Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Araştırma makalesi
Bu çalışma, entegratif biyoinformatik analiz ve serum doğrulaması yoluyla insan wings apart-like (hWAPL) proteininin serviks kanserinde bir serum tanısal biyobelirteç olarak değerlendirilmekte ve serum hWAPL'nin skuamöz hücreli karsinom antijeni ile kombinasyonunun tanısal performansı artırdığını göstermektedir.
Serviks kanseri dünya genelinde kadın sağlığı için büyük bir tehdit olmaya devam etmektedir ve erken teşhis ile terapötik stratifikasyon için güvenilir serum biyobelirteçleri sınırlıdır. İnsan wings-apart-like (hWAPL) proteininin serviks karsinogenezinde rol oynadığı düşünülmektedir, ancak diyagnostik ve klinik değeri tam olarak aydınlatılmamıştır. Bu boşluğu doldurmak amacıyla, bu çalışma; hWAPL ekspresyonunu, klinikopatolojik ilişkileri, immün infiltrasyonu, ko-ekspresyon ağlarını, translasyon sonrası modifikasyonları ve ilaç duyarlılığı öngörülerini karakterize etmek için The Cancer Genome Atlas, GEPIA2, Human Protein Atlas ve tek hücreli transkriptomik verileri dahil olmak üzere halka açık multi-omik veri setlerini entegre etmiştir. Bu bulgular, histolojik olarak doğrulanmış serviks skuamöz hücreli karsinomu olan 89 hasta ve 89 sağlıklı kadın kontrolden oluşan bağımsız tek merkezli bir serum kohortunda değerlendirilmiştir. Serum hWAPL ve skuamöz hücreli karsinom antijeni (SCC) seviyeleri ölçülmüş ve diyagnostik performans, alıcı işletim karakteristik eğrisi analizi ile değerlendirilmiştir. In silico analizlerde, hWAPL birçok maligniteye, özellikle serviks kanserine yaygın olarak yukarı regüle olmuş; malign epitelyal hücrelerde ve monositlerde/makrofajlarda zenginleşmiş; daha kısa progresyonsuz aralık ile ilişkilendirilmiş; cisplatin, paclitaxel ve 5-fluorouracil'e karşı azalmış duyarlılık ile MCL-1 ve Wee1 inhibitörlerine karşı duyarlılık öngörülmüştür. Serum kohortunda hWAPL seviyeleri hastalarda kontrollere göre anlamlı derecede daha yüksek bulunmuş ve serviks kanserini 0,961'lik bir eğri altı alan ile ayırt ederek tek başına SCC'nin performansını aşmıştır. hWAPL'nin SCC ile kombine edilmesi diyagnostik performansı daha da artırmıştır (eğri altı alan, 0,974; sensitivite, %93,3; spesifite, %95,5). Bu bulgular, serum hWAPL'nin performansı SCC ile artırılan, serviks skuamöz hücreli karsinomu için potansiyel yeni bir diyagnostik biyobelirteç olduğunu; kemorezistans ve immün mikroçevre yeniden şekillenmesi ile gözlemlenen ilişkilerin ise hipotez oluşturucu olduğunu ve deneysel onay gerektirdiğini göstermektedir.
Serviks kanseri, 2022 yılında kaydedilen yaklaşık 660.000 yeni tanı ve 350.000 ölümle, dünya genelinde kadınlarda dördüncü en yaygın malignite ve kansere bağlı ölümlerin dördüncü önde gelen nedeni olarak sıralanmaktadır1. Bu hastalık yükü, sistematik tarama programlarının yetersiz kaldığı düşük ve orta gelirli ülkeleri orantısız bir şekilde etkilemektedir2. HPV aşısı ve Pap smear taramaları birçok yüksek gelirli bölgede insidans oranlarını başarıyla düşürmüş olsa da, mevcut tanı yaklaşımları belirgin sınırlamalar göstermektedir. HPV DNA testi suboptimal spesifite sergilemekte ve sitolojik yorumlama doğası gereği subjektif ve değişkendir. Bu eksiklikler, mevcut tanısal çerçeveleri güçlendirecek yenilikçi, objektif ve minimal invaziv serum biyobelirteçlerine olan acil ihtiyacı vurgulamaktadır.
