240–280 g ağırlığında kırk yetişkin erkek Sprague–Dawley (SD) sıçan, Pekin Vital River Laboratuvarı Hayvan Teknolojisi'nden [Lisans No.: SCXK (Jing) 2021-0011] satın alınmıştır. Tüm fareler, Pekin Çin Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Merkezi'nde kontrollü koşullarda barındırıldı; oda sıcaklığı 23°C ± 1°C, bilgili nem %50 ± %5 ve 12 saat ışık/12 saat karanlık döngü, yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlandı. Fareler 5 gün boyunca aklimatize edildi ve bu süre zarfında koşu bandı egzersizi aynı anda alışma eğitimi yapıldı. Hayvanlar, kontrol stresini azaltmak için elektriksel uyarım olmadan seansta 15 dakika boyunca günde bir kez koşu bandı alışması yaptılar.
Önceki çalışmamıza göre, orta beyin arter tıkanması (MCAO) yöntemiyle PSS indüksiyonunun başarı oranı yaklaşık %60'dır15. Rastgele sayı tablosu kullanılarak, 9 fare önceden rastgele seçildi; kalan 31 fare ise model kurulum için kullanıldı. Başarılı modellemeden sonra, bu fareler rastgele model grubu ve MSSA grubuna ayrıldı. Sonuçta, her gruba dokuz fare dahil edildi. Bu deney, laboratuvar hayvan refahı 3R ilkelerine uygun olarak yapılmış ve Pekin Çin Tıp Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmış (BUCM 20250915-008).
Model Kuruluş
MCAO modeli, değiştirilmiş bir intraluminal filament tekniği kullanılarak sıçanlarda kuruldu. Sıçanlar indüksiyon için %3 izoflüran ile anestezi edildi ve cerrahi işlem boyunca %1,5 isofluran ile 1 L/dakika sabit akış hızında oksijenle anestezi sağlandı. Orta hat servikal kesi yapıldı, ardından sağ ortak karotis arter (CCA), dış karotis arter (ECA) ve iç karotis arter (ICA) ortaya çıkarmak için küt diseksiyon yapıldı. ECA aracılığıyla ICA'ya bir naylon monofilament dikişi (çapı 0,36 ± 0,02 mm) getirildi ve arterial tıkanma sağlamak için orta beyin arteri (MCA) kökenine yaklaşık 18–20 mm ilerletildi. Damarlar bağlandı ve kesi kapatıldı. Fareler daha sonra anesteziden iyileşene kadar bir ısıtma pedine yerleştirildi. Sahte ameliyat grubundaki fareler, intraluminal filament yerleştirilmeden CCA, ICA ve ECA'nın aynı cerrahi maruziyetine maruz kaldılar.
Ameliyattan sonra, tüm MCAO fareleri standart ameliyat sonrası bakım aldı. Hayvanlar, hipotermiyi önlemek için ilk 12 saat boyunca 37°C ısıtma pedinde tutuldu. Cerrahi kesiler üç gün üst üste günlük temizlendi, enfeksiyon profilaksisi için intraperitoneal enjeksiyonla ampisilin (100 mg/kg) verildi ve yeterli beslenmeyi korumak için yumuşatılmış yiyecekler verildi. Genel aktivite, yiyecek alımı, yara durumu ve uzuv motor fonksiyonları ameliyat sonrası 1. günlerden 10. güne kadar günlük olarak izlendi.
Nörolojik eksiklikler, Zea Longa nörolojik defisit skoru kullanılarak grup dağılımı kör edilmiş araştırmacılar tarafından değerlendirildi ve kas tonusu Modifiye Ashworth Ölçeği (MAS) kullanılarak değerlendirildi. Değerlendirmeler ameliyattan 1 gün önce (−1. gün), ameliyat öncesi MCAO günü (0. gün) ve ameliyat sonrası 1, 3, 5, 7 ve 10. günlerde yapıldı. Ameliyat sonrası 3. günde Zea Longa ve MAS puanları ≥1 olan fareler, başarılı bir PSS modeli kurmuş olarak kabul edildi.
MSSA Tedavisi
Müdahaleler ameliyat sonrası 3. günde başladı. Saç derisi akupunktur uyarısı bölgesi, ipsilesional MS 6 hattı (ön parietotemporal oblik hattı) idi. Ulusal Standart Saç Derisi Akupunkturu Manipülasyonları Standardı'na (GB/T 21709.2-2021) uygun olarak, MS 6 serisi GV 21'den (Qianding) GB 6'ya (Xuanli) kadar uzanır.
Tek kullanımlık steril akupunktur iğneleri (0,25 × 13 mm), GV 21'de galea aponeurotica'nın altına saç derisi yüzeyine göre yaklaşık 15° eğik açı ile yerleştirildi ve ön parietotemporal oblik çizgi boyunca yaklaşık 10 mm derinlikte GB 6'ya doğru ilerletildi. Hızlı dönme manipülasyonu (200 devir/dakika) 1 dakika boyunca sürekli uygulandı. 15 dakika iğne tutmasından sonra, aynı dönme manipülasyonu bir kez tekrarlandı ve toplam iğne tutma süresi 30 dakika oldu. İğne tutma süresi boyunca fareler aynı anda 10 m/dakika sabit hızda koşu bandı egzersizi yaptılar.
