Bu çalışma; standartlaştırılmış bronkoalveoler lavaj sıvısı toplama ve işlemini, yedi belirteçli bir akış sitometrisi panelini, 13 analitli bir multipleks sitokin analizini ve birleştirilmiş bir analiz hattını içeren entegre bir görselleştirme iş akışı sunmaktadır.
Araştırma makalesi
Bronkoalveoler Lavaj Sıvısında Nötrofil Göçünün ve İnflamatuar Sitokin Profillemesinin Entegre Görselleştirmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Bronkoalveoler lavaj sıvısı (BALF), alt hava yolu inflamasyonunu incelemek için en doğrudan erişilebilir örnekleme matrisidir; ancak geleneksel analizler, bilgi yoğunluğunu sınırlayan ve hücre-faktör eşleşmesini belirsizleştiren, tek belirteçli akış sitometrisinin analiz bazlı enzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) ile birleştirilmesine dayanmaktadır. Bu çalışma; standartlaştırılmış toplama ve ön işleme süreçlerini, yedi belirteçli bir nötrofil ve monosit akış sitometrisi paneli, 13 analizli bir multipleks sitokin deneyi ve uniform manifold approximation and projection (UMAP), FlowSOM meta-kümeleme, hiyerarşik kümeleme, Spearman korelasyon ağları ve temel bileşenler analizi (PCA) tabanlı birleşik bir analiz hattıyla birleştiren entegre bir görselleştirme iş akışı sunmaktadır.
İş akışı, mikrobiyolojik olarak doğrulanmış akciğer enfeksiyonu olan 64 hasta ve 48 enfeksiyon dışı kontrolden oluşan, bronkoskopi uygulanan 12 yetişkinden meydana gelen tek merkezli prospektif bir kohorta uygulanmıştır. Sitolojik ve akış sitometrik okumalar, enfeksiyon sırasında makrofaj baskın bir alveolar profilden nötrofil baskın bir profile belirgin bir kayma olduğunu ortaya koymuş; nötrofil yüzdesi medyan %3,2'den %68,4'e yükselmiş ve mutlak nötrofil konsantrasyonu yaklaşık 50 kat artmıştır. Multiplex profilleme; kemokin, proinflamatuar ve regülatör modüllerin tamamının yukarı regüle olduğu, koordineli üç modüllü bir sitokin yanıtı belirlemiş; CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α ve G-CSF ise çalışma kohortu içinde en güçlü tekli belirteç ayrımını göstermiştir (eğri altında kalan alan [AUC] 0,89 ila 0,94). PCA, bir korelasyon matrisi ve bir ağ grafiği kullanılarak yapılan integratif görselleştirme, katılımcı düzeyinde sıkı bir şekilde eşleşmiş bir nötrofil-kemokin aksını ortaya çıkarmış ve BALF nötrofil sayısı merkezi ağ bağlantı noktası olarak belirlenmiştir.
İş akışı, yalnızca klinik olarak endike BAL'den rutin olarak elde edilen materyalleri kullanır, ek örnek hacmi gerektirmez ve solunum yolu enfeksiyonlarındaki hava yolu inflamasyonunun çözümlenmesi için bilgi yoğun bir çerçeve sunar; bu çerçeve, çok parametreli akış sitometrisi ve multipleks boncuk dizisi platformları ile donanımlı üçüncül bakım laboratuvarlarında uygulanabilir olup boylamsal, tek hücreli ve terapötik değerlendirme çalışmalarına kadar genişletilebilir. Münferit analitlerin biyobelirteç olarak daha geniş klinik kabulü, bağımsız çok merkezli kohortlarda prospektif validasyon gerektirecektir.
