Bu çalışma, üçlü üçlü faktöriyel bir tasarım kullanarak Zuogui Hapı'nın ovaryektomize sıçanlarda postmenopozal osteoporoz üzerindeki etkilerini değerlendirmektedir. Sonuçlar, mekanistik kanıtlar nedensel olmaktan ziyade ilişkisel kalmasına rağmen, Yin ve Yang bileşenlerinin kemik metabolizması ve ilgili EphB4/ephrinB2 yolak belirteçleri üzerindeki sinerjik etkilerini desteklemektedir.
Araştırma makalesi
Ovariektomi Yapılmış Sıçanlarda Zuogui Pill'in Osteoblast-Osteoklast Kenetlenmesini Modüle Etmesi: Üç x Üç Faktöriyel Bir Çalışma
21 görüntülenme
⸱
11 Eylül 2026
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Postmenopozal osteoporoz, östrojen eksikliğine bağlı olarak kemik oluşumu ve rezorpsiyonunun arasındaki dengenin bozulmasıyla tetiklenir. Bu çalışma, ovariektomize sıçan modelinde Zuogui Hapı'nın Yin-besleyici alt formülasyonlarının bağımsız ve etkileşimli etkilerini nicelleştirmiş ve EphB4/ephrinB2/RhoA/alkalen fosfataz yolu ile ilişkilerini incelemiştir. ARRIVE 2.0'a uygun olarak, spesifik patojen içermeyen 130 dişi Sprague-Dawley sıçan, üçlü üçlü faktöriyel tasarımındaki dokuz grup da dahil olmak üzere 13 gruba (n=10/grup) randomize edilmiştir. Sonlanım noktaları arasında P1NP, CTX-1, çift enerjili X-ışını absorbsiyometrisi (DXA) ile ölçülen femoral kemik mineral yoğunluğu, trabeküler histoloji ile ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu ve Western blotting ile ölçülen haberci ribonükleik asit ve protein ekspresyonu yer almıştır. Tam formülasyon (I2A2), model grubuna kıyasla daha yüksek P1NP, daha düşük CTX-1 ve daha yüksek BMD ile ilişkilendirilmiştir. Faktöriyel analiz, P1NP ve BMD arasında bir Yin-Yang etkileşimi tespit ederek farmakolojik sinerjiyi desteklemiştir. Moleküler değişiklikler, artmış EphB4/ephrinB2/ALP ekspresyonu ve azalmış RhoA ekspresyonu ile ilişkili bulunmuştur. Bu bulgular, Zuogui Hapı tedavisi, iyileşmiş kemik fenotipleri ve yol belirteçlerinin modülasyonu arasındaki ilişkiyi desteklemektedir; nedensel yol bağımlılığı ise inhibitör, nakavt ve ko-kültür doğrulaması gerektirmektedir.
Giriş
Postmenopozal osteoporoz (PMOP), geniş bir kadın popülasyonunu etkilemekte ve östrojen eksikliğiyle ilişkili, dengeli kemik oluşumu ve rezorpsiyonunun bozulmasıyla karakterize edilmektedir1,2. EphB4/ephrinB2 reseptör-ligand sistemi, osteoblast-osteoklast iletişimini aracılar; EphB4 sinyalleri osteoblast farklılaşmasını ve alkali fosfataz (ALP) aktivitesini desteklerken, ephrinB2 ters sinyalleri RhoA ile ilişkili mekanizmalar aracılığıyla osteoklastogenezi kısıtlayabilmektedir3,4. Östrojen eksikliği olan kemikte azalmış eşleşme, yeniden modellemenin her iki hücresel kolunu etkileyen müdahalelerin değerlendirilmesi için mekanistik bir temel oluşturmaktadır.
Antiresorptif ve anabolik ajanlar dahil olmak üzere mevcut osteoporoz tedavileri kırık riskini azaltır ancak uyum, maliyet, kontrendikasyonlar, rebound etkiler veya uzun süreli kullanım sırasındaki advers olaylar nedeniyle sınırlı kalabilir5. Bu nedenle, aşırı resorpsiyonu kısıtlarken kemik oluşumunu artıran aday tedaviler bilimsel açıdan güncelliğini korumaktadır.
Zuogui Hapı (ZGP; Zuo Gui Wan), geleneksel Çin tıbbında kemik zayıflığıyla ilişkili teorik bir patern olan böbrek-öz eksikliği için kullanılan klasik, çok bileşenli bir reçetedir. Yin besleyici bileşenler şunları içerir: Rehmannia glutinosa (işlenmiş kök, Shu Di Huang, 24 g), Dioscorea opposita (rizom, Huai Shan Yao, 12 g), Cornus officinalis (meyve, Shan Zhu Yu, 12 g), Lycium barbarum (meyve, Gou Qi Zi, 12 g), Chinemys reevesii plastron jelatini (plastron türevli jelatin, Gui Ban Jiao, 12 g) ve Cyathula officinalis (kök, Chuan Niu Xi, 9 g). Yang artırıcı bileşenler ise Cuscuta australis (tohum, Tu Si Zi, 12 g) ve Cervus elaphus boynuz jelatinini (boynuz türevli jelatin, Lu Jiao Jiao, 12 g) içerir. Klasik teoride, Yin içinde Yang arama prensibi, Yang artırıcı bitkilerin basit bağımsız katkı maddeleri olarak hareket etmek yerine, Yin besleyici bir tabanı potansiyelize edebileceğini öngörür. Klinik kanıtlar ve preklinik çalışmalar; BMD, osteogenez ve farmakokinetik davranış üzerindeki etkiler dahil olmak üzere ZGP'nin veya ZGP içeren müdahalelerin anti-osteoporotik aktivitesini bildirmiştir6,7,8,9,10.
Bu çalışmanın özgünlüğü, Ovariektomize (OVX) sıçanlarda Yin-besleyici ve Yang-artırıcı bileşenlerin resmi üç çarpı üç faktöriyel ayrımının yapılması ve aynı zamanda kemik fenotipleri ile EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP yolu belirteçlerinin değerlendirilmesinde yatmaktadır. Bu tasarım, yol belirteçlerindeki değişikliklerin mekanistik olarak bloke edilmediği veya susturulmadığı sürece ilişkisel kalmaya devam ettiğini kabul ederken1, formül uyumluluğu teorisini, yalnızca tam reçetenin veya tek bir karşılaştırıcının kullanıldığı çalışmalara göre daha doğrudan test etmektedir.