Yassı hücreli karsinom antijeni (SCC-Ag), tüm serviks kanseri vakalarının yaklaşık %85–90'ını oluşturan histolojik bir alt tip olan servikal yassı hücreli karsinom için temel serolojik biyobelirteç olarak hizmet eder3. Sistematik bir inceleme ve meta-analiz, yassı hücreli karsinomda tedavi öncesi yüksek SCC-Ag seviyelerinin, belirgin şekilde daha kötü genel sağkalım vele ilerlemesiz sağkalım ile ilişkili olduğunu göstermiştir4. Nüks izlemi bağlamında SCC-Ag, yassı hücreli karsinom için %78,9 duyarlılık ve %91,2 özgüllük sergilemektedir4. Bununla birlikte, artmış seviyelerin yassı hücreli serviks kanseri tanısı konmuş bireylerin yalnızca %28–88'inde görülmesi nedeniyle, SCC-Ag'nin erken teşhisteki faydası sınırlıdır5. Ayrıca, birçok erken evre tümör yüksek SCC-Ag konsantrasyonları göstermez ve bu biyobelirteç yassı hücreli olmayan histolojik varyantlar için uygun değildir3. Sonuç olarak, özellikle erken evre serviks kanseri için geliştirilmiş tanısal duyarlılık sunan yeni serum biyobelirteçlerinin keşfi, önemli ve henüz çözülmemiş bir klinik önceliktir.
SCC-Ag'nin ötesinde, karsinoembriyonik antijen, CA-125 kanser antijeni, sitokeratin-19 fragmanı (CYFRA 21-1) ve daha yakın zamanda dolaşımdaki tümör DNA'sı ile HPV hücre dışı DNA'sı dahil olmak üzere serviks kanserinde birçok farklı dolaşım belirteci değerlendirilmiştir. Ancak uygulamada bu belirteçler, erken evre hastalıklar için sınırlı hassasiyet, serviks kanserinde baskın olan skuamöz histoloji için düşük özgünlük veya henüz yaygın olarak erişilemeyen özel moleküler platform gereksinimleri nedeniyle kısıtlıdır. Bu durum, hem servikal karsinogenez ile mekanistik olarak bağlantılı olan hem de rutin bir immünassay ile ölçülebilen bir protein belirteci için önemli bir alan bırakmaktadır.
WAPL olarak da adlandırılan insan wings apart-like (hWAPL) geni, mitotik bölünme sırasında kardeş kromatitlerin düzgün ayrılması için gerekli olan bir kohesin salınım faktörünü kodlar6. İlk olarak Oikawa ve arkadaşları tarafından tanımlanan hWAPL, ekspresyonu HPV onkoproteinleri E6 ve E7 tarafından indüklenen yeni bir insan geni olarak karakterize edilmiştir. Diğer normal ve neoplastik dokularda yalnızca minimal ekspresyon gözlemlenirken, uterus serviks karsinomlarında güçlü ekspresyon göstermektedir7. İleriki araştırmalar, hWAPL mRNA seviyelerinin benign serviks epitelyumuna kıyasla serviks karsinomunda belirgin şekilde arttığını ve ekspresyonun serviks intraepitelyal neoplazi (CIN) derecesi ile korelasyon içinde arttığını ortaya koymuştur8,9. Mekanistik bir perspektiften, WAPL'nin düzensiz aşırı ekspresyonu mitotik ve sitokinetik süreçleri bozarak kromozomal instabiliteyi teşvik eder ve tümör ilerlemesini kolaylaştırır10. Ayrıca WAPL,le tumorigenezise ve hücre döngüsü ilerlemesinin düzenlenmesine önemli katkı sağlar. Çeşitli serviks epitelyal örneklerinde WAPL'nin birden fazla alternatif ekleme (splicing) izoformu tanımlanmış olup, bu durum moleküler çeşitliliğinin altını çizmektedir11. Serviks kanseri gelişimindeki yerleşik etkisine ek olarak, artan kanıtlar hWAPL'nin serviks lezyonlarındaki diyagnostik faydasını vurgulamaktadır. Dahası, TAT aracılı hWAPL knockdown işlemi, HPV E6 ekspresyonunu azaltmış, serviks kanseri kök hücrelerinde tümör invazyonunu ve koloni oluşumunu baskılamış ve nude fare modellerinde tümör büyümesini önemli ölçüde hafifletmiştir12. Bu bulgular, hWAPL'nin serviks kanseri kök hücre proliferasyonu için bir marker görevi gördüğünü ve potansiyel olarak uygulanabilir bir terapötik hedef olduğunu göstermektedir12.