Giriş
Aşı stratejileri ve tedavi yöntemlerindeki ilerlemelere rağmen, alt solunum yolu enfeksiyonlarından kaynaklanan enfeksiyöz ölümler küresel mortalitenin önemli bir nedeni olmaya devam etmektedir; bununla birlikte, bu durum özellikle pediatrik ve yaşlı popülasyonlar arasında geçerliliğini korumaktadır1. Nötrofiller, etkilenen solunum sisteminde, istilacı patojenin ortadan kaldırılması için hayati önem taşıyan bir süreç olan doğuştan gelen bağışıklık yanıtının erken evrelerinde bildirilen birincil hücrelerdir; ancak, kontrolsüz nötrofilik inflamasyon, alveoler kapiller bariyerin bozulmasına, dokularda oksidatif hasara ve akut respiratuar distres sendromunun (ARDS) gelişmesine neden olur2,3. Akciğer hava boşluğundaki nötrofiller ayrıca diğer dokulardan farklı olan köşe kinetiği, tutulum modelleri ve efektör davranışlar sergiler ve bu farklılıklar enfeksiyonun iyileşip iyileşmeyeceğini veya şiddetli pnömoniye ilerleyip ilerlemeyeceğini etkiler4.
Bronkoalveoler lavaj sıvısı (BALF), alveoler mikroçevre hakkında önemli bir bilgi kaynağıdır ve bu bölgedeki klinik bağışıklığın en yakın temsilini sunar5. Kemokin CXCL8, CXCL1, CXCL2 ve CXCL5 dahil olmak üzere diğer kemokinlerle birlikte, CXCR1 ve CXCR2 reseptörleri aracılığıyla nötrofillerin akciğerlere çekilmesinde temel bir rol oynar6. IL-1β, IL-6 ve TNF-α sitokinleri bu süreci daha da artırırken, IL-10 karşıt bir sitokin olarak görev yapar. BALF içindeki seviyelerinin, akciğer enfeksiyonlarının şiddetiyle ve bakteriyel, viral ve atipik pnömoniden kaynaklanan akciğer komplikasyonlarının gelişimiyle ilişkili olduğu gösterilmiştir7 ve alt solunum yolu enfeksiyonlarında daha erken tanı ve patojen ayrımı için multipleks BALF biyobelirteç profilleri benimsenmektedir8.
Rutin BALF testleri genellikle testin temelini oluşturan biyolojiyi tam olarak kapsamakta yetersiz kalır. Hücre sayıları, sitospin örneklerindeki hücrelerin manuel olarak ayırt edilmesiyle tahmin edilebilirken, çözünür mediyatörler bireysel enzim bağlantılı immünosorbent assay'ler (ELISA'lar) kullanılarak ölçülür ve sütun grafiği olarak sunulur. Kemokinler, sitokinler ve her bir hücre tipi ayrı değerlendirilir; belirli bir kemokin konsantrasyon gradyanı ile örnekteki etkilediği hücre popülasyonları arasında herhangi bir korelasyon kurulmaz. Sitokin modüllerinin kombinasyonu, kemokin-nötrofil doz-yanıt ilişkileri ve kendi inflamasyon imzalarına sahip hasta alt grupları, çok değişkenli analizlerin yokluğunda sıklıkla göz ardı edilir9.
Hesaplamadaki ilerlemeler, böyle bütünsel bir yaklaşımı giderek daha gerçekçi kılmaktadır. Çok parametreli akış sitometrisi ve spektral akış sitometrisinin, t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) veya uniform manifold approximation and projection (UMAP) gibi boyut indirgeme yaklaşımlarıyla birleştirilmesi, yüksek boyutlu immün fenotiplerin iki boyutlu uzaya haritalanmasına olanak tanır; sitometri verilerine uygulandığında UMAP'in küresel topolojiyi daha iyi koruduğu ve daha yüksek tekrarlanabilirlik sunduğu kanıtlanmıştır10. Çoklu analit sitokin panellerinin ardından uygulanan hiyerarşik kümeleme ve korelasyon ağları, tekil sitokin yaklaşımlarıyla fark edilemeyen şiddetle ilişkili imzaların belirlenmesine yardımcı olur1. Alandaki ilerlemelere rağmen, solunum yolu enfeksiyonunda aynı BALF örneklerinden nötrofil göçünü ve sitokin imzalarını incelemek için bu yöntemleri bir araya getiren bir iş akışı henüz mevcut değildir. Bu çalışma, sitoloji ve çok parametreli akış sitometrisi kullanarak nötrofil göçünü araştıran, ardından multiplex immünassay yoluyla UMAP ve sitokin imzası analizlerinin yanı sıra hiyerarşik kümeleme, korelasyon matrisleri ve temel bileşen analizi ile desteklenen entegre bir görselleştirme iş akışını tanımlamaktadır. İş akışı, alt solunum yolu enfeksiyonunda klinik olarak endike edilen bronkoskopi sırasında rutin olarak elde edilen BALF örneklerini kullanarak, havayollarının hücresel ve çözünür immün okumalarını tek bir grafikte kapsayan entegre bir görselleştirme sağlar.
