Glikoz toleransı bozulmuş sıçanlarda akupunktur yanıtlarını izlemek için redoks-teypkili yüzeye yönelik raman saçma mikroiğneleri

Özet

Bu keşif fare modeli çalışması, glukoz toleransı bozulmuş sıçanlarda yerel oksidatif kapasite ve redoks potansiyeliyle ilişkili SERS indekslerinin eşzamanlı akupunktur müdahalesi ve oranimetrik takibi için redoks-duyarlı yüzeyle güçlendirilmiş Raman saçılması (SERS)-aktif mikroiğne sunmaktadır.

Özet

Bozulmuş glukoz toleransı (IGT), bozulmuş redoks homeostazı ve artan oksidatif stresle ilişkilidir, ancak akupunktur müdahalesi sırasında redoksla ilişkili değişikliklerin dinamik in vivo takibi teknik olarak zordur. Bu çalışma, IGT'li sıçanlarda eşzamanlı akupunktur müdahalesi ve oksidatif kapasite (OC) ile redoks potansiyeli (RP) ile redoks potansiyeli (RP) ile ilgili SERS indekslerinin göreli orantımetrik izini sağlamak için redoks-duyarlı yüzey gelişmiş Raman saçılması (SERS)-aktif mikroiğne sistemi geliştirdi. Oksidatif ve redoks-duyarlı SERS probları, sırasıyla OC yanıtlılığı için p-fenilenediamin (p-PDA) ve RP tepkisi için antrakinon ile fonksiyonel altın nanoshell (GNS) ile hazırlandı. Problar, akupunktur iğnelerinde iki kazınmış oyuklara yüklenerek SERS-aktif mikroiğneler oluşturuldu. Bu keşif çalışmasında spesifik patojensiz erkek Sprague–Dawley fareleri kullanıldı. Üç fare normal kontrol olarak görev yaptı ve 20 sıçan yüksek yağlı diyetle beslendi ve IGT'yi tetiklemek için streptozotosin (STZ) verildi. Tarama sonrasında, 18 uygun IGT sıçan yüksek yağlı ve normal diyet gruplarına ayrıldı; diyet grubunda 9 fare bulundu. Her diyet grubu, alt grupta 3 fare olmak üzere akupunktur noktası bükülmesi, akupunktur noktası olmayan burulma ve akupunktur noktası doğrudan yerleştirme alt gruplarına ayrıldı. İğneleme 7 gün ardışık günde iki kez yapıldı ve açlık kan şekeri (FPG), 2 saat sonrası kan şekeri (2hPG) ve OC- ile ilgili SERS indeksleri kaydedildi. Sonuçlar, burulma ile akupunktur noktalarında iğnelenmenin daha düşük FPG ve 2hPG değerleriyle ilişkili olduğunu ve bu IGT sıçan modelinde OC- ve RP ile ilişkili SERS indekslerinin değiştiğini gösterdi. Dış kalibrasyon eğrileri, bağımsız biyokimyasal oksidatif stres testleri, prob sızdırma testleri ve biyouyumluluk testleri dahil edilmediğinden, SERS oranları mutlak biyokimyasal konsantrasyonlar veya mutlak redoks-potansiyel değerleri yerine göreceli redoks-ilişkili optik indeksler olarak yorumlanmalıdır. Bu bulgular, IGT sıçanlarında akupunktur müdahalesini yerel ratiometrik SERS takibi ile birleştirmek için SERS-aktif mikroiğnelerin keşfe yönelik bir preklinik platform olarak uygulanabilirliğini desteklemektedir.

Giriş

Bozulmuş glukoz toleransı (IGT), vücudun glukozu tolere etme yeteneğinin azalmasıdır ve normal kan şekeri ile diyabetik kan^{şekeri 1} arasında geçiş aşamasını temsil eder. Bu nedenle IGT, tip 2 diyabet^2'nin gelişiminde önemli bir erken uyarı sinyali ve geri dönüşebilir bir aşamadır. Klinik veriler, IGT olan nüfusun yaklaşık %30'unun 5–10 yıl içinde tip 2 diyabete geçeceğini^{göstermektedir 3}; ancak zamanında müdahaleyle bu oran %10'un altına ^düşebilir4.

IGT dinamik ve karmaşık bir süreçtir ve kalıcı yüksek glikozlu bir ortam, oksidatif metabolizma bozuklukları için önemli bir^{tetikleyicidir 5}. Vücut uzun süreli hiperglisemi durumunda olduğunda, mitokondriyal solunum zinciri anormal şekilde çalışır ve reaktif oksijen türlerinin üretim hızı %30–50 artarak vücutta oksidatif gücü doğrudan artırır⁶; Aynı zamanda, yüksek şeker seviyeleri, glutatyon redüktaz gibi önemli enzimlerin aktivitesini engeller; bu da antioksidan sistemin fazla reaktif oksijen türlerini zamanında çıkarmasını engeller ve oksidasyon-indirgeme dengesini daha da bozar. Buna ek olarak, IGT, insülin direnci ve β hücre fonksiyonunun hafif bozulması gibi patolojik değişikliklerle birlikte gelir; bu da çeşitli biyolojik ve biyokimyasal yanıtlara yol^{açar 7,8}. Redoks durumunun evrimiyle birlikte, bu değişiklikler glikoz metabolizmasının bozulmasını daha da kötüleştirir ve retinopati, nefropati ve kardiyovasküler hastalıklar gibi diyabet komplikasyonlarının potansiyel riskini^{artırır 9,10}. Bu nedenle, IGT olan bireylerde veya hayvan modellerinde oksidatif kapasite (OC) ve redoks potansiyeli (RP) izlenmesi, IGT gelişiminin altında yatan mekanizmaları daha iyi anlamamızı ve hedefli terapötik stratejilerin tasarımını yönlendirmelidir.

Akupunkturun 3.000 yılı aşkın bir geçmişi vardır ve birçok hastalığın tedavisinde iyi klinik etkinlik göstermiştir^. Ayrıca, hayvanlarda yapılan çok sayıda deneysel çalışma, akupunkturun hayvan modellerinde oksidatif stres durumlarının düzenlenmesinde antioksidan enzim sistemini güçlendirerek ve lipid peroksidasyonunu azaltarak faydalı etkiler^{gösterdiğini göstermiştir.} Geleneksel bir Çin tıp uygulaması olarak, akupunktur diyabet ve IGT tedavisinde de önemli faydalar göstermiştir. Guanyuan (CV4) ve Sanyinjiao akupunktur noktaları (SP6), iskelet kaslarında SIRT1/PGC-1α yolunu aktive ettiği ve böylece obezite-diyabetli farelerin insülin direncini azalttığı^{bildirilmiştir 13}. Ayrıca, Tianshu akupunktur noktaları (ST25), lateral hipotalamik bölgede bulunan glikoz-inhibitör nöronların aktivitesini modüle eder ve glikolipid^{metabolizmasının düzenlenmesine katkıda bulunur 14}. Ancak, intravasküler akupunktur mekanizmaları üzerine yapılan çoğu çalışma, öncelikle nöromodülasyon, immünomodülasyon ve gastrointestinal sistemlere odaklanmıştır; bu sistemlerde akupunktur, otonom fonksiyonun modülasyonu yoluyla glikoz metabolizmasını etkileyebilir veya bağırsak florasının dengesini artırarak dolaylı olarak kan şekeri seviyelerini düzenleyebilir^15,16. Akupunkturun IGT tedavisindeki etkisinin özel mekanizması ve oksidatif stres üzerindeki etkileri derinlemesine inceleme ve deneysel veri desteğinden yoksundur.