Bu sonuçlar teşvik edici olsa da, birçok önemli soru hala cevapsız kalmıştır. İlk olarak, serum hWAPL'nin serviks kanseri hastalarını sağlıklı bireylerden ayırt etme yeteneği ve yerleşik biyobelirteç SCC'ye göre veya onunla kombinasyon halindeki performansı, titizlikle kontrol edilmiş bir çalışma popülasyonunda değerlendirilmemiştir. İkinci olarak, serum hWAPL seviyeleri ile HPV enfeksiyon durumu arasındaki ilişkinin yanı sıra klinik evre, histolojik derece ve lenf nodu metastazı gibi temel klinikopatolojik özelliklerle olan ilişkisi hala belirsizdir. Üçüncü olarak, hWAPL ve SCC'nin tanı için tamamlayıcı bir değer sunup sunmadığı araştırılmamıştır.
hWAPL doku ve hücresel düzeylerde çalışılmış olsa da, proteinin dolaşımda ölçülüp ölçülemediği veya serum tabanlı bir ölçümün serviks kanserini bir kontrol popülasyonundan ayırt edip edemeyeceği daha önce belirlenmemiştir; mevcut çalışma tam olarak bu bilgi boşluğunu doldurmayı amaçlamaktadır. Önceki doku tabanlı raporları tekrarlamak yerine bunların üzerine inşa ederek, The Cancer Genome Atlas ve diğer halka açık veri depolarından elde edilen verileri kullanarak hWAPL'ye yönelik bütünleştirici bir biyoinformatik taramayı; 89 serviks skuamöz hücreli karsinom hastası ve 89 sağlıklı kadın kontrolden oluşan bağımsız, tek merkezli bir kohorttaki proteinin ilk serum tabanlı değerlendirmesiyle birleştirdik. Temel amaç, serum hWAPL'nin hem tek başına hem de SCC-Ag ile kombinasyonunda, serviks skuamöz hücreli karsinomu sağlıklı kontrollerden ayırt etmedeki tanısal performansını (alıcı işletim karakteristiği eğrisi altındaki alan olarak nicelendirilmiş) belirlemekti; bu nedenle temel sonuç ölçütü eğri altındaki alan, optimal Youden eşiğindeki duyarlılık ve özgüllük ise ikincil ölçütler olarak belirlendi. İkincil amaçlar, serum hWAPL'nin HPV durumu ve diğer klinikopatolojik özelliklerle ilişkisini karakterize etmek ve biyoinformatik analizler aracılığıyla hWAPL'nin biyolojik bağlamına ilişkin mekanistik hipotezler üretmekti.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu çalışma, Shaanxi Eyalet Halk Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmış (Onay No. 2024-R055) ve Helsinki Deklarasyonu ilkelerine uygun olarak yürütülmüştür. Kan alımı yapılmadan önce her katılımcıdan yazılı bilgilendirilmiş onam alınmıştır. Tüm insan kanı ve serum örnekleri, Laboratuvar Tıbbı Bölümü'nün kurumsal kılavuzlarına uygun olarak toplanmış, işlenmiş ve saklanmıştır.
Tüm venöz kan ve serum örnekleri, potansiyel olarak enfeksiyöz biyolojik materyal olarak değerlendirilmiştir. Örnek işleme süreçleri, uygun kişisel koruyucu donanım kullanan eğitimli personel tarafından biyogüvenlik seviyesi 2 laboratuvarında gerçekleştirilmiştir. Biyolojik materyalle temas etmiş olan tek kullanımlık plastik malzemeler, pipet uçları ve kullanılmış mikroplakalar otoklavlanmış veya biyotehlikeli atık olarak toplanmış ve yerel düzenlemelere uygun olarak kurumun lisanslı tıbbi atık akışı üzerinden bertaraf edilmiştir.
Çalışma tasarımına genel bakış:
Bu çalışmanın iş akışı, bir çalışma tasarımı şemasında (Ek Şekil S1) özetlenmiştir ve birbirini tamamlayan iki kola ayrılmıştır. in silico kolunda, hWAPL'nin biyolojik bağlamını karakterize etmek ve mekanistik hipotezler oluşturmak için halka açık transkriptomik, tek hücreli, protein, translasyon sonrası modifikasyon, immün ve ilaç duyarlılığı veri setleri analiz edilmiştir. Deneysel kolda, bağımsız tek merkezli bir kohortta serum hWAPL ve SCC-Ag ölçülmüş; bunların tek başına ve kombinasyon halindeki tanısal performansları, alıcı işletim karakteristiği analizi ve lojistik regresyon ile değerlendirilmiştir. İki kol yalnızca yorumlama düzeyinde entegre edilmiş olup, serum kolu tek deneysel doğrulamayı sağlamıştır.