Sahte ile işletilen ve model gruplardaki fareler ne akupunktur ne de koşu bandağı egzersizi aldı. Spesifik olmayan müdahale ve kısıtlama stresini kontrol etmek için, sıkıştırıcı olmayan stok tutucularında günde 30 dakika boyunca nazikçe tutulup tutuldular; bu, MSSA grubunun toplam günlük müdahale süresine denk geldi.
Davranışsal Değerlendirmeler
Nörolojik Bozukluklar için Zea Longa Puanı:
Sıçanlarda nörolojik eksiklikler, Zea Longa puanlama sistemi16 kullanılarak değerlendirildi. Aşağıdaki kriterler uygulandı: 0 puan, nörolojik bozulma olmadığını ve normal kısıtlanmamış hareketin olduğunu gösteriyordu; 1 puanı, ön uzuvun veya arka uzuvun etkilenen tarafa karşı tam olarak uzatılmadığını gösteriyordu; 2 skoru, hareket sırasında karşı tarafa doğru dairesel olarak döndüğünü gösteriyordu; 3 puanı yürürken karşı tarafa düştüğünü gösteriyordu; ve 4 puan, bilinç kaybı ve spontan yürüyüşün olmaması anlamına geliyordu.
Kas Tonusu için MAS:
Kas tonusu MAS17 kullanılarak değerlendirildi. Kriterler şu şekilde tanımlandı: 0. derece, kas tonunda artış yok; 1. derece, kas tonusunda hafif artış, pasif fleksiyon ve uzatmanın sonunda geçici bir yakalama veya minimal direnç; 1+ derece, kas tonunda belirgin artış, orta hareket aralığında geçici bir yakalama ve hareketin ikinci yarısında kalıcı direnç; 2. derece, kas tonusunda belirgin artış, hareket aralığının çoğunda direnç belirgin, ancak uzuv kolayca hareket ettirilebilir kaldı; 3. derece, kas tonusunda önemli artış ve pasif fleksiyon ve ekspansiyonu zorlaştırdı; ve 4. derece, eklem sertliği nedeniyle sınırlı pasif hareket. 1+ Sınıfına 2 puan verildi ve bu çalışmada maksimum 5 MASpuanı 10 puan aldı.
Beyin İnfarkt Hacminin Niceliklendirilmesi için T2WI Nörogörüntüleme
Tüm T2WI taramaları, ParaVision 360 yazılımı (sürüm 3.5) ile çalışan PharmaScan MRI tarayıcısı kullanılarak alındı. Beyin infarkt hacminin nicelendirilmesi için MCAO sıçanlarına T2 ağırlıklı turbo hızlı kazanım ve gevşeme artırıcı (T2_TurboRARE, ayrıca RARE/hızlı spin eko [FSE]) darbe dizisi uygulandı. Görüntüleme parametreleri şu şekilde yapılandırıldı: tekrarlama süresi (TR) = 3000,0 ms, yankı süresi (TE) = 33,0 ms, görüş alanı (FOV) = 35,00 × 35,00mm 2, matris boyutu = 250 × 250, dilim kalınlığı = 0,80 mm, dilim sayısı = 35, uyarılma sayısı (NEX) = 3,0 ve çevirme açısı (FA) = 180,0°. Beyin enfarkt bölgeleri, ITK-SNAP yazılımında (sürüm 4.4.0) tek bir araştırmacı tarafından, sinyal yoğunluğu değişiklikleri ve iskemik enfarktuyla uyumlu morfolojik özellikler kullanılarak grup atamasına kör edilmiş tek bir araştırmacı tarafından dilim dilim bazında manuel olarak belirlenmiştir. Beyin infarkt hacmi yazılım tarafından otomatik olarak hesaplanıyordu.
Beyaz madde mikroyapısal bütünlüğünün değerlendirilmesi için DTI Nörogörüntüleme
MRI verileri 7.0 T PharmaScan manyetik rezonans tarayıcısı kullanılarak alındı. Anestezi, basınçlı havada %3 izofluran (0,4–0,6 L/dakika) verilerek DTI alımı boyunca %1 izofluran ile tutuldu. Görüntüleme işlemi boyunca çekirdek vücut sıcaklığı, termostatla kontrol edilen su banyosu kullanılarak korundu.