Yüzeye dayalı Raman saçılması (SERS), çok çeşitli analizlerin tespit edilmesini sağlayan büyük hassasiyet ve özgüllük sağlar. Nano-fiber optik¹⁷, kitozan^{membranları 18} temelli SERS nano-probları ve önceki çalışmalar, akupunktur^{iğneleri 19'un} biyobelirteçler, nörotransmitterler ve hücresel biyokimyanın diğer yönlerinin in vivo olarak tespit edilmesinde kullanılabileceğini göstermiştir. Özellikle akupunktur iğneleri, derin doku testleri için umut vadeden araçlardır ve minimum invaziv yerinde izleme ve ardından ex vivo analiz yapılmasını sağlar. Akupunktur, köklü bir tedavi yöntemi olarak son derece geniş klinik uygulama yelpazesine sahiptir. Son çalışmalar, SERS destekli optik lifler, yara pansiyonları ve mikroiğne cihazlarının, biyolojik olarak ilgili ortamlarda redoksla ilişkili sinyallerin yerinde veya minimal invaziv olarak izlenmesini destekleyebildiğini^{göstermiştir 20,21}. Paralel olarak, SERS-aktif akupunktur iğneleri ve ilgili mikroiğne sistemleri, doku müdahalesi¹⁹ ile algılama yeteneğini entegre etmek için umut vadeden taşıyıcılar olarak ortaya çıkmış; bu da in vivo yanıt ve in vitro SERS algılama yeteneklerine sahip SERS-aktif mikroiğneler ortaya çıkmıştır.

Mevcut çalışma, glikozla indüklenen stres modellerinde oksidatif kapasite ve redoks potansiyeliyle ilgili sinyalleri tespit etmek için daha önce bildirilen SERS-aktif mikroiğne stratejisine dayanmaktadır. Ancak mevcut çalışma, önceki çalışmadan hem biyolojik bağlam hem de deneysel amaçla farklıdır. Özellikle, bu çalışma SERS-aktif mikroiğne platformunu bozuk glukoz toleransının bir sıçan modeline uygular ve yerel ratiometrik SERS takibi akupunktur müdahalesiyle entegre eder. Mevcut çalışma, akupunktur noktalarını bitişik akupunktur olmayan bölgelerle karşılaştırıyor, farklı iğneleme manipülasyonlarını değerlendiriyor ve 7 günlük müdahale döneminde redoksla ilişkili SERS indekslerini izliyor. Daha önce bildirilen SERS tabanlı optik lifler, yara sarmanları ve öncelikle tek bölgeli veya tek fonksiyonlu biyokimyasal tespit için tasarlanmış SERS-aktif mikroiğnelerle karşılaştırıldığında, mevcut platform iki gelişme sunmaktadır. İlk olarak, OC- ve RP-duyarlı problar, tek bir akupunktur iğnesinde iki bağımsız oyma olukta entegre edilir ve tamamlayıcı redoks parametrelerinin eşzamanlı izlenmesini sağlar. İkinci olarak, akupunktur iğnesi sadece SERS prob taşıyıcısı olarak değil, aynı zamanda tedavi amaçlı bir cihaz olarak da işlev görür; böylece redoks izleme tedavi sonrası yerine akupunktur müdahalesi sırasında yapılabilir. Şekil 1'de gösterildiği gibi, mikroiğneler dokulara yerleştirildikten sonra küçük yaralar oluşur ve iki oluktaki problar dokularla reaksiyona girerek OC ve RP seviyelerini in vivo tespit etmelerini sağlar. Çalışmanın amacı, bu SERS-aktif mikroiğneleri kullanarak IGT'li sıçanlarda OC ve RP değişikliklerini incelemek ve bu hayvanlarda akupunkturun akupunktur noktalarına eşlik eden etkilerini belirlemek, böylece IGT tedavisinde akupunkturun etkilerinin mekanizması ve redoks ile anormal hiperglisemik durumlar arasındaki ilişki hakkında değerli bilgiler elde etmekti.

Protokol

IGT'nin hayvanları ve modelleri

Tüm hayvan prosedürleri Güneydoğu Üniversitesi Suzhou Araştırma Enstitüsü'nün Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı (onay no. SEU-IACUC-20250318007) ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi. Fareler alındı ve 25 °C sıcaklıkta, 12 saat ışık/12 saat karanlık döngüyle belirli patojensiz (SPF) koşullarda tutuldu. Anestezi gerektiren işlemlerde, fareler indüksiyon odasından oksijenle iletilen izofluran ile anestezi edildi ve burun konusuyla tutuldu. İndüksiyon için %3, bakım için %1 oranında izofluran kullanıldı; konsantrasyon solunum hızı ve prosedürel yanıta göre ayarlandı.

İğneleme veya enjeksiyondan önce doğru refleksin kaybı ve parmak sıkışmasına yanıt olmaması nedeniyle yeterli anestezik derinliği doğrulandı. Anestezi sırasında solunum düzeni, vücut pozisyonu ve iyileşme izlendi ve hayvanlar vücut sıcaklığını korumak için ısınma pedine yerleştirildi. Hayvanlar, her kafeste 2 kişi barındırıldı ve glukoz testi için oruç gerektirmedikçe yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlandı. Gelişten sonra, sıçanlar model indüksiyonundan önce 1 hafta boyunca alıştırıldı. Hayvan refahı günlük olarak izlendi; genel aktivite, bakım, gıda alımı, vücut ağırlığı, enjeksiyon bölgesi durumu ve anestezi sonrası iyileşme dahil. Çalışmanın sonunda, fareler onaylanmış hayvan protokolüne göre ötenazi edildi. Ötenazi, kademeli doldurma CO₂ solumasıyla gerçekleştirildi ve ardından servikal dislokasyon yöntemiyle ölüm doğrulandı. Şiddetli kilo kaybı, kalıcı hareketsizlik, anormal solunum, yeme veya içme yiyememesi veya şiddetli sıkıntı gibi insancıl son nokta kriterlerini karşılayan hayvanlar, planlanan son noktaya kadar devam etmek yerine hemen ötenazi edildi. Bu çalışmada 200 ± 20 g ağırlığında spesifik patojensiz erkek Sprague–Dawley fareleri kullanıldı. 1 haftalık aklimatizasyonun ardından sıçanlar rastgele iki gruba ayrıldı: normal gruptaki üç fare normal chow ile beslenirken, model grubundaki 20 fare 3 hafta boyunca yüksek yağlı chow (%50 bazal chow + %10 domuz eti + %25 sukroz + %15 sarı tozu) ile beslendi. Model gruptaki hayvanlara, 12 saat boyunca su kısıtlaması olmadan 12 saat boyunca %20 mg/kg STZ solüsyesi (0.1 mol/L, pH 4.4 sitrat tamponunda çözünürülmüş) intraperitoneal enjeksiyon yapıldı. Normal gruptakiler, normal yemek yedikten sonra karşılık gelen sitrat tampon çözeltisi dozunun intraperitoneal enjeksiyonu aldılar. 1 hafta sonra intraperitoneal glukoz tolerans testi (IPGTT) yapıldı. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

Açlık kan şekeri (FPG), her gruptaki farelerin kuyruk ucundan su kısıtlaması olmadan 12 saat süren oruçtan sonra alınan kan alımıyla ölçüldü ve 2 saat sonrasında %20 dekstroz 2 g/kg intraperitoneal enjeksiyonun ardından 2 saat sonrasında kan şekeri (2hPG) kaydedildi. Normal grupta FPG aralığı 5.1–6.6 mmol/L, 2hPG glikoz aralığı ise 7.3–9.4 mmol/L idi; model grubunda FPG ≤7.0 mmol/L ve 2hPG aralığı 10–16 mmol/L idi. IGT model indüksiyonuna atanan 20 sıçandan, 18'i IPGTT sonrası önceden tanımlanmış IGT kriterlerini karşıladı ve sonraki müdahale deneyine dahil edildi. İki sıçan, FPG veya 2hPG değerleri önceden tanımlanmış IGT aralığının dışında olduğu için dışlandı. Daha sonra uygun 18 fare rastgele olarak yüksek yağlı ve normal diyetli gruplara ayrıldı; her grupta 9 fare bulunuyordu. Her diyet grubu ayrıca üç alt gruba ayrıldı: akupunktur noktası burulması, akupunktur olmayan bölge bükülmesi ve akupunktur noktası doğrudan yerleştirme; alt grupta üç fare bulunuyor. Bu, akupunktur müdahalesinin SERS tabanlı orantimetrik takip ile birleştirilmesinin uygulanabilirliğini değerlendirmek için tasarlanmış keşif yöntemi geliştirme çalışmasıydı; preklinik bir IGT sıçan modelinde. Resmi istatistiksel güç hesaplaması yapılmadı. Üç sıçanlık alt grup büyüklüğü, fizibilite, ön SERS-mikroiğne çalışmaları ve hayvan indirgemi prensibi temelinde seçildi. Deneyci tarafından fareler rastgele olarak atandı; Resmi tahsis gizleme ve kör etme yapılmadı.

