Farelerde Kılavuz Tel ile İndüklenen Aort Kapak Stenozu Modeli için Optimize Edilmiş Bir Protokol

Özet

Bu protokol, C57BL/6 farelerde optimize edilmiş bir kılavuz telle indüklenen aort kapak stenozu modelini detaylandırmaktadır. Özel olarak 3D yazıcıyla üretilmiş bir vasküler destek platformu, hassas kanama kontrolü sağlayarak 24 saatlik sağkalım oranını %95 (19/20) ve 4. haftadaki genel model başarısını %90 (18/20) seviyesine çıkarmaktadır.

Özet

Aort kapak stenozu (AKS), yaşlanan popülasyonlarda prevalansı artan önemli bir kardiyovasküler hastalıktır; ancak hastalıklı kapak dokusunun kıtlığı, mekanistik çalışmaları ve terapötik geliştirmeleri ciddi şekilde sınırlandırmaktadır. Bu protokol, kontrollü kanama yönetimi aracılığıyla Honda kılavuz teli ile indüklenen kapak yaralanması yöntemini geliştirerek, AKS'nin tekrarlanabilir bir fare modelini oluşturmakta ve optimize etmektedir. Erkek ve dişi C57BL/6 farelere kılavuz teli ile indüklenen aort kapak yaralanması uygulanır; prosedür, kılavuz telinin yerleştirilmesi ve geri çekilmesi sırasında hassas kanama kontrolü sağlayan özel bir 3B yazıcıyla üretilmiş vasküler destek platformu ile iyileştirilmiştir. Sonuç ölçütleri arasında 24 saatlik sağkalım, 4. haftadaki ekokardiyografik değerlendirme ve histopatolojik doğrulama yer almaktadır. Optimize edilen protokol %95 oranında 24 saatlik sağkalım oranı sağlamıştır (20 hayvanın 19'u); sağ kalanlar arasında %94,7'si (19 hayvanın 18'i) 4. haftada önceden tanımlanmış hemodinamik başarı kriterini karşılamış ve ekokardiyografi ile histolojik analizle onaylanmış toplam %90'lık bir model başarı oranı (20 hayvanın 18'i) elde edilmiştir. Bu standartlaştırılmış model, kapak dejenerasyonu mekanizmalarını araştırmak ve aday terapötik müdahaleleri değerlendirmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir platform sunmaktadır.

Giriş

Kapak hastalıkları, nüfusun yaşlanmasıyla paralel olarak artan yaygınlığıyla birlikte hem gelişmiş hem de gelişmekte olan ülkelerde önemli bir sağlık yükü olmaya devam etmektedir¹. Transkateter aort kapak implantasyonu (TAVI), ciddi aort stenozu tedavisini dönüştürmüş olsa da^2,3, kapak dejenerasyonunu tetikleyen hücresel ve moleküler mekanizmalar hâlâ tam olarak anlaşılamamıştır ve hastalık ilerlemesini yavaşlatacak veya geri çevirecek onaylanmış bir farmakolojik tedavi bulunmamaktadır^4,5. Kapak hastalığı araştırmalarındaki temel bir engel, inceleme yapılabilecek hastalıklı dokunun sınırlı mevcudiyetidir^6,7. İnsan aort kapağı örneklerini yeterli miktarda elde etmek zordur ve patolojik kapak değişikliklerini güvenilir şekilde yeniden oluşturan hayvan modelleri de aynı derecede nadirdir⁸. Bu boşluk, aort kapak stenozunun (AVS) hemodinamik ve histolojik özelliklerini yeniden üreten hayvan modelleri geliştirme yönündeki sürekli çabaları tetiklemiştir.

ApoE⁻/⁻ farelerde uzun süreli yüksek yağlı besleme gibi geleneksel diyet yaklaşımları 20–24 hafta gerektirmekte ve yalnızca az sayıda hayvanın kesin bir stenotik fenotip geliştirmesi nedeniyle düşük başarı oranları sunmaktadır^9,10,11,12. Honda ve arkadaşları tarafından tanımlanan kılavuz tel kaynaklı kapak hasarı modeli, karotis arter erişimi yoluyla kapak yaprakçıklarını mekanik olarak yaralayarak bu eksikliklerin çoğunu gidermiştir¹³. Orijinal teknik; karotis arter dissectionu, aort kapağına doğru retrograd kılavuz tel geçişi, tekrarlanan yaprakçık çizme ve tel rotasyonunu içererek günler içinde hızlı hemodinamik değişiklikler ve 4. haftaya kadar stabil bir stenotik fenotip oluşturur^13,14,15,16. Göreceli hızı ve doğrudanlığı nedeniyle Honda yöntemi, güncel kapak araştırmalarında yaygın olarak benimsenmiştir. Ancak, hala birkaç önemli boşluk bulunmaktadır. İşlemle ilgili tüm ayrıntılar literatürde tam olarak belgelenmemiştir, laboratuvarlar arası standardizasyon eksiktir ve bu modelde perioperatif morbiditenin temel belirleyicisi olan kanama kontrolünün rolü hiçbir zaman sistematik olarak ele alınmamıştır. Bu tutarsızlıklar tekrarlanabilirliği azaltmakta ve klinik çevrilebilirliği sınırlamaktadır.

Kanamayı kontrol altına almanın sistematik optimizasyonunun, perioperatif sağkalımı ve model güvenilirliğini anlamlı düzeyde artırabileceği hipotez edilmiştir. Bu protokol, özel olarak tasarlanmış 3D yazıcı ile üretilmiş bir vasküler destek platformu tanıtarak Honda yöntemini geliştiren, rafine edilmiş ve standardize edilmiş bir yaklaşım sunmaktadır. Cihaz, karotis arterine ayarlanabilir boylamsal gerginlik uygulanmasına olanak tanıyarak, damarı ezmeden kılavuz tel yerleştirme ve geri çekme sırasında tam ve geçici hemostaz sağlar. Bu yaklaşımla, optimize edilen protokol ile %95 oranında 24 saatlik sağkalım oranı (20 hayvanın 19'u) elde edilmiştir; sağ kalanlar arasında %94,7'si (19 hayvanın 18'i) 4. haftada önceden tanımlanmış hemodinamik başarı kriterini karşılamakta ve böylece %90'lık (20 hayvanın 18'i) bir genel model başarı oranı sağlanmaktadır. Laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği kolaylaştırmak için adım adım prosedür dokümantasyonu sağlanmıştır.

