Ovariektomi Yapılmış Sıçanlarda Zuogui Pill'in Osteoblast-Osteoklast Kenetlenmesini Modüle Etmesi: Üç x Üç Faktöriyel Bir Çalışma

Özet

Bu çalışma, üçlü üçlü faktöriyel bir tasarım kullanarak Zuogui Hapı'nın ovaryektomize sıçanlarda postmenopozal osteoporoz üzerindeki etkilerini değerlendirmektedir. Sonuçlar, mekanistik kanıtlar nedensel olmaktan ziyade ilişkisel kalmasına rağmen, Yin ve Yang bileşenlerinin kemik metabolizması ve ilgili EphB4/ephrinB2 yolak belirteçleri üzerindeki sinerjik etkilerini desteklemektedir.

Özet

Postmenopozal osteoporoz, östrojen eksikliğine bağlı olarak kemik oluşumu ve rezorpsiyonunun arasındaki dengenin bozulmasıyla tetiklenir. Bu çalışma, ovariektomize sıçan modelinde Zuogui Hapı'nın Yin-besleyici alt formülasyonlarının bağımsız ve etkileşimli etkilerini nicelleştirmiş ve EphB4/ephrinB2/RhoA/alkalen fosfataz yolu ile ilişkilerini incelemiştir. ARRIVE 2.0'a uygun olarak, spesifik patojen içermeyen 130 dişi Sprague-Dawley sıçan, üçlü üçlü faktöriyel tasarımındaki dokuz grup da dahil olmak üzere 13 gruba (n=10/grup) randomize edilmiştir. Sonlanım noktaları arasında P1NP, CTX-1, çift enerjili X-ışını absorbsiyometrisi (DXA) ile ölçülen femoral kemik mineral yoğunluğu, trabeküler histoloji ile ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu ve Western blotting ile ölçülen haberci ribonükleik asit ve protein ekspresyonu yer almıştır. Tam formülasyon (I2A2), model grubuna kıyasla daha yüksek P1NP, daha düşük CTX-1 ve daha yüksek BMD ile ilişkilendirilmiştir. Faktöriyel analiz, P1NP ve BMD arasında bir Yin-Yang etkileşimi tespit ederek farmakolojik sinerjiyi desteklemiştir. Moleküler değişiklikler, artmış EphB4/ephrinB2/ALP ekspresyonu ve azalmış RhoA ekspresyonu ile ilişkili bulunmuştur. Bu bulgular, Zuogui Hapı tedavisi, iyileşmiş kemik fenotipleri ve yol belirteçlerinin modülasyonu arasındaki ilişkiyi desteklemektedir; nedensel yol bağımlılığı ise inhibitör, nakavt ve ko-kültür doğrulaması gerektirmektedir.

Giriş

Postmenopozal osteoporoz (PMOP), geniş bir kadın popülasyonunu etkilemekte ve östrojen eksikliğiyle ilişkili, dengeli kemik oluşumu ve rezorpsiyonunun bozulmasıyla karakterize edilmektedir^1,2. EphB4/ephrinB2 reseptör-ligand sistemi, osteoblast-osteoklast iletişimini aracılar; EphB4 sinyalleri osteoblast farklılaşmasını ve alkali fosfataz (ALP) aktivitesini desteklerken, ephrinB2 ters sinyalleri RhoA ile ilişkili mekanizmalar aracılığıyla osteoklastogenezi kısıtlayabilmektedir^3,4. Östrojen eksikliği olan kemikte azalmış eşleşme, yeniden modellemenin her iki hücresel kolunu etkileyen müdahalelerin değerlendirilmesi için mekanistik bir temel oluşturmaktadır.

Antiresorptif ve anabolik ajanlar dahil olmak üzere mevcut osteoporoz tedavileri kırık riskini azaltır ancak uyum, maliyet, kontrendikasyonlar, rebound etkiler veya uzun süreli kullanım sırasındaki advers olaylar nedeniyle sınırlı kalabilir⁵. Bu nedenle, aşırı resorpsiyonu kısıtlarken kemik oluşumunu artıran aday tedaviler bilimsel açıdan güncelliğini korumaktadır.