Pan-kanser ve servikal skuamöz hücreli karsinom gen ekspresyon profillemesi
The Cancer Genome Atlas (TCGA) kaynaklı RNA-seq verileri UCSC Xena Browser aracılığıyla elde edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan tüm halka açık veri tabanlarına ve web araçlarına Eylül ve Ekim 2025 tarihleri arasında erişilmiş olup, ilgili sürümler ve erişim tarihleri Materyal Tablosunda listelenmiştir. Milyon eşleşmiş okuma başına transkript kilobazı başına fragman (FPKM) olarak nicelendirilen WAPL ekspresyon seviyeleri, 1 pseudocount eklenerek log₂ dönüşümüne tabi tutulmuştur. Bu dönüştürülmüş değerler, birden fazla kanser türünde malign dokular ile eşleşen komşu normal örnekler arasında karşılaştırmalı analizler yapmak için kullanılmıştır. Servikal malignitelere yönelik odaklanmış inceleme için, servikal skuamöz hücreli karsinom ve endoservikal adenokarsinoma (CESC) ile özgü WAPL ekspresyon verileri ayrıştırılmıştır. Bu tümör örneklerindeki ekspresyon profili daha sonra görselleştirilmiş ve normal servikal epitel kontrol dokularındaki ekspresyon seviyeleriyle karşılaştırılmıştır.
WAPL transkript izoformlarının analizi
WAPL transkript izoformlarının ekspresyon profilleri GEPIA2 veri tabanı kullanılarak incelenmiştir. Spesifik izoformlar, karşılık gelen Ensembl transkript tanımlayıcıları (ENST) ile belirlenmiştir. Ekspresyon seviyeleri, milyon başına transkript sayısının bir fazlasının 2 tabanında logaritması [log₂(TPM+1)] olarak hesaplanmış ve keman grafikleri şeklinde sunulmuştur.
Tek hücreli RNA sekanslama analizi
GSE168652 scRNA-seq veri seti, Gene Expression Omnibus (GEO) veri tabanından elde edildi. Veri ön işleme, kalite değerlendirmesi, normalizasyon ve kümeleme işlemleri scCancerExplorer platformu kullanılarak gerçekleştirildi. 200'den az gen eksprese eden hücreler ve üçten az hücrede tespit edilen genler filtrelendi. Normalizasyon, 10.000 ölçeklendirme faktörü ile Log-Normalize yöntemi kullanılarak yapıldı.
Varyans stabilize edici transformasyon kullanılarak en değişken 2.000 gen belirlendi ve ardından bunlar temel bileşen analizi (PCA) için kullanıldı. Boyut indirgeme için Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP), ilk 30 temel bileşene dayanarak uygulandı. Grafik tabanlı kümeleme, 0,8 çözünürlükte Louvain algoritması aracılığıyla gerçekleştirildi. Hücre kümeleri, yerleşik marker genlere göre tanımlandı. Farklı hücre popülasyonları genelinde WAPL ekspresyon seviyeleri ölçüldü ve hücre döngüsü aşamaları CellCycleScoring yöntemi kullanılarak belirlendi.
Protein ekspresyonu ve posttranslasyonel modifikasyon analizi
WAPL'nin CSCC'deki ekspresyonu ve hücre içi dağılımı, Human Protein Atlas veri tabanı kullanılarak değerlendirilmiştir. Post-translasyonel modifikasyon (PTM) bölgeleri PhosphoSitePlus kullanılarak tanımlanmıştır. Ayrıca, CSCC içerisinde WAPL ekspresyon seviyeleri ile protein modifikasyon süreçlerinde yer alan genler, özellikle AKT1, AKT2, KAT2B, EP300, USP7 ve KAT5 arasındaki potansiyel ilişkiler Xiantao Academic aracı kullanılarak araştırılmıştır13,14,15,16,17.
Birlikte ifade ağı ve fonksiyonel zenginleştirme analizi
STAR hizalayıcı kullanılarak işlenen ve milyon transkript başına (TPM) normalize edilen TCGA-CSCC RNA dizileme verileri, Genomic Data Commons (GDC) portalından elde edilmiştir. WAPL ile birlikte ifade edilen genleri belirlemek için, 0,6'dan büyük mutlak Pearson korelasyon katsayısı ve P < 0,05 istatistiksel anlamlılık düzeyine dayalı bir tarama eşiği uygulanmıştır.