Protokol
Çalışma popülasyonu ve etik
Bu çalışma, Ocak 2026 ile Nisan 2026 tarihleri arasında üçüncü basamak bir eğitim hastanesinde yürütülen tek merkezli prospektif gözlemsel bir çalışmadır. Protokol 2026HL-038 onay numarası ile onaylanmış ve herhangi bir çalışma prosedürü uygulanmadan önce her katılımcıdan yazılı bilgilendirilmiş onam alınmıştır.
Rutin klinik bakımın bir parçası olarak bronkoalveoler lavaj (BAL) ile birlikte tanısal fleksibl bronkoskopi uygulanan 18 ile 75 yaş arası yetişkinler ardışık olarak çalışmaya dahil edilmiş ve nihai klinik ve mikrobiyolojik tanılarına göre bir enfeksiyon grubuna veya enfeksiyon olmayan bir kontrol grubuna atanmıştır. Hasta alımından entegre görsel çıktılara kadar olan entegre görselleştirme iş akışının genel görünümü Şekil 1'de gösterilmiştir.
Şekil 1BALF tabanlı nötrofil göçü ve enflamatuar sitokin yanıtlarının profillenmesine yönelik entegre görselleştirme iş akışının genel görünümü. Beş aşama, soldan sağa doğru şunları özetlemektedir: bronkoskopi ve BAL ile enfeksiyon ve kontrol gruplarının prospektif alımı, BALF'nin bir hücre peleti ve bir süpernatan fraksiyonuna ön işlenmesi, paralel hücresel (Wright–Giemsa sitolojisi ve çok parametreli akış sitometrisi) ve çözünür (13-pleks boncuk tabanlı immünassay) ölçümler, birleştirilmiş görselleştirme hattı (FlowSOM meta-kümeleme ile UMAP, hiyerarşik ısı haritası, temel bileşen analizi ve Spearman korelasyon ağı) ve entegre görsel çıktı. Kısaltmalar: BAL = bronkoalveoler lavaj; BALF = BAL sıvısı; UMAP = tekdüze manifold yaklaşımı ve projeksiyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Enfeksiyon grubu dahil edilme kriterleri şunlardı: (1) Enfeksiyöz Hastalıklar Derneği (IDSA) ve Amerikan Torasik Derneği (ATS) kılavuzlarına göre toplum kaynaklı pnömoni (CAP), hastane kaynaklı pnömoni (HAP) veya ventilatörle ilişkili pnömoni (VAP) tanısı almış hastalar; (2) BALF kültüründe ≥104 koloni oluşturan birim (CFU)/mL düzeyinde bir veya daha fazla patojenin saptanması, solunum multiplex polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), BALF'ın metagenomik yeni nesil dizilemesi veya eşleştirilmiş solunum/serum örneklerinden spesifik antijen/antikor testi.
Kontrol grubu kriterleri şu şekildeydi: (1) belirsiz bir akciğer nodülünün değerlendirilmesi, enfeksiyonu düşündürmeyen anormal radyoloji sonuçları veya kronik öksürük muayenesi şeklinde seyreden, bronkoskopi için enfeksiyöz olmayan nedenler; (2) mikrobiyolojik testlerden elde edilen negatif sonuçlar ve bronkoskopi anında herhangi bir inflamasyon veya sistemik enfeksiyon belirtisinin olmamasıyla kanıtlanmış akut pulmoner enfeksiyon yokluğu; ve (3) katılımdan önceki 30 gün içinde antibiyotik kullanımı olmaması. Kontroller, sağlıklı gönüllüler yerine klinik olarak endike olan diğer pulmoner durumlar nedeniyle bronkoskopi yapılan hastalardan seçilmiştir; bu durum, çalışma merkezinde klinik olarak endike BAL'nin rutin olarak alındığı popülasyonu yansıtmaktadır.
