirlendi. Yukarı regüle olan 524 DEG, Ek Tablo S1'de sunulmuştur (ayrıca bkz. Şekil 3A). Anahtar genleri daha fazla rafine etmek için, pnömoni ile ilişkili DEG'ler, DB fenotipi ile ilişkili genler ve Paeonia'nın öngörülen hedefleri ile kesiştirildi. Bu integratif analiz, hastalık ilerlemesinde ve Paeonia ilişkili yanıtlarda potansiyel rolleri olduğunu düşündüren 18 örtüşen gen ortaya çıkardı (Şekil 3B).
Paeonia'nın aktif bileşenleri ile tanımlanan aday genler arasındaki ilişkileri görselleştirmek amacıyla bir bileşik-hedef etkileşim ağı oluşturulmuş ve bileşikler ile hedefler arasında kapsamlı bir bağlantısallık olduğu ortaya çıkarılmıştır (Ek Tablo S2 ve Şekil 3C). Bu 18 genin biyolojik fonksiyonlarını araştırmak için fonksiyonel zenginleştirme analizleri gerçekleştirilmiştir. GO biyolojik süreç zenginleştirmesi, aday genleri temel olarak inflamatuvar yanıt regülasyonu, peptid hormon yanıtı, reaktif oksijen türleri metabolizmasının pozitif regülasyonu ve tip II interferon aracılı sinyalleme regülasyonu dahil olmak üzere immün ve inflamatuvar fonksiyonlarla ilişkilendirmiştir (Şekil 3D). KEGG analizi ayrıca genlerin, IL-17 ve NF-κB sinyal yolakları gibi inflamasyon ve immünite ile ilgili yolakların yanı sıra glukagon sinyallemesi ve steroid hormon biyosentezi dahil olmak üzere metabolik ve endokrin ile ilgili yolaklarda zenginleştiğini göstermiştir (Şekil 3D).
Tek hücreli transkriptomik analizde nötrofillerde ve alveolar makrofajlarda aday genlerin zenginleşmesi
Deneysel bir pnömoni bağlamında aday genlerin hücresel dağılımını araştırmak için fare akciğer scRNA-seq veri seti GSE295484 analiz edildi. Veri güvenilirliğini değerlendirmek amacıyla kalite kontrol analizi gerçekleştirildi. Saptanan gen sayılarının, UMI sayımlarının, mitokondriyal ve ribozomal gen yüzdelerinin dağılımları, işlenen matriste genel olarak yüksek kaliteli tek hücreli verilere işaret etti (Şekil 4A). Saçılım grafikleri, kalite kontrol görselleştirmesinde kullanılan gen saptama ve mitokondriyal içerik için referans eşikleri gösterdi (Şekil 4B).
Normalizasyon ve boyut indirgeme işlemlerinin ardından, hücreler kümelendi ve UMAP kullanılarak görselleştirildi. Nötrofiller, alveoler makrofajlar, monositler, epitel hücreler ve diğer immün ve stromal hücre tipleri dahil olmak üzere belirgin hücre popülasyonları tanımlanarak, pnömoni sırasındaki akciğer mikroçevresinin hücresel heterojenliği ortaya kondu (Şekil 4C). 18 aday genin tek hücre düzeyindeki aktivitesini değerlendirmek için AUCell analizi gerçekleştirildi. Sonuçlar, bu hücre popülasyonlarındaki daha yüksek AUC skorlarının gösterdiği üzere, gen imzasının ağırlıklı olarak nötrofillerde ve alveoler makrofajlarda zenginleştiğini gösterdi (Şekil 4D).