Protokol
Bu çalışmadaki tüm prosedürler, İç Moğolistan Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış (Onay No. YKD202404105) ve ARRIVE 2.012 ile uyumlu olarak yürütülmüştür.
Çalışma tasarımı
Çalışma, İç Moğolistan Tıp Üniversitesi'nin hayvan deney platformunda yürütülmüştür. İki faktörlü üç çarpı üç tam faktöriyel tasarım uygulanmıştır: Yin-besleyici baz formülasyonu (I; üç doz seviyesi: 0, 27, 54 g ham ilaç eşdeğeri) ve Yang-güçlendirici formülasyon (A; üç doz seviyesi: 0, 8, 16 g ham ilaç eşdeğeri), böylece dokuz faktöriyel hücre ve dört referans grubu elde edilmiştir. Faktöriyel tasarım Tablo 1'de gösterilmiştir. I2A2, klinik eşdeğer dozdaki tam ZGP formülünü temsil eder. Doz dönüşümünde vücut yüzey alanı yöntemi kullanılmıştır (sıçan: insan faktörü = 6,25)13.
Hayvanlar, randomizasyon ve körleme
Yüz otuz adet spesifik patojen taşımayan dişi Sprague-Dawley sıçan (6 aylık, 220–250 g), bilgisayar tarafından oluşturulan rastgele sayı tablosuna göre ayrılmıştır. Tahsis kodları, sonuç değerlendirmesinde yer almayan bir araştırmacı tarafından ardışık olarak mühürlü zarflara yerleştirilmiştir. Sıçanlar, 2 ± 2 oC sıcaklık ve %50–60 nem oranında, 12 saatlik ışık/karanlık döngüsü altında, havalandırmalı kafeslerde 3–4'erli olarak barındırılmış; ad libitum su, kalsiyum ve fosfor içeriği belgelenmiş standart kemirgen yemi, kafes aktivitesi ve çevresel zenginleştirme sağlanmıştır. Moleküler analizler, histolojik skorlama, görüntü nicelleştirmesi ve densitometre ölçümleri, gruplandırmadan habersiz araştırmacılar tarafından gerçekleştirilmiştir. Örneklem büyüklüğü, a priori güç analizi ile belirlenmiş ve grup başına n = 10 olarak saptanmıştır.
OVX modeli ve ilaç tedavisi
Bilateral OVX, hassas bir buharlaştırıcı ile iletilen inhale izofluran altında gerçekleştirilmiştir. Anestezi, oksijen içerisinde %3–4 konsantrasyonda indüklenmiş ve bir burun konisi aracılığıyla %1.5–2.5 düzeyinde sürdürülmüştür. Yeterli anestezi derinliği, stabil solunum ile birlikte pedal çekilme ve palpebra reflekslerinin kaybı ile doğrulanmıştır. OVX başarısı, cerrahiden 5 gün sonra vajinal östrus döngüsünün yokluğu ve 12 hafta sonra BMD azalması ile değerlendirilmiştir. Model doğrulaması sonrası, 8 hafta boyunca gavage uygulaması yapılmıştır (1 mL/10 g/gün). Dekoksiyonlar, kaynama noktasındaki ardışık su ekstraksiyonu ile hazırlanmıştır (10 °C, reflüks); önce 10 kat hacimde 2 saat, ardından 8 kat hacimde 1,5 saat süreyle işlem yapılmış, tıbbi gazlı bezin dört katmanından filtrelenmiş ve düşük basınç altında 0,968 g ham ilaç/mL konsantrasyona getirilmiştir. Konsantre ekstrakt 4 °C'de saklanmış ve hazırlanmasını takip eden 7 gün içinde kullanılmıştır. Pozitif kontroller Gusukang granülleri (1,8 g/kg/gün) ve dietilstilbestrol (0,04 mg/kg/gün) olarak belirlenmiştir. Deney sonunda sıçanlar, pedal ve kornea refleksleri kaybolana kadar %5 izofluran ile derin şekilde anestezi edilmiş, ardından kanları boşaltılmış ve servikal dislokasyona tabi tutulmuştur. Ölüm, kalp atışının ve solunumun durmasıyla doğrulanmıştır. Kadavralar ve dokular biyolojik atık olarak; kimyasal kalıntılar tehlikeli atık olarak; iğneler veya bıçaklar ise onaylı delici-kesici alet konteynerlerine atılmıştır.
Sonuç ölçümleri
Serum P1NP ve CTX-1 düzeyleri, sandviç ELISA (Jiyinmei) ile ölçülmüştür.14Femoral BMD, DXA ile nicel olarak belirlenmiştir. Trabeküler histoloji, 20x büyütmede hematoksilin ve eozin boyama ile değerlendirilmiştir. Gen ekspresyonu, 2'li RT-qPCR kullanılarak değerlendirilmiştir.-ΔΔCt yöntem, gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH) normalize edildi. Protein ekspresyonu, Western blot ve ImageJ kantifikasyonu ile değerlendirildi (bakınız Materyaller Tablosu). Gözlemlenen moleküler ağırlıklar ve antikor katalog bilgileri şurada verilmiştir: Ek Tablo 1Primer dizileri şunlardı: EphB4 ileri/geri, 5'-CTAGACTCTTTCCTGCGGCT/GGGAACTTGTGTAGGTGGGA-3'; ephrinB2, 5'-CGGACAAGGCCTGGTACTAT/ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT-3'; RhoA, 5'-GTTTATGTGCCCACGGTGTT/ACTATCAGGGCTGTCGATGG-3'; ALP, 5'-CGGACACAAGCATTCCCAGA/TGGTGGAGCTGAACAGGCTT-3'; GAPDH, 5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC/TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'.
İstatistiksel analiz
Parametrik analizden önce normallik Shapiro-Wilk testi ile, varyans homojenliği ise Levene testi ile değerlendirildi. Veriler ortalama ± SD olarak ifade edilmiştir ve tüm nicel şekil hata çubukları SD'yi belirtmektedir. Ana etkileri ve I ile A etkileşimini tahmin etmek için dokuz faktöriyel hücreye, etki büyüklüğü olarak kısmi eta-kare (ηp2) kullanılarak iki yönlü faktöriyel ANOVA uygulandı. Tüm 13 grup arasındaki ikili karşılaştırmalar, Bonferroni düzeltmeli tek yönlü ANOVA kullanılarak gerçekleştirildi. İstatistiksel analizler GraphPad Prism programında yapıldı. Anlamlılık sembolleri tutarlı bir şekilde şu şekilde tanımlanmıştır: *, **, ***, **** modelle karşılaştırıldığında p <0.05, p <0.01, p <0.01, p <0.01 değerlerini; #, ##, ###, #### ise tam formüllü ZGP ile karşılaştırıldığında aynı eşik değerleri belirtmektedir.
