Yöntem makalesi

Mitokondriyal Solunum Süperkomplekslerinin Fonksiyonel Rekonstitüsyonu

59 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/72243

⸱

21 Ağustos 2026

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Korele yapısal ve fonksiyonel karakterizasyon için fonksiyonel mitokondriyal solunum süperkomplekslerinin iyi tanımlanmış proteolipozomlar içine yeniden konfigüre edilmesi için basit bir protokol sunuyoruz.

Özet

Mitokondriler, biyoenerjetik metabolizmanın merkezi merkezleridir ve ATP'nin birincil kaynağıdır. İç mitokondriyal membran, elektron taşıma zinciri komplekslerini (CI, CII, CIII) içeren oksidatif fosforilasyon sistemine ev sahipliği yapar.2ve CIV) ve ATP sentaz (CV). Memelilerde, CI, CIII2, ve CIV, SC I+III gibi süperkompleksler (SC'ler) adı verilen yüksek dereceli yapılar oluşturur2+IV, SC I+III2ve SC III2+IV. SC oluşumunu destekleyen fizyolojik faktörler henüz tam olarak açıklığa kavuşmamış olsa da, SC oluşumunun kompleksler arasındaki elektron transfer hızlarını artırabileceği, reaktif oksijen türleri üretimini azaltabileceği veya yoğun şekilde paketlenmiş mitokondriyal iç membran içinde nonspesifik protein agregasyonunu önleyebileceği öne sürülmüştür. Solunumsal SC'lerin yapısal ve fonksiyonel çalışmaları büyük ölçüde deterjanla ekstrakte edilmiş komplekslere dayanmıştır. Bu çalışmalar elektron taşıma zincirine dair anlayışımızı geliştirmiş olsa da, sızdırmaz bir membran çift tabakasının yokluğu, süperkompleks montajının fonksiyonel avantajlarını inceleme kapasitelerini sınırlamaktadır. Bununla birlikte, son gelişmeler, membran proteinlerinin yeniden oluşturulmuş, doğal benzeri membran ortamlarında yapısal olarak karakterize edilebileceğini göstererek bu araştırmalar için daha fizyolojik bir bağlam sunmuştur. Burada, solunumsal SC'lerin lipozomlara yeniden konfigüre edilmesi için basit, hızlı ve tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem; farklı lipid kompozisyonlarının, protein konsantrasyonunun ve membran potansiyelinin solunumsal SC'lerin fonksiyonu üzerindeki etkilerinin test edilmesine olanak tanıyarak gelecekteki mekanistik çalışmalar için değerli bir araç sağlamaktadır.

Giriş

Mitokondriler, ökaryotik solunumun merkezinde yer alır. İç mitokondriyal membran (IMM), elektron taşıma zinciri komplekslerini (CI–CIV) ve ATP sentazı (CV) içeren oksidatif fosforilasyon sistemine ev sahipliği yapar1. CI ve CII, elektronları indirgenmiş substratlardan ubikinona (CoQ) aktararak ubikinol (CoQH2) üretir; ubikinol elektronları CIII2 üzerinden ve sitokrom c aracılığıyla, oksijenin suya indirgendiği CIV'e iletir. CI, CIII2 ve CIV tarafından gerçekleştirilen proton pompalama, CV tarafından ADP ve inorganik fosfattan (P) ATP sentezlemek için kullanılan proton motive kuvvetini (PMF) oluşturur1.

CI, CIII2 ve CIV, bağımsız olarak işlev görmelerinin yanı sıra; SC I+III2+IV (respirasom olarak da bilinir), SC I+III2 ve SC III2+IV gibi belirli stokiyometrilere sahip daha yüksek dereceli süperkompleks (SC) yapıları oluşturabilirler2,3,4,5. Bu düzenlemelerin fonksiyonel avantajları henüz netleşmemiştir6. İşlevlerine dair hipotezler, montaj ve substrat kanallama rollerinden, iç mitokondriyal membranındaki (IMM) yüksek protein yoğunluğunun bir yan ürünü olmaya kadar geniş bir yelpazeye yayılmaktadır3,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Güncel çalışmalar; hidrofobik uyumsuzluğun tetiklediği membran gerginliği, protein-protein etkileşimleri ve protein-lipid etkileşimleri dahil olmak üzere membran özelliklerinin, SC oluşumuna ve stabilitesine katkıda bulunduğunu göstermektedir16.

Membran proteinlerinin yapısal ve fonksiyonel çalışmaları geleneksel olarak, doğal membran ortamlarını bozan ve membran potansiyeline ile iyon gradyanlarına bağlı süreçlerin incelenmesini sınırlayan deterjanla çözünürleştirilmiş komplekslere dayanmıştır. Buna karşılık, son gelişmeler membran proteinlerinin rekonstite edilmiş17,18,19 veya doğal membranlar20,21,22,23 içinde yapısal olarak karakterize edilebileceğini göstermekte olup, bu durum membran potansiyeli ve iyon gradyanlarına dayalı membran proteini fonksiyonel mekanizmalarını inceleme yeteneğimizi önemli ölçüde artırmaktadır.

Bu protokol, mitokondriyal solunum süperkomplekslerinin (SC'ler) tanımlı proteolipozomlara yeniden konstrükte edilmesi için basit ve tekrarlanabilir bir yöntemi tanımlamaktadır. Elde edilen sistem, kontrollü ve doğal benzeri bir membran ortamında solunum SC oluşumu, stabilitesi ve fonksiyonu ile ilgili temel soruların araştırılması için güçlü bir platform sağlamaktadır. Yeniden konstrüksiyon sırasında CoQ10 ve sitokrom c ekleyerek, proteolipozomla yeniden konstrükte edilmiş SC'lerin NADH ile tetiklenen oksijen tüketimini desteklediğini ve böylece komplekslerin lipid çift tabakası içinde fonksiyonel olarak yetkin kaldıklarını göstermekteyiz. Ayrıca, SC'lerin kriyojenik elektron mikroskobu (cryo-EM) kullanılarak proteolipozomlarda kolayca görselleştirilebildiğini, böylece yapısal organizasyon ile biyokimyasal aktivite arasında doğrudan bir korelasyon kurulabildiğini göstermekteyiz.

Yöntem sağlam ve kolayca tekrarlanabilir olsa da, başarılı bir rekonstitüsyon; süperkompleks stabilitesini ve aktivitesini korumak için lipid kompozisyonunun, deterjan konsantrasyonunun, protein-lipid oranının dikkatli optimizasyonuna ve etkin membran sızdırmazlığına bağlıdır.

Bu yöntemin genel amacı, tanımlanmış membran koşulları altında solunum SC'lerinin entegre yapısal ve fonksiyonel analizini sağlamaktır. Bu yaklaşım, SC'leri bir membran potansiyeli oluşumunu ve fizyolojik olarak ilgili protein-lipid etkileşimlerini destekleyebilecek sızdırmaz bir lipid çift katmanına geri döndürerek, deterjan tabanlı sistemlerin temel kısıtlamalarını giderir. Ayrıca sistem; lipid kompozisyonu, kofaktörler ve protein içeriği üzerinde hassas kontrol imkanı sağlayarak, membran özelliklerinin SC stabilitesini ve aktivitesini nasıl etkilediğinin sistematik olarak test edilmesi için oldukça uygundur. Deterjanla çözünürleştirilmiş preparatlara veya in situ yaklaşımlara kıyasla bu yöntem, NADH ile tetiklenen oksijen tüketimi gibi fonksiyonel analizleri cryo-EM tabanlı yapısal analizlerle birleştirme avantajı sunmakta ve böylece diğer sistemlerle elde edilmesi zor olan yapı-fonksiyon korelasyonlarını mümkün kılmaktadır.

Protokol

Domuz kalp mitokondriyal membranları, insan tüketimi için kesilen hayvanlardan elde edilen ve ticari olarak satın alınan kalp dokularından izole edilmiştir. Bu protokol için özel olarak canlı hayvan kullanılmamıştır. Dokunun, insan tüketimi için kesilen hayvanların bir yan ürünü olarak elde edilmiş olması nedeniyle, bu materyalin kullanımı hayvan etiği onayından muaf tutulmuştur.