Zuogui Hapı (ZGP; Zuo Gui Wan), geleneksel Çin tıbbında kemik zayıflığıyla ilişkili teorik bir patern olan böbrek-öz eksikliği için kullanılan klasik, çok bileşenli bir reçetedir. Yin besleyici bileşenler şunları içerir: Rehmannia glutinosa (işlenmiş kök, Shu Di Huang, 24 g), Dioscorea opposita (rizom, Huai Shan Yao, 12 g), Cornus officinalis (meyve, Shan Zhu Yu, 12 g), Lycium barbarum (meyve, Gou Qi Zi, 12 g), Chinemys reevesii plastron jelatini (plastron türevli jelatin, Gui Ban Jiao, 12 g) ve Cyathula officinalis (kök, Chuan Niu Xi, 9 g). Yang artırıcı bileşenler ise Cuscuta australis (tohum, Tu Si Zi, 12 g) ve Cervus elaphus boynuz jelatinini (boynuz türevli jelatin, Lu Jiao Jiao, 12 g) içerir. Klasik teoride, Yin içinde Yang arama prensibi, Yang artırıcı bitkilerin basit bağımsız katkı maddeleri olarak hareket etmek yerine, Yin besleyici bir tabanı potansiyelize edebileceğini öngörür. Klinik kanıtlar ve preklinik çalışmalar; BMD, osteogenez ve farmakokinetik davranış üzerindeki etkiler dahil olmak üzere ZGP'nin veya ZGP içeren müdahalelerin anti-osteoporotik aktivitesini bildirmiştir^6,7,8,9,10.

Bu çalışmanın özgünlüğü, Ovariektomize (OVX) sıçanlarda Yin-besleyici ve Yang-artırıcı bileşenlerin resmi üç çarpı üç faktöriyel ayrımının yapılması ve aynı zamanda kemik fenotipleri ile EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP yolu belirteçlerinin değerlendirilmesinde yatmaktadır. Bu tasarım, yol belirteçlerindeki değişikliklerin mekanistik olarak bloke edilmediği veya susturulmadığı sürece ilişkisel kalmaya devam ettiğini kabul ederken¹, formül uyumluluğu teorisini, yalnızca tam reçetenin veya tek bir karşılaştırıcının kullanıldığı çalışmalara göre daha doğrudan test etmektedir.

Protokol

Bu çalışmadaki tüm prosedürler, İç Moğolistan Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış (Onay No. YKD202404105) ve ARRIVE 2.0¹² ile uyumlu olarak yürütülmüştür.

Çalışma tasarımı

Çalışma, İç Moğolistan Tıp Üniversitesi'nin hayvan deney platformunda yürütülmüştür. İki faktörlü üç çarpı üç tam faktöriyel tasarım uygulanmıştır: Yin-besleyici baz formülasyonu (I; üç doz seviyesi: 0, 27, 54 g ham ilaç eşdeğeri) ve Yang-güçlendirici formülasyon (A; üç doz seviyesi: 0, 8, 16 g ham ilaç eşdeğeri), böylece dokuz faktöriyel hücre ve dört referans grubu elde edilmiştir. Faktöriyel tasarım Tablo 1'de gösterilmiştir. I2A2, klinik eşdeğer dozdaki tam ZGP formülünü temsil eder. Doz dönüşümünde vücut yüzey alanı yöntemi kullanılmıştır (sıçan: insan faktörü = 6,25)¹³.