Sonuçlar
Vajinal sitoloji ile model doğrulaması
OVX başarısı, cerrahiden sonraki 5 gün içinde östrus döngüsünün kaybı ile kanıtlandığı üzere tüm ovaryektomize hayvanlarda doğrulanmışken (Şekil 1A), sham operasyon uygulanan hayvanlar 4 günlük döngülerini korumuşlardır (Şekil 1B). 12. haftada DXA, OVX model grubunda sham kontrollere göre daha düşük femoral BMD göstermiş (0.214 ± 0.020'ye karşı 0.281 ± 0.019 mg/cm3; Bonferroni-düzeltilmiş p < 0.001), bu durum tedavi öncesinde OVX kaynaklı kemik kaybı modelinin oluşturulduğunu desteklemiştir.
Kemik mineral yoğunluğu
Tam ZGP formülü (I2A2), faktöriyel alt formülasyonlar arasında en yüksek BMD geri kazanımını göstermiş ve her iki pozitif kontrolle de istatistiksel olarak karşılaştırılabilir bulunmuştur (Tablo 2, Şekil 2). Tüm faktöriyel alt formülasyonlar, model grubuna kıyasla BMD'yi artırmıştır. Yalnızca Yüksek Yin-besleyici (I3A1: 0.253 mg/cm3) ve yalnızca Yüksek Yang-güçlendirici (I1A3: 0.243 mg/cm3) değerleri, tam ZGP'den (I2A2: 0.307 mg/cm3) daha düşük kalmış olup, bu durum basit bir doz etkisinden ziyade bir etkileşimi desteklemektedir.
Serum kemik döngüsü belirteçleri
Model grubuyla karşılaştırıldığında, tam formüllü ZGP'nin artmış P1NP (+%51; %95 GA: 210.3–327.5 pg/mL; p <0.01) ve azalmış CTX-1 (-%16; p <0.01) ile ilişkili olduğu görülmüş olup, bu durum iyileşmiş formasyon-rezorpsiyon dengesiyle uyumludur (Şekil 3A,B). Yüksek doz monoterapi kolları bazı karşılaştırmalarda daha yüksek mutlak P1NP değerleri üretmiş, ancak faktöriyel patern maksimum tek kol doz yanıtından ziyade optimize edilmiş kombine aktiviteyi desteklemiştir. Grup düzeyindeki tüm veriler Tablo 3'te yer almaktadır.
Faktöriyel ANOVA ve sinerjik etkileşim
Dokuz faktöriyel hücrenin iki yönlü faktöriyel ANOVA analizi, Yin-besleyici ve Yang-artırıcı faktörlerin anlamlı ana etkilerini ve birincil son noktalar genelinde anlamlı I x A etkileşim terimlerini belirlemiştir (Tablo 4). P1NP için etkileşim etkisi (ηp2 = 0.74), Yang-artırıcı bileşenlerin bu deneysel koşullar altında Yin-besleyici bileşenlerin aktivitesini artırdığını göstermektedir.
Kemik yoğunluğu (model doğrulama)
Şekil 4'te gösterildiği üzere, Model (OVX) grubundaki femoral kemik yoğunluğunun Blank ve Sham-operasyonlu gruplardan daha düşük olması, tedavi öncesinde OVX kemik kaybı fenotipinin başarılı bir şekilde indüklendiğini doğrulamıştır.
EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP ekspresyonu
RT-qPCR analizlerinde, her gruptan alınan biyolojik örnekler teknik olarak üç tekrarlı reaksiyonlarla kullanılmış ve Western blot densitometrisi bağımsız biyolojik lizatlar üzerinde gerçekleştirilmiştir (Şekil 5 ve Şekil 6). Model grubu ile karşılaştırıldığında, tam formülasyon ZGP'nin daha yüksek EphB4 (0,498 ± 0,09'a karşı 0,048 ± 0,02; p < 0,001), ephrinB2 (0,41 ± 0,036'ya karşı 0,048 ± 0,03; p < 0,01) ve ALP (0,842 ± 0,019'a karşı 0,090 ± 0,03; p < 0,01) ile daha düşük RhoA (1,658 ± 0,028'e karşı 7,32 ± 0,430; p < 0,01) değerleri ile ilişkili olduğu görülmüştür. Bu moleküler bulgular, nedensel aracılığın kanıtı olmaktan ziyade yolak-markör ilişkileri olarak yorumlanmaktadır.
Veri Kullanılabilirliği
Mevcut çalışma sonuçlarını oluşturmak için kullanılan orijinal veri dosyaları, bu makaleye eşlik eden bir Ek Kodlama Dosyası olarak sunulmuştur
Şekil 1. Overektomi sonrası östrus döngüselliğini doğrulamak için kullanılan temsili vajinal sitoloji (hematoksilen ve eozin boyama, 20x). (A) Ovariektomi uygulanmış bir sıçandan alınan ve kalıcı non-siklik sitolojiyi gösteren temsili vajinal yayma. (B) Normal östrus döngüselliğini gösteren, sham operasyon uygulanmış bir sıçandan alınan temsili vajinal smear. Lütfen bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayın.