Protokol

NOT: Bu protokolde açıklanan tüm hayvan prosedürleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiş ve West China Hastanesi'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (Protokol No. 20240311055). Çalışma boyunca erkek C57BL/6 fareler (8–10 haftalık; yaklaşık 22–25 g) ve dişi C57BL/6 fareler (8–10 haftalık; yaklaşık 18–20 g) kullanılmıştır. Özel olarak 3D yazıcıyla üretilen vasküler destek platformu da dahil olmak üzere, bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler, enstrümanlar, yazılımlar ve özel cihazlar Malzemeler Tablosunda listelenmiştir.

1. Ameliyat öncesi hazırlık ve cerrahi insizyon

1. Fareyi, %100 oksijen içinde buharlaştırılmış izofluran (%3 indüksiyon için, %1,5–2 idame için) kullanarak anesteziye alın. Pedal çekilme reflekslerinin (ayak parmağı sıkıştırma) yokluğunu doğrulayarak anestezi derinliğinin yeterli olduğundan emin olun.
   UYARI: İzofluran uçucu bir anesteziktir. Aktif tahliye sistemi ile veya iyi havalandırılan bir alanda kullanın, uygun kişisel koruyucu donanım giyin ve kurumsal güvenlik prosedürlerini takip edin.
2. Her iki göze oftalmik pomad uygulayın. Fareyi, 37 °C'de tutulan sıcaklık kontrollü bir cerrahi platforma sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
3. Kimyasal tüy dökücü krem ile anterior servikal bölgedeki tüyleri temizleyerek cerrahi alanı hazırlayın.
4. Cildi, povidon-iyodür (veya klorheksidin) ve %70 alkol (veya sıcak steril salin) ile sırayla üç kez temizleyin ve işlemi antiseptik ile bitirin.
5. Preemptif lokal analjezi sağlamak amacıyla, planlanan insizyon hattı boyunca subkütan olarak %0.5 lidokain infiltre edin.
6. Ardından, mikro makas kullanarak ön boyun bölgesinde, trakeal orta hattın hafifçe sağında konumlandırılmış longitudinal bir orta hat cilt insizyonu (yaklaşık 1,0–1,5 cm) yapın.
   UYARI: Mikro makaslar, iğneler, kılavuz teller ve diğer kesici/delici aletler yaralanmaya neden olabilir. Bunları dikkatli kullanın ve kullanılmış kesici/delici aletleri onaylı tıbbi atık kutularına atın.

2. Damar izolasyonu ve sütür yerleştirme

1. Cerrahi bir stereomikroskop altında, üzerindeki fasya ve kas tabakaları küt diseksiyonla açılarak sağ ortak karotis arteri (RCCA) ortaya çıkarın. Vagus sinirinin mekanik olarak irite edilmemesine dikkat ederek, RCCA'yı bitişikteki vagus sinirinden ve çevredeki bağ dokusundan dikkatle ayırın.
   NOT: Kurumayı önlemek için işlem boyunca tükürük bezlerini ve açığa çıkan dokuları sıcak steril salin ile nemli tutun.
2. RCCA'nın distal ucunu, güvenli ve kaymayan bir düğümle bağlanan 6-0 ipek sütür ile kalıcı olarak ligasyon yapın.
3. RCCA'nın proksimal segmentinin etrafına, kılavuz tel yerleştirme sırasında daha sonra kullanılmak üzere sıkılmamış gevşek bir 6-0 ipek sütür kaydırıcı düğüm yerleştirin.

3. Platform uygulaması ve arteriyotomi

NOT: Cerrahi işlemden önce, 3D yazıcıyla üretilen platformu etilen oksit (EtO) gazı kullanarak sterilize edin, ardından yeterince havalandırın ve tüm metal cerrahi aletleri otoklavlayarak sterilize edin.

DİKKAT: Etilen oksit toksik, yanıcı ve kansirojendir. EtO sterilizasyonunu yalnızca onaylanmış tesislerde uygulayın, yeterli havalandırma sağlayın ve kurumsal atık yönetimi prosedürlerini takip edin.

1. 3B yazıcıyla üretilmiş vasküler destek platformunu, ters V şeklindeki apeksi doğrudan damarın altına gelecek şekilde, izole edilmiş RCCA segmentinin altına dikkatlice yerleştirin.
2. Önceden yerleştirilmiş süturları kademeli olarak daha yüksek yan çentiklere geçirerek, RCCA üzerindeki boylamsal gerginliği artırmak için platformu yavaşça ayarlayın.
   NOT: Ters V şeklindeki apeks, damar duvarını ezmeden damarın eğimine uyum sağlaması için 120° açıyla tasarlanmıştır. Arteriyel pulsasyonun artık görsel olarak algılanamadığı tam noktada gerginliği artırmayı durdurun. Bu kritik görsel bitiş noktası, aşırı damar hasarı oluşmadan geçici hemostazı sağlar.
3. Mikro makas kullanarak stabilize edilmiş RCCA segmenti üzerinde küçük bir transvers arteriyotomi (damar çevresinin yaklaşık yarısı kadar) yapın. Gerginlik doğru ayarlanmışsa, minimal düzeyde kanama olmalı veya hiç kanama olmamalıdır.