1. Domuz kalp mitokondrisi yıkanmış membranlarından mitokondriyal süperkompleks SC I+III2/SC I+III2+IV saflaştırılması

  1. Yıkanmış mitokondriyal membranların 40 mg'ını (4 mL), 10 mg/mL'lik alikotlar halinde çözdürün (yıkanmış membranlar daha önce bildirildiği şekilde hazırlanmıştır24,25).
  2. Membranları 4 mL Buffer MX (30 mM HEPES, pH 7.7, 150 mM potasyum asetat, %10 gliserol, 1 mM EDTA, %0.002 (a/h) fenilmetilsülfonil florür, %0.1 (a/h) CHAPS (3-[(3-kolamidopropil)dimetilammonio]-1-propanesülfonat), 1 mM potasyum ferisiyanür) içinde seyreltin. Buffer MX içinde %2 (a/h) digitonin'den 8 mL ekleyin (8 mL'de 160 mg digitonin; final oran 4:1, (mg digitonin: mg toplam membran proteini). Final hacim 16 mL'dir.
  3. Kabarcık oluşmamasına dikkat ederek bir Dounce homojenizatöründe manuel olarak homojenize edin (50 vuruş). 4 °C'de 1 saat boyunca inkübe edin (tumble).
  4. Homojenatı 16,000 × g, 4 °C'de 30 dk boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı toplayın.
  5. Süpernatantı, 3000 × g, 4 °C'de 100 kDa kesme sınırına sahip bir santrifüj filtre konsantratörü kullanarak 1 mL'ye konsantre edin. İstenilen hacme ulaşana kadar, santrifüj işlemleri arasında iyice karıştırarak 10 dakikalık döngüler halinde konsantre edin (santrifüj döngüleri arasında resüspansiyon yapılmazsa, filtrenin yakınındaki deterjanın artan yerel konsantrasyonu nedeniyle numuneler agregasyon eğilimi gösterir).
  6. Konsantre numuneyi dört adet 250 µL'lik alikota ayırın. 
  7. Boyut dışlama kromatografisi kolonunu (kolon hacmi: 24 mL), 48 mL (2 kolon hacmi) boyut dışlama kromatografisi tamponu (SEC tamponu; 30 mM HEPES pH 7.8, 150 mM potasyum asetat, 1 mM EDTA, %0.005 glikozid deterjanı) ile dengeleyin.
  8. Kromatografi programını, 6 mL elüsyon hacminden başlayıp 24 mL elüsyon hacmine kadar 1 mL'lik fraksiyonlar toplayacak şekilde ayarlayın. 250 µL'lik bir alikotu (adım 1.6'dan) 24 mL'lik bir boyut dışlama kromatografisi reçinesine enjekte edin. Boyut dışlama kromatografisi tamponu ile önceden dengelenmiş kolonu kullanın (adım 1.7'den). Bir sonraki çalışmaya başlamadan önce fraksiyonları fraksiyonatörden toplayın.
  9. Adım 1.6'dan kalan konsantre alikotlar için 1.7 ve 1.8 adımlarını tekrarlayın.
  10. SEC çalışmalarından elde edilen her fraksiyondan 10 µL'yi, 5 µL mavi-native poliakrilamid jel elektroforezi (BN-PAGE) yükleme boyası ile karıştırarak %3–12 akrilamid gradyanında yürütün ve fraksiyonlardaki CI aktivitesini kontrol etmek için bir NADH/Nitro tetrazolyum mavi klorür CI jel içi aktivite testi26  gerçekleştirin. 
    NOT: Solunum SC'leri, yaklaşık 11.5 mL elüsyon hacminde 24 mL'lik çapraz bağlı agaroz jel filtrasyon ortamından elüe olur.
  11. CI jel içi aktivite testinde maksimum yüksek MW CI aktivitesi gösteren fraksiyonları birleştirin. Numuneyi yukarıdaki 1.5'te açıklandığı gibi konsantre edin.
    NOT: Glikozid deterjan gliko-diosgenin GDN içindeki konsantre SC'ler, yaklaşık 10 mg/mL final konsantrasyonda %30 (v/v) gliserol ile Sıvı N2 içinde saklanabilir. Yıkanmış 40 mg mitokondriyal kompleks, BCA testine göre 3.4 mg toplam protein sağlamıştır.

2. Lipid karışımının hazırlanması

NOT: Daha önce raporlanan protokollerden27,28 modifiye edilmiştir. Kloroform toksiktir, uçucudur ve şüphelenilen bir kanserojendir. Yalnızca uygun KKD ile sertifikalı bir kimyasal çeker ocakta çalışın. Pentan yüksek derecede yanıcıdır. Ateş kaynaklarından uzak tutun. Yalnızca uygun KKD ile sertifikalı bir kimyasal çeker ocakta çalışın. Organik çözücü atıklarını, kurumsal EH&S politikalarına uygun olarak onaylı halojenli/halojensiz çözücü atık konteynerlerine atın.

  1. Çeker ocak altında, POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glisero-3-fosfokolin), POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glisero-3-fosfoetanolamin) ve CL (kardiyolipin: 1,3-bis(sn-3’-fosfatidil)-sn-gliserol; sığır kalp dokusundan) için ayrı ayrı kloroform içinde 25 mg/mL stok çözeltiler hazırlayın. 
  2. Kloroform içinde 10 mM CoQ10 hazırlayın. 25 mg toplam lipid karışımı için, stok çözeltilerden 0,4 mL (10 mg) POPC, 0,4 mL (10 mg) POPE, 0,2 mL (5 mg) CL ve 50 µL 10 mM CoQ10 (final 500 nmol CoQ10 (20 nmol CoQ10/mg lipid))'i 13 mL'lik cam bir test tüpüne ekleyin. POPC:POPE:CL'nin ağırlıkça final oranı 2:2:1'dir.
  3. Kloroformu uzaklaştırmak için karışımı inert bir gaz akımı (argon veya azot) altında kurutun; bu sırada tüpü nazikçe döndürerek lipid karışımının tüp duvarları boyunca ince bir tabaka oluşturmasını sağlayın. Sabit bir inert gaz akımı ile 10 dk boyunca kurutun.
  4. Kurutulmuş lipid tabakasını 1 mL pentan ile yeniden çözün ve kalıntı kloroformun uzaklaştırılmasını kolaylaştırmak için adım 2.3'ü tekrarlayın.
  5. Çözücüleri tamamen uzaklaştırmak için kurutulmuş lipid tüpünü oda sıcaklığında bir vakum desikatöründe gece boyunca inkübe edin. 
  6. Lipid karışımını rehidrate etmek için 5 mL Proteolipozom Tamponu (PLB; 10 mM MOPS pH 7.4, 150 mM KCl) ekleyin, herhangi bir dökülmeyi önlemek için tüpü sıkıca kapatın ve lipidler tamamen çözünene kadar (kurumuş lipidler artık tüp yüzeyinde görünmeyecek şekilde) nazikçe vorteksleyin.
  7. Kapağı açın, tüpü inert gaz (argon veya azot) ile doldurun, tüpü tekrar kapatın ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. 1 saatlik inkübasyonun ardından, lipid karışımından 300 µL'lik alikotlar hazırlayın ve −20 °C'de saklayın. 
    NOT: POPC:POPE:kardiyolipin (2:2:1) karışımı, ampirik optimizasyona ve PE ile kardiyolipinin mitokondriyal iç membranın ana bileşenleri olmasına dayanarak seçilmiştir; ancak protokol, alternatif lipid kompozisyonlarını test etmek için kolayca uyarlanabilir.

3. Mitokondriyal SC'lerin lipozomlara yeniden yapılandırılması

  1. Sıvı N 2  (adım 1.12) içinde saklanan SC alikotlarını buz üzerinde çözdürün. Örnekteki gliserolü uzaklaştırmak için örneği SEC tamponunda yeniden süspanse ederek bir tampon değişimi gerçekleştirin. Örneği, 4 °C'de 3000 × g hızında, 100 kDa kesim noktalı santrifüj filtreleri kullanarak konsantre edin. Konsantrasyon santrifüjleri arasında (~her 5 dakikada bir), örneği SEC tamponunda yeniden süspanse ederek tampon değişimine devam edin.
  2. SC'nin nihai konsantrasyonunu bir BCA testi (bir bisinkoninin asit protein analiz kiti) kullanarak kontrol edin.
  3. Adım 2.7'de hazırlanan lipid karışımının 300 µL'lik bir alikotunu çözdürün ve oda sıcaklığında, 100 nm polikarbonat membran ile monte edilmiş bir ekstrüzyon cihazı aracılığıyla altı döngü boyunca ekstrüde edin (bir döngü, lipid karışımının sol şırıngadan sağa ve tekrar geri geçirilmesinden oluşur). Ekstrüzyon döngüleri tamamlandıktan sonra, oluşan 100 nm liposomları başlangıç tarafının karşı tarafındaki şırıngadan toplayın. Alternatif olarak, liposomlar sonikasyon yoluyla da üretilebilir. 
  4. Ayrı bir tüpte, ekstrüde edilmiş 250 µL lipid karışımına 9 µL %20 (w/v) deterjan (nihai konsantrasyon %0.6 w/v) ekleyin.
    NOT: Farklı deterjanlar denenebilir. Bu deneyler için anyonik bir safra tuzu deterjanı olan sodyum kolat en iyi sonucu vermiştir.
  5. Ters çevirerek karıştırın ve 4 °C'de 30 dk inkübe edin. 
  6. Karışıma 120 µg (veya daha fazla) mitokondriyal SC ve 3 µL 10 mM sitokrom c (nihai konsantrasyon 100 µM) ekleyin. Hacmi PLB ile 300 µL'ye tamamlayın. Nihai lipid:protein oranı yaklaşık olarak 10:1 (w:w) şeklindedir. Ek bir kontrol olarak, mitokondriyal SC'ler ve sitokrom c yerine lipid-deterjan karışımına SEC tamponu (30 mM HEPES, pH 7.8, 150 mM potasyum asetat, 1 mM EDTA, %0.005 glikozid deterjan) ekleyerek paralel olarak boş liposomlar üretin. 
  7. Ters çevirerek karıştırın ve 4 °C'de 30 dk inkübe edin. 
  8. G-25 reçinesi içeren önceden doldurulmuş bir tuzsuzlaştırma spin kolonunu, yer çekimi akışını kullanarak dört kez PLB tamponu ile yıkayın. Ardından, kolonu 1.000 × g hızında 2 dk boyunca santrifüjle yıkayın.
  9. Proteolipozom örneğini yıkanmış önceden doldurulmuş G-25 reçineli tuzsuzlaştırma spin kolonuna ekleyin ve deterjanı uzaklaştırmak için kolonu 4 °C'de 1.000 × g hızında 2 dk boyunca santrifüjleyin. Elüatı toplayın.
    NOT: Ekstrüzyonla hazırlanan liposomlar, sonikasyonla üretilenlere göre daha homojen bir boyut dağılımı sergilemiştir. Örneğin deterjanla kontamine olmasını önlemek için, önceden doldurulmuş tuzsuzlaştırma spin kolonunu üreticinin önerdiğinden daha uzun süre santrifüjlemeyin. Proteolipozomlar 4 °C'de saklanmış ve potansiyel aktivite kaybını minimize etmek ve süperkompleks bütünlüğünü korumak için genellikle 36 saat içinde kullanılmıştır.