Şekil 2Tüm gruplarda femoral BMD. Hata çubukları SD'yi belirtmektedir. İstatistiki semboller, İstatistiksel analiz bölümünde tanımlandığı üzere, model veya tam formüllü ZGP'ye karşı Bonferroni düzeltmeli karşılaştırmaları göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3Serum kemik döngü belirteçleri. (A) Bir kemik oluşum markörü olan P1NP. (B) Kemik rezorpsiyon belirteci olan CTX-1. Hata çubukları standart sapmayı (SD) göstermektedir. İstatistiki semboller, model veya tam formüllü ZGP'ye göre Bonferroni düzeltmeli karşılaştırmaları belirtmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4Tedavi öncesinde OVX ile indüklenen kemik kaybını doğrulayan femoral kemik yoğunluğu. Femoral kemik yoğunluğunu karşılaştıran sütun grafiği (mg/cm3) ön işlem model doğrulama zaman noktasında Blank (ovariektomi yapılmamış, tedavi edilmemiş), Sham-operasyon ve Model (OVX) grupları arasında. Çubuklar ortalamayı temsil etmektedir ± SS (n = 10/grup). *** = p < 0,01'in Blank ve Sham ile karşılaştırılması (Bonferroni düzeltmeli tek yönlü ANOVA). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5Relatif mRNA gen ekspresyonu. ( değerlerinin ekspresyon seviyeleriA) EphB4 (B) ephrinB2 (C) RhoA (D) 2^- kullanarak ALPΔΔGAPDH'ye göre normalize edilmiş Ct yöntemi. qPCR'da her biyolojik örnek için teknik olarak üçlü tekrarlar kullanılmıştır. Hata çubukları standart sapmayı (SD) göstermektedir. İstatistiksel semboller, Bonferroni ile düzeltilmiş karşılaştırmaları belirtmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6Western blot protein ekspresyonu. Paneller; bağımsız biyolojik örneklerden seçilen EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP ve yükleme kontrolü GAPDH için temsili immünoblotları göstermektedir. Densitometre ölçümleri, ImageJ kullanılarak GAPDH'ye göre normalize edilmiştir. Gözlemlenen moleküler ağırlıklar: EphB4, 110 kDa; ephrinB2, 36 kDa; RhoA, 2 kDa; ALP, 39 kDa; GAPDH, 37 kDa (bakınız Ek Tablo 1). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Yin besleyici faktör (I) | ||||
| I₁ (0 g) | I₂ (27 g) | I₃ (54 g) | ||
| Yang artırıcı faktör (A) | A₁ (0 g) | I₁A₁ (Model) | I₂A₁ (Yin) | I₃A₁ (Hi-Yin) |
| A₂ (8 g) | I₁A₂ (Yang) | I₂A₂ (ZGP†) | I₃A₂ (Hi-Yin+Yang) | |
| A₃ (16 g) | I₁A₃ (Hi-Yang) | I₂A₃ (Yin+Hi-Yang) | I₃A₃ (Tam-Yüksek) | |
Tablo 1: Üç çarpı üç faktöriyel tasarım ve deney grupları. Tablo, Yin-besleyici (I) ve Yang-artırıcı (A) doz seviyelerinin 3x3 faktöriyel tasarımında düzenlenmiş 13 deney grubunu ve ek olarak 4 referans grubunu sunmaktadır. †I₂A₂ = klinik eşdeğer dozda tam Zuogui Pill formülü. Vücut yüzey alanı yöntemi kullanılarak yapılan doz dönüşümü (sıçan : insan = 6.25).
| Grup | Faktöriyel Hücre | BMD (mg/cm³, x̄ ± SD) | Model ile karşılaştırma |
| Boş kontrol | — | 0.279 ± 0.030 | **** |
| Şam operasyonlu | — | 0.281 ± 0.019 | **** |
| Model (OVX) | I₁A₁ | 0.214 ± 0.020 | — |
| Yang artırıcı | I₁A₂ | 0.258 ± 0.01 | ** |
| Yüksek Yang artırıcı | I₁A₃ | 0.243 ± 0.021 | * |
| Yin besleyici | I₂A₁ | 0.262 ± 0.015 | *** |
| Yüksek Yin besleyici | I₃A₁ | 0.253 ± 0.017 | ** |
| Yin + Yük-Yang | I₂A₃ | 0.240 ± 0.014 | * |
| Yük-Yin + Yang | I₃A₂ | 0.248 ± 0.014 | * |
| Tam-Yüksek | I₃A₃ | 0.257 ± 0.017 | ** |
| ZGP tam formül | I₂A₂ | 0.307 ± 0.010 | **** |
| TCM pozitif kontrol | — | 0.307 ± 0.029 | **** |
| Batı tıbbı kontrol | — | 0.307 ± 0.09 | **** |
Tablo 2: Tüm gruplarda femoral BMD (grup başına n=10, ortalama ± SD). * = p <0.05, ** = p <0.01, *** = p<0.001, **** = p<0.01 model ile karşılaştırıldığında (Bonferroni düzeltmeli).
| Grup | Hücre | P1NP (pg/mL, x̄ ± SD) | CTX-1 (ng/mL, x̄ ± SD) |
| Boş kontrol | — | 138.8 ± 29.7****#### | 3.4 ± 6.8****#### |
| Sham operasyon | — | 1268.7 ± 124.1****#### | 45.0 ± 6.7****#### |
| Model (OVX) | I₁A₁ | 526.4 ± 78.7 | 105.5 ± 9.9 |
| Yang artırıcı | I₁A₂ | 845.1 ± 76.7**** | 84.2 ± 6.6**** |
| Yüksek Yang artırıcı | I₁A₃ | 1013.0 ± 73.7 ****## | 65.5 ± 6.6****#### |
| Yin besleyici | I₂A₁ | 870.7 ± 63.6**** | 8.2 ± 7.6** |
| Yüksek Yin besleyici | I₃A₁ | 1068.0 ± 48.7****#### | 64.5 ± 4.0****#### |
| Yin + Yük-Yang | I₂A₃ | 951.5 ± 146.5****# | 63.1 ± 6.0****#### |
| Yük-Yin + Yang | I₃A₂ | 90.2 ± 16.8****## | 62.6 ± 4.4****#### |
| Tam-Yüksek | I₃A₃ | 739.5 ± 93.5** | 97.1 ± 8.9 |
| Tam ZGP formülü | I₂A₂ | 794.8 ± 6.0**** | 8.2 ± 6.0**** |
| TCM pozitif kontrol | — | 967.7 ± 49.9****# | 6.3 ± 6.1****#### |
| Batı tıbbı kontrol | — | 1026.6 ± 65.1****### | 68.8 ± 7.3****### |
Tablo 3: Tüm gruplarda serum P1NP ve CTX-1 seviyeleri (n=10/grup, ortalama ± SD). ** = model ile karşılaştırıldığında p <0.01, **** = model ile karşılaştırıldığında p <0.01; # = ZGP ile karşılaştırıldığında p <0.05, ## = ZGP ile karşılaştırıldığında p <0.01, ### = ZGP ile karşılaştırıldığında p <0.01, #### = ZGP ile karşılaştırıldığında p <0.001 (Bonferroni). ZGP P1NP'nin modele göre %95 GA: 210.3–327.5 pg/mL.