Hayvanlar, randomizasyon ve körleme

Yüz otuz adet spesifik patojen taşımayan dişi Sprague-Dawley sıçan (6 aylık, 220–250 g), bilgisayar tarafından oluşturulan rastgele sayı tablosuna göre ayrılmıştır. Tahsis kodları, sonuç değerlendirmesinde yer almayan bir araştırmacı tarafından ardışık olarak mühürlü zarflara yerleştirilmiştir. Sıçanlar, 2 ± 2 ^oC sıcaklık ve %50–60 nem oranında, 12 saatlik ışık/karanlık döngüsü altında, havalandırmalı kafeslerde 3–4'erli olarak barındırılmış; ad libitum su, kalsiyum ve fosfor içeriği belgelenmiş standart kemirgen yemi, kafes aktivitesi ve çevresel zenginleştirme sağlanmıştır. Moleküler analizler, histolojik skorlama, görüntü nicelleştirmesi ve densitometre ölçümleri, gruplandırmadan habersiz araştırmacılar tarafından gerçekleştirilmiştir. Örneklem büyüklüğü, a priori güç analizi ile belirlenmiş ve grup başına n = 10 olarak saptanmıştır.

OVX modeli ve ilaç tedavisi

Bilateral OVX, hassas bir buharlaştırıcı ile iletilen inhale izofluran altında gerçekleştirilmiştir. Anestezi, oksijen içerisinde %3–4 konsantrasyonda indüklenmiş ve bir burun konisi aracılığıyla %1.5–2.5 düzeyinde sürdürülmüştür. Yeterli anestezi derinliği, stabil solunum ile birlikte pedal çekilme ve palpebra reflekslerinin kaybı ile doğrulanmıştır. OVX başarısı, cerrahiden 5 gün sonra vajinal östrus döngüsünün yokluğu ve 12 hafta sonra BMD azalması ile değerlendirilmiştir. Model doğrulaması sonrası, 8 hafta boyunca gavage uygulaması yapılmıştır (1 mL/10 g/gün). Dekoksiyonlar, kaynama noktasındaki ardışık su ekstraksiyonu ile hazırlanmıştır (10 °C, reflüks); önce 10 kat hacimde 2 saat, ardından 8 kat hacimde 1,5 saat süreyle işlem yapılmış, tıbbi gazlı bezin dört katmanından filtrelenmiş ve düşük basınç altında 0,968 g ham ilaç/mL konsantrasyona getirilmiştir. Konsantre ekstrakt 4 °C'de saklanmış ve hazırlanmasını takip eden 7 gün içinde kullanılmıştır. Pozitif kontroller Gusukang granülleri (1,8 g/kg/gün) ve dietilstilbestrol (0,04 mg/kg/gün) olarak belirlenmiştir. Deney sonunda sıçanlar, pedal ve kornea refleksleri kaybolana kadar %5 izofluran ile derin şekilde anestezi edilmiş, ardından kanları boşaltılmış ve servikal dislokasyona tabi tutulmuştur. Ölüm, kalp atışının ve solunumun durmasıyla doğrulanmıştır. Kadavralar ve dokular biyolojik atık olarak; kimyasal kalıntılar tehlikeli atık olarak; iğneler veya bıçaklar ise onaylı delici-kesici alet konteynerlerine atılmıştır.

Sonuç ölçümleri

Serum P1NP ve CTX-1 düzeyleri, sandviç ELISA (Jiyinmei) ile ölçülmüştür.¹⁴Femoral BMD, DXA ile nicel olarak belirlenmiştir. Trabeküler histoloji, 20x büyütmede hematoksilin ve eozin boyama ile değerlendirilmiştir. Gen ekspresyonu, 2'li RT-qPCR kullanılarak değerlendirilmiştir.^-ΔΔCt yöntem, gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH) normalize edildi. Protein ekspresyonu, Western blot ve ImageJ kantifikasyonu ile değerlendirildi (bakınız Materyaller Tablosu). Gözlemlenen moleküler ağırlıklar ve antikor katalog bilgileri şurada verilmiştir: Ek Tablo 1Primer dizileri şunlardı: EphB4 ileri/geri, 5'-CTAGACTCTTTCCTGCGGCT/GGGAACTTGTGTAGGTGGGA-3'; ephrinB2, 5'-CGGACAAGGCCTGGTACTAT/ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT-3'; RhoA, 5'-GTTTATGTGCCCACGGTGTT/ACTATCAGGGCTGTCGATGG-3'; ALP, 5'-CGGACACAAGCATTCCCAGA/TGGTGGAGCTGAACAGGCTT-3'; GAPDH, 5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC/TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'.