4. Lipid flotasyon analizi29

  1. PLB içerisinde %27 ve %7 (w/v) sakroz çözeltileri hazırlayın. 3,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne 1,5 mL %27'lik sakroz ve 0,9 mL %7'lik sakroz ekleyerek katmanlar oluşturup bir basamak gradyanı hazırlayın.
  2. SC içeren 300 µL proteolipozomu (adım 3.9'dan) sakroz gradyanının üzerine nazikçe ekleyin. Gradyanları, sabit açılı bir rotorda 4 °C'de 2 saat boyunca 100,000 × g hızda santrifüjleyin.
  3. Yukarıdan aşağıya doğru 300 µL'lik dokuz fraksiyon (veya 270 µL'lik 10 fraksiyon) dikkatlice toplayın (karıştırmamaya çalışın). Varsa peleti, son fraksiyonda yeniden süspande edin ve bunu 9. veya 10. fraksiyon olarak toplayın. Rekonstitüe olmamış tüm SC'ler 9. veya 10. fraksiyonda birikmelidir.
    NOT: Flotasyon analizi, rekonstitüe proteolipozomların boş lipozomlardan ve rekonstitüe olmamış protein komplekslerinden ayrılmasına yardımcı olur. Rekonstitüyonu optimize etmek için kullanılır.

5. CI spektroskopik ferrisiyanid aktivite analizi ve CI jel içi aktivite analizi

  1. Gerekli miktarda ferrisiyanid reaksiyon tamponu (FRB; 20 mM Tris HCl, pH 7.4, 50 mM NaCl, %0.1 w/v 3-[(3-kolamidopropil)dimetilammonio]-1-propanesülfonat (CHAPS), 1 mM potasyum ferrisiyanid) hazırlayın.
  2. 1 mL'lik bir küvete 990 µL reaksiyon tamponu ekleyin. Küvete örneğin (her bir gradyan fraksiyonundan) 5 µL'sini ekleyin, ardından reaksiyona 5 µL 20 mM NADH (final konsantrasyonu 100 µM) ekleyin. Küveti şeffaf film ile kapatın ve ters çevirerek karıştırın.
  3. Bir spektrometrede, 25 °C'de 340 nm'deki absorbans azalma hızını izleyin. 340 nm'deki absorbans azalması, NADH oksidasyonunu gösterir. Tüm fraksiyonlar için işlemi üç kez tekrarlayın. Kör (blank) değerini kaydetmek için örnek yerine 5 µL PLB kullanın.
  4. Kör değeri çıkarıldıktan sonra NADH oksidasyon hızını hesaplayın ve fraksiyonların her birinin toplam aktivitesini grafiğe aktarın.
    NOT: Alternatif olarak, deney 96 kuyucuklu bir plakada gerçekleştirilebilir.
  5. Maksimum toplam aktiviteye sahip fraksiyonları birleştirin (tüpün dibinde aktivite içeren fraksiyonlardan kaçının, çünkü bunlar yeniden konstitüe edilmemiş proteine karşılık gelir). Sakkarozu seyreltmek için birleştirilen fraksiyonların toplam hacmini PLB ile 20 mL'ye tamamlayın.
  6. Örnekleri sabit açılı bir rotorda, 4 °C'de 1 saat boyunca 150,000 × g hızında santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve peleti 200 µL PLB içinde yeniden süspande edin.
  7. Yukarıdaki adımdan elde edilen yeniden süspande peletin 25 µL'sini, PLB içindeki %2 w/v digitonin'in 25 µL'si ile karıştırın ve 4 °C'de 1 saat boyunca inkübe edin (takla döndürün).
  8. Ekstraksiyonu gerçekleşmemiş proteinleri 16,000 × g hızında 20 dakika boyunca çöktürün. Süpernatantı toplayın.
  9. Süpernatantın 30 µL'sine 10 µL BN-PAGE yükleme boyası ekleyin ve %3–12 gradyan BN-PAGE'e yükleyin. CI ve CIV jel içi aktivite analizlerini gerçekleştirmek için iki jel çalıştırın26.
  10. Jeli, koyu BN-PAGE tamponu (25 mM Tris, 0.192 g Glisin, 200 mg Coomassie blue) ile 150 V'da 30 dakika boyunca çalıştırın. Koyu mavi tamponu açık mavi tamponla (25 mM Tris, pH 8.3, 0.192 g Glisin, 20 mg Coomassie blue) değiştirin ve 200 V'da 2 saat daha çalıştırın.
  11. Çalışma tamamlandıktan sonra jelleri uygun bir kaba aktarın ve CI ile CIV jel içi aktivite analizlerini gerçekleştirin26.
    NOT: Lipozomlarda yeniden konstitüe edilen komplekslerin yapısal ve fonksiyonel çalışmaları için, adım 5.6'dan kalan yeniden süspande proteolipozomları kullanın. Rekonstitüsyon tamamen optimize edildiğinde, 4. ve 5. adımlar atlanabilir ve adım 3'ten gelen rekonstitüe proteolipozomlar doğrudan kullanılabilir.

6. Rekonstitüe proteolipozomların membran bütünlüğünü ölçmek için ACMA floresan sönümleme analizi29

  1. Gerekli miktarda ACMA (9-amino-6-kloro-2-metoksiakridin) reaksiyon tamponu (10 mM MOPS pH 7.4, 15 mM KCl, 4 µM ACMA, 0.5 mg/mL sığır serum albümini (BSA), 2 mM 2-Merkaptoetanol) hazırlayın. 
  2. 1 mL'lik bir küvete 930 µL reaksiyon tamponu paylaştırın. Küvete 50 µL rekonstitüe proteolipozom ekleyin, küveti kapatın ve ters çevirerek karıştırın. Işıktan uzak bir ortamda 8 dk inkübe edin.
  3. Spektrometrenin parametrelerini şu şekilde ayarlayın: Eksitasyon dalga boyu 410 nm, Emisyon dalga boyu 490 nm. 
  4. İnkübasyon sonrası küveti tekrar ters çevirerek karıştırın ve floresansı oda sıcaklığında spektrometre ile 8 dk boyunca okuyun.
  5. Küvete 4 µL 20 µM valinomisin (final konsantrasyonu 80 nM) ekleyin, ters çevirerek karıştırın ve 8 dk boyunca ölçüm yapın.
  6. Küvete 6 µL 1 mM CCCP (karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon) (final konsantrasyonu 6 µM) ekleyin, ters çevirerek karıştırın ve 8 dk boyunca ölçüm yapın.
  7. Boş vezikül kontrolü oluşturmak için, 6.2–6.6 arasındaki adımları tekrarlayın ancak rekonstitüe proteolipozomlar yerine “boş lipozomlar” kullanın. Boş lipozomlar, rekonstitüe proteolipozomlarla aynı adımlar izlenerek üretilir, ancak rekonstitüsyon sırasında SC eklemesi yerine (adım 3.6) SEC tamponu kullanılır.
  8. Hem rekonstitüe proteolipozomlar hem de boş lipozomlar için ölçümü üç tekrarlı olarak gerçekleştirin ve rölatif floresans değerlerini zamana karşı grafiğe dökün.
    NOT: Rekonstitüe proteolipozomlardan veya boş lipozomlardan elde edilen veriler (Fi − Fmin)/(Fmax−Fmin) formülü ile ölçeklendirilir; burada Fmax ilgili örneğin başlangıç bazal floresans değeri, Fmin ise CCCP eklendikten sonraki en düşük bazal değerdir.
    UYARI: CCCP toksik bir mitokondriyal ayrıştırıcıdır (uncoupler) ve çeker ocak altında, eldiven kullanılarak işlenmelidir.