| Sonuç | Faktör | df | F | p-değeri | Kısmi η² |
| P1NP (pg/mL) | Yin (I) | 2, 81 | 17.84 | <0.001 | 0.31 |
| Yang (A) | 2, 81 | 6.22 | 0.003 | 0.13 | |
| I × A | 4, 81 | 57.21 | <0.001 | 0.74 | |
| BMD (mg/cm²³) | Yin (I) | 2, 81 | 31.90 | <0.0001 | 0.44 |
| Yang (A) | 2, 81 | 28.70 | <0.0001 | 0.41 | |
| I × A | 4, 81 | 24.60 | <0.0001 | 0.55 | |
| CTX-1 (ng/mL) | Yin (I) | 2, 81 | 14.22 | <0.001 | 0.26 |
| Yang (A) | 2, 81 | 5.88 | 0.004 | 0.13 | |
| I × A | 4, 81 | 19.43 | <0.001 | 0.49 |
Tablo 4: Bonferroni düzeltmeli post-hoc karşılaştırmalarla birlikte üç çarpı üç faktöriyel ANOVA ana etkileri ve etkileşim terimleri. Etki büyüklüğü olarak kısmi eta-kare rapor edilmiştir. df serbestlik derecesini belirtir.
Ek Tablo 1. Western blot antikor bilgileri. Tablo; bu çalışmada kullanılan primer ve sekonder antikorların hedef proteinlerini, gözlenen moleküler ağırlıklarını, tedarikçilerini, katalog numaralarını, konak türlerini ve çalışma dilüsyonlarını listelemektedir.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.
Ek Kodlama Dosyası 1. Çalışmayı destekleyen ham deneysel veriler. Bu arşiv; bireysel BMD ölçümleri, ELISA ham verileri, amplifikasyon ve erime eğrisi çıktılarıyla birlikte RT-qPCR Ct değerleri, orijinal Western blot görüntüleri ve densitometre analiz dosyaları, temsili histolojik mikroskopi görüntüleri ve bu deneylerle ilişkili cihaz kaynaklı çıktı dosyaları da dahil olmak üzere, makalede sunulan sonuçların oluşturulmasında kullanılan orijinal veri dosyalarını içermektedir.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.
Tartışma
Faktöriyel etkileşim terimi, ZGP'nin Yin-besleyici ve Yang-artırıcı bileşenleri arasındaki non-aditif bir ilişkiyi desteklemektedir. Bu sonuç, Yang-artırıcı bileşenlerin Yin-besleyici temeli aktive etmesinin veya potansiyelize etmesinin beklendiği, Yin içinde Yang arama şeklindeki geleneksel ilkeyle tutarlıdır15. Bu bulgu, formülasyon düzeyinde farmakolojik sinerji olarak yorumlanmalıdır. Etkiden sorumlu olan bireysel aktif bileşenleri tanımlamamaktadır.
EphB4 ve ephrinB2, osteoblast-osteoklast eşleşmesinin biyolojik olarak makul aracılarıdır3,4, ancak mevcut kanıtlar korelatiftir. RhoA azalmasıyla birlikte EphB4, ephrinB2 ve ALP düzeylerinde gözlenen artış, iyileşmiş bir eşleşme ile uyumludur; ancak bu durum, bu yolağın ZGP etkisi için gerekli veya yeterli olduğunu kanıtlamaz. Nedensel bağımlılığı test etmek için yolak inhibitörleri, anti-EphB4 veya ephrinB2-blokaj yaklaşımları, RhoA/ROCK modülasyonu16, gen susturma ve osteoblast-osteoklast ko-kültür deneyleri gereklidir.
Klinik translasyon dikkat gerektirir. Sıçanlardan insanlara eşdeğer doz dönüşümü ilk ölçeklendirmeyi destekler, ancak insan dozajlaması ayrıca farmakokinetik, farmakodinamik ve uzun vadeli güvenlik çalışmaları gerektirir. Standartlaştırılmış bir ZGP ürünü; HPLC veya LC-MS kimyasal profilleme, belirteç bileşik limitleri, partiler arası karşılaştırılabilirlik, kontaminant testi ile bitki kaynağının, ekstraksiyonunun, konsantrasyonunun ve üretim uygulamasının belgelendirilmesini gerektirecektir17. Düzenleyici translasyon ayrıca bileşenler arasındaki etkileşimleri, mevcut anti-osteoporotik ilaçlarla uyumluluğu ve yalnızca BMD yerine kırık azalması gibi karşılaştırmalı klinik sonuçları da göz önünde bulundurmalıdır.
Bu çalışmanın birkaç kısıtlılığı bulunmaktadır. OVX sıçan modeli ani östrojen çekilmesine neden olur ve insan menopozunu, yaşlanmayı, bağışıklık düzenlemesini, yaşam süresini, komorbiditeleri veya uzun vadeli kemik yeniden şekillenme dinamiklerini tam olarak yansıtamaz18,19. Gözlemlenen sonuçlara sistemik endokrin etkiler katkıda bulunmuş olabilir, bu nedenle doğrudan kemik hücresi sinyalizasyonu olduğu varsayılmamalıdır. Yolak inhibisyonunun veya gen nakavtının (knockdown) yapılmamış olması, nedensel mekanizmik iddiaların ortaya konulmasını engellemektedir. HPLC veya LC-MS profillemesinin eksikliği, tekrarlanabilirliği sınırlamakta ve etkilerin belirli bileşenlere atfedilmesini önlemektedir. Trabeküler kemik mikro mimarisinin kantitatif değerlendirmesi yapılmamıştır. Kemik yapısal değişikliklerinin daha kapsamlı bir değerlendirmesini sağlamak için gelecek çalışmalar, BV/TV, Tb.N, Tb.Th ve Tb.Sp'yi içeren mikro-CT veya kantitatif histomorfometrik analizleri kapsamalıdır20. Bitkisel parti değişkenliği, ekstraksiyon prosedürleri ve kalite kontrol gereksinimleri önemli translasyonel engeller olmaya devam etmektedir.