Akupunktur tedavi protokolleri, geleneksel Çin tıbbı için kanıta dayalı klinik uygulama kılavuzları ve hayvan deneylerinin uygulanabilirliği referansında^{incelendi 22}. Seçilen akupunktur noktaları Zhongwan (RN12/CV12), Shuifen (RN9/CV9), Yinjiao (RN7/CV7), çift taraflı Tianshu (ST25), çift taraflı Shuidao (ST28) ve çift taraflı Zusanli (ST36) idi. RN12, RN9 ve RN7 ön orta hatta yer aldı ve tek orta hat noktaları olarak muamele edildi; ST25, ST28 ve ST36 ise iki taraflı olarak tedavi edildi. Akupunktur nokta eşleşmeleri, IGT^23'ün klinik tedavisinde kullanılan eşleşmelere dayanmaktadır. Uyarlama,^24,25 literatürüne dayanarak, ikili yöntemle yapılmıştır. Fareler için akupunktur noktaları anatomik işaretlere ve standart insan akupunktur noktalarından orantılı dönüşüme göre lokalize edilmiştir. Karın RN/CV noktaları, anatomik işaretler olarak xiphoid süreci, umbilikus ve pubik simfiz kullanılarak ön orta çizgi boyunca tanımlandı. ST25 göbek seviyesinde iki taraflı olarak işaretlenmiş, ST28 ise alt karın bölgesinde ön orta çizgiden aynı lateral mesafede iki taraflı olarak işaretlenmiştir. ST36, tibial tüberkülün lateral bölgesindeki tibialis anterior bölgedeki anterolateral arka uzuvda tespit edilmiştir. Bitişik akupunktur olmayan karşılaştırma noktaları, ilgili akupunktur noktalarına 5 mm yan tarafta ve tanınan meridyen çizgisinin dışında işaretlenmiş, görünür damarlar, yaralar ve önceki delme noktalarından kaçınılmıştır. İğneleme öncesi, sıçanlar onaylanmış hayvan protokolüne göre izofluran ile anestezi edilip, ısıtıcı pedde sırtüstü pozisyonda konurdu. Her hedef bölgedeki karın ve arka uzuv derisi tıraş edilip %75 etanol ile dezenfekte edildi. SERS-aktif mikro iğneler, cilde yaklaşık dik olarak yaklaşık 10 mm derinliğe yerleştirildi. Akupunktur noktalı burma grupları için, SERS-aktif mikroiğneler seçilen aküpunktur noktalarına yerleştirildi ve 20 dakikalık tutma süresi boyunca nazikçe çift yönlü olarak döndürüldü. Akupunktur bölgesi olmayan gruplar için aynı işlem, 5 mm bitişik akupunktur olmayan karşılaştırma noktalarında da uygulandı. Doğrudan yerleştirme grupları için, SERS-aktif mikro iğneler akümut noktalarına yerleştirildi ve bükülmeden 20 dakika boyunca tutuldu. Tüm iğneleme prosedürleri, operatörler arası değişimi en aza indirmek için aynı eğitimli operatör tarafından gerçekleştirildi.

İğneleme işlemi günde iki kez, saat 10:00 ve 15:00'te, 7 gün ardışık olarak gerçekleştirildi. Her günün prosedüründen önce, 8 saat oruç tutunmanın ardından su kısıtlaması olmadan FPG ölçüldü. Her günün iğneleme işleminden sonra, OC ve RP yanıtları kaydedildi. 7. gün, akupunktur tedavisinden sonra IPGTT yapıldı ve 2hPG değerleri kaydedildi.

Uyarılar

Streptozotosin tehlikelidir ve toksik bir kimyasal olarak ele alınmalıdır. Streptozotosin çözeltisini kimyasal bir buhar davlumbazında veya sertifikalı bir biyogüvenlik dolabında hazırlayın; bir laboratuvar önlüğü, nitril eldivenler, koruyucu gözlük ve maske takın. Streptozotosin ile kontamine olan şırıngalar, iğneler, mendiller, yatak takımları, kafesler ve hayvansal atıklar, kurumsal tehlikeli biyolojik ve kimyasal atık prosedürlerine uygun şekilde ele alınmalıdır. Kullanılmış iğne ve şırıngalar, kapağı yenilemeden hemen delinmeye dayanıklı keskin kaplara atılmalıdır.

OC ve RP tespiti için SERS-aktif mikroiğnelerin üretimi

Akupunktur iğneleri daha önce bildirildiği gibi^{hazırlandı 26}. SERS-aktif mikroiğneler, çalışma boyunca aynı tür ticari paslanmaz çelik akupunktur iğneleri (0,25 mm × 26 mm) kullanılarak üretildi. İğneler deriye yaklaşık dik olarak 10 mm derinliğe yerleştirildi. Dönme grupları için, aynı eğitimli operatör tarafından tutma süresi boyunca 20 dakika boyunca nazikçe ve tutarlı şekilde manuel çift yönlü dönüş uygulandı. Manipülasyon enstrüman kontrolü altında değildi; bu nedenle, tam dönme frekansı ve genlik nicelendirilmedi. Bu sınırlama Tartışmada kabul edilmiştir.

Başlangıçta, iğneler MMA'da %20 (w/v) PMMA çözeltisinde bekletildi, ardından oda sıcaklığında (25 °C) 1 gün boyunca kurutuldu. Sonra, PMMA koruyucu katmanında (5 mm aralıkta) eşit boyutta ve benzer şekil ve derinlikte iki paralel girinti etanolle temizlenmiş küçük bir bıçağı kullanılarak yapıldı; ardından iğneler 0,5 M sülfürik asitin içine batırıldı ve 10 saniye elektrokimyasal aşındırma işlemi için 12 V voltajda elektrokimyasal aşındırma yapıldı, böylece skor noktalarında neredeyse dairesel iki oluk oluştu. Üçüncü olarak, üç kez durulama yapıldıktan sonra, iğneler oda sıcaklığında 24 saat boyunca 0,1 mol L⁻¹ MPTES ve 0,3 mol L⁻¹ APTES içeren etanol çözeltisine daldırıldı; böylece oluklu yüzeylere sülfüdril işlevselliği kazandırdı. Dördüncüsü, iğne MMA'ya batırarak kaplama soyuldu. Redoks-potansiyele duyarlı SERS-aktif mikroiğneler, daha önce bildirilen bir yöntem²⁷ temelinde hazırlanmıştır. SERS substratı, her akupunktur iğnesinin kazıma oluklarından birine adsorbe edildi; ardından ortaya çıkan SERS-aktif mikroiğneler, 37 °C'de 60 dakika boyunca 1 × ^10-4 mol/L konsantrasyonda sulu p-PDA çözeltisine batırıldı ve oksidasyona duyarlı SERS-aktif mikroiğneler elde edildi. Altın nanokabuklara dayalı SERS substratları daha önce tarif edildiği^{gibi sentezlenmiştir 28}. Mevcut çalışmada, bu mikro iğneler her akupunktur iğnesinin diğer yivine damlatılmış ve doğal olarak kurumasına izin verilmiştir. Bu, OC ve RP yanıtına sahip SERS-aktif mikroiğneler ortaya çıkardı.