7. Rekonstite edilmiş SC'lerin fonksiyonunu değerlendirmek için oksijen tüketiminin respirometri ölçümleri30.

NOT: Oksijen tüketim hızı, Clark tipi bir oksijen elektrot sistemi kullanılarak ölçülür. Rekonstitüe edilen SC'lerin fonksiyonel analizleri, doğrudan tuz giderme kolonundan (adım 3.9) elde edilen elüat üzerinde gerçekleştirilir.

  1. Oksijen elektrodu sistem cihazını üretici talimatlarına göre kurun ve cihaz kontrol yazılımını açın. Ölçüm odasına 2 mL ultrapure su ekleyin.
  2. Karıştırma hızı arttırıldığında oksijen konsantrasyonu grafiği değişmeyene kadar karıştırma hızını ayarlayın (10'dan başlayın, 10'ar birim artırın). MQ suyu uzaklaştırın ve oksijenle doyurulmuş su (bir şişe içindeki MQ suyunun şiddetle çalkalanmasıyla elde edilen) ekleyin.
  3. Kalibre et > Sıvı faz kalibrasyonu > Hava ile doyurulmuş su seçeneklerine tıklayın ve kalibrasyonun stabilize olmasını bekleyin (hız 0 nmol/dk). Odada sıfır oksijen sağlamak için reaksiyon kabına küçük bir spatula ile birkaç (4–6) adet sodyum ditiyonit kristali ekleyin.
  4. Devam etmeden önce sinyalin platoya ulaşmasını bekleyin. Kalibrasyonu kaydedin ve reaksiyon odasını sırasıyla 5 × 1 mL %70 etanol, 5 x 1 mL 0,1 mM EDTA, 5 × 1 mL MQ su ve 5 × 1 mL oksigraf reaksiyon tamponu (ORB; 150 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7,4, 5 mM MgCl2, 5 mM KH2PO4, 0,02 mM EGTA, 0,5 mg/mL BSA) ile temizleyin.
  5. 2 mL ORB ekleyin, yazılımdaki “okumayı başlat” (start read) düğmesine tıklayın ve grafiğin stabilize olmasını bekleyin. Proteolipozomları (numune) reaksiyon odasına eklerken, yazılımdaki grafikte numunenin eklendiğini belirtecek şekilde etiketleme yapın.
    NOT: Proteolipozom numunesindeki protein konsantrasyonu, lipozomlara eklenen toplam protein miktarından tahmin edilir. 1:12 protein: lipid oranı ve oksijen elektrodu sistemi odasındaki (2 mL) nihai 50 µg/mL protein konsantrasyonu en iyi sonucu vermiştir. Kesin proteolipozom verimi ölçülmemiştir.
  6. Oksijen elektrodu sistemi okuması stabilize olduktan sonra reaksiyon odasına NADH ekleyin ve aynı zamanda yazılımdaki grafikte NADH ilavesini belirtecek şekilde etiketleme yapın. Okumaya 5 dk boyunca devam edin.
  7. CCCP ekleyin, eklemeyi yazılımda etiketleyin ve okumaya 5 dk boyunca devam edin.
  8. Bir inhibitör (örneğin, CI inhibitörü (Piericidin A) veya CIII2 inhibitörü (Myxothiazol) veya CIV inhibitörü (NaN3)) ekleyin ve yazılımdaki grafiği etiketleyin, 2 dk boyunca okuma yapın ve ardından okumayı durdurun. 
  9. Grafiği kaydedin ve başka bir ölçüm yapmadan önce reaksiyon odasını 5 x 1 mL %70 etanol, 5 × 1 mL 0,1 mM EDTA, 7 × 1 mL MQ su ve 5 × 1 mL ORB ile temizleyin.
  10. Verileri arka plan hızına göre düzeltmek için; arka plan hızını, yani NADH eklemesi öncesindeki okuma eğimini hesaplayın ve her zaman noktası için beklenen bir arka plan [O2] hesaplayarak bu hızı ölçüm süresi boyunca doğrusal olarak ekstrapole edin. Ardından, her zaman noktası için ölçülen [O2] değerinden ekstrapole edilen arka plan [O2] değerini çıkarın.
  11. Her bir reaktanın eklenmesinden sonraki arka plan düzeltmeli [O2] konsantrasyon ölçümlerinin eğimi olarak oksijen tüketim hızlarını (OCR'ler) hesaplayın.
  12. NADH eklemesi sonrası OCR'ye göre oranları hesaplamak için, her bir bireysel iz için ölçülen her bir OCR'yi (örneğin, sırasıyla NADH, CCCP ve inhibitör eklemesi sonrası OCR'ler), NADH eklemesi sonrası ölçülen OCR'ye bölün.     
    NOT: DİKKAT: Sodyum ditiyonit güçlü bir indirgeyici ajandır ve oksidanlarla veya nemle şiddetli şekilde reaksiyona girebilir. Eldiven kullanarak işlem yapın. İnhibitör içeren atıkları, kurum kılavuzlarına uygun olarak tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edin.

8. Dinamik ışık saçılması kullanılarak yeniden oluşturulmuş lipozomların boyutunun kestirilmesi

  1. Dinamik ışık saçılımı (DLS) cihazını açın ve lazerin stabilize olması için yaklaşık 30 dakika bekleyin.
  2. Cihazın veri toplama yazılımını başlatın ve açık olan önceki tüm dosyaları kapatın.
  3. Partikülleri gidermek için proteolipozomları (0.2 μm) filtreleyin.
  4. Parmak izi veya leke bırakmamaya dikkat ederek, 70 µL proteolipozomu temiz bir küvete aktarın.
  5. Küveti cihaza yerleştirin ve kapağı güvenli bir şekilde kapatın.
  6. Yeni bir dosya oluşturun ve Manuel Ölçüm > Boyut (Manual Measurement > Size) seçeneğini belirleyin.
  7. Sıcaklığı 25 °C'ye ayarlayın ve zayıflatma indeksini (attenuation index) otomatik modda tutun.
  8. Dispersan özelliklerini tanımlayın (viskozite ve kırılma indisi; örneğin, su/tampon için RI = 1.330).
  9. Veri toplama parametrelerini ayarlayın (otomatik süre, yaklaşık 3 ölçüm, Genel Amaçlı (General Purpose) işlemleme).
  10. Ölçümü başlatın ve boyutu, polidispersite indeksini (PDI) ve sayım hızını (hedef ~100–500 kcps) izleyin.
  11. Sonuçları analiz edin: boyut dağılımını (şiddet/hacim), PDI değerini (<0.3 kabul edilebilir) ve otokorelasyon kalitesini (pürüzsüz sönümlenme, stabil baz hattı) kontrol edin; verileri kaydedin.

9. Kriyojenik elektron mikroskobu ızgara hazırlama ve tarama

  1. EM ızgaralarını hazırlamak için adım 5.11'deki (veya 4. ve 5. adımlar atlandıysa adım 3.9'daki) proteolipozom örneğini kullanın. Gerekiyorsa, adım 5.6'yı tekrarlayarak ve daha küçük bir PLB hacminde yeniden süspanse ederek proteolipozomları konsantre edin.
  2. Bir glow-discharge temizleme sisteminde, havayı kullanarak 300-mesh bakır, delikli karbon kaplı ızgaraları 20 mA'de 90 s boyunca glow-discharge işlemine tabi tutun.
  3. Otomatik bir plunge freezer sistemini; %95 nem ve 15 °C'de, şu parametrelerle plunge freezing yapacak şekilde ayarlayın: blot süresi 10 s, blot kuvveti −8, bekleme süresi 10 s ve drenaj süresi 0.
  4. Glow-discharge işlemi yapılmış ızgarayı tutan cımbızı plunge freezer sistemine takın.
  5. Otomatik bir plunger üzerinde, glow-discharge işlemi yapılmış ızgaraya 4,0 µL proteolipozom örneği ekleyin.
  6. Izgaraları 10 s boyunca inkübe edin, ardından 10 s boyunca blot yapın ve sıvı etanda plunge freezing gerçekleştirin. Izgaraları dikkatlice sıvı N2 haznesindeki ızgara kutusuna, daha sonra ise sıvı N2 saklama dewarına aktarın.
  7. Dondurulmuş ızgaraları kriyojenik bir örnek yükleyici ile transmisyon elektron mikroskobuna yükleyin ve tarama yapın. Doğrudan elektron dedektörlü bir transmisyon elektron mikroskobu kullanılmıştır.
  8. Mikroskobu üretici talimatlarına göre ayarlayın ve rekonstitüe proteolipozomlar için ızgaraları tarayın. Görüntüleri kaydedin.
    NOT: DİKKAT: Sıvı etan yüksek derecede yanıcı ve kriyojeniktir; yangın ve soğuk yanığı yaralanmalarını önlemek için uygun KKD ile ve ateşleme kaynaklarından uzakta işlem yapın. Sıvı nitrojen kriyojeniktir ve ciddi soğuk yanıklarına ve oksijen yer değiştirmesine neden olabilir. Uygun kriyojenik KKD ile işlem yapın ve yalnızca iyi havalandırılan alanlarda kullanın.