OVX kaynaklı PMOP sıçanlarda, tam formülasyon Zuogui Pill, iyileşmiş BMD, olumlu kemik döngüsü serum belirteçleri ve EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP yolak belirteçlerindeki koordineli değişikliklerle ilişkilendirilmiştir. Üçlü üçlü faktöriyel analiz, geleneksel formül uyumluluk teorisiyle tutarlı olarak, Yin besleyici ve Yang artırıcı bileşenler arasında sinerjik bir etkileşimi desteklemektedir. Bu veriler, ZGP'nin PMOP için çok hedefli bir aday olarak daha fazla araştırılmasını desteklemektedir; ancak mekanistik veya translasyonel iddiaların kesinleşmesi öncesinde inhibitör çalışmaları, gen susturma deneyleri, osteoblast-osteoklast ko-kültürleri, kimyasal profilleme, kantitatif kemik mikro mimarisi, farmakokinetik, uzun süreli güvenlik testleri ve klinik çalışmalar gereklidir.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, İç Moğolistan Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 2025LHMS08047), İç Moğolistan Tıp Üniversitesi Genel Projesi (Hibe No. YKD2025MS015) ve İç Moğolistan Tıp Üniversitesi Doktora Başlangıç Fonu (Hibe No. YKD2023BSQD07) tarafından desteklenmiştir. Fon sağlayan kurumların çalışma tasarımı, veri toplama, analiz, yayınlama kararı veya taslağın hazırlanmasında herhangi bir rolü olmamıştır.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| %1 amonyaklı su | N/A | N/A | Hematoksilen diferansiyasyonu sonrası mavileştirme solüsyonu. |
| %1 hidroklorik asit alkol | N/A | N/A | Hematoksilen boyama için diferansiyasyon solüsyonu. |
| 2x qPCR Mix | N/A | N/A | Kantitatif PCR master mix. Kaynak reaksiyon hacmi: reaksiyon başına 12.5 µL. |
| %4 paraformaldehit solüsyonu | N/A | N/A | Histolojik analiz için sol femur ve tibia örneklerinin fiksasyonu. |
| 5x yükleme tamponu | N/A | N/A | Elektroforez öncesi örnek denatürasyonu. |
| ALP primer antikoru | Affinity Biosciences | N/A | Western blot antikoru. Kaynak dilüsyonu: 1:200. JoVE için RRID ve lot numarası gereklidir. |
| ALP primer çifti | N/A | N/A | ALP mRNA'sı qRT-PCR ile ölçülmüştür ancak ana primer tablosu ALP primer dizilerini sağlamamaktadır. Yazar onayı gereklidir. |
| Biyotin antikor reaktifi | ELISA kiti ile birlikte sağlanır, Jiyinmei | Kit bileşeni | ELISA sırasında örnek kuyucuklarına eklenir. |
| Cervus elaphus geyik boynuzu jelatini, Lu Jiao Jiao | Beijing Tongrentang | N/A | Yang artırıcı bileşen. Kaynaktaki tam formül dozu: 12 g, oran 4. Jelatin, dekoksiyona eritilmiştir. |
| Chinemys reevesii plastron jelatini, Gui Ban Jiao | Beijing Tongrentang | N/A | Yin besleyici bileşen. Kaynaktaki tam formül dozu: 12 g, oran 4. Jelatin, dekoksiyona eritilmiştir. |
| Kloroform | N/A | N/A | RNA ekstraksiyonu sırasında faz ayrımı. |
| Soğutma tablası | Leica | 150 | Kesit alma iş akışı için kriyojenik veya soğutma desteği. |
| Cornus officinalis, Shan Zhu Yu | Beijing Tongrentang | N/A | Yin besleyici bileşen. Kaynaktaki tam formül dozu: 12 g, oran 4. |
| Cuscuta australis, Tu Si Zi | Beijing Tongrentang | N/A | Yang artırıcı bileşen. Kaynaktaki tam formül dozu: 12 g, oran 4. |
| Cyathula officinalis, Chuan Niu Xi | Beijing Tongrentang | N/A | Yin besleyici bileşen. Kaynaktaki tam formül dozu: 9 g, oran 3. |
| DEPC ile işlem görmüş PBS | N/A | N/A | Sıvı azotla dondurma öncesi L4'ten L5'e lomber vertebraların durulanması. |
| Dietilstilbestrol | N/A | N/A | Batı tıbbı pozitif kontrolü. Kaynak dozu: 0.04 mg/kg/gün, 1 mL/10 g/gün. Ana belge aynı zamanda diethylstilbestrol olarak harmonize edilmesi gereken bir Çince nomenklatür tutarsızlığı içermektedir. |
| Dioscorea opposita, Huai Shan Yao | Beijing Tongrentang | N/A | Yin besleyici bileşen. Kaynaktaki tam formül dozu: 12 g, oran 4. |
| dNTP karışımı | N/A | N/A | Ters transkripsiyon reaksiyonuna dahildir. |
| ECL kemilüminesans reaktifi | N/A | N/A | Western blot deteksiyon reaktifi. |
| ELISA kromojenik reaktif A | ELISA kiti ile birlikte sağlanır, Jiyinmei | Kit bileşeni | ELISA için renk geliştirme reaktifi. |
| ELISA kromojenik reaktif B | ELISA kiti ile birlikte sağlanır, Jiyinmei | Kit bileşeni | ELISA için renk geliştirme reaktifi. |
| ELISA stop solüsyonu | ELISA kiti ile birlikte sağlanır, Jiyinmei | Kit bileşeni | ELISA renk reaksiyonunu sonlandırmak için kullanılır. |
| Enzim işaretli ELISA reaktifi | ELISA kiti ile birlikte sağlanır, Jiyinmei | Kit bileşeni | ELISA'daki boş olmayan kuyucuklara eklenir. |
| EphB4 primer antikoru | Proteintech | N/A | Western blot antikoru. Kaynak dilüsyonu: 1:200. JoVE için RRID ve lot numarası gereklidir. |
| EphB4 primer çifti | N/A | PCR ürünü 232 bp | İleri CTAGACTCTTTCCTGCGGCT; Geri GGGAACTTGTGTAGGTGGGA. Ana tablodaki Rat RphB4 yazım hatası Rat EphB4 olarak okunmalıdır. |
| ephrinB2 primer antikoru | Affinity Biosciences | N/A | Western blot antikoru. Kaynak dilüsyonu: 1:20. JoVE için RRID ve lot numarası gereklidir. |
| ephrinB2 primer çifti | N/A | PCR ürünü 172 bp | İleri CGGACAAGGCCTGGTACTAT; Geri ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT. |
| Etanol, absolut ve kademeli %95, %85, %75 | N/A | N/A | Hematoksilen ve eozin boyama sırasında gradyant dehidrasyon ve rehidrasyon. |