SERS-aktif mikroiğnelere karşı OC ve RP yanıtının ex vivo değerlendirmesi

OC ve RP problarının yanıtları, SERS-aktif mikroiğnelerin ex vivo dokuya yerleştirilmesiyle değerlendirildi. OC probun oksidatif değişikliklere tepkisini doğrulamak için, oksidasyondan önce ve sonra p-PDA'nın SERS spektrumları kaydedildi. Redoks SERS problarının spektrumları ayrıca güçlü indirgeme NaBH₄ çözeltisi ve güçlü oksitleyici HAuCl₄ çözeltisi içinde de alındı. OC probunun seçiciliği, 1 × ^10-4 M FeSO₄, 1 × ^10-4 M Na_{2SO 4} ve 1 × ^10-4 M askorbik asit ve oksitleyici ajanlar kullanılarak değerlendirildi; bunlar arasında 1 × ^10-4 M CuSO₄, 1 × ^10-4 M H₂O₂, 1 × ^10-4 M FeCl₃ yer alıyor, ve 1 × ^10-4 M HAuCl₄. Tüm çözeltiler 20 mM PBS (pH 7.4) içinde hazırlandı ve problar her çözeltiyle 37 °C'de 20 dakika kuluçka edildi. SERS-aktif mikroiğnelerin sağlamlığı, oda sıcaklığında 1 × ^10-4 mol/L FeCl₃ ile reaksiyon öncesi ve sonrası OC yanıtları kaydedilerek değerlendirildi. Bu ex vivo ve çözelti tabanlı testler, kontrollü koşullarda prob yanıt vermesini doğrulamak için kullanıldı. Ancak, lokal pH varyasyonu, protein adsorpsiyonu, hücre dışı matriks bileşenleri ve diğer biyolojik maddelerin SERS sinyallerini etkileyebildiği in vivo doku mikro ortamının karmaşıklığını tam olarak yeniden üretemezler. Bu nedenle, in vivo OC ve RP okumaları, matrissiz biyokimyasal ölçümler olarak değil, redoksla ilişkili SERS indeksleri olarak yorumlandı.

Akupunktur ve akupunktur dışı bölgelerde OC ve RP tespiti

OC ve RP problarının akupunktur noktalarında ve akupunktur dışı noktalarda performansını değerlendirmek için, SERS-aktif mikroiğneler sağlıklı sıçanlara ST36 ve RN12 akupunktur noktalarında ve bu noktaların her birine 5 mm bitişik, yaklaşık 10 mm derinlikte aynı süre boyunca yerleştirildi.

İğne burulmasının OC ve RP algılama üzerindeki etkileri

OC ve RP problarının farklı iğneleme teknikleri altında yanıt vermesini değerlendirmek için, SERS-aktif mikroiğneler ST36 ve RN12 akupunktur noktalarına ve bu noktalara 5 mm bitişikte sağlıklı sıçanlarda yaklaşık 10 mm derinliğe yerleştirildi. Her akupunktur noktasında bir iğne bükülür, iken noktaya bitişik iğne bükülür ve tam tersi (akupunktur noktasına bitişik iğne bükülür, akupunktur noktasındaki iğne ise bükülür). Problardan gelen SERS sinyalleri her iğne için aynı yerleştirme zamanında toplandı.

IGT'li sıçanlarda akupunktur noktaları, iğne burulması ve beslenme koşulları açısından OC ve RP değişiklikleri

Akupunktur noktaları, iğne burulması ve diyet koşullarının IGT'li sıçanların OC ve RP üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, yüksek yağlı diyet grubundaki fareler rastgele üç gruba (A1, A2 ve A3; her grupta üç fare) ayrıldı; normal diyet grubundakiler ise (B1, B2 ve B3 grupları; her grupta üç fare). A1 ve B1 gruplarındaki fareler için, sedasyon sonrası akupunktur noktalarına SERS-aktif mikroiğneler yerleştirildi ve 20 dakika boyunca büküldü; aynı prosedür A2 ve B2 gruplarındaki fareler için de uygulandı, ancak mikroiğneler akupunktur noktalarının yanına 5 mm yerleştirildi. A3 ve B3 içindeki sıçanlarda SERS-aktif mikroiğneler burulmadan sıçan akupunktur noktalarına yerleştirildi; İğneler 20 dakika yerinde bırakıldı. İğneleme işlemi günde iki kez, saat 10:00 ve 15:00'te, 7 gün boyunca gerçekleştirildi. Her günün prosedürlerinden önce, her fare grubunun FPG değerlerini (oruçtan sonra 8 saat su kısıtlaması olmadan) bir glukoz ölçer olarak kaydedildi. Her günün iğnelemesinden sonra, OC ve RP yanıtları ölçülüp kaydedildi. 7. gün, akupunkturdan sonra, her fare grubuna IPGTT uygulandı ve 2hPG değerleri kaydedildi.

Karakterizasyon ve ölçüm

SERS-aktif mikroiğnelerin morfolojisi, taramalı elektron mikroskopisi (SEM) ile incelendi. SERS spektrumları, 50× uzun çalışma mesafesi hedefi (NA: 0.5) ve 785 nm lazer ile yapılandırılmış bir Raman spektrometresi kullanılarak 25 °C'de alındı. Tüm ölçümlerde alım süresi 10 saniyeydi ve Raman sistemi aynı optik konfigürasyonda nominal lazer gücü 600 μW olarak çalıştırıldı. Bu çalışmada doku yüzeyine verilen gerçek lazer gücü doğrudan ölçülmemiştir. Bu nedenle, aynı alım ortamlarında gruplar arasında göreceli karşılaştırmalar için SERS spektrumları kullanıldı ve mutlak doku fototermal güvenliği konusunda hiçbir sonuç çıkarılmadı. İki SERS probun yoğunluk oranları aşağıdaki yaklaşımla hesaplandı: 1450 cm^−1'deki yoğunluk değerlerinin 1500 cm^−1'deki oranı, 1700 cm^−1'deki yoğunluk her iki zirveden çıkarıldıktan sonra (I₁₄₅₀ cm⁻¹/_{I 1500} cm⁻¹) OC göstergesi olarak belirlenmiştir. önceki ^{raporlarda olduğu gibi sırasıyla 17}; ve I₁₆₀₆ cm⁻¹/I₁₆₆₆ cm⁻¹ RP göstergesi olarak kullanılarak, 1700 cm^−1'deki yoğunluk (arka plan olarak) sırasıyla iki zirveden her birinden çıkarıldı. Hesaplanan I₁₄₅₀ cm⁻¹/_{I 1500} cm⁻¹ ve I₁₆₀₆ cm⁻¹/I₁₆₆₆ cm⁻¹ değerleri, sırasıyla OC- ve RP ile ilişkili yanıtların göreceli SERS teşrekili indeksleri olarak analiz edilmiştir. Bu oranlar, aynı satın alma ayarlarında gruplar ve zaman noktaları arasındaki değişiklikleri karşılaştırmak için kullanıldı.