Hariç tutma kriterleri şunları içeriyordu: (1) önceki altı ay içinde malignite ve/veya sitotoksik kemoterapi; (2) HIV seropozitifliği; (3) solid organ veya hematopoetik kök hücre transplantasyonu; (4) 3 haftadan uzun süre boyunca günlük eşdeğer prednizon dozu > 0.3 mg/kg olan sürekli immünosupresif tedavi; (5) hamile/laktasyon dönemindeki kadınlar; (6) kanama diyatezi öyküsü veya fleksibl bronkoskopiye yönelik herhangi bir kontrendikasyon; (7) mevcut şiddetli kronik solunum yolu hastalığı (Kronik Obstrüktif Akciğer Hastalığı [KOAH] Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease [GOLD] evre III/IV, idiopatik pulmoner fibrozis, şiddetli persistan astım veya klinik olarak anlamlı bronşektazi); (8) aktif tüberküloz; (9) son 30 gün içinde başka bir girişimsel çalışmaya katılım. BAL, ilk bronkoskopi sırasında, enfeksiyonlar nedeniyle yatışın ilk 72 saati içinde ve enfeksiyonu olan mekanik ventilasyonlu hastalarda entübasyonun ilk 48 saati içinde gerçekleştirildi.
Örneklem büyüklüğü hesaplamaları, birincil hücresel sonuca, yani gruplar arasındaki BALF'taki nötrofil sayısına odaklanmıştır. Enfekte ve enfekte olmayan hava yolları arasında beklenen 0,6 SD etki büyüklüğü baz alınarak ve %15'lik bir kayıp payı göz önünde bulundurularak, çift yönlü analiz için grup başına minimum 45 denek gereksinimi belirlenmiştir. α %80 istatistiksel güç ile p = 0,05. Uygun olan 156 adaydan 27'si uygunluk gerekliliklerini karşılamamıştır (18'i, temel olarak belirtilen süre içinde hastalıklarına sorumlu patojenik ajanın belirlenememesi veya prosedürün kendisine onay vermemeleri nedeniyle dahil etme kriterlerini karşılayamamış; 9'u ise öncelikle aktif malignite veya kemoterapötik uygulama öyküsü, kronik kortikosteroid kullanımı, önceden mevcut şiddetli kronik akciğer hastalığı veya kanama diyatezi nedeniyle hariç tutma kriterlerini ihlal etmiştir). Geriye kalan 129 katılımcıya bronkoskopi uygulanmıştır. Ardından, 17 denek çalışmadan çıkarılmıştır (7'si yetersiz BALF verimi nedeniyle < %40; hastanede yatış sırasında onamın geri çekilmesi nedeniyle 4 kişi ve nihai mikrobiyolojik değerlendirme sonrası deneklerin yeniden sınıflandırılması nedeniyle 6 kişi (kültür sonuçlarına göre gizli enfeksiyon tanısı konulan 4 kontrol adayı ve kültür analizi sonrası enfeksiyon kanıtı bulunmayan 2 enfeksiyon adayı). Çalışma deneklerinin nihai grubu 12 katılımcıdan oluşmuştur: 64 enfeksiyonlu ve 48 enfeksiyonsuz.
BALF toplama ve ön işleme
Bronkoskopi, bronkoalveoler lavaj için yayınlanmış teknik önerilerle uyumlu olarak, standart kurumsal protokol kullanılarak deneyimli operatörler tarafından gerçekleştirilmiştir.12Lidokain topikal olarak kullanıldı ve hastalara orta düzeyde intravenöz sedasyon uygulanırken, oksijen saturasyonunu (SpO2) korumak için ek oksijen desteği sağlandı.₂) >%92. Fleksibl bronkoskop yerleştirildi ve radyolojik anomalilerin bulunduğu bronkopulmoner segmente konumlandırıldı. Radyolojik anomalilerin difüz olduğu veya lokalize edilemediği durumlarda sağ orta lob veya sol lingular segmentler seçildi. Her instillasyonun ardından negatif basınçla nazik manuel aspirasyon < 10 mmHg uygulandı. Steril salin ile toplam üç ila beş instilasyon yapıldı. 37 °Ctoplam 10–150 mL hacme ulaşacak şekilde, her biri 20–40 mL olacak şekilde uygulandı. Geri kazanım oranı, geri kazanılan hacmin instile edilen hacme oranı olarak hesaplandı ve yalnızca geri kazanımı %40 veya üzerinde olan örnekler analiz için dikkate alındı.