İstatistiksel analiz

Parametrik analizden önce normallik Shapiro-Wilk testi ile, varyans homojenliği ise Levene testi ile değerlendirildi. Veriler ortalama ± SD olarak ifade edilmiştir ve tüm nicel şekil hata çubukları SD'yi belirtmektedir. Ana etkileri ve I ile A etkileşimini tahmin etmek için dokuz faktöriyel hücreye, etki büyüklüğü olarak kısmi eta-kare (ηp²) kullanılarak iki yönlü faktöriyel ANOVA uygulandı. Tüm 13 grup arasındaki ikili karşılaştırmalar, Bonferroni düzeltmeli tek yönlü ANOVA kullanılarak gerçekleştirildi. İstatistiksel analizler GraphPad Prism programında yapıldı. Anlamlılık sembolleri tutarlı bir şekilde şu şekilde tanımlanmıştır: *, **, ***, **** modelle karşılaştırıldığında p <0.05, p <0.01, p <0.01, p <0.01 değerlerini; #, ##, ###, #### ise tam formüllü ZGP ile karşılaştırıldığında aynı eşik değerleri belirtmektedir.

Sonuçlar

Vajinal sitoloji ile model doğrulaması

OVX başarısı, cerrahiden sonraki 5 gün içinde östrus döngüsünün kaybı ile kanıtlandığı üzere tüm ovaryektomize hayvanlarda doğrulanmışken (Şekil 1A), sham operasyon uygulanan hayvanlar 4 günlük döngülerini korumuşlardır (Şekil 1B). 12. haftada DXA, OVX model grubunda sham kontrollere göre daha düşük femoral BMD göstermiş (0.214 ± 0.020'ye karşı 0.281 ± 0.019 mg/cm³; Bo...

Tartışma

Faktöriyel etkileşim terimi, ZGP'nin Yin-besleyici ve Yang-artırıcı bileşenleri arasındaki non-aditif bir ilişkiyi desteklemektedir. Bu sonuç, Yang-artırıcı bileşenlerin Yin-besleyici temeli aktive etmesinin veya potansiyelize etmesinin beklendiği, Yin içinde Yang arama şeklindeki geleneksel ilkeyle tutarlıdır¹⁵. Bu bulgu, formülasyon düzeyinde farmakolojik sinerji olarak yorumlanmalıdır. Etkiden sorumlu olan bireysel aktif bileşenleri tanımlamamaktadır.