Bu çalışmada bu oranları mutlak oksidatif türlerin konsantrasyonlarına veya mutlak elektrokimyasal redoks-potansiyel değerlerine dönüştürmek için harici bir kalibrasyon eğrisi oluşturulmamıştır. Her spektrum, SERS probunda beş farklı noktada üç kopya örnekte iki kez kaydedildi. Origin verileri işlemek ve grafikler oluşturmak için kullanıldı. Satın alma ile ilgili değişkenliği en aza indirmek için tüm gruplara aynı lazer dalga boyu, hedef, alım süresi, lazer gücü ayarı ve spektral işleme iş akışı uygulandı. Lazer ışınının neden olduğu potansiyel fototermal veya fotokimyasal etkiler bağımsız olarak nicelendirilmemiş ve bir sınırlama olarak kabul edilmiştir. İstatistiksel veriler, ortalama ± ortalama standart hata (SEM) olarak sunulur. Her deney veya şekil paneli için kullanılan örneklem boyutu ve istatistiksel test, ilgili şekil efsanelerinde belirtilmiştir. Ex vivo prob doğrulama deneylerinde, analiz birimi olarak SERS probu veya bağımsız hazırlanmış mikroiğne kullanılmıştır. In vivo kan glikozu ve SERS-indeks analizleri için sıçan biyolojik analiz birimi olarak kullanıldı. Aynı probda birden fazla noktadan toplanan spektrumlar teknik ölçüm olarak ele alındı ve grup düzeyinde analizden önce ortalamaları alındı. İstatistiksel analizler SPSS yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. Gruplar arasındaki karşılaştırmalar, ilgili şekil efsanelerinde belirtilen istatistiksel testler kullanılarak yapıldı. 7 günlük müdahale döneminde seri açlık kan şekeri ve SERS-indeks ölçümleri, küçük alt grup büyüklüğü nedeniyle keşif amaçlı boylamasına eğilimler olarak yorumlandı ve resmi tekrarlanan ölçüm veya karışık etki modeli uygulanmadı. İstatistiksel anlamlılık p < 0.05 olarak tanımlandı. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

Sonuçlar

OC ve RP tespiti için SERS-aktif mikroiğnelerin üretimi

OC ve RP'deki değişiklikleri tespit etmek için, ilgili probları içeren SERS-aktif mikroiğneler üretildi. Temsilli SEM görüntüleri, SERS-aktif mikroiğnelerin iki oluklu yapısını doğruladı. Şekil 2A, iki kazıklı oluklu akupunktur iğne gövdesini gösterir, Şekil 2B'de GNS yüklü bir oluk ve Şekil 2C, oluk içinde yayılan GNS'nin genişletilmiş bir görünümünü gösterir. Bu görüntüler, oyma oluklarının OC- ve RP-duyarlı SERS probları için yerel yükleme noktaları olarak hizmet edebileceğini doğruladı. P-PDA'nın oksitlenme derecesini göstermek için tepe yoğunlukları I₁₄₅₀ ^cm−1/I₁₅₀₀ cm⁻¹ oranı kullanıldı. Şekil 3A, 1 × 10⁻⁴ M FeCl₃ ile etkileşimden önce ve sonra p-PDA'nın SERS spektrumlarını gösterirken, Şekil 3B, 1 × 10⁻³ M NaBH4 ve 1 × 10-4 M HAuCl₄ sulu çözelti redoks probu spektrumlarını sunar. RP prob yanıtı, RP arttıkça azalan bir tepe yoğunluk oranı (I₁₆₀₆ ^cm-1/I₁₆₆₆ ^cm-1) olarak ifade edildi.

Oksidatif kapasiteye yanıt veren probun seçiciliğini değerlendirmek için, farklı indirgeme ve oksitleyici maddelere maruz kaldıktan sonra I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ oranı ölçüldü. Bağımsız prob ölçümleri her grup başına n = 3 ile yapıldı ve analiz birimi olarak SERS probu veya bağımsız hazırlanmış mikro iğne kullanıldı (Şekil 3C). CK grubuyla karşılaştırıldığında (Kruskal–Wallis testi ve ardından Dunn'un çoklu karşılaştırma testi), indirgentici maddeler FeSO₄ ve Na₂SO₄ I₁₄₅₀ ^cm−1/I₁₅₀₀ cm⁻¹ oranını anlamlı şekilde değiştirmedi (p > 0.05). Askorbik asit (AA, p < 0.001), indirgentici madde olarak dahil edilmesine rağmen, mevcut test koşullarında artan oran üretmiştir. Bu nedenle, AA yanıtı bu çözelti tabanlı testte oksitleyici davranışın kanıtı olarak değil, proba özgü spektral yanıt olarak temkinli şekilde yorumlandı. Buna karşılık, oksitleyici veya oksidlenmeye bağlı reaktifler oranı farklı derecelerde artırmıştır. CuSO₄ (p < 0.0001), H₂O₂ (p < 0.0001), FeCl₃ (p < 0.0001) ve HAuCl₄ (p < 0.0001) maruz kaldıktan sonra oran artırıldı. Oda sıcaklığında OC probun kararlılığını değerlendirmek için, SERS spektrumları probun 1 × 10⁻⁴ M FeCl₃ ile reaksiyon öncesi 6 saatlik aralıklarla alındı (Şekil 3D), ve karşılık gelen I₁₄₅₀ ^cm−1/I₁₅₀₀ cm⁻¹ oranları hesaplandı. Prob adsorpsiyonundan sonra, başlangıç değeri yaklaşık 0.20 ± 0.02 arasında sabit kaldı; FeCl₃ ile reaksiyonda da yaklaşık 0.9 ± 0.10 aralığında, 6 saat boyunca aynı şekilde. Bu sonuçlar, GNS'deki p-PDA'nın havada stabil olduğunu göstermektedir.

Akupunktur ve akupunktur dışı noktalarda OC ve RP yanıtları

Önceki^{çalışmalar 29} , OC probun yerleştirildikten 10 dakika sonra maksimum yanıtına ulaştığını göstermiştir. Şekil 4A ve B, ST36 ve RN12 akupunktur noktalarına yerleştirilen sağlıklı sıçanlarda ve noktaların yanına 5 mm mesafede 10 dakika boyunca yerleştirilen SERS-aktif mikro iğnelerin yanıtını göstermektedir. Bu deneyler için, grup başına n = 3 fare ve aynı probda birden fazla noktadan toplanan spektrumlar teknik kopyalar olarak değerlendirilip grup düzeyinde analizden önce ortalamaya alındı. SERS-aktif mikroiğneler, in vivo olarak OC ve RP değişikliklerine etkili şekilde yanıt verdi; akupunktur puan grubundaki OC ve RP oranlarında akupunktur olmayan puan grubuna kıyasla belirgin bir fark olmadı (Bağımsız örnekler t-testi, p > 0.05).

İğne bükülmesinin in vivo yerel OC ve RP üzerindeki etkilerini daha iyi belirlemek için, SERS-aktif mikroiğneler sağlıklı sıçanlara ST36 ve RN12 akupunktur noktalarında ve bu noktaların 5 mm ötesinde 10 mm derinliğe yerleştirildi. Her akupunktur noktasında yapılan burma manevrası sırasında, noktaya bitişik iğne açıldı ve tam tersi de açıldı ve delme noktasında OC ve RP değerlerindeki değişiklikler kaydedildi (Şekil 4C–F). Sağlıklı sıçanlarda burulmanın akupunktur noktalarında veya akupunktur dışı noktalarda yapılmasına bağlı olarak OC ve RP'de önemli bir değişiklik olmadı ve bitişik bir noktada bükülmenin etkisi de yoktu (p > 0.05).

IGT'li sıçanlarda akupunktur, iğne burulması ve diyet koşullarıyla ilişkili OC ve RP değişiklikleri

IGT'nin başarılı bir fare modelinin kurulmasını doğrulamak için, FPG ve 2hPG değerleri sırasıyla model ve kontrol sıçanlarında IPGTT testi kullanılarak kaydedildi. Kontrol grubunda n = 3 fare vardı, model grubunda ise önceden belirlenmiş glikoz toleransı kriterlerini karşılayan n = 18 fare yer aldı. Model fareler, kontrol sıçanlarına göre daha yüksek açlık kan şekeri gösterdi (6,92 mmol/L vs. 5,54 mmol/L; Mann–Whitney U testi, p < 0.01) ve kontrol sıçanlarına göre 2 saat sonrakı kan şekeri (11.52 mmol/L v.7.92 mmol/L; Mann–Whitney U testi, < 0.001) (Şekil 5), model hayvanlarda IGT'nin başarılı bir şekilde indüklenmesini göstermektedir.