WAPL ile ilişkili biyolojik fonksiyonları araştırmak için, önce hastalar medyan ekspresyon değeri kesme noktası olarak kullanılarak yüksek ve düşük WAPL ekspresyon gruplarına ayrılmış ve ardından diferansiyel ekspresyon analizi gerçekleştirilmiştir. Diferansiyel ekspresyon gösteren genler Xiantao Academic platformu ile belirlenmiş ve sonrasında biyolojik süreç, hücresel bileşen ve moleküler fonksiyon kategorilerini içeren Gen Ontolojisi zenginleştirme analizine ve Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes yolak analizine tabi tutulmuştur. Bağımsız olarak, WAPL'yi içeren protein etkileşim ilişkileri STRING kullanılarak araştırılmış ve elde edilen etkileşim ağı Cytoscape'de yeniden oluşturularak incelenmiştir.
Gen Kümesi Zenginleştirme Analizi (GSEA); Reactome, WikiPathways ve KEGG veri tabanları kullanılarak, tarama kriterleri mutlak normalize edilmiş zenginleştirme skoru (|NES|) > 1 ve yanlış keşif oranı (FDR) < 0.25 olarak belirlenerek gerçekleştirilmiştir.
İmmün infiltrasyon analizi
TCGA-CESC kohortundan elde edilen transkriptomik verileri analiz etmek için TIMER 2.0 ve xCell hesaplama araçları kullanılmış, böylece 24 farklı immün hücre popülasyonunun infiltrasyon durumunun kantitatif değerlendirmesi sağlanmıştır.
İlaç duyarlılık tahmini
İlaç duyarlılık tahminleri, oncoPredict R paketi kullanılarak GDSC2 veri tabanından elde edilmiştir. 86 kemoterapötik bileşikten oluşan bir panel için yarı maksimal inhibitör konsantrasyon (IC50) hesaplanmıştır.
Sağkalım ve tanısal analiz
Genel sağkalım (OS) vele ilerlemesiz aralık (PFI) eğrileri, hasta kohortları medyan WAPL ekspresyon seviyesine göre ikiye ayrılarak Xiantao analiz platformu kullanılarak oluşturulmuştur. Değişkenlerin prognostik önemi, hem tek değişkenli hem de çok değişkenli Cox orantılı risk regresyon modelleri aracılığıyla değerlendirilmiştir. WAPL ve SCC (SERPINB3)'nin CSCC'yi komşu normal dokudan ayırt etmedeki tanısal yeteneğini değerlendirmek için, The Cancer Genome Atlas'tan elde edilen ve milyon başına transkript (TPM) olarak ifade edilen transkriptomik verilere alıcı işletim karakteristik (ROC) eğrisi analizi uygulanmıştır.
Serum örneği toplama ve ELISA
Bu çalışma, Shaanxi Eyalet Halk Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu'ndan onay almış olup (Onay No. 2024-R055) Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Histopatolojik olarak doğrulanmış CSCC hastalarından toplam 89 serum örneği ve bunlarla yaş açısından eşleştirilmiş 89 sağlıklı kadın kontrolden örnekler elde edilmiştir. Medyan yaş CSCC kohortunda 54 yıl (aralık 31–77 yıl), kontrol kohortunda ise 41 yıl (aralık 30–52 yıl) olarak belirlenmiştir. Tüm serviks kanseri vakaları, kan toplama anında yeni tanı almış ve tedavi görmemiş hastalardır; örnekler herhangi bir cerrahi, kemoterapi veya radyoterapi başlatılmadan önce alınmıştır. İki grubun benzer bir klinik ortamdan seçilmiş olmasına rağmen medyan yaşların 13 yıl farklılık gösterdiği not edilmiştir. Bu fark, Sonuçlar bölümünde ve özel bir yaşa göre düzeltilmiş hassasiyet analizinde doğrudan incelenmiş olup Tartışma bölümünde bir kısıtlılık olarak kabul edilmiştir.
Venöz kan, antikoagülan içermeyen tüplere toplandı, ortam sıcaklığında 10–20 dk pıhtılaşmaya bırakıldı ve ardından 2.000–3.000 × g hızda 20 dk santrifüj edildi. Serum, toplama işleminden sonraki 1 saat içinde ayrıldı, hemen alikotlara bölündü ve −20 °C'de saklandı; venipunksiyon ile dondurma arasındaki süre hiçbir örnek için 2 saati aşmadı. Alikotlar, analizden önce tek bir dondurma-çözme döngüsüne tabi tutuldu ve tüm ölçümler saklama tarihinden itibaren üç ay içinde tamamlandı. Elde edilen serum alikotlara ayrıldı ve −20 °C'de muhafaza edildi. Hemolize olmuş veya lipemik olan tüm örnekler analiz dışı bırakıldı.