4. Kılavuz tel yerleştirme ve kapak hasarı

1. Mikroskobik görüntüleme altında, kılavuz teli (0,014 inç / 0,36 mm çap) transvers arteriotomi üzerinden arter lümenine, aort köküne doğru retrograd yönde yerleştirin.
   NOT: Bu kalibre, yayınlanmış kılavuz tel yaralanma modelleri için standarttır ve fare RCCA lümen çapına (~0,4–0,5 mm) yakındır; bu da yaklaşık 0,7–0,9 oranında bir kılavuz tel-damar oranı sağlar.
   UYARI: Kılavuz tel damarları veya çevre dokuları delinebilir. Görüntüleme altında yavaşça ilerletin ve kullanılmış kılavuz telleri kesici/delici aletler veya kontamine cerrahi atıklar olarak bertaraf edin.
2. Yerleştirme bölgesinde tam hemostaz sağlamak için önceden yerleştirilmiş proksimal kayıcı düğümü hem damarın hem de kılavuz telin etrafında sıkın. Kayıcı düğüm sabitlendiğinde, 3D yazıcıyla üretilmiş platformu damarın altından dikkatlice kaldırın.
   NOT: Yerleştirme sırasında beklenmedik kanama meydana gelirse veya kılavuz tel çapı aşırı sürtünme yaratırsa, hemostaza yardımcı olmak için platformu geçici olarak yeniden konumlandırın veya yerleştirmeyi tekrar denemeden önce damar lümeninin genişlemesine izin vermek için platform gerginliğini hafifçe azaltın.
3. Kılavuz teli dikkatlice RCCA üzerinden retrograd yönde, aort arkını geçerek aort kapağına doğru ilerletin. Gerçek zamanlı ekokardiyografik rehberlik altında, kılavuz tel ucunun aort kapağını geçtiğini ve sol ventriküle girdiğini onaylayın.
4. Hemostazı sürdürmek için proksimal kayıcı düğüm tamamen sıkılıyken, aort kapak boyunca 100 kez itme-çekme (ileri-geri) hareketi ve ardından kılavuz telin kapak yapraklarına karşı 100 kez rotasyonel hareketi uygulanarak mekanik kapak yaralanmasını gerçekleştirin.
   NOT: 100 itme-çekme ve 100 rotasyonel hareket, işlem süresi ile hemodinamik olarak anlamlı stenozun güvenilir şekilde indüklenmesi arasındaki dengeyi en iyi sağlayan sayılar olarak kurum içi kapsamlı optimizasyonlar aracılığıyla belirlenmiştir.

5. Kılavuz telin geri çekilmesi ve yaranın kapatılması

1. Kapak yaralaması tamamlandığında, kılavuz teli damardan yavaşça geri çekin.
2. Proksimal RCCA'yı bağlamak ve işlem sonrası kanamaları önlemek için proksimal kayıcı düğümü derhal kalıcı, kaymayan bir düğüme dönüştürün.
3. Cilt insizyonunu kesikli 5-0 naylon sütürler veya cerrahi yara klipsleri ile kapatın.
4. Ameliyat sonrası non-steroid anti-inflamatuar ilaçlar (NSAİİ) uygulamayın. İşlem aseptik koşullar altında gerçekleştirildiğinden, peroperatif antibiyotik uygulamayın.
5. Hayvanı temiz ve ısıtılmış bir iyileşme kafesine transfer edin ve tam mobilite geri kazanılana kadar sürekli olarak izleyin.

6. Transvalvüler hemodinamiklerin ekokardiyografik değerlendirmesi

1. Aort kapak stenozunun şiddetini değerlendirmek için cerrahiden 4 hafta sonra hayatta kalan tüm farelerde ekokardiyografik değerlendirmeler gerçekleştirin.
2. Hayvanı %100 oksijen içinde %3 izofluran içeren bir indüksiyon haznesine yerleştirerek anesteziyi indükleyin. Ped reaksiyonlarının kaybını doğrulayarak anestezik derinliği teyit edin. Anterior göğüs duvarındaki kılları kimyasal tüy dökücü krem kullanarak temizleyin. Kornea kurumasını önlemek için her iki göze oftalmik pomad uygulayın.
3. Anestezi altındaki fareyi sırtüstü pozisyonda sıcaklık ayarlı bir görüntüleme platformuna transfer edin.
4. Sürekli kalp hızı izlemesi için patileri yüzey elektrokaridiyogram (EKG) elektrotlarına sabitleyin. 450–550 atım/dakika değerinde stabil bir fizyolojik kalp hızı sağlamak için izofluran konsantrasyonunu (tipik olarak %1,0–1,5) titre edin.
5. Anterior göğüs duvarını temizleyin ve bol miktarda önceden ısıtılmış akustik kuplaj jeli uygulayın.
6. B-mod görüntüleme alımı
   1. MX550D transdüserli (40 MHz) bir Vevo 3100 ultrason sistemi kullanarak, canlı iki boyutlu görüntülemeyi başlatmak için B-Mode kontrolüne basın.
   2. Sol ventrikül, aort kapak ve çıkan aortun parasternal uzun eksen görünümünü elde etmek için transdüseri sol parasternal pozisyona yerleştirin. Derinlik, genişlik ve 2D kazancı optimize edin.
7. M-mod alımı ve sol ventrikül ölçümü
   1. Parasternal uzun eksen görünümünden M-Mode kontrolüne basın. Örnekleme hattını papiller kas seviyesinde sol ventrikül boyunca konumlandırın.
   2. Alımı başlatmak için Start düğmesine basın. En az üç kalp döngüsünü kapsayan stabil bir iz elde edildiğinde Save düğmesine basın.
   3. Vevo LAB'da, end-diyastol ve end-sistoldeki endokardiyumu izlemek için LV Trace aracını kullanın; sol ventrikül internal boyutlarını, anterior ve posterior duvar kalınlıklarını (LVAWd, LVPWd) ve sol ventrikül kütlesini kaydedin.
8. Özel bir aort arkı görünümü elde etmek için transdüserin konumunu ve açısını yeniden ayarlayın.
   ​NOT: Bu spesifik aort arkı görünümünün elde edilmesi, ultrason ışınının aort kapaktaki kan akış yönüyle optimal şekilde hizalanmasını sağladığından, doğru transvalvüler hız ölçümleri için gereklidir.
9. Renkli Doppler değerlendirmesi
   1. Aort arkı görünümünden Color kontrolüne basın. Renk kutusunu aort kapak ve proksimal çıkan aort üzerine yerleştirin.
   2. Sistolik jetin aliasing olmadan net bir şekilde görünmesi için renk ölçeğini ve kazancı ayarlayın. Start, ardından Save düğmesine basın.
10. Atımlı dalga Doppler hız ölçümü
    1. PW Doppler kontrolüne basın. Örnek hacim kapısını jetin en dar noktasına (vena contracta) yerleştirin ve açı düzeltmesi uygulayın (<60°).
    2. Spektral izi başlatmak için Start düğmesine basın; en az üç kalp döngüsü kaydedildiğinde Save düğmesine basın. Vevo LAB'da, en az üç döngünün ortalamasını alarak Peak Velocity aracıyla pik transvalvüler hızı ölçün.