Bir fare bakteriyel pnömoni modelinde Paeonia türevli bileşik hedefleriyle ilişkili enflamatuar genler
Fare deneysel pnömoni modelindeki immün hücre dinamiklerini daha ayrıntılı incelemek için; oda havası, PBS ve E. coli gruplarında aspirasyondan sonraki 48. ve 96. saatlerde alveoler makrofajların ve nötrofillerin oranları analiz edildi. 48. saatte, alveoler makrofajlar hava ve PBS koşullarına kıyasla E. coli enfeksiyonu altında belirgin bir azalma gösterirken, nötrofiller hücre oranında önemli bir artış sergiledi (Şekil 5A). Benzer bir eğilim 96. saatte de gözlemlendi; nötrofil oranları E. coli stimülasyonuna yanıt olarak yüksek kalmaya devam ederken, alveoler makrofajlar nispeten daha düşük seviyeler gösterdi. Bu sonuçlar, bakteriyel enfeksiyon sırasında nötrofillerin belirgin bir ekspansiyon gösterdiğini işaret etmektedir. Nötrofillerin fonksiyonel özelliklerini araştırmak için nötrofil marker genleri belirlendi ve fonksiyonel zenginleştirme analizi gerçekleştirildi. KEGG zenginleştirmesi, nötrofil marker genlerini TNF, MAPK ve C-tipi lektin reseptör yolakları dahil olmak üzere enflamatuar sinyalizasyonla ilişkilendirdi (Şekil 5B). GO biyolojik süreç terimleri de lökosit migrasyonu, lökosit hücre-hücre adezyonu, savunma yanıtının pozitif regülasyonu ve bakteriyel kökenli moleküllere yanıt gibi immün yanıt fonksiyonlarında yoğunlaşmıştı (Şekil 5B). Nötrofil aktivitesini, pnömoniyi ve Paeonia hedeflerini birbirine bağlayan kilit genleri belirlemek için nötrofil marker genleri, önceden tanımlanmış 18 aday genle kesiştirildi. Bu analiz sonucunda üç örtüşen gen elde edildi: MMP9, PYGL ve GADD45A (Ek Tablo S3 ve Şekil 5C). Son olarak, tek hücreli gen ekspresyon görselleştirmesi, bu üç genin ağırlıklı olarak nötrofil popülasyonlarında eksprese edildiğini göstererek (Şekil 5D), nötrofil aracılı enflamatuar yanıtlardaki potansiyel rollerini daha da desteklemiştir.
Moleküler kenetlemede kateşinin seçilen proteinlere öngörülen bağlanma afinitesi
Potansiyel kateşin-protein etkileşimlerini daha ayrıntılı değerlendirmek için, seçilen proteinler (MMP9, PYGL ve GADD45A) ile Paeonia kaynaklı aktif bir bileşik olan kateşin arasında moleküler kenetleme analizi gerçekleştirilmiştir. GADD45A, MMP9 ve PYGL'nin kristal yapıları Protein Veri Bankası'ndan (Protein Data Bank) elde edilmiş, kateşinin 3D yapısı ise PubChem veri tabanından alınmıştır. Kenetleme sonuçları, kateşinin seçilen üç proteinin tamamının bağlanma bölgelerine bağlanabildiğini göstermiş; bağlanma enerjileri GADD45A için −6.3 kcal/mol, MMP9 için −7.6 kcal/mol ve PYGL için −8.0 kcal/mol olarak belirlenmiştir (Şekil 6). Seçilen bu proteinler arasında kateşin, en güçlü öngörülen bağlanma afinitesini PYGL ile sergilemiş, bunu sırasıyla MMP9 ve GADD45A izlemiştir; bu durum, metabolizma ile ilişkili bir proteinle potansiyel bir tercihi etkileşime işaret etmektedir.
Moleküler düzeyde kateşin, her bir proteindeki temel amino asit kalıntılarıyla birden fazla hidrojen bağı ve hidrofobik etkileşim oluşturmuştur. GADD45A'da kateşin, GLN33 ve TRP135 gibi kalıntılarla etkileşime girmiştir. MMP9'da GLN227, TYR248 ve HIS236 dahil olmak üzere kalıntılarla kararlı hidrojen bağları gözlemlenmiştir. Benzer şekilde, PYGL'de kateşin, LYS554 ve ASN631 gibi kalıntılarla çoklu hidrojen bağları oluşturarak bağlanma stabilitesine katkıda bulunmuştur. Hidrojen bağlarının yanı sıra, etkileşim analizi van der Waals kuvvetlerini ve π-ilişkili etkileşimleri ortaya koymuş olup, bu durum öngörülen ligand-protein komplekslerinin stabilitesini artıran çok modlu bir bağlanma paternine işaret etmektedir. Toplu olarak bu sonuçlar, kateşinin MMP9, PYGL ve GADD45A ile kararlı öngörülen kompleksler oluşturabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, bu etkileşimlerin terapötik ilgisi daha fazla deneysel doğrulama gerektirmektedir.