Serum hWAPL protein seviyelerinin kantifikasyonu, çift antikor sandviç prensibine dayalı, ticari olarak temin edilen bir enzim bağlı immünosorbent assay (ELISA) kiti kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Kısaca, hem kalibrasyon standartları hem de test örnekleri, hWAPL'ye özgü bir yakalama antikoru ile önceden kaplanmış mikroplaka kuyucuklarına çift örnek olarak dağıtılmış ve ardından 37 °C'de 30 dk inkübe edilmiştir. Bağlanmamış materyalleri uzaklaştırmak için uygulanan bir dizi yıkama adımının ardından, hWAPL'ye karşı yönelmiş, horseradish peroksidaz (HRP) işaretli bir saptama antikoru eklenmiş ve aynı koşullar altında inkübe edilmiştir.
Ek yıkama işlemlerinin ardından, kuyucuklara kromojenik substrat çözeltileri A ve B'den 50 µL eklenerek birleştirilmiş ve 37 °C'de karanlıkta 10 dk boyunca gelişmeye bırakılmıştır. Enzimatik reaksiyonu sonlandırmak için durdurma çözeltisi (50 µL) eklenmiştir. Optik yoğunluk, reaksiyon durdurulduktan sonraki 15 dk içinde 450 nm ana dalga boyunda ve 630 nm referans okuması ile ölçülmüştür. 10–450 pg/mL konsantrasyon aralığını kapsayan seri dilüsyonlu kalibratörler kullanılarak bir standart eğri oluşturulmuştur. Her bir bilinmeyen örneğin hWAPL konsantrasyonu, bu standart eğriden interpolasyon yoluyla türetilmiş ve varsa herhangi bir preanalitik dilüsyon için düzeltilmiştir. Analiz, tamamen üreticinin talimatlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Üretici spesifikasyonlarına göre, kitin çalışma tespit aralığı 10–450 pg/mL'dir. Örnekler nihai 5 kat dilüsyonla analiz edilmiş ve optik yoğunluğu en yüksek kalibratörünkini aşan numuneler daha fazla dilüe edilerek, geri hesaplama sırasında toplam dilüsyon faktörü uygulanarak yeniden analiz edilmiştir. Analitik performans, çalışma örnekleri çalıştırılmadan önce serum matrisinde doğrulanmıştır: seri dilüsyonlu yüksek konsantrasyonlu bir serum havuzu, kalibrasyon aralığı boyunca kabul edilebilir bir lineerite göstermiş ve üç serum havuzundaki rekombinan kalibratörün spike geri kazanımı, kitin çift antikorlu sandviç tasarımıyla uyumlu şekilde kabul edilebilir bir aralıkta kalmıştır. Nicelleştirme alt sınırı, en düşük kalibratöre (10 pg/mL) karşılık gelmiştir. Bu kitin üretici tarafından yalnızca araştırma kullanımı için etiketlendiğini ve klinik olarak valide edilmiş bir in vitro tanı cihazı olmadığını vurgularız; bu nedenle, mutlak konsantrasyonlar ve türetilen cutoff değeri, aşağıda tartışıldığı üzere platforma özgü ve geçici olarak yorumlanmalıdır.
Eş zamanlı olarak, serum SCC-Ag seviyeleri, üst referans limiti 1.5 ng/mL olan kemilüminesans mikropartikül immünassay (CMIA) aracılığıyla Abbott Alinity i platformu kullanılarak kantifiye edilmiştir. Tüm analitik prosedürler; hastalık durumu ile klinik evre, histolojik derece ve HPV durumu dahil olmak üzere tüm klinik değişkenlere karşı körleme uygulanmış laboratuvar personeli tarafından çift paralel olarak gerçekleştirilmiştir. Kullanılan metodolojilerin hem assaylar arası hem de assay içi varyasyon katsayıları %10'un altında tutulmuştur.
İstatistiksel analiz
Serum hWAPL konsantrasyonları Shapiro–Wilk testine göre normallik varsayımını karşılamadığından (tüm P < 0.05), sonraki analizler non-parametrik yöntemler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu nedenle sürekli değişkenler, medyan ve çeyrekler arası aralıklar (IQR) şeklinde sunulmuştur. İki bağımsız grup arasındaki farklar Mann–Whitney U testi ile değerlendirilirken, üç veya daha fazla grup arasındaki karşılaştırmalar Kruskal–Wallis H testi ile yapılmıştır. Değişkenler arasındaki korelasyonlar, sürekli veya sıralı veriler için Spearman sıra korelasyon analizi ile HPV enfeksiyon durumu gibi ikili değişkenler için ise noktalı-biseriyal korelasyon katsayısı kullanılarak değerlendirilmiştir. Sağkalım sonuçları log-rank testi kullanılarak karşılaştırılmış ve %95 güven aralıklarıyla beraber risk oranları Cox orantılı riskler regresyon modellerinden tahmin edilmiştir.