7. Histolojik işlem ve aort kökü boyama

1. Ekokardiyografik değerlendirmenin ardından, pedal geri çekilme refleksinin tamamen yok olduğunu doğrulayarak derin anesteziyi onaylayın. AVMA Hayvanların Ötanazisi Kılavuzları (2020 edisyonu) ve kurumsal olarak onaylanmış protokollere uygun olarak, ikincil ötanazi yöntemi olarak servikal dislokasyon gerçekleştirin.
   DİKKAT: Hayvan kadavraları, çıkarılan dokular ve kana kontamine olmuş materyaller biyolojik/hayvansal atıklardır. Bunları kurumsal biyogüvenlik ve hayvan tesisi düzenlemelerine göre bertaraf edin.
2. Kalbi açığa çıkarmak için cerrahi mikro makas kullanarak torakotomi gerçekleştirin.
3. Sol ventrikül apeksine bir perfüzyon iğnesi yerleştirin ve sistemik dolaşımı soğuk steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Başarılı perfüzyon, karaciğer ve akciğerlerin beyazlamasıyla anlaşılır.
4. Sağlam kalbi çıkarın ve tam fiksasyonu sağlamak için oda sıcaklığında en az 24 saat boyunca %4 paraformaldehit (PFA) içinde bekletin.
   DİKKAT: Paraformaldehit toksik ve irite edicidir. %4 PFA'yı uygun KKD ile kimyasal çeker ocak içinde kullanın ve PFA atıklarını tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edin.
5. Fikse edilmiş dokuyu, kademeli etanol serisi aracılığıyla ardışık dehydrasyon, ardından ksilenle şeffaflaştırma ve 65 °C'de parafin mumu infiltrasyonu için otomatik bir doku işlemciye aktarın.
   DİKKAT: Ksilen yanıcı ve toksiktir; sıcak parafin yanıklara neden olabilir. Ksileni bir çeker ocakta veya onaylanmış bir işlemcide kullanın ve ksilen içeren atıkları tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edin.
6. İşlenmiş kalpleri parafin bloklara gömün.
   NOT: Gömme sırasında kalbin doğru yönlendirilmesi kritiktir. Kalbi, aort kökünden üç valf yaprağı seviyesinde transvers kesit alınmasına izin verecek şekilde konumlandırın.
7. Rotary mikrotom kullanarak, üç yaprağın da kapsandığından emin olarak, aort kapak düzlemi boyunca 4–5 µm kalınlığında seri çapraz kesitler alın. Kesitleri cam lamlara monte edin ve oda sıcaklığında saklayın.
8. Doku morfolojisini, yapısal yeniden şekillenmeyi ve kapak yaprağı kalınlığını değerlendirmek için seçili lamlarda Hematoksilin ve Eozin (H&E) boyaması yapın.
9. Kapak yaprakları içinde koyu kahverengi-siyahtaki mineral çökelmeleri olarak tanımlanabilen distrofik kalsifikasyonu tespit etmek ve miktarlamak için komşu seri kesitlerde Von Kossa boyaması yapın.

8. Şam cerrahi prosedürü

NOT: Bu bölüm Sham kontrol prosedürünü tanımlamaktadır. Sham fareler; aynı anestezi, cilt hazırlığı, damar açığa çıkarma, arteriyotomi ve retrograd kılavuz tel yerleştirme işlemlerinden aortik tel yaralanması (AWI) grubuyla aynı şekilde geçerler; kılavuz tel supravalvüler seviyeye kadar ilerletilir ancak aort kapağından geçirilmez ve herhangi bir mekanik kapak yaralanması gerçekleştirilmez.

1. Fareyi anesteze edin ve 1.1. ile 1.5. arasındaki adımlarda açıklandığı şekilde cerrahi alanı hazırlayın.
2. Stereomikroskobik görüntüleme altında, 2.1. adımda açıklandığı gibi künt diseksiyonla RCCA'yı açığa çıkarın.
3. RCCA'nın distal ucunu 6-0 ipek süturla kalıcı olarak bağlayın ve proksimal kısma gevşek bir kayıcı düğüm yerleştirin (2.2–2.3. adımlarda olduğu gibi).
4. 3.1–4.2. adımlarda açıklandığı şekilde transvers arteriyotomi gerçekleştirin ve kılavuz teli yerleştirin.
5. Ekokardiyografik rehberlik altında, kılavuz teli retrograd yönde asendan aortun supravalvüler seviyesine kadar ilerletin ve kılavuz tel ucunun aort kapağını GEÇMEDİĞİNİ doğrulayın.
   NOT: 4.4. adımda açıklanan itme-çekme veya rotasyonel kapak yaralama hareketlerini YAPMAYIN. Kılavuz teli geri çekin ve 5.1–5.2. adımlarda açıklandığı gibi proksimal RCCA'yı derhal bağlayın.
6. Cilt insizyonunu kesikli 5-0 naylon süturlar veya yara klipsleri ile kapatın.
   NOT: AWI grubunda olduğu gibi, intraoperatif analjezi lokal lidokain infiltrasyonu ile sağlanır (adım 1.5). Hayvanı ısıtılmış bir iyileşme kafesine alın ve tamamen hareketli hale gelene kadar izleyin.
7. Sham fareleri, AWI grubuyla aynı şekilde post-operatif izlemeye, 4. haftada ekokardiyografik değerlendirmeye ve histolojik işlemlere tabi tutun.

9. İstatistiksel analiz ve çalışma tasarımı

1. Çalışma boyunca, 20 fare (10 erkek, 10 dişi) AWI prosedürüne, 6 C57BL/6 fare (3 erkek, 3 dişi) ise Sham prosedürüne tabi tutulmuştur.
2. Hayatta kalan tüm hayvanlarda (19 AWI, 6 Sham) pik transvalvüler hızı (model başarısını tanımlayan kriter) ölçün.
3. Önceden belirlenmiş, cinsiyet dengeli 6 AWI fareden oluşan bir alt grupta (3 erkek, 3 dişi) detaylı ekokardiyografik ve histolojik indeksleri analiz edin.
4. Tüm ekokardiyografik ve histolojik ölçümlerin, grup atamalarına karşı körlemiş araştırmacılar tarafından gerçekleştirildiğinden emin olun.
5. Parametrik testlerden önce verilerin normalliğini Shapiro-Wilk testi ile değerlendirin. İki bağımsız grubu (AWI ve Sham) eşleştirilmemiş iki kuyruklu Student's t-testi kullanarak karşılaştırın.
6. Sağkalım verilerini Kaplan-Meier yöntemiyle analiz edin ve görüntüleyin.
7. Tüm analizleri GraphPad Prism'de gerçekleştirin. Verileri ortalama ± SEM olarak sunun ve p < 0.05 değerini istatistiksel olarak anlamlı kabul edin.