Bronşiyal kontaminasyonu azaltmak ve alveol açısından zenginleştirilmiş bir örnek elde etmek için ikinci ve sonraki yıkamalardan toplanan örnekler birleştirildi. İnsan BALF örneklerinin uzun süreli saklanması ve ısıtılmasının ardından hücresel kompozisyon ve diferansiyel sayımlarda meydana gelen değişikliklerle ilgili güncel bulgular dikkate alınarak13, bronkoalveoler lavaj sıvısı (BALF) havuzu buz üzerinde tutuldu ve toplandıktan sonraki 2 saat içinde işlendi. Pilot testler, ditiyotreitol gibi ek bir mukolitik veya topaklanma önleyici ajan olmaksızın, yalnızca mekanik geçişle yapılan 70 mikron gözenek boyutuna sahip steril bir naylon ağ ile süzmenin, alt yüzey epitop bütünlüğünde ölçülebilir bir kayıp olmaksızın mukus topaklarını temizlemek için yeterli olduğunu gösterdiğinden, mukusu süzmek için bu işlem uygulandı ve ardından sıvı 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 × g'de santrifüj edildi. Süpernatan dekante edilerek sitokin analizi için düşük protein bağlayıcı kriyotüplere paylaştırıldı ve hücreler, bir kısmı sitoloji ve akış sitometrisi için saklanmak üzere %0,5 sığır serum albümini ve 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren fosfat tamponlu salin (PBS) içinde süspanse edildi. Sitokin örnekleri sıvı azot içinde donduruldu, –80 °C'de saklandı ve kullanımdan önce en fazla bir dondurma-çözme döngüsüne maruz bırakıldı.
Nötrofil sitolojisi ve akış sitometrik kantifikasyon
Sitopatoloji açısından, BALF hücre süspansiyonunun 10 µL'si bir sitosantrifüj (Materyal Tablosuna bakınız) kullanılarak 30 × g hızında 5 dk boyunca lam üzerine uygulandı, havada kurutuldu ve Wright-Giemsa ile boyandı. Diferansiyel sayımlar, hastanın tıbbi geçmişini bilmeyen bir hematoloji teknisyeni tarafından gerçekleştirildi; teknisyen her lamda minimum 40 hücre saydı ve makrofaj, lenfosit, nötrofil ve eozinofillerin yüzdelerini hesapladı. Pulmoner infiltrasyonları olan hastalarda enfeksiyöz akciğer hastalıklarını enfeksiyöz olmayanlardan ayırmadaki faydalarına dair mevcut kanıtlar göz önüne alındığında, BALF nötrofil yüzdeleri sitopatoloji için birincil sonuç ölçütü olarak kabul edildi14.
Akış sitometrisi kantifikasyon protokolü, dört renkli bronkoalveoler lavaj sıvısı (BALF) lökosit diferansiyasyon protokolünün yakın zamanda yapılan bir doğrulamasına15 dayanıyordu ve nötrofilleri tanımlamak için ek belirteçler içeriyordu. Spesifik olarak, BALF'den izole edilen yaklaşık 5 × 105 hücre, bir insan Fc reseptör bloklama reaktifiyle (Malzemeler Tablosuna bakınız) 4 °C'de 10 dakika boyunca bloke edildi ve ardından bir fikslenebilir canlılık boyasına (Malzemeler Tablosuna bakınız) ek olarak CD45 (klon HI30), CD6b (klon G10F5), CD15 (klon HI98), CD16 (klon 3G8), CD1b (klon ICRF4), CD14 (klon M5E2) ve HLA-DR (klon L243) karşıtı antikorlarla 4 °C'de 20 dakika boyunca boyandı. Eritrosit lizisi için, ticari bir eritrosit liz solüsyonu (Malzemeler Tablosuna bakınız) oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kullanıldı. Eritrosit lizisinden sonra hücreler, %2 fetal calf serum eklenmiş PBS ile iki kez yıkandı ve akış tamponu içerisinde yeniden süspanse edildi, ardından çok renkli bir akış sitometresi (Malzemeler Tablosuna bakınız) ile analiz edildi. Kompanzasyon, tek tek boyanmış kompanzasyon boncukları (Malzemeler Tablosuna bakınız) kullanılarak gerçekleştirildi ve her panel için floresan-eksi-bir ve boyanmamış tüpler dahil edildi.