Akupunktur noktaları, iğne burulması ve beslenme koşullarının IGT sıçanları üzerindeki etkilerini doğrulamak için tipik bir akupunktur nokta çiftleri seti seçildi. 18 uygun model fare daha sonra yüksek yağlı ve normal diyetli gruplara ayrıldı; diyet grubu başına n = 9 fare bulundu. Her diyet grubu üç müdahale alt grubuna ayrıldı: akupunktur noktası bükülmesi, akupunktur olmayan bölge bükülmesi ve akupunktur noktası doğrudan yerleştirme, alt grup başına n = 3 fare bulunmakta. FPG değerleri iğneleme gününden önce kaydedildi (Şekiller 6A–C), 2hPG (Şekil 6D) değerleri ise 7 gün iğneleme sonrası IPGTT testiyle her grupta ölçüldü. Bu keşif veri setinde, akupunktur noktalarında iğneleme sonrası yüksek yağlı diyet ve normal diyet model grupları arasında FPG veya 2hPG açısından belirgin bir fark gözlemlenmedi. Akupunktur noktası ile akupunktur dışı iğneleme arasındaki karşılaştırmalar, akupunktur noktası bükülmesinin mevcut deneysel koşullarda daha düşük kan şekeri değerleriyle ilişkili olduğunu gösterdi (bağımsız örnekler t-testleri, p < 0.05). Alt grup büyüklüğü küçük ve diyet, akümutur konumu ile burulma manipülasyonu tam istatistiksel olarak ayrılamadığı için, bu bulgular ön hayvan modeli gözlemleri olarak yorumlandı.

IGT sıçanlarında 1 haftalık akupunktur müdahalesi süresince oksidatif kapasite ile ilişkili ve redoks potansiyeline bağlı SERS indekslerindeki değişiklikler izlendi. Bu analizler için n = 3 fare alt grup başına dahil edildi ve her sıçan biyolojik analiz birimi olarak ele alındı. Yüksek yağlı diyet farelerinde, oksidatif kapasiteye bağlı SERS indeksi akupunktur noktası bükülme ve akupunktur noktası doğrudan yerleştirme gruplarında zamanla azalırken, akupunktur olmayan burulma grubunda nispeten daha yüksek kalmıştır (Şekil 7A). Redoks potansiyeline bağlı SERS indeksi, akupunktur noktası bükülme ve akupunktur noktası doğrudan yerleştirme gruplarında zamanla artmışken, akupunktur olmayan burulma grubu nispeten daha zayıf bir artış göstermiştir (Şekil 7B). Benzer eğilimler normal diyetli IGT sıçanlarında gözlemlendi. Oksidatif kapasiteye bağlı SERS indeksi, akupunktur noktası bükülme ve akupunktur noktası doğrudan yerleştirme gruplarında zamanla azalmış, akupunktur olmayan burama grubunda ise daha küçük bir değişiklik olmuştur (Şekil 7C). Redoks potansiyeline bağlı SERS indeksi, akupunktur noktası bükülme ve akupunktur noktası doğrudan yerleştirme gruplarında zamanla artmışken, akupunktur olmayan burulma grubu nispeten daha düşük kalmıştır (Şekil 7D).

Aynı akupunktur manipülasyonu altında diyet koşullarını daha da karşılaştırmak için, yüksek yağlı ve normal diyet gruplarındaki akupunktur noktası bükülme alt grupları karşılaştırıldı. Bu karşılaştırmada, oksidatif kapasiteye bağlı SERS indeksi her iki diyet durumunda da zamanla azalmış, normal diyet akupunktur noktası bükülme alt grubunda 7. güne kadar daha büyük bir azalma gözlemlenmiştir (Şekil 7E). Redoks potansiyeline bağlı SERS indeksi her iki diyet durumunda da zamanla arttı ve normal diyet akupunktur noktası burulma alt grubunda 7. gün değeri daha yüksek oldu (Şekil 7F). Bu bulgular, akupunktur noktası bükülmesi ve diyet normalizasyonunun, IGT sıçanlarında yerel redoks-ilişkili SERS indekslerindeki değişikliklerle ilişkili olduğunu göstermektedir. Her alt grup sadece üç fare içerdiği ve bağımsız biyokimyasal oksidatif stres testleri yapılmadığı için, bu sonuçlar oksidatif stres iyileşmesinin kesin biyokimyasal kanıtı yerine keşif hayvan modeli gözlemleri olarak yorumlanmalıdır.

VERİ ERIŞILEBILIRLIĞI:

Şekil üretimi ve istatistiksel analiz için kullanılan tüm sayısal ham veriler, kan şekeri ölçümleri, SERS'ten türetilen oran değerleri ve nicel şekil panelleri için kaynak veriler dahil olmak üzere Ek Tablo 1 olarak düzenlenmiş ve yüklenmiştir. Analitik cihaz tarafından doğrudan üretilen sürekli prob izleme deneyleri için, prob performansını değerlendirmek için kullanılan dışa aktarılan değerler ve temsil eden enstrüman tarafından üretilen çıktılar Ek Dosya 1'e dahil edilmiştir.