Sonuçlar

Kanamayı kontrol etmek için 3B yazıcıyla üretilmiş bir platformun geliştirilmesi

Geleneksel kılavuz tel ile indüklenen AVS modelinde morbidite ve mortalitenin temel kaynağı olan perioperatif hemorajiyi önlemek amacıyla, 3 boyutlu yazıcıyla üretilmiş bir vasküler destek platformu tasarlanmıştır (Şekil 1). Platform, biyouyumlu (USP Sınıf VI / ISO 10993 uyumlu) bir fotopolimer reçine kullanılarak stereolitografi (SLA) baskı yöntemiyle 1,07 mm yapısal kalınlıkta üretilmiştir. Baskı sonrası parçalar, kürlenmemiş reçineyi temizlemek için izopropil alkol ile yıkanmış ve ultraviyole ışık altında son kürleme işlemine tabi tutulmuştur. Platformun standart SLA sistemlerinde yeniden üretilebilmesi için tasarım dosyasının tamamı (.stp) sağlanmıştır. Platform, izole edilmiş sağ ortak karotis arterinin eğimine uygun, aşırı duvar kompresyonuna neden olmayan 120° tepe açısına sahip ters V şeklinde bir apikal yüzeye sahiptir (Şekil 1A–B). Çok sayıda kademeli yan çentik (Şekil 1C–D) operatörün önceden yerleştirilmiş süturları tutmasına ve damara ayarlanabilir boylamsal gerginlik uygulamasına olanak tanır. Gerginlik, arteriyel pulsasyon görünmez olana kadar artırılır; bu görsel bitiş noktası, yeterli geçici hemostazın sağlandığını gösterir. Bu yaklaşım, vasküler duvarın aşırı ezilme hasarına uğramasını önlerken arteriyotomi ve kılavuz tel yerleşimi için stabil bir cerrahi alan sağlar.

Kılavuz tel yerleşiminin intraoperatif doğrulanması

Kılavuz telin doğru yerleşimi, prosedür sırasında iki aşamada doğrulanmıştır. İlk olarak, doğrudan stereomikroskobik görüntüleme altında, kılavuz telin transvers arteriyotomiden retrograd yönde RCCA lümenine girdiği gözlemlenmiştir (Şekil 2A). İkinci olarak, gerçek zamanlı ekokardiyografik görüntüleme, kılavuz tel ucunun aort kapağını geçtiğini ve sol ventriküle girdiğini doğrulamıştır. B-mod görüntüleme, kılavuz teli aort kapak düzlemini geçen hiperekoik lineer bir artefakt olarak tanımlamıştır (Şekil 2B). Renkli Doppler görüntüleme, aort kapak seviyesinde lokalize türbülanslı akış göstermiş ve kılavuz telin kapak yaprakçıkları boyunca konumlandırmasına ek onay sağlamıştır (Şekil 2C; Ek Video 1).

Perioperatif sağkalım ve model başarı oranı

Gerginliği ayarlanabilir platformun cerrahi iş akışına entegrasyonu, yüksek erken sağkalım oranıyla sonuçlanmıştır. Kaplan-Meier analizi, cerrahi sonrası 24. saatte %95'lik bir sağkalım oranı göstermiştir (20 fareden 19'u; Şekil 3A). Hayatta kalan tek hayvanın post-mortem incelemesi sonucunda majör kanama, yapısal hasar veya kardiyak iskemiye dair hiçbir kanıt saptanmamış olup, bu durum ölümün cerrahi travmadan ziyade anesteziyle ilişkili komplikasyonlara bağlanabileceğini düşündürmektedir. 4. haftadaki model başarısı, önceden tanımlanmış bir kriter kullanılarak değerlendirilmiştir: destekleyici histolojik bulgularla birlikte, transvalvüler pik akış hızının 2.000 mm/s değerini aşması. Hayatta kalan 19 hayvanın 18'i (%94,7) bu eşiği karşılamış ve toplam kohort genelinde %90'lık bir genel model başarı oranı elde edilmiştir (20 fareden 18'i; Şekil 3B). Sonuçlar cinsiyetler arasında benzerdir: 24 saatlik sağkalım erkeklerde 10'da 9, dişilerde ise 10'da 10 olarak gerçekleşmiş ve 4 haftalık model başarı oranı her iki cinsiyette de 10'da 9 (%90) olmuştur; tek perioperatif ölüm erkek (anesteziyle ilişkili) hayvanda, tek model başarısızlığı ise hayatta kalan bir dişi hayvanda görülmüştür.

Aort darlığının ekokardiyografik doğrulanması

Ameliyat sonrası 4. haftada yapılan transtorasik ekokardiyografi, AWI grubunda şiddetli aort darlığı ile uyumlu hemodinamik değişiklikleri doğrulamıştır. Kantitatif ekokardiyografik değerler ortalama ± ortalama standart hata (SEM) olarak sunulmuştur; sol ventrikül fonksiyonel ve yeniden şekillenme parametreleri 6 Sham ve 6 AWI faresinde analiz edilirken, peak transvalvüler hız hayatta kalan tüm AWI farelerinde ve Sham kontrollerinde ölçülmüştür (n = 19 AWI, n = 6 Sham). 4. haftada sol ventrikül ejeksiyon fraksiyonu AWI grubunda Sham kontrollerine göre hafifçe daha düşüktü (56.21 ± 1.15% vs. 61.57 ± 2.12%; p = 0.0503; Şekil 3C), ancak bu fark istatistiksel anlamlılığa ulaşmamıştır. Pulsed-wave Doppler kayıtları, AWI grubunda transvalvüler jet hızında belirgin bir artış olduğunu ve Sham kontrol grubundaki 988.00 ± 126.24 mm/s değerine kıyasla 2740.89 ± 104.10 mm/s değerine ulaştığını göstermiştir (Şekil 3D). Kantitatif analiz, AWI grubunda peak transvalvüler jet hızının Sham kontrollerine kıyasla oldukça anlamlı düzeyde arttığını doğrulamıştır (p < 0.0001; Şekil 3E). Basınç yüklenmesi adaptasyonunun erken bir evresi ile uyumlu olarak, AWI grubu konsantrik sol ventrikül yeniden şekillenmesi sergilemiştir: diyastolik ön duvar kalınlığı anlamlı derecede artmıştır (LVAWd 1.14 ± 0.02 vs. 0.96 ± 0.03 mm; p = 0.0016; Şekil 3F), öte yandan diyastolik arka duvar kalınlığı ve sol ventrikül kütlesi daha yüksek olmasına rağmen istatistiksel anlamlılığa ulaşmamıştır (LVPWd 1.01 ± 0.12 vs. 0.76 ± 0.02 mm, p = 0.0650, Şekil 3G; LV kütlesi 124.51 ± 10.63 vs. 104.47 ± 2.45 mg, p = 0.0961, Şekil 3H).