EphB4 ve ephrin...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
%1 amonyaklı su	N/A	N/A	Hematoksilen diferansiyasyonu sonrası mavileştirme solüsyonu.
%1 hidroklorik asit alkol	N/A	N/A	Hematoksilen boyama için diferansiyasyon solüsyonu.
2x qPCR Mix	N/A	N/A	Kantitatif PCR master mix. Kaynak reaksiyon hacmi: reaksiyon başına 12.5 µL.
%4 paraformaldehit solüsyonu	N/A	N/A	Histolojik analiz için sol femur ve tibia örneklerinin fiksasyonu.
5x yükleme tamponu	N/A	N/A	Elektroforez öncesi örnek denatürasyonu.
ALP primer antikoru	Affinity Biosciences	N/A	Western blot antikoru. Kaynak dilüsyonu: 1:200. JoVE için RRID ve lot numarası gereklidir.
ALP primer çifti	N/A	N/A	ALP mRNA'sı qRT-PCR ile ölçülmüştür ancak ana primer tablosu ALP primer dizilerini sağlamamaktadır. Yazar onayı gereklidir.
Biyotin antikor reaktifi	ELISA kiti ile birlikte sağlanır, Jiyinmei	Kit bileşeni	ELISA sırasında örnek kuyucuklarına eklenir.
Cervus elaphus geyik boynuzu jelatini, Lu Jiao Jiao	Beijing Tongrentang	N/A	Yang artırıcı bileşen. Kaynaktaki tam formül dozu: 12 g, oran 4. Jelatin, dekoksiyona eritilmiştir.
Chinemys reevesii plastron jelatini, Gui Ban Jiao	Beijing Tongrentang	N/A	Yin besleyici bileşen. Kaynaktaki tam formül dozu: 12 g, oran 4. Jelatin, dekoksiyona eritilmiştir.
Kloroform	N/A	N/A	RNA ekstraksiyonu sırasında faz ayrımı.
Soğutma tablası	Leica	150	Kesit alma iş akışı için kriyojenik veya soğutma desteği.
Cornus officinalis, Shan Zhu Yu	Beijing Tongrentang	N/A	Yin besleyici bileşen. Kaynaktaki tam formül dozu: 12 g, oran 4.
Cuscuta australis, Tu Si Zi	Beijing Tongrentang	N/A	Yang artırıcı bileşen. Kaynaktaki tam formül dozu: 12 g, oran 4.
Cyathula officinalis, Chuan Niu Xi	Beijing Tongrentang	N/A	Yin besleyici bileşen. Kaynaktaki tam formül dozu: 9 g, oran 3.
DEPC ile işlem görmüş PBS	N/A	N/A	Sıvı azotla dondurma öncesi L4'ten L5'e lomber vertebraların durulanması.
Dietilstilbestrol	N/A	N/A	Batı tıbbı pozitif kontrolü. Kaynak dozu: 0.04 mg/kg/gün, 1 mL/10 g/gün. Ana belge aynı zamanda diethylstilbestrol olarak harmonize edilmesi gereken bir Çince nomenklatür tutarsızlığı içermektedir.
Dioscorea opposita, Huai Shan Yao	Beijing Tongrentang	N/A	Yin besleyici bileşen. Kaynaktaki tam formül dozu: 12 g, oran 4.
dNTP karışımı	N/A	N/A	Ters transkripsiyon reaksiyonuna dahildir.
ECL kemilüminesans reaktifi	N/A	N/A	Western blot deteksiyon reaktifi.
ELISA kromojenik reaktif A	ELISA kiti ile birlikte sağlanır, Jiyinmei	Kit bileşeni	ELISA için renk geliştirme reaktifi.
ELISA kromojenik reaktif B	ELISA kiti ile birlikte sağlanır, Jiyinmei	Kit bileşeni	ELISA için renk geliştirme reaktifi.
ELISA stop solüsyonu	ELISA kiti ile birlikte sağlanır, Jiyinmei	Kit bileşeni	ELISA renk reaksiyonunu sonlandırmak için kullanılır.
Enzim işaretli ELISA reaktifi	ELISA kiti ile birlikte sağlanır, Jiyinmei	Kit bileşeni	ELISA'daki boş olmayan kuyucuklara eklenir.
EphB4 primer antikoru	Proteintech	N/A	Western blot antikoru. Kaynak dilüsyonu: 1:200. JoVE için RRID ve lot numarası gereklidir.
EphB4 primer çifti	N/A	PCR ürünü 232 bp	İleri CTAGACTCTTTCCTGCGGCT; Geri GGGAACTTGTGTAGGTGGGA. Ana tablodaki Rat RphB4 yazım hatası Rat EphB4 olarak okunmalıdır.