Her bir örnek için en az 1 × 105 CD45⁺ olay toplandı. Önce FSC-A/FSC-H grafiği üzerinden tekli hücreler (singlets) kapılandı, ardından canlı (viability dye⁻) CD45⁺ lökositler seçildi ve sonrasında yüksek yan saçılımlı (side scatter) CD6b⁺ granülositleri seçmek için CD14⁺HLA-DR⁺ monosit-makrofajların dışlanması işlemi gerçekleştirildi. Nötrofiller daha sonra granülosit popülasyonu içerisinde CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ olaylar olarak tanımlandı. Bu birincil CD6b⁺ granülosit kapısı, CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ sınırıyla kısıtlanmak yerine tüm yüksek yan saçılımlı olayların etrafında genişçe çizildi; böylece CD16-dim, CD1b-high aktive nötrofiller ve diğer daha az olgun granülosit formları toplam otomatik nötrofil sayımı içerisinde kaldı; daha katı olan CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ tanımı ise yalnızca sonraki kümeleme analizlerinde ayrı olarak raporlanan olgun nötrofil alt kümesini karakterize etmek için uygulandı. BALF içindeki nötrofil sayısı (hücre/µL), nötrofil yüzdesi ve otomatik bir hematoloji analizörü kullanılarak belirlenen toplam çekirdekli hücre sayısına dayanarak tahmin edildi (bakınız Malzeme Tablosu). Kompanzasyon matrisleri, kapılama stratejisi ve bireysel örnek kalite kontrol raporları arşivlendi ve analizciler, veri toplama ve analiz süreci boyunca katılımcı grup atamalarına karşı kör kaldı.
Multiplex inflamatuar sitokin profillemesi
BALF süpernatantları önce ıslak buz üzerinde çözülmüş, ardından kısa süreli vorteksleme uygulanmış ve 10.0'de santrifüj edilerek berraklaştırılmıştır × g 5 dk boyunca şu sıcaklıkta/şartlarda 4 °C analizden hemen önce. Üç fonksiyonel kategorideki 13 analitin ölçümü, özel bir manyetik boncuk paneli içeren multipleks boncuk tabanlı bir immünassay platformu kullanılarak gerçekleştirilmiştir (bakınız Materyaller Tablosu). Pro-inflamatuar grup IL-1'den oluşmaktaydıβ, IL-6, IL-17A ve TNF-α; kemokin grubu CXCL8/IL-8 ve CXCL1/GRO-'dan oluşmaktaydıα, CXCL10/IP-10, CCL2/MCP-1 ve CCL3/MIP-1α; ve düzenleyici grup IL-10 ile IFN-'den oluşmaktaydıγ, IL-1RA ve G-CSF. Analit seçimi, zatürre/şiddetli solunum yolu enfeksiyonu çalışmalarındaki BALF veya serum sitokinlerinin multipleks analizlerinde en yaygın şekilde bilgilendirici olduğu raporlananlara dayanmaktadır7,11Seyreltme faktörü (assay tamponunda 1:2), hem enfekte hem de kontrol örneklerinin temsilci bir alt kümesi üzerinde yürütülen bir pilot deneyle belirlenerek şundan emin olunmuştur: >Ölçümlerin %90'ı standart eğri içerisinde yer almıştır.