Valvüler yeniden şekillenme ve kalsifikasyonun histopatolojik doğrulaması

Aort köklerinin histolojik incelemesi, ekokardiyografik bulguları doğrulamıştır. Kantitatif histolojik değerler ortalama ± SEM olarak sunulmuş olup 6 Sham ve 6 AWI farede analiz edilmiştir. AWI grubundaki H&E boyaması, Sham kontrollerinde görülmeyen belirgin yaprak kalınlaşması ve yapısal organizasyon bozukluğu özelliklerini ortaya çıkarmıştır (Şekil 3I). Kantitatif morfometri, AWI grubunda ortalama kapak yaprağı kalınlığında Sham grubuna kıyasla anlamlı bir artış olduğunu doğrulamıştır (p < 0.0001; Şekil 3J). Von Kossa boyaması, AWI grubunun kalınlaşmış kapak yaprakları içinde, koyu kahverengi-siyah mineral birikintileri olarak tanımlanan yaygın distrofik kalsifikasyonu göstermiştir. Sham kontrolleri ihmal edilebilir düzeyde mineral birikimi sergilemiştir (Şekil 3K). Kantitatif görüntü analizi, AWI grubunda Sham kontrollerine kıyasla toplam kalsifikasyon alanında (µm²) anlamlı bir artış olduğunu ortaya koymuştur (p < 0.0001; Şekil 3L).

Şekil 1: Dört farklı görünümde gösterilen 3B yazıcıyla üretilmiş vasküler destek platformunun tasarımı. (A) Ön-sol eğik görünüm. (B) Arka-sağ eğik görünüm. (C) Platformun genel boylamsal geometrisinin lateral profil görünümü. (D) Ters V şeklindeki apeks bölgesini vurgulayan açılı görünüm. Bileşen etiketleri: 110, platform gövdesi; 120, lateral kollar; 121, kademeli yan çentikler; 130, çalışma ucu; 140, ters V şeklindeki yerleştirme apeksi; 150, damarla temas eden destek yüzeyi; 160, bitişik çentikler arasındaki geçiş eğimi; 190, sağ ortak karotis arteri (RCCA). Platform, biyouyumlu fotopolimer reçineden imal edilmiştir (yapısal kalınlık: 1.07 mm). 3B yapısal çizim, yazarlar tarafından vasküler destek platformunun orijinal CAD tasarım dosyası (.stp) kullanılarak, ücretsiz ve açık kaynaklı bir CAD görselleştirme ve modelleme yazılımı olan FreeCAD ile oluşturulmuştur. Üçüncü taraf bir yayın veya telif hakkı olan bir çizim uyarlanmamıştır. Orijinal CAD tasarım dosyası ek dosya olarak sunulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kılavuz tel yerleşiminin intraoperatif ve ekokardiyografik doğrulaması. (A) Doğrudan stereomikroskobik görüntüleme altında, transvers arteriotomi aracılığıyla sağ ortak karotis arterine (RCCA) lümenine kılavuz telin (ok) retrograd yerleşimini gösteren intraoperatif fotoğraf. (B) Kılavuz telin (hiperekoik lineer artefakt olarak tanımlanmıştır; ok) aort kapağını geçerek sol ventriküle girdiğini gösteren B-mod ekokardiyografik görüntü. (C) Aort kapağı düzeyinde lokalize türbülanslı akımı gösteren ve kılavuz telin kapak yaprakçıkları boyunca yerleşimini doğrulayan renkli Doppler ekokardiyografik görüntü. Kılavuz tel yerleşimi sırasında transvalvüler akımın gerçek zamanlı Renkli Doppler görüntülemesi Ek Video 1'de gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Optimize edilmiş aortik tel yaralanması (AWI) modelinin sağkalım, hemodinamik, ventriküler remodeling ve histopatolojik sonuçları. (A) AWI farelerinin (n = 20) 24 saatlik Kaplan-Meier sağkalım eğrisi. (B) AWI grubunda 4. haftadaki model başarısı (kırmızı) ve başarısızlığı (siyah) (n = 20); başarı, pik transvalvüler hızın > 2,000 mm/s olması olarak tanımlanmıştır. (C) Ejeksiyon fraksiyonu (EF; p = 0.0503). (D) Sham (sol) ve AWI (sağ) faresinden alınan temsili pulsed-wave (PW) Doppler ekokardiyogramlar. (E) Pik transvalvüler hız (n = 19 AWI, n = 6 Sham; p < 0.0001). (F) Diyastolik sol ventrikül anterior duvar kalınlığı (LVAWd; p = 0.0016). (G) Diyastolik sol ventrikül posterior duvar kalınlığı (LVPWd; p = 0.0650). (H) Sol ventrikül kütlesi (p = 0.0961). (I) Temsili HE boyalı aort kökü kesitleri (Sham, sol; AWI, sağ). (J) Aort kapağı yaprakçık kalınlığı (p < 0.0001). (K) Temsili Von Kossa boyalı aort kökü kesitleri (Sham, sol; AWI, sağ). (L) Toplam kalsiyum birikim alanı (µm²; p < 0.0001). Ölçek çubukları = 500 µm. Tüm kantitatif sütun grafikleri için sütunlar ortalama değerleri, hata çubukları ise ortalamanın standart hatasını (SEM) temsil etmektedir. C, E–H, J ve L panellerindeki Sham ve AWI grupları arasındaki kantitatif karşılaştırmalar, eşleştirilmemiş çift kuyruklu Student’s t-testi kullanılarak yapılmıştır. Panel E'deki pik transvalvüler hız hariç (tüm sağ kalan AWI fareleri ve Sham kontrollerinde ölçülmüştür; n = 19 AWI, n = 6 Sham), kantitatif veriler Sham ve AWI gruplarından alınmıştır (grup başına n = 6). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 1: Kılavuz tel yerleştirme sırasında transvalvüler kan akışının renkli Doppler ekokardiyografik görüntülemesi. Video, AWI prosedürü sırasında aort kapağı seviyesindeki gerçek zamanlı Renkli Doppler görüntülemesini göstermekte ve kapak yaprakları boyunca kılavuz tel yerleştirmesinin neden olduğu lokalize türbülanslı akışı sergilemektedir. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tartışma