Kateşin ve seçilen proteinler arasındaki öngörülen stabil etkileşimler
Moleküler kenetleme ile elde edilen kenetleme pozlarına dayanarak, kateşin-protein komplekslerinin stabilitesini daha ayrıntılı değerlendirmek amacıyla 100 ns'lik moleküler dinamik simülasyonları gerçekleştirilmiştir. RMSD analizi, üç protein-ligand kompleksinin de simülasyon süresince dengeye ulaştığını göstermiştir. Bunlar arasında PYGL-kateşin ve MMP9-kateşin kompleksleri nispeten stabil RMSD dalgalanmaları sergilerken, GADD45A-kateşin kompleksi biraz daha yüksek dalgalanmalar göstermiş ancak kabul edilebilir bir aralıkta kalmıştır (Şekil 7A). Rg analizi, tüm komplekslerin simülasyon boyunca zamanla minimal varyasyonlar göstererek stabil yapısal kompaktlığı koruduğuna işaret etmiştir (Şekil 7B). Benzer şekilde, SASA analizi tüm kompleksler için stabil maruziyet seviyelerini ortaya koyarak yapısal stabilitelerini daha da desteklemiştir (Şekil 7C). Hidrojen bağı analizi, kateşin ile seçilen proteinler arasında kalıcı etkileşimler olduğunu ortaya çıkarmıştır. PYGL-kateşin kompleksi, MMP9 ve GADD45A'ya kıyasla zaman içinde daha yüksek sayıda hidrojen bağı korumuş; bu durum daha güçlü ve daha stabil bağlanma etkileşimlerine işaret etmiştir (Şekil 7D).
Kalıntı düzeyindeki esneklik RMSF kullanılarak değerlendirilmiştir. Sonuçlar, çoğu kalıntının düşük dalgalanma sergilediğini, yalnızca birkaç bölgenin daha yüksek esneklik gösterdiğini ortaya koymuş ve bu durum ligand bağlanmasının proteinlerde büyük bir yapısal instabiliteye yol açmadığını göstermiştir (Şekil 7E). Toplu olarak bu bulgular, kateşinin MMP9, PYGL ve GADD45A ile öngörülen kararlı kompleksler oluşturduğunu ve en güçlü stabilitenin PYGL–kateşin etkileşiminde gözlemlendiğini göstermektedir. Bu sonuçlar, kateşin ile seçilen proteinler arasındaki öngörülen kararlı etkileşimleri desteklemekte ve daha ileri deneysel doğrulama için hesaplamalı kanıtlar sunmaktadır.
Veri Kullanılabilirliği:
Bu çalışmada halka açık veri setleri analiz edilmiştir. bulk RNA-seq veri seti, GSE261482 erişim numarası altında Gene Expression Omnibus (GEO) üzerinden (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE261482) ve fare akciğer scRNA-seq veri seti, GSE295484 erişim numarası altında (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE295484) erişilebilirdir. Makalede kullanılan işlenmiş çıktılar, Ek Tablo S1, Ek Tablo S2 ve Ek Tablo S3 olarak sunulmuştur.
Şekil 1. WGCNA kurulumu ve hastalıkla ilişkili modüllerin tanımlanması (A) Gen ekspresyon profillerinden örnek kümelemesi yapılmış olup, ilgili özellik açıklamaları dendrogramun altında gösterilmiştir. (B) Temel bileşenler analizi, örneklerin ilk iki temel bileşen boyunca dağılımını göstermektedir. (C) Yumuşak eşikleme kuvveti, ölçeksiz topoloji uyum indeksi ve ortalama bağlantı kullanılarak değerlendirilmiştir. (D) Genler topolojik örtüşmeye göre kümelenmiş ve modül atamaları renklerle belirtilmiştir. (E) Modül özgen (eigengene) korelasyonlarının klinik özelliklerle ilişkisi bir ısı haritası olarak gösterilmiştir. (F) Mavi modüldeki genler için modül üyeliği ile gen anlamlılığı arasındaki ilişki gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Zatürre etiyolojisine dayalı WGCNA analizi. (A) Kontrol, kesin bakteriyel, kesin viral, olası bakteriyel, olası viral ve bilinmeyen grupları içeren etiyoloji grupları için modül eigengene korelasyonları gösterilmiştir. (B) Gen modülleri, topolojik örtüşme tabanlı kümeleme dendrogramından atanmıştır. (C) Mavi modül için modül üyeliği ve gen anlamlılığı grafiğe aktarılmıştır. (D) Mavi modül eigengene ekspresyonu etiyoloji grupları arasında karşılaştırılmıştır. Kısaltmalar: WGCNA = ağırlıklı gen ko-ekspresyon ağ analizi; C = kontrol; DB = kesin bakteriyel; DV = kesin viral; PB = olası bakteriyel; PV = olası viral; U = bilinmeyen. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Aday genlerin tanımlanması ve fonksiyonel analizi. (A) Zatürre ve kontrol örnekleri arasında farklı şekilde ifade edilen genleri gösteren yanardağ grafiği. (B) Zatürre DEG'leri, kesin bakteri ilişkili genler ve Paeonia hedef genleri arasındaki örtüşmeyi gösteren Venn diyagramı. (C) Paeonia'nın aktif bileşenleri ile aday genler arasındaki bileşik-hedef etkileşim ağı. (D) Örtüşen genler için Gen Ontolojisi biyolojik süreç zenginleştirmesini (sol) ve KEGG yolak zenginleştirmesini (sağ) gösteren sütun grafikleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Zatürrenin tek hücreli transkriptomik analizi. (A) Keman grafikleri; nCount_RNA, nFeature_RNA, mitokondriyal gen yüzdesi ve ribozomal gen yüzdesi dahil olmak üzere kalite kontrol metriklerini özetlemektedir. (B) UMI sayıları, hücre başına tespit edilen genler ve mitokondriyal gen yüzdesi arasındaki ilişkileri gösteren dağılım grafikleri. (C) Hücre tiplerine göre açıklanmış hücre kümelerinin UMAP görselleştirmesi. (D) Tek hücrelerde aday gen imzasının AUCell skorlarını gösteren UMAP grafiği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5. Nötrofil dinamikleri ve temel genlerin belirlenmesi. (A) Farklı koşullarda (hava, PBS ve E. coli) 48 sa. ve 96 sa. sonunda alveolar makrofajların ve nötrofillerin hücre oranlarını gösteren kutu grafikleri. (B) Nötrofil belirteç genleri için KEGG yolak zenginleştirmesini (solda) ve GO biyolojik süreç zenginleştirmesini (sağda) gösteren sütun grafikleri. (C) Nötrofil belirteç genleri ile bakteriyel pnömoni ve Paeonia'nın ortak hedefleri arasındaki örtüşmeyi gösteren Venn diyagramı. (D) Hücre popülasyonları genelinde MMP9, PYGL ve GADD45A ekspresyon modellerini gösteren UMAP grafikleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6. Kateşinin seçilen proteinlerle moleküler kenetlenmesi. Kateşinin GADD45A (üst), MMP9 (orta) ve PYGL (alt) proteinlerine bağlanmasını gösteren protein-ligand komplekslerinin üç boyutlu yapıları. Büyütülmüş paneller bağlanma bölgelerini ve ana amino asit kalıntıları ile olan temasları göstermektedir. İki boyutlu diyagramlar, kateşin ile seçilen proteinler arasındaki hidrojen bağlarını ve diğer etkileşimleri sunmaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7. Protein–ligand komplekslerinin moleküler dinamik simülasyonları. (A) Simülasyon sırasında komplekslerin kare ortalama sapması. (B) Zamanla değişen jirasyon yarıçapı. (C) Simülasyon sırasında çözücüye açık yüzey alanı. (D) Kateşin ile hedef proteinler arasındaki hidrojen bağı sayılarının zamanla değişimi. (E) Her bir kompleksteki protein kalıntılarının kare ortalama dalgalanması. Kısaltmalar: RMSD = kare ortalama sapma; Rg = jirasyon yarıçapı; SASA = çözücüye açık yüzey alanı; RMSF = kare ortalama dalgalanma. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo S1. Pediyatrik pnömoni ile sağlıklı kontrol örnekleri arasında yukarı regüle olmuş farklı eksprese edilen genler; gen sembolleri, log2 kat değişimleri, P-değerleri, düzeltilmiş P-değerleri ve ilgili limma istatistikleri dahil. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo S2. Ağ analizi için kullanılan, bileşik tanımlayıcılarını, bileşik isimlerini ve ilişkili hedef genleri içeren Paeonia bileşik-hedef etkileşim tablosu. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.