Sonuçlar

Bu protokolü kullanarak, domuz kalp mitokondriyalarından izole edilen mitokondriyal süperkompleksler (SC'ler) için optimal rekonstitüsyon koşullarını belirledik (Şekil 1A,B). Sükroz basamak gradyanı protokolü, rekonstitüe edilmiş proteolipozomları boş veziküllerden ve yapıya dahil olmamış proteinlerden etkili bir şekilde ayırarak hızlı test yapılmasına ve koşulların optimize edilmesine olanak tanır. Şekil 2'deki temsilci sonuçlar, santrifüj öncesi ve sonrası uygulanan örneğe sahip bir gradyanı göstermektedir. Ek olarak, solunum SC'lerini lipozomlara rekonstitüe etmek için kullanılan deterjanı optimize ettik. Rekonstitüsyon için SC'lerle birlikte dört farklı deterjan —anyonik safra tuzu deterjanı, CHAPS, digitonin ve glikozit deterjanı— ayrı ayrı kullanılmıştır. Test edilen her bir deterjan için fraksiyonlardaki toplam CI aktivitesi, NADH-ferrisiyanid oksidoreduksiyon deneyi ile ölçülmüştür (Şekil 3A–D). Başarılı rekonstitüsyonlar için CI'nın maksimum aktivitesi, iki sükroz konsantrasyonunun (yüzde 27 w/v sükroz ve yüzde 7 w/v sükroz) ara yüzeyindeki fraksiyonlarda gözlemlenmiştir. Özellikle, anyonik safra tuzu deterjanı ve CHAPS için Fraksiyon #10'da minimum aktivite saptanırken; hem digitonin hem de glikozit deterjanı için Fraksiyon #10 önemli bir aktivite göstermektedir; bu durum digitonin ve glikozit deterjanının süperkompleksleri lipozomlara etkili bir şekilde rekonstitüe etmediğini göstermektedir. Sonraki tüm rekonstitüsyonlar için anyonik safra tuzu deterjanı kullanılmıştır.

Digitonin ile ekstrakte edilmiş POPC:POPE:CL (2:2:1) proteolipozomların mavi-doğal poliakrilamid jel elektroforez jeli üzerinde gerçekleştirilen CI ve CIV jel içi aktivite analizi, rekonstitüsyon sonrası SC ve bireysel ETC komplekslerinin göreli miktarlarını göstermektedir (Şekil 4). Sonuçlar, CI ve CIII2 arasındaki etkileşimin, digitonin ve BN-PAGE ile yeniden ekstraksiyon sonrası proteolipozomlarda büyük ölçüde korunduğunu göstermektedir. Süperkompleks bandında bir miktar CIV aktivitesi mevcut olsa da, tek başına CIV ile uyumlu olarak daha düşük bir moleküler ağırlıkta güçlü bir sinyal gözlenmiş olup bu durumte ayrışmaya işaret etmektedir. Rekonstitüe edilen lipozomların membran sızıntısı, ACMA floresans sönümleme analizi kullanılarak ölçülmüş ve proteolipozomların protonlara karşı önemli ölçüde sızdırmaz olduğu gösterilmiştir (Şekil 5A,B). Rekonstitüe edilen lipozomların boyutu DLS kullanılarak tahmin edilmiş ve rekonstitüsyon öncesi ekstrüzyonun, boş veziküller için 82,9 ± 0,8 nm çapında ve rekonstitüe süperkompleks proteolipozom RSP'leri için 110,6 ± 0,4 nm çapında nihai bir proteolipozom boyut dağılımına yol açtığı gösterilmiştir (Şekil 6). SC fonksiyonunu değerlendirmek için proteolipozomların oksijen tüketimi kullanılmış ve belirgin inhibitör-duyarlı NADH kaynaklı oksijen tüketimi ortaya çıkarılmıştır (Şekil 7A). OCR'lerin, NADH eklenmesi sonrası OCR'ye göre çizilmesi, RSP'ler içindeki eşleşme derecesini doğrudan raporlar; yani OCR, sadece NADH eklenmesine kıyasla CCCP eklenmesi sonrası yaklaşık 1,5 kat artış göstermektedir (Şekil 7B). Taranan Cryo-EM ızgaraları, proteolipozom membranındaki SC'lerin görselleştirilmesini sağlamış ve başarılı rekonstitüsyonu doğrulamıştır (Şekil 8A–I).

figure-results-1
Şekil 1: Domuz kalp mitokondrilerinden deterjanla çözünürleştirilmiş süperkomplekslerin izolasyonu ve karakterizasyonu. (A) Digitonin ile ekstrakte edilmiş domuz mitokondriyal membran komplekslerinin boyut dışlama kromatografisi (SEC) saflaştırmasına ait temsilci kromatogram. (B)  A'daki fraksiyonların, jel içi CI aktivite boyaması ile görselleştirilmiş mavi-native PAGE (BN-PAGE) analizi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Proteolipozomlar ile sakroz basamak gradyanları. Bir ultrasantrifüjde 100,000 × g'de 2 s boyunca santrifüjlemeden önce (sol), santrifüjlemeden sonra (sağ). Gradyana yüklenen proteolipozom örneği; boş veziküller, proteolipozomlar ve dipte toplanmış agregat proteinler şeklinde ayrışır. Bu gradyan daha sonra belirtildiği üzere karakterizasyon için fraksiyonlara ayrılır. Her bir fraksiyonun yaklaşık kapsamı belirtilmiş ve etiketlenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Farklı deterjanlarda rekonstitüsyon verimliliğini değerlendirmek için flotasyon analizi. (A) anyonik safra tuzu deterjanı, (B) 3-[(3-kolamidopropil)dimetilammoniyo]-1-propanesülfonat (CHAPS) (0.6% (w/v)), (C) digitonin (0.6% w/v), (D) glikozid deterjanı (GDN) (0.6% (w/v)) ile rekonstitüsyon sonrası sukroz basamak gradyanından elde edilen fraksiyonlardaki CI NADH-ferrisiyanid aktivitesi. Fraksiyon #10, son fraksiyondaki herhangi bir peletin yeniden süspande edilmesiyle elde edilir. Fraksiyon #10'daki aktivite, proteinlerin rekonstitüsyonu gerçekleşmediğini gösterir. n = 3 ve hata çubukları SD = standart sapmayı göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: %3–12 BN-PAGE üzerinde yürütülen digitonin ile ekstrakte edilmiş proteolipozomların jel içi aktivite analizi. CI (sol) ve CIV (sağ) jel içi aktivite analizi. R = respirasom (SC I+III2+IV), SC1,3 (SC I+III2), IGA CI = (CI jel içi aktivite analizi); IGA = jel içi aktivite analizi CIV = (CIV jel içi aktivite analizi). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Rekonstitüe proteolipozomlarda proton sızıntısını tespit etmek için ACMA floresans sönümleme analizi. pH-duyarlı bir boya (ACMA) kullanılarak, Valinomycin ve CCCP'nin ardışık eklemesinden sonra rekonstitüe proteolipozomların (Siyan) iç pH'ı, boş lipozomlarla (Turuncu) karşılaştırılmıştır. Karşılaştırma amacıyla farklı proteolipozom preparatlarından elde edilen temsili ACMA floresans izleri gösterilmektedir. (A) Membranı bozulmuş rekonstitüe lipozomlar (sızıntılı). (B) Membranı sağlam rekonstitüe lipozomlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Boş lipozomların ve yeniden konstrüktü SC proteolipozomlarının dinamik ışık saçılım ölçümleri. Ekstrüde edilmiş boş lipozomların (turuncu) ve SC-yeniden konstrüktü proteolipozomların (cam göbeği) ortalama hacim ağırlıklı boyut dağılımları gösterilmiştir. Ölçümler üç teknik tekrar olarak gerçekleştirilmiştir. Boş lipozomlar 82.9 ± 0.8 nm ortalama hidrodinamik çap değerine sahipken, RSP'ler 110.6 ± 0.4 nm ortalama hidrodinamik çap değerine sahiptir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Lipozomlarda yeniden oluşturulan SC'lerin eşleşmesini değerlendirmek için oksijen tüketim analizleri. Ekstrüzyon yoluyla oluşturulan lipozomlara yeniden yerleştirme sonrası solunum aktivitesini ve ETC komplekslerinin eşleşmesini değerlendirmek için oksijen tüketimi ölçülmüştür. (A) CI ile tetiklenen solunumu başlatmak için NADH, proton gradyanını dağıtmak ve maksimal ayrışmış oksijen tüketim hızını (OCR) ölçmek için CCCP, CI'yı inhibe etmek için piericidin A, CIII2'yu inhibe etmek için Antimycin A veya CIV'ü inhibe etmek için NaN3 (Azid) şeklindele ardışık eklemeler sonrasında oksijen konsantrasyonundaki değişimleri gösteren, arka plan düzeltmesi yapılmış temsilci oksijen elektrodu izlemi. (B) Belirtilen koşullar altındaki OCR'nin nicelleştirilmesi ve adım 7.10'a göre düzeltilmesi. Her bir izlem için NADH eklenmesi sonrası OCR'ye oranla veri noktaları, ortalama ± SD (hata çubukları) ile birlikte gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: Proteolipozom membranlarında yeniden oluşturulmuş SC'lerin Cryo-EM görselleştirmesi. (A–C) Proteolipozom membranları ile ilişkili yeniden oluşturulmuş SC'leri gösteren taranmış ızgaraların temsilci elektron mikrografları. Yeniden oluşturulmuş SC'ler sarı oklarla belirtilmiştir. Ölçek çubukları = 50 nm. (D–I) Proteolipozom membranları üzerinde daha yüksek yakınlaştırmada görüntülenen temsilci SC partikülleri. Ölçek çubukları = 10 nm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Mitozondriyal solunum süperkomplekslerinin (SC) tanımlanmış proteolipozomlar içine yeniden konstitüsyonu için, yapılarının ve işlevlerinin kontrollü bir şekilde incelenmesine olanak tanıyan basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sunulmuştur. Bu protokoldeki birkaç adım, başarılı bir yeniden konstitüsyon için kritiktir. Çalışmalarımızda, ekstrüzyon ile oluşturulan lipozomlar, sonikasyon ile üretilenlere göre daha üniform bir boyut dağılımına (dinamik ışık saçılması ile değerlendirilmiştir) sahiptir. Membran sızdırmazlığını ve SC'lerin bir lipid çift katmanına düzgün şekilde entegrasyonunu teşvik etmek için önceden hazırlanmış bir tuz giderme spin kolonu kullanılarak deterjanın etkili bir şekilde uzaklaştırılması esastır; deterjanın eksik uzaklaştırılması, sızdıran veya stabil olmayan proteolipozomlara yol açabilir. Lipid kompozisyonunun, protein-lipid oranlarının ve deterjan seçiminin optimizasyonu da aynı derecede önemlidir, çünkü bu parametreler yeniden konstitüsyon verimliliğini ve SC stabilitesini güçlü bir şekilde etkiler. Sükroz gradyan flotasyon analizi başlangıç optimizasyonu için yararlıdır; ancak koşullar belirlendikten sonra, gradyan fraksiyonasyonu sırasında örnek kaybını ve bozulmayı önlemek amacıyla, alt yapısal ve fonksiyonel analizler için proteolipozomların önceden hazırlanmış tuz giderme spin kolonundan hemen sonra kullanılması tercih edilir. Aktiviteyi gözlemlemek için gereken fraksiyon hacmi, preparasyonlar arasında farklılık gösterir. Farklı preparasyonlar için reaksiyon karışımına eklenecek hacmi ayarlayın. Solunum SC'sinin proteolipozom membranı içindeki oryantasyonu, solunum ölçümlerini önemli ölçüde etkileyebilir. Yeniden konstitüsyon prosedürü, tek bir topolojiyi zorunlu kılacak şekilde optimize edilmemiştir; bu nedenle, karışık bir oryantasyon popülasyonu beklense de, CI ferrisiyanür erişilebilirlik analizleri, dışa bakan CI periferik kollarına doğru güçlü bir eğilim olduğunu göstermektedir.