Bu protokol, aort darlığının stabil ve güvenli bir hayvan modelinin ayrıntılı bir açıklamasını sunmaktadır. Bu yaklaşımın bir özelliği, kılavuz telin ortak karotis arterine yerleştirilmesini kolaylaştıran yardımcı bir platformdur. Platform, biyouyumlu bir fotopolimer reçineden (yapısal kalınlık 1.07 mm) stereolitografi (SLA) baskı ile üretilmiştir ve 120° apeks açısına sahip ters V şeklinde bir apikal yüzey içerir; eksiksiz tasarım dosyası ek bir .stp dosyası olarak ücretsizce sunulmuştur. Bu cihaz, kılavuz telin sorunsuz girişini sağlar, perioperatif kan kaybını objektif olarak kontrol eder ve böylece model farelerin hem kısa hem de uzun vadeli sağkalımını korur. İlk tanımlamadan bu yana, kılavuz tel ile oluşturulan model, hafiften ağıra kadar darlığı üretmek için yaralanma yoğunluğunu ayarlayan dereceli şiddet varyantları¹⁷ ve perioperatif komplikasyonlarını belgeleyen güncel raporlar¹⁸ dahil olmak üzere daha da geliştirilmiş ve karakterize edilmiştir; mevcut protokol, perioperatif hemorajiyi sistematik olarak ele alarak bu çalışmalar üzerine inşa edilmiştir.

Bu protokoldeki birkaç adım, modelin başarılı bir şekilde indüklenmesi için kritik öneme sahiptir ve özel dikkat gerektirir. İlk olarak, 3D yazıcıyla üretilen platform aracılığıyla uygulanan boylamsal gerginlik derecesi hassas bir şekilde kalibre edilmelidir: gerginlik, arteriyel pulsasyon görsel olarak fark edilemez hale gelene kadar artırılmalıdır. Yetersiz gerginlik, arteriyotomi sırasında kanamanın devam etmesine yol açarken, aşırı gerginlik endotel hasarı ve damar yırtılması riskini doğurur. İkinci olarak, platform çıkarılmadan önce proksimal kaydırak düğüm, hem damarın hem de kılavuz telin etrafında güvenli bir şekilde sıkılmalıdır; kaydırak düğümün yetersiz şekilde sabitlendiği durumlarda platformun erken çıkarılması, prosedür sırasında meydana gelen hemorajinin en yaygın nedenidir. Üçüncü olarak, kılavuz telin sol ventriküle girişinin ekokardiyografik rehberlik altında doğrulanması esastır. Bu doğrulama adımı olmadan, operatör kılavuz telin aort kapağında doğru konumlandırıldığından emin olamaz ve yetersiz yaralanma modelin başarısızlığıyla sonuçlanır.

Bazı yaygın komplikasyonlar öngörülebilir ve yönetilebilir. Kılavuz tel yerleştirme sırasında kanama meydana gelirse, işleme devam etmeden önce geçici hemostazı yeniden sağlamak için platform damarın altına yeniden konumlandırılmalıdır. Daha küçük çaplı karotis arterleri olan hayvanlarda, platform gerginliğini hafifçe azaltmak, kılavuz tele yer açmak için damar lümenini genişletebilir. Sonuçlar yorumlanırken dikkate alınması gereken birkaç sınırlama mevcuttur. Mekanik tel yaralanması, insan kalsifik aort darlığını karakterize eden kronik, lipid odaklı dejeneratif süreçten farklı olarak, akut mekanik ve inflamatuar kapak yaralanmasına yol açar^17,19,20,21. Sonuç olarak, histolojik özellikler —yaprak kalınlaşmasını ve distrofik kalsifikasyonu yeniden üretse de— insan hastalığının tüm moleküler olaylarını tam olarak yansıtmayabilir. Protokol, 8–10 haftalık hem erkek hem de dişi C57BL/6 farelerde geliştirilmiş ve doğrulanmıştır; ancak diğer suşlara veya yaşlı hayvanlara uygulanabilirliği bağımsız doğrulama gerektirir. Karotis arteri çapı ve kardiyak anatomideki cinsiyete bağlı farklılıklar, cerrahi zorluğu ve hemodinamik sonuçları etkileyebilir; araştırmacıların sonraki analizlerde cinsiyeti biyolojik bir değişken olarak rapor etmeleri önerilir²². Ek olarak, sağ ortak karotis arterin kalıcı ligasyonu prosedürün doğasında vardır; farelerde Willis halkası kollateral serebral perfüzyon sağlasa ve belirgin nörolojik defisitler gözlemlenmese de, hafif bilişsel veya serebrovasküler etkiler dışlanamaz. Bazal (prosedür öncesi) ekokardiyografi yapılmamıştır; eş zamanlı sham grubu, normal kapak fonksiyonu için kontrol olarak kullanılmıştır ve hayvan içi karşılaştırma yapabilmek ve C57BL/6 farelerde bildirilen nadir spontan aort kapak anomalilerini (~modifiye edilmemiş suşlarda %0,3) taramak için mümkün olan yerlerde bazal tarama önerilir. Aort yetmezliği bu çalışmada sistematik olarak değerlendirilmemiştir; yaralanma kaynaklı aort yetmezliğinin sıklığı ve stenoz şiddeti ile ilişkisi özel bir değerlendirmeyi gerektirmektedir ve gelecek çalışmalarda ele alınacaktır.

Platformun potansiyel dezavantajları da göz önünde bulundurulmalıdır. Cihaz, karotis arter boyunca uzanan vagus siniri dahil olmak üzere komşu yapıları mekanik olarak irite edebilir; bu risk, platformun yuvarlatılmış, küt kenarları, damara uyumlu 120° apeksi ve kısa uygulama süresi ile minimize edilmiştir ve bu çalışmada cihaza atfedilebilecek herhangi bir solunum anomalisi veya diğer belirgin komplikasyonlar gözlemlenmemiştir. Yerleşik alternatif yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, bu optimize edilmiş protokol birkaç pratik avantaj sunmaktadır. ApoE⁻/⁻ farelerdeki diyet modelleri 20–24 haftalık yüksek yağlı besleme gerektirir ve değişken stenotik fenotipler oluşturur; birçok hayvan hemodinamik olarak anlamlı bir hastalık geliştirmez. Mevcut protokol, %90'lık bir genel başarı oranıyla (20 hayvandan 18'i) 4 hafta içinde tutarlı bir stenotik fenotip üretmektedir. Orijinal Honda kılavuz tel yöntemiyle karşılaştırıldığında, bu protokolün temel ilerlemesi, 3D baskılı platform aracılığıyla perioperatif kanamanın sistematik kontrolüdür.