Ek Tablo S3. GSE295484'ten alınan; P-değerlerini, ortalama log2 kat değişimlerini, ekspresyon yüzdelerini, düzeltilmiş P-değerlerini, hücre kümesi anotasyonlarını ve gen sembollerini içeren tek hücreli marker gen tablosu. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tartışma
Zatürre, bebeklerde ve küçük çocuklarda hastalık ve ölümün küresel çapta temel nedenlerinden biri olup önemli bir halk sağlığı yükü oluşturmaktadır1. Pediyatrik zatürrenin patogenezi karmaşıktır ve aşırı inflamatuar yanıtlar, oksidatif stres ile immün ve metabolik yolakların düzensizliği dahil olmak üzere birbiriyle bağlantılı birden fazla süreci kapsar2,10,11. Önceki çalışmalar, özellikle nötrofillerin ve makrofajların başında olmak üzere doğal bağışıklık hücrelerinin kontrolsüz aktivasyonunun; pro-inflamatuar sitokinlerin, proteolitik enzimlerin ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) salınımı yoluyla akciğer dokusu hasarına katkıda bulunduğunu öne sürmüştür12. Antimikrobiyal ve destekleyici tedavilerdeki ilerlemelere rağmen, bu temel moleküler mekanizmaları hedefleyen etkili stratejiler sınırlı kalmaya devam etmektedir. Bu nedenle, inflamasyonu modüle edebilecek ve immün homeostazı yeniden sağlayabilecek yeni terapötik ajanların belirlenmesi büyük önem taşımaktadır.
Fitokimyasallar, özellikle de kateşinler, iyi belgelenmiş anti-inflamatuar, antioksidan ve immünomodülatör özellikleri nedeniyle giderek daha fazla dikkat çekmektedir13,14,15. Ancak, kateşinin pnömonide koruyucu etkilerini meydana getirdiği kesin moleküler mekanizmalar büyük ölçüde belirsizliğini korumaktadır. Bu çalışma; transkriptomik, tek hücreli RNA dizileme, moleküler kenetleme ve moleküler dinamik simülasyonlarını birleştiren bütünleştirici bir yaklaşım kullanarak, pediatrik pnömonideki potansiyel kateşin ilişkili mekanizmaları sistematik olarak araştırmıştır.
Başlangıç hipoteziyle uyumlu olarak sonuçlar, WGCNA tarafından tanımlanan mavi modülün hem hastalık durumuyla hem de etiyoloji sınıflandırmasıyla anlamlı düzeyde ilişkili olduğunu göstermiş ve bu modülün pediatrik pnömonide yer alan temel bir transkripsiyonel programı temsil ettiğini ortaya koymuştur. Diferansiyel ekspresyon analizi ve Paeonia hedef tahmininin daha ileri entegrasyonu; enflamatuar yanıt, reaktif oksijen türleri metabolizması ve tip II interferon sinyalleme dahil olmak üzere immün ilgili yolaklarda zenginleşmiş 18 ortak gen ortaya çıkarmıştır16,17. Bu bulgular, disregüle immün yanıtların ve oksidatif stresin hastalık progresyonunun merkezi itici güçleri olduğu görüşünü daha da desteklemektedir.
Tek hücreli RNA sekanslama analizi, aday gen setinin ağırlıklı olarak nötrofillerde ve alveolar makrofajlarda zenginleştiğini ortaya koyarak, zatürre progresyonunda doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin merkezi rolünü vurgulamıştır. Nötrofil oranları, özellikle 48 h ve 96 h sürelerinde E. coli stimülasyonu altında önemli ölçüde artmıştır; bu durum, akut inflamasyon sırasında süregelen aktivasyonu göstermekte olup, nötrofillerin patojen temizleme ve inflamatuar mediyatörler ile ROS aracılığıyla doku hasarı oluşturma yönündeki ikili rolüyle uyumludur18. Yapılan daha ileri analizler, MMP9, PYGL ve GADD45A olmak üzere üç temel genin bağışıklık yanıtları, metabolik regülasyon ve hücresel stres arasında potansiyel bağlantılar olduğunu belirlemiştir. MMP9 ekstrasellüler matriks yeniden şekillenmesi ve inflamatuar infiltrasyonda rol oynarken19, GADD45A stres ve bağışıklık yanıtlarını regüle etmekte; PYGL ise immün aktivasyonda metabolik yeniden programlamanın bir rolü olduğunu düşündürmektedir20,21. Moleküler kenetlenme ve dinamik simülasyonlar; uygun bağlanma enerjileri, stabil RMSD, Rg ve SASA profillerinin yanı sıra kalıcı hidrojen bağları ve düşük RMSF değerleri ile desteklenen, kateşinin seçilen bu proteinlere öngörülen stabil bağlanmasını göstermiştir. Bu bulgular, kateşinin bu inflamatuar ve metabolik hedeflerle ilişkili olabileceğini düşündürmekte ancak doğrudan düzenleyici etkilerin daha fazla deneysel doğrulama gerektirdiği görülmektedir22.