Şekil 1: Akupunktur müdahalesi ve yerel orantimetrik SERS takibi için çift oluklu SERS-aktif mikroiğne kullanılarak metodolojik iş akışı. Şematik, iki oluklu SERS-aktif mikroiğnenin akupunktur noktasına veya bitişik akupunktur olmayan bölgeye yerleştirilmesini ve ardından Raman spektral alımını göstermektedir. Yazarlar bu figürü WPS yazılımı kullanarak oluşturmuşlardır ve telif hakkı lisansı gerekmemektedir. Kısaltmalar: SERS = yüzeyle güçlendirilmiş Raman saçılması. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: SERS-aktif mikroiğnelerin temsil SEM görüntüleri. (A) İki oluklu akupunktur iğne gövdesi; ölçek çubuğu = 200 μm; büyütme = 77×. (B) GNS ile entegre bir oluk; ölçek çubuğu = 20 μm; büyütme = 1.000×. (C) B'deki oluğun büyütülmüş görüntüsü; ölçek çubuğu = 2 μm; büyütme = 30.000×. Kısaltmalar: SEM = taramalı elektron mikroskopi; GNS = altın nanoshelller. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: OC-teaktlı ve RP-teypli SERS problarının karakterizasyonu. (A) FeCl₃ ile etkileşimden önce ve sonra p-PDA'nın normalize spektrumları. (B) Sırasıyla NaBH₄ ve HAuCl₄ çözeltilerindeki RP problarının normalize SERS spektrumları. (C) Çeşitli oksitleyici ve indirgentici çözeltilerdeki OC problar için₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ oranları. n=3 bağımsız prob ölçümü grup başında. Kruskal–Wallis testi ve ardından Dunn'ın çoklu karşılaştırma testi ve CK grubu ile karşılaştırılması. Veriler, ortalama ± ortalama standart hatası (SEM) olarak sunulur. (D) OC-teaklı probun FeCl₃ ile reaksiyon öncesi ve sonrası altı saatlik stabilite değerlendirmesi. Kısaltmalar: SERS = yüzeyle güçlendirilmiş Raman saçılması; CK = kontrol kontrolü; p-PDA = p-fenilenediamin; AA = askorbin asit. p < 0.001, ****p < 0.0001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Sağlıklı sıçanlarda akupunktur ve akupunktur olmayan bölgelerde farklı iğneleme yöntemleriyle ölçülen OC- ve RP ile ilgili SERS indeksleri. (A) Akupunktur noktalarında ve bitişik akupunktur olmayan bölgelerde doğrudan yerleştirildikten sonra OC ile ilgili SERS indeksi. (B) Akupunktur noktalarında ve bitişik akupunktur olmayan bölgelerde doğrudan yerleştirildikten sonra RP ile ilgili SERS indeksi. (C) Akupunktur olmayan bölgelere doğrudan yerleştirildikten sonra OC ile ilgili SERS indeksi ve akupunktur noktalarında iğne burulması. (D) RP ile ilgili SERS indeksi, akupunktur olmayan bölgelere doğrudan yerleştirildikten sonra ve akupunktur noktalarında iğne bükülmesi. (E) Akupunktur noktalarında doğrudan yerleştirildikten sonra OC ile ilgili SERS indeksi ve bitişik akupunktur olmayan bölgelerde iğne burulması. (F) Akupunktur noktalarına doğrudan yerleştirildikten sonra RP ile ilgili SERS indeksi ve bitişik akupunktur olmayan bölgelerde iğne bükülmesi. OC I₁₄₅₀ ^cm-1/_{I 1500} ^cm-1 olarak hesaplandı ve RP I₁₆₀₆ ^cm-1/I₁₆₆₆ ^cm-1 olarak hesaplandı. n=3 her grup. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmaktadır. Eşleştirilmiş karşılaştırmalar arasında anlamlı farklar gözlemlenmemiştir. Kısaltmalar: OC = oksidatif kapasite; RP = redoks potansiyeli. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Model ve kontrol (CK) sıçanlarında IPGTT testine göre FPG ve 2hPG değerleri. FPG ve 2hPG ölçülü, bozulmuş glikoz toleranslı fare modelinin kurulmasını doğrulamak için yapılmıştır. n = kontrol grubunda 3 fare ve model grubunda n = 18 fare bulunur. İstatistiksel analiz Mann–Whitney U testi ile yapıldı ve sonuçlar ortalama ± SEM olarak sunuldu. **p < 0.01, ***p < 0.001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Akupunktur işlemleri sırasında IGT sıçanları için FPG ve 2hPG değerleri. (A) Akupunktur noktalarında iğne bükülmesi ve akupunktur noktalarında doğrudan iğne yerleştirilmesiyle (grup başına n = 3) akupunktur alan grup için FPG değerleri. (B) Akupunktur noktalarında ve akupunktur olmayan noktalarda bükülme ile grup alıcı iğneleme için FPG değerleri (n = 3 grup başına 3). (C) Yüksek yağlı diyet ve normal diyet grupları için FPG değerleri (n = grup başına 3). (D) 7. Gün 2hPG değerleri, akupunktur noktası burulma, akupunktur olmayan burulma ve akupunktur noktası doğrudan yerleştirme koşulları altında yüksek yağlı diyet ve normal diyet farelerde. (n = grup başına 3). Sonuçlar, ortalama ± SEM olarak sunuldu. Panel D'deki planlı çiftli uç nokta karşılaştırmaları, eşleşmemiş iki kuyruklu Öğrenci t-testi kullanılarak analiz edildi. *p < 0.05. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Akupunkturun 1 haftası boyunca her gruptaki farelerin OC ve RP değişimleri. (A) Yüksek yağlı diyet IGT farelerinde OC değişiklikleri. (B) Yüksek yağlı diyet IGT farelerinde RP değişiklikleri. (C) Normal diyet IGT farelerinde OC değişiklikleri. (D) Normal diyet IGT farelerinde RP değişiklikleri. (E) Akupunktur noktası bükülme alt grubundaki yüksek yağlı diyet ile normal diyet koşulları arasında OC ile ilgili SERS indeks karşılaştırması; (F) Akupunktur noktası bükülme alt grubundaki yüksek yağlı diyet ile normal diyet koşulları arasında RP ile ilgili SERS indeks karşılaştırması. n = alt grup başına 3 fare var. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmaktadır. Seri ölçümler keşif boylamasına eğilimler olarak yorumlanmıştır. Kısaltmalar: OC = oksidatif kapasite; RP = redoks potansiyeli. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Prob-response değerlendirmesi için temsilli enstrüman üretimi çıktıları. Bu dosya, doğrudan analitik cihaz tarafından üretilen ve prob-yanıt performansını değerlendirmek için kullanılan temsilli sürekli izleme çıktılarını içerir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Nicel analizler için ham veri tablosu. Bu dosya, kan şekeri ölçümleri, SERS'ten türetilen oran değerleri ve nicel şekil paneli verileri dahil olmak üzere şekil üretimi ve istatistiksel analiz için kullanılan sayısal kaynak verilerini içerir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bozulmuş glukoz toleransı, tip 2 diyabetten önce geri dönebilir bir geçiş aşamasını temsil eder ve metabolik dengesizlik, insülin direnci ve oksidatif stresle ilişkili düzensizlikle yakından ilişkilidir. Yaşam tarzı müdahalesi ve diğer erken tedavi stratejileri, glukoz toleransının bozulmasından diyabete ilerleme riskini azaltabilir, ancak müdahale sırasında yerel biyokimyasal yanıtların dinamik olarak izlenmesi için araçlar sınırlı^kalır30. Akupunkturun deneysel ve klinik çalışmalarda glikoz metabolizmasını ve oksidatif stresle ilişkili yolları etkilediği bildirilmiştir. Ancak, akupunkturla ilgili çoğu mekanik çalışma, son nokta kan veya doku ölçümlerine dayanır ve nispeten az sayıda yöntem akupunktur müdahalesi sırasında yerel redoksla ilişkili yanıtların minimal invaziv izlenmesine izin verir. IGT tedavisinin önceki klinik denemeleri, diyabet riskinin, diyet değişiklikleri, vücut kütlesi azaltılması ve fiziksel aktivitenin artırılması gibi yaşam tarzı müdahaleleriyle büyük ölçüde azaltılabileceğini^{doğrulamıştır 31}. Akupunkturun glikoz metabolik indekslerini artırmada ve açlık ile 2hPG'yi düşürmede etkili olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, akupunktur, redoks ve IGT arasındaki ilişkinin aydınlatılması, IGT'yi tersine çevirmek veya ilerlemesine müdahale etmek için yaklaşımlar sunabilir; böylece diyabet mellitus insidansını azaltabilir ve IGT'nin patolojisi ve gelişiminin altında yatan mekanizmalar hakkında içgörü sağlar.

Mevcut çalışma, akupunktur müdahalesini yerel ratiometrik SERS izleme ile birleştirmek için, glukoz toleransının bozulmuş bir fare modelinde çift oluklu redoks-duyarlı, yüzeye dayanıklı Raman saçılma-aktif mikroiğne platformu önermektedir. Bu sistemde, tek bir akupunktur iğnesinde iki oyma oluk kullanılarak, oksidatif kapasiteye duyarlı ve redoks-potansiyele duyarlı probları taşımak için kullanıldı. Bu tasarım, akupunktur iğnesinin sadece bir müdahale aracı olarak değil, aynı zamanda göreceli yerel redoks-ilişkili optik okumalar için algılama taşıyıcısı olarak da işlev görmesini sağladı. Sonuçlar, akupunktur noktalarında bükülme ile iğnelenmenin, düşük açlık kan şekeri ve 2hPG değerleri ile oksidatif kapasiteye bağlı ve redoks potansiyeline bağlı SERS indekslerindeki değişikliklerle ilişkili olduğunu gösterdi; bu durum glikoz toleransı bozulmuş sıçanlarda gerçekleşti. Bu bulgular, akupunktur müdahalesi sırasında yerel redoks-ilişkili yanıtları incelemek için SERS-aktif mikroiğnelerin kullanılmasının mümkün olduğunu desteklemektedir. Genel olarak, sonuçlar akupunktur noktalarında bükülme ile iğnelenmenin daha düşük FPG ve 2hPG değerleri ile IGT sıçanlarında OC ve RP ile ilişkili SERS indekslerindeki değişikliklerle ilişkili olduğunu göstermektedir. Bu bulgular, akupunktur müdahalesi sırasında yerel redoks-ilişkili optik yanıtları takip etmek için SERS-aktif mikro iğnelerin kullanılmasının uygulanabilirliğini desteklemektedir. Ancak, standart biyokimyasal oksidatif stres testleri, prob sızdırma analizi ve doku biyouyumluluk testleri yapılmadığından, gözlemlenen SERS-indeks değişiklikleri, oksidatif stres iyileşmesinin kesin biyokimyasal kanıtı olarak yorumlanmamalıdır.