| Dişi Sprague-Dawley sıçanlar | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | Hayvan sertifikası ve lisans numarası kaynak makalede sağlanmamıştır | Spesifik patojen içermeyen, 6 aylık, sağlıklı, gebe olmayan dişiler. Çince kaynak 230 ila 270 g; önceki İngilizce taslak 20 ila 250 g belirtmektedir. Gönderimden önce nihai bir aralık doğrulayın. |
| GAPDH primer antikoru | Servicebio | N/A | Yükleme kontrol antikoru. Kaynak dilüsyonu: 1:20. JoVE için RRID ve lot numarası gereklidir. |
| GAPDH primer çifti | N/A | PCR ürünü 253 bp | İleri ACAGCAACAGGGTGGTGGAC; Geri TTTGAGGGTGCAGCGAACTT. |
| GraphPad Prism yazılımı | GraphPad Software | Version 9.4.1; RRID:SCR_02798 | İstatistiksel analiz ve grafikleme. Normallik, varyans homojenliği, ANOVA, Bonferroni düzeltmesi ve etki büyüklükleri çıktı dosyalarında tutulmalıdır. |
| Gusukang granülleri | Liaoning Wohua Kangchen Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | Geleneksel Çin tıbbı pozitif kontrolü. Kaynak dozu: 1.8 g/kg/gün veya 0.5 mL/10 g/gün. |
| Hematoksilen boyama solüsyonu | Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd. | N/A | Histolojik boyama. Kaynak prosedürde 5 dakikalık hematoksilen boyama kullanılmıştır. |
| Yüksek hızlı mikro santrifüj | N/A | TG16W | Serum ve nükleik asit prosedürleri için santrifüjleme. |
| Hologic çift enerjili X-ışını absorpsiyometresi | Hologic | N/A | Kemik mineral yoğunluğu analizi. Kaynak, in vivo ve ex vivo femoral taramalar bildirmektedir. |
| ImageJ yazılımı | National Institutes of Health | RRID:SCR_03070 | Western blot bantları için densitometrik kantifikasyon. Kaynak makalede versiyon belirtilmemiştir. |
| İndüksiyon ocağı | Midea | N/A | Çince ana cihaz tablosunda listelenmiştir. |
| İzofluran | N/A | N/A | Bilateral ovaryektomi ve DXA konumlandırması için anestezi. Revize protokol; indüksiyon, idame, yol ve anestezik derinlik kriterlerini belirtmelidir. |
| İzopropanol | N/A | N/A | Ekstraksiyon sırasında RNA presipitasyonu. |
| Sıvı azot | N/A | N/A | Lomber vertebra örneklerinin şok dondurulması. |
| Lycium barbarum, Gou Qi Zi | Beijing Tongrentang | N/A | Yin besleyici bileşen. Kaynaktaki tam formül dozu: 12 g, oran 4. |
| Mikroplaka okuyucu | N/A | AMR-10 | 450 nm'de ELISA absorbans deteksiyonu. |
| Mikroplaka yıkayıcı | N/A | APW-20 | ELISA plakaları için yıkama adımı. |
| MMLV ters transkriptaz | N/A | N/A | Ters transkripsiyon enzimi. |
| Nötr montaj medyumu | Sinopharm Group | N/A | Hematoksilen ve eozin boyalı lamlar için montaj medyumu. |
| Normal salin | N/A | N/A | Boş kontrol, şam-operasyon ve model grupları için taşıyıcı gavage. |
| Oligo(dT)18 primeri | N/A | N/A | Ters transkripsiyon için kullanılır. |
| Penisilin | N/A | N/A | Post-operatif enfeksiyon profilaksisi. Kaynak dozu: 3 gün boyunca intramüsküler 20,0 U/kg. |
| Düdüklü tencere | Xinfei | N/A | Çince ana cihaz tablosunda listelenmiştir. |
| Proteaz inhibitörü | N/A | N/A | Protein ekstraksiyonu sırasında eklenir. |
| Protein lizis tamponu | N/A | N/A | Western blotting için kemik dokusu protein ekstraksiyonu. |
| PVDF membran | N/A | N/A | Metanol ile aktive edilmiş Western blot transfer membranı. |
| qRT-PCR cihazı | N/A | N/A | EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP ve GAPDH için kantitatif ters transkripsiyon PCR. |
| Sıçan CTX-1 ELISA kiti | Jiyinmei | JYM026Ra | Serum tip 1 kolajen C-terminal telopeptidi için sandviç ELISA. 450 nm'de deteksiyon. |
| Sıçan P1NP ELISA kiti | Jiyinmei | JYM030Ra | Serum prokolajen tip 1 N-terminal propeptidi için sandviç ELISA. 450 nm'de deteksiyon. |
| Rehmannia glutinosa, Shu Di Huang | Beijing Tongrentang | N/A | Yin besleyici bileşen. Kaynaktaki tam formül dozu: 24 g, oran 8. |
| RhoA primer antikoru | Proteintech | N/A | Western blot antikoru. Kaynak dilüsyonu: 1:200. JoVE için RRID ve lot numarası gereklidir. |
| RhoA primer çifti | N/A | PCR ürünü 17 bp | İleri GTTTATGTGCCCACGGTGTT; Geri ACTATCAGGGCTGTCGATGG. Terminoloji RHoA'dan RhoA'ya harmonize edilmiştir. |
| RNaz inhibitörü | N/A | N/A | Ters transkripsiyon reaksiyonuna dahildir. |
| RNazden arındırılmış su | N/A | N/A | Kurutma sonrası RNA çözünmesi. |
| Rotary mikrotom | Leica | 2245 | Histolojik kesit alma. |
| Western blotting için sekonder antikor | N/A | N/A | Kaynak dilüsyonu: 1:150. JoVE için konakçı reaktivitesi ve RRID gereklidir. |
| Yağsız süt tozu, %5 | N/A | N/A | Western blotting için bloklama reaktifi, oda sıcaklığında 2 saat. |
| Lam yayma ve kurutma makinesi | Jinhua Yidi | N/A | Histoloji için lam hazırlama. |
| Sodyum pentobarbital, %3 | N/A | N/A | Çince ana belgede abdominal aorta kan alımı öncesi terminal anestezi. Nihai ötanazi prosedürü ve konfirmasyon yöntemi doğrulanmalıdır. |
| Standart örnek dilüenti | ELISA kiti ile birlikte sağlanır, Jiyinmei | Kit bileşeni | ELISA prosedüründe seri standart dilüsyonu için kullanılır. |
| TBST tamponu | N/A | N/A | Western blotting için yıkama tamponu. |
| Termostatik çalkalamalı inkübatör | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | N/A | Laboratuvar inkübasyonu ve çalkalama. |
| TRIzol reaktifi | N/A | N/A | 10 mg kemik dokusundan RNA ekstraksiyonu. |
| Dik mikroskop | Leica | DM10 | 20x'te hematoksilen ve eozin histoloji görüntüleme. |
| Su ceketli termostatik inkübatör | N/A | GNP-9080 | Analiz prosedürleri için inkübasyon. |