Yeniden oluşturulan süperkomplekslerin oryantasyonu deneysel olarak değerlendirildi ve CI ferrisiyanür aktivitesi deterjan varlığında ve yokluğunda ölçüldü. Bozulmamış RSP'lerde, dışarıdan eklenen NADH yalnızca periferik kolu dış ortama açık olan CI moleküllerine erişebilirken, deterjanla permeabilizasyon NADH'ın tüm komplekslere erişimine olanak tanır. Bu nedenle, söz konusu analiz proteolipozom topolojisinin tam bir yapısal belirlemesini sağlamaktan ziyade, dış ortama bakan fonksiyonel olarak erişilebilir CI periferik kollarının oranını tahmin eder. Bu koşullar altında ölçülen aktivitelerin karşılaştırılması, respirasomların (SC) %83,1 ± %0,04'ünün CI periferik kolu dışarıya bakacak şekilde oryante olduğunu göstermiş ve yeniden oluşturma sırasında belirgin bir oryantasyon eğilimi olduğunu ortaya koymuştur.

Tekrar üretilebilirliği ve stabiliteyi artırmak için çeşitli modifikasyonlar ve sorun giderme stratejileri uygulanabilir. Sükroz gradyanlarından elde edilen digitonin ile ekstre edilmiş ortak fraksiyonlar üzerinde gerçekleştirilen CI ve CIV için jel içi aktivite analizleri, SC'ye ait bantlar göstermekte olup bu durum, rekonstitüsyon sırasında SC'nin tamamen ayrışmadığını göstermektedir. Ancak, SC bandı CI aktivite jelinde CIV aktivite jeline kıyasla daha güçlüdür; bu da CIV'nin rekonstitüsyon sonrası CI ve CIII2'den kısmen ayrışabileceğini göstermektedir (Şekil 4). Lipid kompozisyonunun ayarlanması SC stabilitesini artırabilir. CIV'nin kısmi ayrışması, deterjan seçiminden veya rekonstitüsyon sırasında deterjanın hızlıca uzaklaştırılmasından da kaynaklanabilir; bu durum süperkompleks içindeki daha zayıf protein-protein etkileşimlerini destabilize edebilir. Deterjan değişim koşullarının daha fazla optimize edilmesi CIV tutulumunu iyileştirebilir. Ek olarak, mekanik stresin minimize edilmesi, gereksiz saflaştırma adımlarından kaçınılması ve numunelerin dikkatli bir şekilde taşınması proteolipozomların bütünlüğünün korunmasına yardımcı olabilir. Fonksiyonel analizler için proteolipozomların tamamen sızdırmaz olduğundan emin olunması kritiktir, çünkü membran sızıntısı transmembran proton gradyanı ile eşleşmeyi engeller. Kriyo-EM grid hazırlığı için, grid delikleri içindeki partikül dağılımını iyileştirdiği gösterildiğinden, sürekli karbon kaplı gridlerin kullanımı önemlidir19.

Avantajlarına rağmen, bu yaklaşımın bazı kısıtlamaları bulunmaktadır. Proteolipozomlar, doğal iç mitokondriyal membranın bileşimsel ve dinamik karmaşıklığını tam olarak yansıtmazlar ve özellikle CIV olmak üzere Süperkompleks (SC) bileşenlerinin kısmi ayrışması bir sorun olmaya devam etmektedir. Fonksiyonel okumalar, yetersiz kenetlenmeden veya rekonstitüsyon verimliliğindeki heterojenlikten da etkilenebilir. Buna rağmen, deterjanla çözünürleştirilmiş sistemlerle karşılaştırıldığında bu yöntem, lipid-protein etkileşimlerini korur ve doğal benzeri bir membran ortamını desteklerken, in situ yaklaşımlardan daha fazla deneysel kontrol sunar. Bu haliyle, lipid bileşiminin ve membran özelliklerinin SC stabilitesini ve aktivitesini nasıl düzenlediğinin sistematik olarak araştırılması için değerli bir platform sağlar.

Bu ilişkileri anlamak özellikle önemlidir çünkü solunum süperkompleks organizasyonunun bozulmasının, çok çeşitli mitokondriyal ve metabolik bozukluklarda rol oynadığı bildirilmiştir31,32,33,34,35,36,37,38,39,40. Leigh sendromu41,42,43,44,45,46,47, Barth sendromu48,49,50,51,52,53,54 ve Sengers sendromu48 gibi bozukluklarda gözlemlendiği üzere, ETC kompleks montajındaki, kardiyolipin sentezindeki veya lipid yeniden şekillenmesindeki defektler, süperkompleksleri destabilize edebilir, elektron transferini bozabilir, ATP üretimini azaltabilir ve reaktif oksijen türlerinin üretimini artırabilir. Bu bioenerjetik defektler; kalp, iskelet kası ve beyin gibi yüksek enerji talebi olan doketleri orantısız şekilde etkileyerek kardiyomiyopati, egzersiz intoleransı ve nörodejenerasyon dahil fenotiplere yol açar36,37,38. Aksine, yeni ortaya çıkan kanıtlar, süperkompleks oluşumunun ETC komplekslerini stabilize ederek ve patolojik ROS üretimini sınırlayarak stres altında kompansatuar ve koruyucu roller üstlenebileceğini göstermektedir55,56. Burada açıklanan yeniden oluşturulmuş proteolipozom platformu, hastalıkla ilişkili lipid yeniden şekillenmesinin, mutasyonların veya farmakolojik müdahalelerin süperkompleks montajını ve işlevini nasıl değiştirdiğini doğrudan test etmek için kontrollü bir sistem sağlayarak, böylece mitokondriyal disfonksiyonun mekanistik çalışmalarına olanak tanır ve gelecekteki terapötik stratejilere ışık tutar.