ephrinB2 primer antikoru	Affinity Biosciences	N/A	Western blot antikoru. Kaynak dilüsyonu: 1:20. JoVE için RRID ve lot numarası gereklidir.
ephrinB2 primer çifti	N/A	PCR ürünü 172 bp	İleri CGGACAAGGCCTGGTACTAT; Geri ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT.
Etanol, absolut ve kademeli %95, %85, %75	N/A	N/A	Hematoksilen ve eozin boyama sırasında gradyant dehidrasyon ve rehidrasyon.
Dişi Sprague-Dawley sıçanlar	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	Hayvan sertifikası ve lisans numarası kaynak makalede sağlanmamıştır	Spesifik patojen içermeyen, 6 aylık, sağlıklı, gebe olmayan dişiler. Çince kaynak 230 ila 270 g; önceki İngilizce taslak 20 ila 250 g belirtmektedir. Gönderimden önce nihai bir aralık doğrulayın.
GAPDH primer antikoru	Servicebio	N/A	Yükleme kontrol antikoru. Kaynak dilüsyonu: 1:20. JoVE için RRID ve lot numarası gereklidir.
GAPDH primer çifti	N/A	PCR ürünü 253 bp	İleri ACAGCAACAGGGTGGTGGAC; Geri TTTGAGGGTGCAGCGAACTT.
GraphPad Prism yazılımı	GraphPad Software	Version 9.4.1; RRID:SCR_02798	İstatistiksel analiz ve grafikleme. Normallik, varyans homojenliği, ANOVA, Bonferroni düzeltmesi ve etki büyüklükleri çıktı dosyalarında tutulmalıdır.
Gusukang granülleri	Liaoning Wohua Kangchen Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	Geleneksel Çin tıbbı pozitif kontrolü. Kaynak dozu: 1.8 g/kg/gün veya 0.5 mL/10 g/gün.
Hematoksilen boyama solüsyonu	Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Histolojik boyama. Kaynak prosedürde 5 dakikalık hematoksilen boyama kullanılmıştır.
Yüksek hızlı mikro santrifüj	N/A	TG16W	Serum ve nükleik asit prosedürleri için santrifüjleme.
Hologic çift enerjili X-ışını absorpsiyometresi	Hologic	N/A	Kemik mineral yoğunluğu analizi. Kaynak, in vivo ve ex vivo femoral taramalar bildirmektedir.
ImageJ yazılımı	National Institutes of Health	RRID:SCR_03070	Western blot bantları için densitometrik kantifikasyon. Kaynak makalede versiyon belirtilmemiştir.
İndüksiyon ocağı	Midea	N/A	Çince ana cihaz tablosunda listelenmiştir.
İzofluran	N/A	N/A	Bilateral ovaryektomi ve DXA konumlandırması için anestezi. Revize protokol; indüksiyon, idame, yol ve anestezik derinlik kriterlerini belirtmelidir.
İzopropanol	N/A	N/A	Ekstraksiyon sırasında RNA presipitasyonu.
Sıvı azot	N/A	N/A	Lomber vertebra örneklerinin şok dondurulması.
Lycium barbarum, Gou Qi Zi	Beijing Tongrentang	N/A	Yin besleyici bileşen. Kaynaktaki tam formül dozu: 12 g, oran 4.
Mikroplaka okuyucu	N/A	AMR-10	450 nm'de ELISA absorbans deteksiyonu.
Mikroplaka yıkayıcı	N/A	APW-20	ELISA plakaları için yıkama adımı.
MMLV ters transkriptaz	N/A	N/A	Ters transkripsiyon enzimi.
Nötr montaj medyumu	Sinopharm Group	N/A	Hematoksilen ve eozin boyalı lamlar için montaj medyumu.
Normal salin	N/A	N/A	Boş kontrol, şam-operasyon ve model grupları için taşıyıcı gavage.
Oligo(dT)18 primeri	N/A	N/A	Ters transkripsiyon için kullanılır.
Penisilin	N/A	N/A	Post-operatif enfeksiyon profilaksisi. Kaynak dozu: 3 gün boyunca intramüsküler 20,0 U/kg.
Düdüklü tencere	Xinfei	N/A	Çince ana cihaz tablosunda listelenmiştir.