Tanısal performans, ROC eğrisi analizi ile değerlendirilmiş ve her bir biyobelirteç için optimal kesme değeri Youden indeksini maksimize ederek belirlenmiştir. Eğri altında kalan alan (AUC) arasındaki farklar DeLong yöntemi kullanılarak test edilmiştir. Kombine tanısal faydayı araştırmak için, bağımlı değişken olarak hastalık durumu (CSCC = 1; kontrol = 0), bağımsız öngörücüler olarak ise serum hWAPL ve SCC antijeni ile bir ikili lojistik regresyon modeli oluşturulmuştur. Elde edilen tahmin edilen olasılıklar, sonraki ROC analizi için kompozit bir skor olarak kaydedilmiştir.
WAPL-yüksek ve WAPL-düşük grupları arasındaki diferansiyel ilaç duyarlılığı, düzeltilmiş P < 0.05 ve |log₂ kat değişimi| > 0.3 eşik değerleri uygulanarak limma paketi ile değerlendirilmiştir. İstatistiksel anlamlılık, iki kuyruklu P-değeri < 0.05 olarak tanımlanmıştır. Tüm analizler SPSS, R veya belirtilen çevrimiçi araçlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Kullanılan R paketleri survival, survminer, pROC, ggplot2, oncoPredict ve limma'dır. Birçok hipotezin eşzamanlı olarak test edildiği tüm yüksek boyutlu analizlerde (yani pan-kanser karşılaştırmaları, ko-ekspresyon taraması, diferansiyel ekspresyon ve fonksiyonel zenginleştirme analizleri ile ilaç duyarlılığı analizi), P-değerleri Benjamini–Hochberg yanlış keşif oranı kullanılarak çoklu karşılaştırmalar için düzeltilmiş ve uygun olan yerlerde düzeltilmiş P-değerleri rapor edilmiştir; hWAPL ile bireysel genler veya immün hücre fraksiyonları arasındaki ikili korelasyonlar nominal P-değerleri ile raporlanmış olup, bu korelasyon sonuçları doğrulayıcıdan ziyade hipotez üretici olarak kabul edilmiştir. Kamuya açık kohorttaki az sayıdaki klinikopatolojik alan eksik doldurulduğu için, eksik veriye sahip olgular imputasyon yapmak yerine eşli bazda ilgili analizden hariç tutulmuş ve değerlendirilebilir olgu sayısı her bir değişken için Tablo 1'de verilmiştir. Serum kohortları arasındaki yaş farkını gidermek için yaşa göre düzeltilmiş binary lojistik regresyon kullanılarak bir duyarlılık analizi yapılmış ve her grup içinde serum hWAPL ile yaş arasındaki Spearman korelasyonu hesaplanmıştır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Geniş hWAPL insan malignitelerinde, özellikle serviks kanseri dokularında artan ekspresyon
TCGA veri setlerinin pan-kanser analizi, ... olduğunu ortaya koymuştur WAPL karşılık gelen normal dokulara kıyasla, solid tümörlerin çoğunluğunda anlamlı derecede yüksek ekspresyon sergiler (Şekil 1A). Özellikle, hWAPL meme invaziv karsinomu (BRCA), kolon adenokarsinomu (COAD), özofagus karsinomu (ESCA) ve uterus korpus endometrial karsinomu (UCEC) dahil ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
TCGA verileri üzerinde yaptığımız pan-kanser analizi, WAPL ekspresyonunun çoğu solid tümörde normal dokulara kıyasla belirgin şekilde artmış olduğunu ve en belirgin yukarı yönlü düzenlemenin CESC'de gözlendiğini ortaya koymuştur. Bu gözlem, hWAPL mRNA'sının ağırlıklı olarak serviks kanserinde eksprese edildiği, diğer normal ve malign dokularda ise minimal ekspresyon gösterdiği yönündeki önceki bulgularla uyumludur7. Oikawa ve arkadaşları, hWAPL'yi ilk olarak serviks kans...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarların beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Yazarlar, bu çalışmada yer alan tüm katılımcılara ve klinik personele teşekkür ederler. Bu çalışma, Shaanxi Eyaleti Doğal Bilimler Temel Araştırma Programı (Hibe No. 2021JM-552) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Abbott GmbH, Wiesbaden, Almanya | Sağlanmadı | SCC-Ag tespiti için kullanıldı | |
| Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd., Shenzhen, Çin | Model RT-3100 | Plaka yıkama için kullanıldı | |
| Shanghai Anting Scientific Instrument Factory, Şanghay, Çin | Model TLXY-IIC düşük hızlı santrifüj | Serum örneği santrifügasyonu için kullanıldı | |
| Cytoscape Konsorsiyumu | Sürüm 3.9.1 | Ağ görselleştirme için kullanıldı; ağ görselleştirme | |
| Ulusal Kanser Enstitüsü (National Cancer Institute) | https://portal.gdc.cancer.gov; erişim Ekim 2025 | TCGA-CSCC STAR-hizalanmış TPM verilerinin alınması için kullanıldı; RRID:SCR_014514 | |
| Çevrimiçi platform/veritabanı | Uygulanamaz | İlaç duyarlılığı tahmini için kullanıldı; ilaç duyarlılığı referans verileri | |
| Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (National Center for Biotechnology Information) | GPL24676 Illumina NovaSeq 6000 (Homo sapiens) | Tek hücreli RNA dizileme veri seti alımı için kullanıldı; tek hücreli RNA-seq veri seti | |
| Çevrimiçi platform | Uygulanamaz | Transkript izoform ve gen ekspresyon analizi için kullanıldı; transkript izoform ve ekspresyon analizi | |
| R paketi | Sürüm 3.4.4 | Veri görselleştirme için kullanıldı | |
| Çevrimiçi platform/veritabanı | Uygulanamaz | Protein ekspresyon ve hücre altı lokalizasyon analizi için kullanıldı; protein ekspresyonu ve lokalizasyonu | |
| Shanghai Fusheng Biotechnology Co., Ltd. | A977261-96T | A977261-96T; çift antikorlu sandviç ELISA; tespit aralığı 10-450 pg/mL; sadece araştırma amaçlı kullanım (www.affandi-e.com) | |
| R paketi | Sürüm 3.54.0 | Diferansiyel analiz için kullanıldı | |
| Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd., Shenzhen, Çin | Model RT-6100 | Optik yoğunluk ölçümü için kullanıldı | |
| R paketi | Sürüm 0.2 | İlaç duyarlılığı (IC50) tahmini için kullanıldı; RRID:SCR_023220 | |
| Çevrimiçi platform/veritabanı | Uygulanamaz | Post-translasyonel modifikasyon analizi için kullanıldı; post-translasyonel modifikasyon bölgesi analizi | |
| R paketi | Sürüm 1.18.0 | ROC eğrisi analizi için kullanıldı | |
| R Foundation for Statistical Computing | Sürüm 4.2.1 | İstatistiksel analiz ve biyoinformatik analiz için kullanıldı; istatistiksel ve biyoinformatik analiz | |
| Abbott GmbH, Wiesbaden, Almanya | REF 09P3374 | Serum SCC-Ag kantifikasyonu için kullanıldı | |
| Çevrimiçi platform | Uygulanamaz | Tek hücreli RNA dizileme analizi için kullanıldı | |
| Sanli Medical Technology Development Co., Ltd., Liuyang, Hunan, Çin | Sağlanmadı | Venöz kan toplama için kullanıldı | |
| IBM Corp. | Sürüm 26.0 | İstatistiksel analiz için kullanıldı; istatistiksel analiz | |
| STRING Konsorsiyumu | Sürüm 11.5 | Protein-protein etkileşim ağı analizi için kullanıldı; protein-protein etkileşim ağları | |
| R paketi | Sürüm 3.4 | Sağkalım analizi için kullanıldı | |
| R paketi | Sürüm 0.4.9 | Sağkalım eğrisi görselleştirmesi için kullanıldı | |
| Ulusal Kanser Enstitüsü (National Cancer Institute) | https://www.cancer.gov/tcga; erişim Ekim 2025 | RRID:SCR_003193; kanser transkriptomik verileri | |
| Çevrimiçi platform | http://timer.cistrome.org; erişim Ekim 2025 | RRID:SCR_018737; immün infiltrasyon analizi | |
| UCSC Xena Browser | https://xenabrowser.net; erişim Ekim 2025 | TCGA veri alımı için kullanıldı; TCGA veri alımı | |
| Çevrimiçi platform/araç | Sürüm 1.0 | İmmün hücre infiltrasyonu tahmini için kullanıldı | |
| Çevrimiçi platform | https://www.xiantaoxueshu.com; erişim Ekim 2025 | Diferansiyel ekspresyon, korelasyon, sağkalım ve tanısal analizler için kullanıldı |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.