Kateşin, anti-inflamatuar etkilerinin yanı sıra, oksidatif stresi ve metabolik dengeyi modüle ederek koruyucu roller de üstlenebilir. ROS ile ilgili yolakların zenginleşmesi, kateşinin antioksidan kapasiteyi artırarak oksidatif hasarı hafifletebileceğini göstermektedir ve bu durum, kateşinlerin antioksidatif özelliklerine ilişkin önceki raporlarla tutarlıdır. Ayrıca, PYGL gibi metabolik enzimlerin sürece dahil olması, kateşinin inflamatuar hastalıklarda gelişmekte olan bir kavram olan immünometabolizmayı düzenlemede potansiyel bir rolü olduğunu vurgulamaktadır.
Bu çalışmanın bazı kısıtlılıkları kabul edilmelidir. İlk olarak, bu çalışma temel olarak halka açık transkriptomik veri setlerine ve hesaplamalı analizlere dayanmaktadır ve öngörülen mekanizmalar henüz deneysel olarak doğrulanmamıştır. Moleküler kenetleme ve moleküler dinamik simülasyonları, kateşin ile aday hedef proteinler arasında stabil etkileşimler olduğunu göstermiş olsa da bu bulgular fonksiyonel inhibisyonu, aktivasyonu veya terapötik etkinliği kanıtlamamaktadır. Kateşinin MMP9, PYGL ve GADD45A üzerindeki düzenleyici etkilerini doğrulamak ve pnömonideki terapötik ilgisini belirlemek için daha fazla biyokimyasal analiz, hücresel deney ve in vivo çalışmalara ihtiyaç vardır. İkinci olarak, pediatrik pnömoni veri seti için mevcut olan klinik bilgiler sınırlıydı. GSE261482 veri seti, pediatrik pnömoni hastaları ve sağlıklı kontrollerden alınan tam kan transkriptomik verilerinin yanı sıra cinsiyet, etiyolojik sınıflandırma, toplama tüpü, parti ve hastalık durumu gibi meta verileri sağlamıştır.
Bununla birlikte, bireysel yaş, zatürre şiddeti, örnekleme sırasındaki tedavi durumu ve diğer hastalık seyri bilgileri dahil olmak üzere ayrıntılı klinik değişkenler, bu çalışmada kullanılan GEO meta verilerinde tam olarak mevcut değildi. Bu nedenle, klinik şiddete, tedavi aşamasına veya yaş alt grubuna göre daha ileri tabakalı analizler gerçekleştirilemedi. Üçüncü olarak, bulk RNA-seq ve tek hücreli RNA-seq veri setleri farklı biyolojik bağlamlardan türetilmiştir. GSE261482 pediatrik hastalardan alınan tam kan örneklerinden oluşturulurken, GSE295484 deneysel bir zatürre modelindeki C57BL/6 vahşi tip farelerin akciğer dokularından oluşturulmuştur. Dolayısıyla, tek hücreli sonuçlar, insan pediatrik zatürresinde doğrudan bir doğrulama olarak değil, inflamatuar hücre popülasyonları ve aday gen dağılımı için destekleyici hücresel bağlam kanıtları olarak yorumlanmalıdır. Ek olarak, E. coli ile indüklenen fare zatürre modeli; bakteriyel, viral, muhtemel bakteriyel, muhtemel viral ve bilinmeyen nedenler dahil olmak üzere pediatrik zatürrenin heterojen etiyolojilerini tam olarak temsil etmemektedir.
Son olarak; MMP9, PYGL ve GADD45A seçimi, entegratif biyoinformatik taramaya ve bilinen biyolojik ilişkilere dayandırılmıştır, ancak nötrofil ilişkili inflamasyondaki kesin rolleri ve kateşin aracılı düzenlemeleri henüz doğrulanmamıştır. Bu bulguları doğrulamak ve kateşinin translasyonel potansiyelini netleştirmek için pediatrik klinik kohortlar, insan tek hücreli veri setleri, hedefe özgü fonksiyonel analizler ve deneysel pnömoni modelleri kullanan gelecek çalışmalara ihtiyaç vardır.