Düşük oksijen tüketim hızları; yetersiz süperkompleks katılımı, kısmi CIV ayrışması, kalıntı deterjan, yetersiz CoQ10 veya sitokrom c, bozunmuş NADH veya oksigraf odasındaki düşük protein konsantrasyonundan kaynaklanabilir. Flotasyon analizi veya BN-PAGE ile rekonstitüsyonu doğrulayın, ACMA sönümlenmesi ile membran bütünlüğünü kesinleştirin, taze NADH hazırlayın ve protein-lipid oranını, kofaktör konsantrasyonunu, deterjan gidermeyi ve örnek konsantrasyonunu optimize edin. Sızdıran proteolipozomlar; eksik deterjan giderimi, aşırı deterjan konsantrasyonu, sert işlemeler, tekrarlanan dondurma-çözme döngüleri veya hasarlı lipitlerden kaynaklanabilir. ACMA analizinde proton sızıntısı gözlemlenirse, yeni dengelenmiş bir tuz giderme kolonu kullanarak deterjan giderimini tekrarlayın, kolonun aşırı santrifüjlenmesinden kaçının, taze lipozomlar hazırlayın, mekanik stresi minimize edin ve proteolipozomları rekonstitüsyon sonrası hemen kullanın. Konsantrasyon basamakları sırasında agregasyon, konsantratör membranındaki yüksek lokal protein veya deterjan konsantrasyonları nedeniyle oluşabilir. Örnekleri kısa (10 dk) santrifüj döngülerinde konsantre edin, çevirmeler arasında örneği nazikçe yeniden süspanse edin, aşırı konsantrasyondan kaçının, örnekleri 4 °C'de tutun ve sonraki kullanımlardan önce düşük hızlı berraklaştırma ile görünür agregatları giderin. Tutarsız flotasyon davranışı; değişken lipozom boyutunu, eksik deterjan giderimini, agregasyonu, yanlış sükroz katmanlamasını veya örnek yükleme ya da fraksiyon toplama sırasında gradyanın bozulmasını yansıtabilir. Taze sükroz çözeltileri hazırlayın, arayüzleri karıştırmadan gradyanları yavaşça katmanlayın, tekdüze ekstrüde edilmiş lipozomlar kullanın, santrifüj koşullarını sabit tutun ve fraksiyonları yukarıdan aşağıya doğru nazikçe toplayın. Zayıf cryo-EM partikül dağılımı; düşük proteolipozom konsantrasyonu, agregasyon, karbona tercihli adsorpsiyon, zayıf grid ıslanması, kalın buz veya aşırı blotting işlemini kaynaklı olabilir. Proteolipozom konsantrasyonunu optimize edin, grid hazırlığından önce agregatları giderin, glow-discharge koşullarını ayarlayın, blot süresini ve blot kuvvetini test edin, farklı grid tiplerini veya karbon destekleri tarayın ve mümkün olduğunca taze hazırlanmış örnekler kullanın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Izgaralar, UC Davis BioEM Core tesisinde taranmıştır. Tarama sürecindeki yardımları için Dr. Fei Guo'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH'e bağlı NIGMS tarafından R35GM137929 (JAL) ödülü kapsamında finanse edilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (POPC)Avanti Research860320
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glisero-3-fosfoetanolamin (POPE)Avanti Araştırma850757
1,3-bis(sn-3-’-fosfatidil)-sn-gliserol (kardiyolipin, sığır kalbi dokusundan)Avanti Research840012
2-[4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il]etansülfonik asit --- HEPESSigma-AldrichH23830
3-(N-morfolino)propan sülfonik asit (MOPS)Sigma-AldrichM12545
3,3′-Diaminobenzidin ---- DABBSigma-AldrichD4293
Karbonil Siyanür m-Klorofenilhidrazon ---- CCCPSigma-AldrichC2759
CHAPSSigma-Aldrich220201
KloroformSigma-Aldrich650948
Koenzim Q10Sigma-AldrichC9538
At kalbinden sitokrom cSigma-AldrichC2506
DigitoninSigma-Aldrich300410
Etilen glikol-bis(2-aminoetileter)-N,N,N′,N′-tetraasetik asit --- EGTASigma-AldrichE3889
Etilendiamintetraasetik asit -- EDTASigma-AldrichE6758
GliserolSigma-AldrichG7893
Gliko-diosgeninAnatraceGDN101deterjan
Lauril Maltoz Neopentil Glikol ---- LMNGSigma-AldrichNG310
Magnezyum klorürSigma-AldrichM8266
MiksotiyazolSigma-AldrichT5580
NADH, Disodyum TuzuSigma-Aldrich481913
Nitrotetrazolyum mavi klorürSigma-AldrichN6876
Pierisidin ASigma-Aldrich96861
Potasyum asetatSigma-AldrichP5708
Potasyum klorürSigma-AldrichP3911
Potasyum FerrisiyanürSigma-Aldrich702587
Potasyum fosfat monobazik ---- KH2PO4Sigma-AldrichP0662
Sodyum azidSigma-AldrichS2002
Sodyum kolat hidratSigma-AldrichC1254
Sodyum klorürSigma-AldrichS9888
Sodyum ditiyonitSigma-Aldrich71699
SükrozSigma-AldrichS9378
TRISSigma-AldrichT1503
ACMA (9-amino-6-kloro-2-metoksiakridin)Sigma-AldrichSML4162
Ekipmanlar ve Kitler
Amicon® Ultra Santrifüj Filtre, 100 kDa MWCO 0,5 mLMilliporeUFC5100
Amicon® Ultra Santrifüj Filtresi, 100 kDa MWCO 15 mLMilliporeUFC9100
Beckman Optima TLX UltrasantrifüjBeckman Coulter
BN-PAGE jelimavi-doğal poliakrilamid jel elektroforez jeli
Beckman Optima XE UltrasantrifüjBeckman Coulter
Işıma Deşarj Temizleme Sistemiışıma boşalımı temizleme sistemi
Gatan K3 detektörlü Glacios 2 Cryo-TEMThermo Fisher Scientifictransmisyon elektron mikroskobu
KIMBLE Dounce doku parçalayıcı setSigma-AldrichD9188
Leica Otomatik GP2 PistonuLeica
Mikrosantrifüj 16Beckman CoulterA46474
NGC Discover 10 Kromatografi SistemiBio-Rad7880009
Oxygraph+oksijen elektrot sistemi
PD-10 Tuz Giderme KolonuCytiva28918007boyut dışlama spin kolonu
Pierce BCA Protein analiz kitiThermo Fisher Scientific23225bis-sinkoninik asit protein analiz kiti
Q-125 SonikatörQ-sonicaQ125-110
Sephadex G-25 M kolonuönceden doldurulmuş G-25 reçineli tuz giderme spin kolonu
SpectraMax M2 mikroplaka okuyucuMolecular Devices
Superose 6 increase 10/300 GLCytiva29091596çapraz bağlı agaroz jel filtrasyon ortamı
TLA-100.3 Sabit Açılı Rotor PaketiBeckman Coulter349490
Tip 50.2 Ti Sabit Açılı RotorBeckman Coulter337901
Milli-Q (MQ) suyuultra saf su
Malvern Zetasizer ZS Dinamik Işık Saçılımı (DLS)Malvern Pananalytical
Hansatech Oxygraph+ SistemiHansatech Instruments
PELCO easiGlow İıkı Boşalım Temizleme SistemiTED PELLA, INC
Vitrobot Mark IV SistemiThermo Fisher Scientifichızlı dondurucu
2 nm karbon kaplı 300 mesh Quantifoil R 1.2/1.3 bakır gridlerTED PELLA, INC668-300-Cu-100delikli karbon kaplı
Avanti mini-ekstrüderAvanti Lipids610000