Aynı hipotezi daha fazla incelemek için birkaç alternatif yaklaşım kullanılabilir. Reaktif oksijen türleri, malondialdehit, süperoksit dismutaz, katalaz, glutatyon peroksidaz ve glutatyon/glutatyon disülfit oranlarının ölçümleri dahil olmak üzere standart biyokimyasal oksidatif stres testleri, SERS kaynaklı indekslerdeki değişikliklerin geleneksel oksidatif stres biyobelirteçleriyle örtüşüp örtüşmediğini doğrulamak^{için kullanılabilir 32,33}. Elektrokimyasal redoks probları, floresans tabanlı redoks sensörleri, kemilyüminsans testleri, mikrodiyaliz ve ardından biyokimyasal analiz ve doku tabanlı immünohistokimyasal veya histolojik doğrulama da tamamlayıcı bilgi sağlayabilir. SERS-aktif mikroiğne algılamasını bu bağımsız yaklaşımlarla birleştirmek, gözlemlenen optik değişikliklerin spesifik biyokimyasal redoks değişikliklerini mi yoksa iğneleme ve metabolik duruma daha geniş yerel doku yanıtlarını mı yansıttığını^{belirlemeye yardımcı olur 34}.

Bu yöntemin potansiyel uygulamaları, mevcut bozuk glukoz toleransı modelinin ötesine geçmektedir. Redoks dengesizliği metabolik hastalık, doku hasarı, iltihap ve yara onarımında rol oynadığından, SERS-aktif mikroiğneler, diyabetle ilgili modellerde, yara iyileşme çalışmalarında, iltihap hastalık modellerinde ve diğer minimal invaziv müdahale ortamlarında yerel redoksla ilişkili yanıtların izlenmesi için faydalı bir preklinik araç olabilir³⁵. Akupunktur araştırmalarında, platform akupunktur noktalarını, akupunktur dışı bölgeleri, farklı iğneleme manipülasyonlarını ve farklı müdahale programlarını karşılaştırmak için faydalı olabilir. Ancak, bu uygulamalar keşif niteliğinde kalmaya devam etmekte ve daha fazla teknik ve biyolojik doğrulama gerektirmektedir.

Birkaç sınırlama belirtilmelidir. İlk olarak, OC ve RP okumaları SERS'ten türetilen oran metrik indeksler olarak hesaplanmış ve oksidatif türlerin standart konsantrasyonları veya mutlak elektrokimyasal redoks-potansiyel değerleri karşılaştırılmaya göre kalibre edilmemiştir. Bu nedenle, mevcut sonuçlar, mutlak biyokimyasal ölçümler yerine aynı alım koşulları altında göreceli redoks-ilişkili optik yanıtlar olarak yorumlanmalıdır. İkinci olarak, biyolojik doku mikro ortamı, yerel pH değişiklikleri, protein adsorpsiyonu, hücre dışı matriks bileşenleri ve diğer matris etkileri gibi ek sinyal varyasyonları kaynakları getirebilir. Bu faktörler, serum içeren veya doku taklit eden ortamlarda tam olarak değerlendirilmemiştir. Üçüncüsü, doku yüzeyine ulaşan gerçek lazer gücü ve Raman alımı sırasında yerel sıcaklık değişimi doğrudan ölçülmemiştir; bu nedenle, potansiyel fototermal veya fotokimyasal etkiler tamamen dışlanamaz. Dördüncüsü, oluk geometrisi ve prob yükünün parti düzeyinde tekrarlanabilirliği, çok iğneli SEM görüntüleme veya yükleme verimliliği analiziyle nicel olarak değerlendirilmemiştir. Son olarak, bağımsız biyokimyasal doğrulama, prob sızdırma analizi ve yerel biyouyumluluk testi yapılmadı. Gelecekteki çalışmalar, biyolojik olarak ilgili matrislerde kalibrasyon eğrileri oluşturmalı, SERS indekslerini standart oksidatif stres ve redoks testleriyle ilişkilendirmeli, prob süzülmesini nicelikle ölçmeli, tekrar tekrar yerleştirildikten sonra yerel doku uyumluluğunu değerlendirmeli ve cihazı daha büyük hayvan kohortlarında doğrulamalıdır. SERS-aktif mikroiğneler, preklinik IGT sıçan modelinde akupunktur müdahalesini yerel redoksla ilişkili indekslerin göreli oranimetrik SERS takibi ile birleştirmek için faydalı bir platform sağlayabilir. Mutlak nicel izleme veya translasyonel uygulama talep edilemeden önce ek kalibrasyon, biyokimyasal doğrulama, prob sızdırma değerlendirmesi ve biyouyumluluk çalışmaları gereklidir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES, 98%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A800524
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTES, 95%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	M742544
Askorbik asit	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CFAD310554
Kan şekeri ölçer	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe A03
Kan şekeri test şeritleri	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe-A03-C
Bakır sülfat (CuSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	PHR1477
Etil alkol (≥99.7%)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW00641752
Demir sülfat (FeSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW01772078701
Glukoz (Glu)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	D9434
Hidrojen peroksit (H2O2)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	P-17-0500
Demir klorür (FeCl3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CP81015228
Metil metakrilat (MMA)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	M109626
Mikro-Raman spektrometresi	Renishaw	InVia Raman Mikroskobu
p-Fenilendiamin (p-PDA)	Shanghai TCI Chemical Industry Development Co., Ltd.	P128784
Polimetil metakrilat (PMMA)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	P742581
Taramalı elektron mikroskobu	Zeiss	ULTRA Plus
Sodyum borohidrit (NaBH4)	Shanghai Adamas-beta Reagents Co., Ltd.	S432207
Sodyum sülfit (Na2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	S572396
Paslanmaz çelik akupunktur iğneleri	Suzhou Tianxie Acupuncture Instruments Co., Ltd.	X-20-03
İstatistiksel analiz yazılımı	International Business Machines Corporation	Versiyon 2021
Streptozosin (STZ)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	S408311
Tetrakloroauririk asit (HAuCl4)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A124024
SPSS yazılımı	International Business Machines Corporation, Armonk, New York State, USA	versiyon 26.0
sıçanlar	Jiangsu Qinglongshan Biotechnology Co., Ltd.	Spesifik patojen içermeyen erkek Sprague-Dawley
bazal yem	Anuokang Biotech.	SY10001
Domuz yağı	MCE	HY-W127601
Sükroz	MCE	HY-B1779
Yumurta sarısı tozu	MCE	HY-B2235B
Sitrik asit monohidrat	Sigma-Aldrich	C1909
Trisodyum sitrat dihidrat	Sigma-Aldrich	S4641
Sitrik asit tamponu	beyotime	P0086
Fosfat tamponlu salin	beyotime	ST448-1L
İzofluran	Bioss	D54468
Küçük hayvanlar için izofluran anestezi sistemi	RWD Life Science	R500
İndüksiyon odası ve burun konisi	RWD Life Science	R500 uyumlu aksesuarlar
Isıtma pedi	Shanghai Yuyan Life Science	Y69020
%75 etanol	Boyu Bio.	YB60401
CO2 ötenazi odası	Lab Animal Tec. Co.	LAT-10-0090
WPS	Beijing Kingsoft Office Software	WPS365