| Suda çözünür eozin boyama solüsyonu | Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd. | N/A | Histolojik karşıt boyama. Kaynak prosedürde 3 dakikalık eozin boyama kullanılmıştır. |
| Western blot elektroforez sistemi | N/A | N/A | Protein ayrımı. Kaynak elektroforez: başlangıçta 80 V, ardından 120 V. |
| Western blot görüntüleme sistemi | N/A | N/A | Kemilüminesans membran görüntüleme. Gönderim için kırpılmamış membranlar gereklidir. |
| Western blot transfer sistemi | N/A | N/A | Proteinlerin PVDF membrana transferi. Kaynak transfer koşulu: 40 mA, 90 dk, buz banyosu. |
| Ksilen | N/A | N/A | Histoloji sırasında dewaksasyon ve doku şeffaflaştırma. |
| Zuogui hap bileşen bitkileri | Beijing Tongrentang | N/A | Sekiz bitkili formülasyon: Rehmannia glutinosa, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Lycium barbarum, Chinemys reevesii plastron jelatini, Cyathula officinalis, Cuscuta australis ve Cervus elaphus geyik boynuzu jelatini. |
Kaynaklar
- Compston JE, McClung MR, Leslie WD. Osteoporosis. Lancet. 2019;393(10169):364-376. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(18)32112-3
- Shen Y, Huang X, Wu J, et al. The global burden of osteoporosis, low bone mass, and its related fracture in 204 countries and territories, 1990-2019. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:882241. https://doi.org/10.3389/fendo.2022.882241
- Zhao C, Irie N, Takada Y, et al. Bidirectional ephrinB2-EphB4 signaling controls bone homeostasis. Cell Metab. 2006;4(2):111-121. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2006.05.012
- Wu Z, Li W, Jiang K, et al. Regulation of bone homeostasis: signaling pathways and therapeutic targets. MedComm (2020). 2024;5(8):e657. https://doi.org/10.1002/mco2.657
- Reid IR, Billington EO. Drug therapy for osteoporosis in older adults. Lancet. 2022;399(10329):1080-1092. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(21)02646-5
- Li J, Sun K, Qi B, et al. An evaluation of the effects and safety of Zuogui pill for treating osteoporosis: current evidence for an ancient Chinese herbal formula. Phytother Res. 2021;35(4):1754-1767. https://doi.org/10.1002/ptr.6908
- Shi T, Liu T, Kou Y, et al. The synergistic effect of Zuogui Pill and eldecalcitol on improving bone mass and osteogenesis in type 2 diabetic osteoporosis. Medicina (Kaunas). 2023;59(8):1414. https://doi.org/10.3390/medicina59081414
- Yang S, Zhang B, Wang YG, et al. Zuo Gui Wan promotes osteogenesis via PI3K/AKT signaling pathway: network pharmacology analysis and experimental validation. Curr Med Sci. 2023;43(5):1051-1060. https://doi.org/10.1007/s11596-023-2782-x
- Qiu J, Zhu Y, Xing J, Wang L, Zhang J, Yin H. Comparative pharmacokinetic study of 5 active ingredients after oral administration of Zuogui Pill in osteoporotic rats with different syndrome types. Int J Anal Chem. 2023;2023:1473878. https://doi.org/10.1155/2023/1473878
- Gong W, Zhang N, Cheng G, et al. Rehmannia glutinosa Libosch extracts prevent bone loss and architectural deterioration and enhance osteoblastic bone formation by regulating the IGF-1/PI3K/mTOR pathway in streptozotocin-induced diabetic rats. Int J Mol Sci. 2019;20(16):3964. https://doi.org/10.3390/ijms20163964
- Wang K, Kou Y, Rong X, Wei L, Li J, Liu H, Li M, Song H. ED-71 improves bone mass in ovariectomized rats by inhibiting osteoclastogenesis through EphrinB2-EphB4-RANKL/OPG axis. Drug Des Devel Ther. 2024;18:1515-1528. https://doi.org/10.2147/DDDT.S454116
- Percie du Sert N, Hurst V, Ahluwalia A, et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 2020;18(7):e3000410. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000410
- Reagan-Shaw S, Nihal M, Ahmad N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB J. 2008;22(3):659-661. https://doi.org/10.1096/fj.07-9574LSF
- Eastell R, Szulc P. Use of bone turnover markers in postmenopausal osteoporosis. Lancet Diabetes Endocrinol. 2017;5(11):908-923. https://doi.org/10.1016/S2213-8587(17)30184-5
- Yao ZY, Fan SY, Song ZF, Li ZC. Network pharmacology-based and molecular docking-based analysis of You-Gui-Yin for the treatment of osteonecrosis of the femoral head. Medicine (Baltimore). 2023;102(43):e35581. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000035581
- Wang J, Xu C, Zhang J, Bao Y, Tang Y, Lv X, Ma B, Wu X, Mao G. RhoA promotes osteoclastogenesis and regulates bone remodeling through mTOR-NFATc1 signaling. Mol Med. 2023;29(1):49. https://doi.org/10.1186/s10020-023-00638-1
- Noviana E, Indrayanto G, Rohman A. Advances in fingerprint analysis for standardization and quality control of herbal medicines. Front Pharmacol. 2022;13:853023. https://doi.org/10.3389/fphar.2022.853023
- Fischer V, Haffner-Luntzer M. Interaction between bone and immune cells: implications for postmenopausal osteoporosis. Semin Cell Dev Biol. 2022;123:14-21. https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2021.05.014
- Komori T. Animal models for osteoporosis. Eur J Pharmacol. 2015;759:287-294. https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2015.03.028
- Dempster DW, Compston JE, Drezner MK, et al. Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 2013;28(1):2-17. https://doi.org/10.1002/jbmr.1805