Kaynaklar

  1. Mitchell P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 1961;191:144-8.
  2. Dudkina NV, Kudryashev M, Stahlberg H, Boekema EJ. Interaction of complexes I, III, and IV within the bovine respirasome by single particle cryoelectron tomography. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108:15196-200.
  3. Althoff T, Mills DJ, Popot JL, Kühlbrandt W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 2011;30:4652-64.
  4. Schäfer E, Dencher NA, Vonck J, Parcej DN. Three-dimensional structure of the respiratory chain supercomplex I1III2IV1 from bovine heart mitochondria. Biochemistry. 2007;46:12579-85.
  5. Schägger H, Pfeiffer K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. EMBO J. 2000;19:1777-83.
  6. Milenkovic D, Blaza JN, Larsson NG, Hirst J. The enigma of the respiratory chain supercomplex. Cell Metab. 2017;25:765-76.
  7. Berndtsson J, et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Rep. 2020;21. doi:10.15252/embr.202051015.
  8. Moe A, Di Trani J, Rubinstein JL, Brzezinski P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118. doi:10.1073/pnas.2021157118.
  9. Blaza JN, et al. Kinetic evidence against partitioning of the ubiquinone pool and the catalytic relevance of respiratory-chain supercomplexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111:15735-40.
  10. Diaz F, Enríquez JA, Moraes CT. Cells lacking Rieske iron-sulfur protein have a reactive oxygen species-associated decrease in respiratory complexes I and IV. Mol Cell Biol. 2012;32:415-29.
  11. Maranzana E, et al. Mitochondrial respiratory supercomplex association limits production of reactive oxygen species from complex I. Antioxid Redox Signal. 2013;19:1469-80.
  12. Schägger H, et al. Significance of respirasomes for the assembly/stability of human respiratory chain complex I. J Biol Chem. 2004;279:36349-53.
  13. Acín-Pérez R, et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Mol Cell. 2004;13:805-15.
  14. Letts JA, Sazanov LA. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nat Struct Mol Biol. 2017;24:800-8.
  15. Protasoni M, et al. Respiratory supercomplexes act as a platform for complex III-mediated maturation of human mitochondrial complexes I and IV. EMBO J. 2020;39. doi:10.15252/embj.2019102817.
  16. Pöverlein MC, Jussupow A, Kim H, Kaila VRI. Protein-induced membrane strain drives supercomplex formation. eLife. 2024;13. doi:10.7554/eLife.102104.1.
  17. Mandala VS, MacKinnon R. Voltage-sensor movements in the Eag Kv channel under an applied electric field. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022;119. doi:10.1073/pnas.2214151119.
  18. Falzone ME, MacKinnon R. Gβγ activates PIP2 hydrolysis by recruiting and orienting PLCβ on the membrane surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120. doi:10.1073/pnas.2301121120.
  19. Grba DN, et al. Molecular mechanism of the ischemia-induced regulatory switch in mammalian complex I. Science. 2024;384:1247-53.
  20. Tao X, Zhao C, MacKinnon R. Membrane protein isolation and structure determination in cell-derived membrane vesicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120. doi:10.1073/pnas.2302325120.
  21. Zheng W, Chai P, Zhu J, Zhang K. High-resolution in situ structures of mammalian respiratory supercomplexes. Nature. 2024;631:232-9.
  22. Nakano A, et al. Structures of respiratory supercomplexes and ATP synthase oligomers in mammalian mitochondrial inner membrane. Nat Commun. 2026;17:4075. doi:10.1038/s41467-026-70578-x.
  23. Coupland CE, et al. High-resolution electron cryomicroscopy of V-ATPase in native synaptic vesicles. Science. 2024;385:168-74.
  24. Letts JA, Fiedorczuk K, Sazanov LA. The architecture of respiratory supercomplexes. Nature. 2016;537:644-8.
  25. Letts JA, et al. Structures of respiratory supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Mol Cell. 2019;75:1131-46.e6.
  26. Jha P, Wang X, Auwerx J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Curr Protoc Mouse Biol. 2016;6:1-14.
  27. Biner O, Fedor JG, Yin Z, Hirst J. Bottom-up construction of a minimal system for cellular respiration and energy regeneration. ACS Synth Biol. 2020;9:1450-9.
  28. Wright JJ, et al. Reverse electron transfer by respiratory complex I catalyzed in a modular proteoliposome system. J Am Chem Soc. 2022;144:6791-801.
  29. Lee SY, Letts JA, MacKinnon R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 2009;387:1055-60.
  30. Caldeira D de AF, Oliveira DF de, Cavalcanti-de-Albuquerque JP, Nascimento JHM, Zin WA, et al. Isolation of mitochondria from fresh mice lung tissue. Front Physiol. 2021;12:748261. doi:10.3389/fphys.2021.748261.
  31. Shi H, et al. Global burden of ischaemic heart disease from 2022 to 2050: projections of incidence, prevalence, deaths, and disability-adjusted life years. Eur Heart J Qual Care Clin Outcomes. 2025;11:355-66.
  32. Rahman S. Mitochondrial disease in children. J Intern Med. 2020;287:609-33.
  33. Pérez-Albert P, et al. Mitochondrial disease in children: the nephrologist’s perspective. JIMD Rep. 2018;42:61-70.
  34. Gorman GS, et al. Prevalence of nuclear and mitochondrial DNA mutations related to adult mitochondrial disease. Ann Neurol. 2015;77:753-9.
  35. Pitceathly RDS, Rahman S. Mitochondrial DNA-related diseases associated with single large-scale deletions and point mutations. In: Gasparre G, Porcelli AM, editors. The Human Mitochondrial Genome: From Basic Biology to Disease. London: Academic Press; 2020. p. 353-74.
  36. Morán M, et al. Mitochondrial respiratory chain dysfunction: implications in neurodegeneration. Free Radic Biol Med. 2012;53:595-609.
  37. Chinnery PF. Primary mitochondrial disorders overview. In: Adam MP, Feldman J, Mirzaa GM, Pagon RA, Wallace SE, Bean LJH, et al., editors. GeneReviews®. Seattle: University of Washington, Seattle; 1993–2026. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1224/
  38. Ellis CE, et al. Mitochondrial lipid abnormality and electron transport chain impairment in mice lacking α-synuclein. Mol Cell Biol. 2005;25:10190-201.
  39. Hekimi S, Wang Y, Noë A. Mitochondrial ROS and the effectors of the intrinsic apoptotic pathway in aging cells: the discerning killers. Front Genet. 2016;7:161. doi:10.3389/fgene.2016.00161.
  40. Chouchani ET, et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 2014;515:431-5.
  41. Van de Wal MAE, et al. Ndufs4 knockout mouse models of Leigh syndrome: pathophysiology and intervention. Brain. 2022;145:45-63.
  42. Hoefs SJG, et al. NDUFA10 mutations cause complex I deficiency in a patient with Leigh disease. Eur J Hum Genet. 2011;19:270-4.
  43. Ostergaard E, et al. Respiratory chain complex I deficiency due to NDUFA12 mutations as a new cause of Leigh syndrome. J Med Genet. 2011;48:737-40.
  44. Marin SE, et al. Leigh syndrome associated with mitochondrial complex I deficiency due to novel mutations in NDUFV1 and NDUFS2. Gene. 2013;516:162-7.
  45. Adjobo-Hermans MJW, et al. NDUFS4 deletion triggers loss of NDUFA12 in Ndufs4−/− mice and Leigh syndrome patients: a stabilizing role for NDUFAF2. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 2020;1861:148213. doi:10.1016/j.bbabio.2020.148213.
  46. Leshinsky-Silver E, et al. NDUFS4 mutations cause Leigh syndrome with predominant brainstem involvement. Mol Genet Metab. 2009;97:185-9.
  47. Piekutowska-Abramczuk D, et al. NDUFB8 mutations cause mitochondrial complex I deficiency in individuals with Leigh-like encephalomyopathy. Am J Hum Genet. 2018;102:460-7.
  48. Bertero E, Kutschka I, Maack C, Dudek J. Cardiolipin remodeling in Barth syndrome and other hereditary cardiomyopathies. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2020;1866:165803. doi:10.1016/j.bbadis.2020.165803.
  49. Xu Y, et al. Loss of protein association causes cardiolipin degradation in Barth syndrome. Nat Chem Biol. 2016;12:641-7.
  50. McKenzie M, Lazarou M, Thorburn DR, Ryan MT. Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth syndrome patients. J Mol Biol. 2006;361:462-9.
  51. Acehan D, Xu Y, Stokes DL, Schlame M. Comparison of lymphoblast mitochondria from normal subjects and patients with Barth syndrome using electron microscopic tomography. Lab Invest. 2007;87:40-8.
  52. Dudek J, et al. Cardiolipin deficiency affects respiratory chain function and organization in an induced pluripotent stem cell model of Barth syndrome. Stem Cell Res. 2013;11:806-19.
  53. Hagen TM, et al. Acetyl-L-carnitine fed to old rats partially restores mitochondrial function and ambulatory activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95:9562-6.
  54. Schlame M, et al. Phospholipid abnormalities in children with Barth syndrome. J Am Coll Cardiol. 2003;42:1994-9.
  55. Ayala-Hernandez MG, et al. Respiratory complex III2 assembles complex I via toxic intermediate in mitochondrial disease. bioRxiv. 2025:doi:10.1101/2025.06.17.660237.
  56. Liang C, et al. Formation of I2+III2 supercomplex rescues respiratory chain defects. Cell Metab. 2025;37:441-59.e11.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

BiochemistryMitochondriaSupercomplexesReconstitutionProteoliposomesRespirationMetabolism
Video yakında

İlgili makaleler