Özetle bu çalışma, kateşinin zatürrede nötrofil kaynaklı inflamatuar yanıtlar ile immün düzenleme, oksidatif stres ve metabolik yollarla ilişkili seçilmiş genlerle bağlantılı olabileceğini öne sürmektedir. Toplu RNA dizileme, tek hücreli RNA dizileme, moleküler kenetleme ve moleküler dinamik simülasyonlarının entegratif bir analizi aracılığıyla bu çalışma, hastalıkla ilişkili bir gen modülü tanımlamış ve kateşin kenetleme ile simülasyon analizleri için MMP9, PYGL ve GADD45A genlerini seçmiştir. Aday genlerin nötrofillerde ve alveolar makrofajlarda zenginleşmesi, kateşin ile seçilen proteinler arasında gözlemlenen stabil öngörülen etkileşimlerle birlikte, daha ileri deneysel doğrulama için potansiyel bir mekanizmayı desteklemektedir. Genel olarak bu bulgular, zatürredeki potansiyel kateşin ilişkili mekanizmalara sistem düzeyinde bir bakış açısı sunmaktadır ancak bu gözlemleri doğrulamak ve terapötik ilgilerini netleştirmek için daha fazla deneysel ve klinik çalışmaya ihtiyaç vardır.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| AMBER14SB force field Tür: Kuvvet alanı | Moleküler dinamik simülasyonları için protein kuvvet alanı | ||
| AUCell R package Tür: R paketi | Tek hücreli gen seti aktivite skorlaması | ||
| AutoDock Tools Tür: Yazılım | Reseptör ve ligand hazırlama | ||
| AutoDock Vina Tür: Yazılım | Moleküler kenetleme | ||
| BindingDB Tür: Veritabanı | BindingDB | Deneysel olarak doğrulanmış bileşik-hedef etkileşimleri; makalede URL/versiyon belirtilmemiştir | |
| clusterProfiler R package Tür: R paketi | GO ve KEGG zenginleştirme analizi | ||
| DrugBank Tür: Veritabanı | DrugBank | Deneysel olarak doğrulanmış bileşik-hedef etkileşimleri; makalede URL/versiyon belirtilmemiştir | |
| ETCM database Tür: Veritabanı | ETCM | Paeonia aktif bileşik taraması; makalede URL/versiyon belirtilmemiştir | |
| GAFF2 force field Tür: Kuvvet alanı | Moleküler dinamik simülasyonları için ligand kuvvet alanı | ||
| GROMACS 2022 Tür: Yazılım | GROMACS | Moleküler dinamik simülasyonu | |
| GSE261482 Tür: Kamuya açık dökme RNA-seq veri seti | Gene Expression Omnibus (GEO) | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE261482 | Pediyatrik pnömoni ve sağlıklı kontrol tam kan ekspresyon verileri |
| GSE295484 Tür: Kamuya açık scRNA-seq veri seti | Gene Expression Omnibus (GEO) | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE295484 | Deneysel bir pnömoni modelinden alınan fare akciğer tek hücreli RNA sekanslama verileri |
| limma R package Tür: R paketi | Diferansiyel ekspresyon analizi | ||
| PharmMapper Server Tür: Veritabanı/araç | PharmMapper | http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/ | Ters farmakofor eşleme |
| Protein Data Bank (PDB) Tür: Veritabanı | Protein Data Bank | GADD45A (2KG4), MMP9 (6ESM) ve PYGL (3DDS) protein yapıları | |
| PubChem database Tür: Veritabanı | PubChem | Üç boyutlu kateşin yapısı | |
| R software Tür: Yazılım | R Project | İstatistiksel analizler | |
| Seurat R package Tür: R paketi | Tek hücreli RNA sekanslama kalite kontrolü, normalizasyon, kümeleme, UMAP görselleştirme ve hücre anotasyonu | ||
| Similarity Ensemble Approach (SEA) Tür: Veritabanı/araç | SEA | http://sea.bkslab.org | Potansiyel hedef dışı etkileşim tahmini |
| sobtop_1.0 (dev3.1) Tür: Yazılım | Ligand parametre üretimi | ||
| SwissTargetPrediction Tür: Veritabanı/araç | SwissTargetPrediction | http://www.swisstargetprediction.ch | Bileşik hedef tahmini |
| TIP3P water model Tür: Su modeli | Protein-ligand komplekslerinin solvasyonu | ||
| Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database (TCMSP) Tür: Veritabanı | TCMSP | https://tcmsp-e.com | Paeonia aktif bileşik taraması |
| UniProt database Tür: Veritabanı | UniProt | https://www.uniprot.org | Gen sembolü standardizasyonu |
| WGCNA R package Tür: R paketi | Ağırlıklı gen ko-ekspresyon ağ analizi |
Kaynaklar
- Chen L, Chen Y, Huang J, Zhang J. LncRNA LINC00707 serves as a sponge of miR-382-5p to alleviate lipopolysaccharide (LPS)-induced WI-38 cell injury through upregulating NKAP in infantile pneumonia. Autoimmunity. 2022;55(5):328-38.