Kılavuz tel yerleştirme sırasında meydana gelen kanama, orijinal tekniğin bir komplikasyonu olarak kabul edilmiş ancak üzerinde yeterince durulmamıştır. Aynı laboratuvarın konvansiyonel (platform öncesi) prosedürle ilgili retrospektif deneyiminde (400'den fazla vaka), vakaların tahminen ~%40'ında majör intraoperatif kanama meydana gelmiş; kanama sonrası mortalite ~%60 ve 24 saatlik sağkalım ~%75 olarak görülmüştür. Bu vakalarda perioperatif ölümlerin neredeyse tamamı, temel olarak karotid erişim bölgesindeki kanamalardan kaynaklanmıştır. Bu durum, bu modelde perioperatif ölümün temel nedeni olarak karotid ponksiyon bölgesi kanamasını tanımlayan Qian ve ark. ile tutarlıdır. 3D yazıcıyla üretilen platform, kan kaybını kontrol altına alarak 24 saatlik sağkalımı %95'e çıkarmış ve mevcut kohortta kanamaya bağlı herhangi bir ölüm gözlenmemiştir. Kanama artık sınırlayıcı bir sorun olmadığı için, dereceli stenoz şiddeti oluşturmak amacıyla mekanik yaralanmanın yoğunluğu değiştirilebilir. Bu ayarlanabilirlik doğrudan translasyonel öneme sahiptir: sınırlı etki büyüklüğüne sahip aday terapötikler için, daha hafif bir modelde gizli kalabilecek tedaviye bağlı farklılıkları ortaya çıkarmak adına daha şiddetli bir bazal yaralanma gerekli olabilir.

Bu model, çeşitli alt araştırma kategorileri için oldukça uygundur. Stenotik fenotip tanımlanmış ve tekrarlanabilir bir zaman dilimi içinde geliştiği için, kapak kalsifikasyonunu veya fibrozisini yavaşlatmayı amaçlayan aday farmakolojik tedavilerin preklinik değerlendirmesi için bir platform görevi görebilir²³. Model aynı zamanda genetik yaklaşımlarla da uyumludur: protokol, belirli sinyal yolaklarının kapak hastalığı ilerlemesine olan katkısını incelemek amacıyla C57BL/6 arka planlı transgenik veya nakavt farelere uygulanabilir. Ayrıca, 4 haftalık bitiş noktası, hastalığın evriminin veya tedavi yanıtının seri ekokardiyografik takibi için pratik bir pencere sunar. 3B yazıcı platform tasarım dosyaları ek bir .stp dosyası olarak ücretsizce paylaşılabilir ve bu cihazın laboratuvarlar arası standartlaştırılmasının, merkezler arası tekrarlanabilirliği daha da artıracağı öngörülmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
3B yazdırılmış vasküler destek platformu	Özel yapım	N/A	Özel 3B yazdırılmış vasküler destek platformu; .stp formatında tamamlayıcı CAD dosyası sağlanmıştır.
%4 Paraformaldehit	Servicebio	G1101-3ML	Doku fiksasyonu
5-0 naylon sütür	Jinhuan Medical	F503	Kesintili sütürlerle cilt kapatma
6-0 ipek sütür	Jinhuan Medical	RC411	Distal RCCA'nın kalıcı ligasyonu ve proksimal kayıcı düğüm
Akustik kuplaj jeli (önceden ısıtılmış)	Keppler	KL-250	Ekokardiyografi
Biyouyumlu fotopolimer reçine	Formlabs	RS-F2-BMCL-01	Özel 3B yazdırılmış vasküler destek platformunu üretmek için kullanılan SLA baskı malzemesi.
C57BL/6 fareler (8–10 haftalık; erkekler 22–25 g, dişiler 18–20 g)	GemPharmatech	C57BL/6	Süreç boyunca her iki cinsiyet kullanılmıştır; standart koşullar altında barındırılmıştır
Etilen oksit gazı	Kurumsal sterilizasyon tesisi	N/A	Özel 3B yazdırılmış vasküler destek platformunun sterilizasyonu.
FreeCAD	FreeCAD Project Association	1.1.1	CAD görselleştirme ve .stp dosyasından 3B yapısal çizimin oluşturulması.
GraphPad Prism	GraphPad Software	9.0	İstatistiksel analiz ve grafik çizimi
Kılavuz tel, 0,014 inç çapında	Boston Scientific	H749393071900	Mekanik aort kapak hasarı
Hematoksilen ve Eozin (H&E) boyama kiti	Beyotime	C0105S	Yaprakçık morfolojisi ve kalınlığı
İzofluran	RWD Life Science	R510-22-2	%3 indüksiyon; %100 O2 içinde %1,5–2 idame
Lidokain	Shijiazhuang Pharmaceutical Group	H14024045	İnsizyon bölgesine önleyici lokal infiltrasyon (%0,5, adım 1,5)
Mikrocerrahi makaslar	RWD Life Science	F11022-11	Cilt insizyonu, arteriyotomi, torakotomi
MX550D transdüser (40 MHz)	FUJIFILM VisualSonics	MX550D	Ekokardiyografi
Nair tüy dökücü krem	Nair	255 g	Anterior servikal ve göğüs duvarı depilasyonu için
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Servicebio	G4202-100ML	Perfüzyon
Rotary mikrotom	Leica Biosystems	RM2125 RTS	4–5 µm'de seri kesit alma
Stereomikroskop (cerrahi)	Olympus	SZX7	Damar izolasyonu ve mikrocerrahi
Vevo 3100 yüksek çözünürlüklü ultrason sistemi	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 3100	Ekokardiyografi
Von Kossa boyama kiti	Servicebio	G1043-20ML	Distrofik kalsifikasyon tespiti
Ksilen	Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd.	C0430530209	Parafin işlemi sırasında doku şeffaflaştırma.