MRI taraması sırasında, önce üç düzlemli bir lokalizasyon dizisi uygulanarak fare beyni mıknatıs içinde konumlandırıldı. DTI, aşağıdaki parametrelerle eksenel tek atışlı spin-eko eko-düzlemsel görüntüleme dizisi kullanılarak gerçekleştirildi: TR/TE = 3000/27 ms, matriks = 90 × 75, FOV = 20 × 15mm 2, dilim kalınlığı = 0,7 mm, 30 difüzyon gradyanı yönü ve b-değerleri 0 ile 1000 s/mm 2. DTI analizi için, bregma'nın 1,3 mm gerisindeki beyin dilimlerinde dış kapsülde ilgi alanları çizildi. ParaVision 360 yazılımı kullanılarak fraksiyonel anizotropi (FA), ortalama difüzözite (MD), eksenel difüzyon (AD) ve radyal difüzyon (RD) parametrik haritaları yeniden oluşturuldu. Veriler, etkilenen yarımkürenin karşı taraflı sağlıklı yarımküreye oranı olarak ifade edilir.
Miyelin Yaralanması ve Remiyelinasyonun Değerlendirilmesi İçin LFB Boyama
LFB boyama işlemi dış kapsüldeki miyelinizlenmiş aksonlara yapılan yapısal hasarı değerlendirmek için gerçekleştirildi. Miyelin hasarı, miyelin seyreklenmesi ve vakuolasyonu ile karakterize edilen, harici kapsüldeki ROI içindeki LFB boyalı miyelinli liflerin entegre optik yoğunluğu (IOD) ImageJ yazılımı kullanılarak ölçülerek (sürüm 6.0; gri ton eşiği, 35–225) ölçüldü. Fare beyni stereotaksik atlas18'e dayanarak, her hayvan için bregma +1,0 mm, −1,3 mm ve −1,6 mm ölçülerinde üç koronal kesit analiz edildi; bu aralıklar dış kapsülün ön, orta ve orta-arka kısımlarına karşılık geldi. Üç bölüm boyunca ortalama OGD, her hayvanı temsil etmek için hesaplandı (n = 4 her grup). İpsilateral IOD değerleri kontralateral tarafa normalize edildi ve yüzde19 olarak ifade edildi.
Omurga refleks uyarılabilirliğinin değerlendirilmesi için elektrofizyolojik kayıtlar
Omurga monosinaptik H-refleksi biyolojik fonksiyon deney sistemi kullanılarak kaydedilmiştir. Fareler, elektrofizyolojik kayıtlar sırasında omurga reflekslerinin uyarılmasını korumak için α-kloraloz (50 mg/kg, intraperitoneal) ile hafifçe anestezi edildi. Sol siyatik sinir küt diseksiyon ile açığa çıkarıldı ve elektriksel uyarım için bipolar kanca elektrotlarına yerleştirildi. Yağlı bir vitamin çözeltisi, doku hidrasyonunu ve sinirsel canlılığı korumak için aralıklı olarak maruz kalan sinire uygulandı. Sol arka patinin arasal kaslarına bir çift paslanmaz çelik kayıt elektrodu yerleştirildi ve kuyruğuna bir topraklama elektrodu yerleştirildi. H-refleksi, 100 μs nabız süresine sahip monopolar-bipolar darbe uyarıcısı kullanılarak uyarıldı. H-refleks eşiği ve motor eşik (MT), geri dönmez periferik sinir hasarını önlemek için akım 0,05 mA adımlarla maksimum 3,0 mA yoğunluğuna çıkarılarak belirlendi.
Maksimum H-refleksi (Hmax) ortaya çıkaran aynı uyarım yoğunluğu kullanılarak, farklı frekanslarda (0,3, 5 ve 10 Hz) darbe uyarıları verilerek farklı uyarım frekanslarında H-refleks genlikleri elde edildi. M-dalgası genliğinin başlangıç değerinin %95'i içinde kaldığını doğrulamak için 0.3 Hz'de tekrarlanan darbe uyarısı uygulandı; aksi takdirde, veri seti atıldı. H-refleks frekansına bağlı depresyon (FDD), 5 Hz ve 10 Hz'deki H-dalga/M-dalga genlik oranının (H/M oranı) 0,3 Hz'e göre yüzdesi olarak hesaplandı; 0,3 Hz'deki H/M oranı temel referans10 olarak kullanıldı.
Veri Analizi
İstatistiksel analizler SPSS yazılımı (sürüm 20.0) kullanılarak gerçekleştirildi. Sürekli veriler, ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulur. Veri normalliği Shapiro–Wilk testi kullanılarak değerlendirildi. Gruplar arasında geleneksel görüntüleme sonuçları ve diğer nicel değişkenleri karşılaştırmak için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanıldı. Varyans homojenliği sağlandığında, Bonferroni sonradan yapılan testler yapıldı; aksi takdirde, Dunnett'in T3 testi uygulandı. Davranışsal veriler, sabit faktörler olarak deneysel grup ve ameliyat sonrası zaman noktası ile iki yönlü ANOVA kullanılarak analiz edildi. Çalışma değişkenleri arasındaki ilişkileri değerlendirmek için Spearman korelasyon analizi kullanıldı. p < 0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.