- Li S et al. miRNA-302e attenuates inflammation in infantile pneumonia through the RelA/BRD4/NF-κB signaling pathway. Int J Mol Med. 2019;44(1):47-56.
- Kennedy II DE et al. Contribution of Puma to inflammatory resolution during early pneumococcal pneumonia. Front Cell Infect Microbiol. 2022;12:886901.
- Wang C et al. Suppressing neutrophil itaconate production attenuates Mycoplasma pneumoniae pneumonia. PLoS Pathog. 2024;20(11):e1012614.
- Shen N et al. Plant flavonoids: classification, distribution, biosynthesis, and antioxidant activity. Food Chem. 2022;383:132531.
- Peng X, McClements DJ, Liu X, Liu F. EGCG-based nanoparticles: synthesis, properties, and applications. Crit Rev Food Sci Nutr. 2025;65(12):2177-98.
- Li T et al. Synergistic anti-inflammatory effects of quercetin and catechin via inhibiting activation of TLR4-MyD88-mediated NF-κB and MAPK signaling pathways. Phytother Res. 2019;33(3):756-67.
- Viz-Lasheras S et al. A diagnostic host-specific transcriptome response for Mycoplasma pneumoniae pneumonia to guide pediatric patient treatment. Nat Commun. 2025;16(1):673.
- Michki SN et al. Age-dependent immune responses and resident cell dynamics in young mice following pneumonia. iScience. 2026;29(1):114219.
- Jin M et al. Catechin-functionalized cationic lipopolymer based multicomponent nanomicelles for lung-targeting delivery. Adv Mater. 2024;36(17):e2302985.
- Shin-Ya M et al. Effects of tea, catechins and catechin derivatives on Omicron subvariants of SARS-CoV-2. Sci Rep. 2023;13(1):16577.
- Zheng Q, Li J, Yang L. Systematic investigation of catechin/cyclodextrin encapsulated polymeric nanospheres for the treatment and nursing care of pediatric pneumonia-causing human pathogens. Microb Pathog. 2025;205:107524.
- Zhang Y et al. Anti-inflammatory effect of chlorogenic acid in Klebsiella pneumoniae-induced pneumonia by inactivating the p38MAPK pathway. Int J Med Microbiol. 2023;313(2):151576.
- Gleeson K, Reynolds HY. Life-threatening pneumonia. Clin Chest Med. 1994;15(3):581-602.
- Ross SM. Resveratrol: the anti-inflammatory effects of a phytochemical compound on pneumonia, respiratory syncytial virus, and severe acute respiratory syndrome (SARS-CoV-2). Holist Nurs Pract. 2023;37(2):110-2.
- Hu H et al. Hybrid biomimetic membrane coated particles-mediated bacterial ferroptosis for acute MRSA pneumonia. ACS Nano. 2023;17(12):11692-712.
- Dong L et al. A ROS-responsive nanoprodrug-engineered phage biotherapy for precision treatment of multidrug-resistant Gram-negative bacterial pneumonia. J Control Release. 2025;382:113708.
- Wiegman CH et al. Oxidative stress in ozone-induced chronic lung inflammation and emphysema: a facet of chronic obstructive pulmonary disease. Front Immunol. 2020;11:1957.
- Jiang T et al. Dual role of Baimao-Longdan-Congrong-Fang in inhibiting Staphylococcus aureus virulence factors and regulating TNF-α/TNFR1/NF-κB/MMP9 axis. Phytomedicine. 2025;139:156477.
- Zhang H et al. The attenuated Mycoplasma bovis strain promotes apoptosis of bovine macrophages by upregulation of CHOP expression. Front Microbiol. 2022;13:925209.
- Borella R et al. Metabolic reprograming shapes neutrophil functions in severe COVID-19. Eur J Immunol. 2022;52(3):484-502.
- Xu Y et al. Exosomal miR-155-5p drives widespread macrophage M1 polarization in hypervirulent Klebsiella pneumoniae-induced acute lung injury via the MSK1/p38-MAPK axis. Cell Mol Biol Lett. 2023;28(1):92.