Proteaz inhibitörü	N/A	N/A	Protein ekstraksiyonu sırasında eklenir.
Protein lizis tamponu	N/A	N/A	Western blotting için kemik dokusu protein ekstraksiyonu.
PVDF membran	N/A	N/A	Metanol ile aktive edilmiş Western blot transfer membranı.
qRT-PCR cihazı	N/A	N/A	EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP ve GAPDH için kantitatif ters transkripsiyon PCR.
Sıçan CTX-1 ELISA kiti	Jiyinmei	JYM026Ra	Serum tip 1 kolajen C-terminal telopeptidi için sandviç ELISA. 450 nm'de deteksiyon.
Sıçan P1NP ELISA kiti	Jiyinmei	JYM030Ra	Serum prokolajen tip 1 N-terminal propeptidi için sandviç ELISA. 450 nm'de deteksiyon.
Rehmannia glutinosa, Shu Di Huang	Beijing Tongrentang	N/A	Yin besleyici bileşen. Kaynaktaki tam formül dozu: 24 g, oran 8.
RhoA primer antikoru	Proteintech	N/A	Western blot antikoru. Kaynak dilüsyonu: 1:200. JoVE için RRID ve lot numarası gereklidir.
RhoA primer çifti	N/A	PCR ürünü 17 bp	İleri GTTTATGTGCCCACGGTGTT; Geri ACTATCAGGGCTGTCGATGG. Terminoloji RHoA'dan RhoA'ya harmonize edilmiştir.
RNaz inhibitörü	N/A	N/A	Ters transkripsiyon reaksiyonuna dahildir.
RNazden arındırılmış su	N/A	N/A	Kurutma sonrası RNA çözünmesi.
Rotary mikrotom	Leica	2245	Histolojik kesit alma.
Western blotting için sekonder antikor	N/A	N/A	Kaynak dilüsyonu: 1:150. JoVE için konakçı reaktivitesi ve RRID gereklidir.
Yağsız süt tozu, %5	N/A	N/A	Western blotting için bloklama reaktifi, oda sıcaklığında 2 saat.
Lam yayma ve kurutma makinesi	Jinhua Yidi	N/A	Histoloji için lam hazırlama.
Sodyum pentobarbital, %3	N/A	N/A	Çince ana belgede abdominal aorta kan alımı öncesi terminal anestezi. Nihai ötanazi prosedürü ve konfirmasyon yöntemi doğrulanmalıdır.
Standart örnek dilüenti	ELISA kiti ile birlikte sağlanır, Jiyinmei	Kit bileşeni	ELISA prosedüründe seri standart dilüsyonu için kullanılır.
TBST tamponu	N/A	N/A	Western blotting için yıkama tamponu.
Termostatik çalkalamalı inkübatör	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	N/A	Laboratuvar inkübasyonu ve çalkalama.
TRIzol reaktifi	N/A	N/A	10 mg kemik dokusundan RNA ekstraksiyonu.
Dik mikroskop	Leica	DM10	20x'te hematoksilen ve eozin histoloji görüntüleme.
Su ceketli termostatik inkübatör	N/A	GNP-9080	Analiz prosedürleri için inkübasyon.
Suda çözünür eozin boyama solüsyonu	Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Histolojik karşıt boyama. Kaynak prosedürde 3 dakikalık eozin boyama kullanılmıştır.
Western blot elektroforez sistemi	N/A	N/A	Protein ayrımı. Kaynak elektroforez: başlangıçta 80 V, ardından 120 V.
Western blot görüntüleme sistemi	N/A	N/A	Kemilüminesans membran görüntüleme. Gönderim için kırpılmamış membranlar gereklidir.
Western blot transfer sistemi	N/A	N/A	Proteinlerin PVDF membrana transferi. Kaynak transfer koşulu: 40 mA, 90 dk, buz banyosu.
Ksilen	N/A	N/A	Histoloji sırasında dewaksasyon ve doku şeffaflaştırma.
Zuogui hap bileşen bitkileri	Beijing Tongrentang	N/A	Sekiz bitkili formülasyon: Rehmannia glutinosa, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Lycium barbarum, Chinemys reevesii plastron jelatini, Cyathula officinalis, Cuscuta australis ve Cervus elaphus geyik boynuzu jelatini.