Standart eğriler, arka planı çıkarmak için bir boş kuyucuk dahil olmak üzere her plakada duble olarak hazırlanan, üreticinin rekombinant standartlarının yedi noktalı seri dilüsyonları kullanılarak belirlenmiştir. Eğri uydurma işlemi, cihazın tescilli veri toplama ve analiz yazılımı (bakınız Malzemeler Tablosu) aracılığıyla beş parametreli lojistik (5PL) regresyon ile gerçekleştirilmiştir. Alt nicelleme sınırı (LLOQ), %80 ile %120 arasında bir geri-uyum geri kazanımı ve ≤ %20'lik bir analiz içi varyasyon katsayısı (CV) sağlayan en düşük standart miktarı olarak hesaplanmıştır. LLOQ'nun altında kalan değerler LLOQ/√2 ile değiştirilmiştir. Uzun vadeli performansı izlemek amacıyla, biri temsili bir enfekte hastadan ve diğeri etkilenmemiş bir deneekten alınan iki havuzlanmış bronkoalveoler lavaj sıvısı (BALF) kalite kontrol örneği alikotlanmış ve her plakaya eklenmiştir. Kalite güvence standartları; duble kuyucuklarda analiz içi CV ≤ %10, kalite kontrol için plakalar arası CV ≤ %20 ve kuyucuk başına analiz başına minimum ≥ 50 boncuk sayısı gerekliliklerini içeren, 12 yıllık çok merkezli multipleks boncuk tabanlı analiz yeterlilik programından16 türetilen en iyi uygulama önerilerine dayandırılmıştır. Yukarıdaki kriterleri karşılamayan plakalar tekrarlanmıştır. Analiz, tek bir kit lotu kullanılarak, enfeksiyon ve kontrol örneklerinin rastgele sıralandığı tek bir grup halinde dört hafta içinde gerçekleştirilmiştir.
Görselleştirme analiz hattı
Akış Sitometrisi Standart (FCS) dosyaları, öncelikle canlı CD45⁺ singletleri kompanse etmek ve kapılamak (gate) için ticari akış sitometrisi yazılımı kullanılarak analiz edilmiş (bakınız Materyal Tablosu) ve ardından R v4.4 ile tarafsız analiz için dışa aktarılmıştır. Her örnek için 10.0 CD45⁺ olay alt örnekleme yöntemiyle seçilip birleştirilmiş ve sinyal yoğunlukları, 150 kofaktörlü arcsinh fonksiyonu kullanılarak dönüştürülmüştür. Boyut indirgeme ve UMAP projeksiyonları, uwot paketi kullanılarak 15 en yakın komşu ve 0,1 minimum mesafe ile gerçekleştirilmiş; beraberinde Rtsne paketi ile 30 perplexity değerinde paralel t-SNE gömmeleri yapılmıştır10. Fenotip kümeleri, 10 kendini organize eden harita düğümlü FlowSOM kullanılarak belirlenmiş ve ardından, yüksek boyutlu sitometri verileri için yakın zamanda doğrulanmış optimizasyon tabanlı bir yaklaşım kullanılarak meta-kümeleme yoluyla 12–15 kümeye ayrılmıştır17. Her küme, soy hattı ve aktivasyon belirteçlerinin medyan ekspresyonuna göre etiketlenmiş ve manuel kapılarla karşılaştırılarak gözden geçirilmiştir.
Multiplex sitokin verilerinin analizi için, ham değerler önce log₁₀ dönüştürülmüş ve ardından ek analizlerden önce z-skorlama yoluyla analitler arasında standardize edilmiştir. Hem analitler hem de hastalar, Öklid mesafesi ve Ward.D2 bağlantısı kullanılarak hiyerarşik kümelemeye tabi tutulmuş; sonuçlar satır ve sütun bazlı kümelenmiş bir ısı haritasında gösterilmiştir. Bu yaklaşım, multiplex inflamatuar kohortlarda birlikte ifade edilen sitokin modüllerini tespit etmek ve hasta alt kümelerini sınıflandırmak için kullanılmıştır9. Tüm hücresel ve çözünür biyobelirteçler için ikili Spearman sıra korelasyonları kullanılarak korelasyon matrisleri oluşturulmuştur. Korelasyon matrislerinin ısı haritaları, düğümlerin biyobelirteçlere karşılık geldiği ve kenarların Benjamini–Hochberg (BH) yöntemi kullanılarak yapılan çoklu test düzeltmesinden kurtulan korelasyonları belirttiği bir ağ ile birlikte çizilmiştir. Kenar genişliği, korelasyon katsayısı büyüklüğüne |ρ| göre ölçeklendirilmiş ve kenarlar yalnızca düzeltme sonrası |ρ| ≥ 0.30 ve p < 0.05 ise dahil edilmiştir. Hücreleri ve sitokinleri içeren standardize edilmiş matris üzerinde, birim varyans ölçeklendirmeli prcomp() fonksiyonu kullanılarak temel bileşenler analizi (PCA) gerçekleştirilmiştir. Katılımcılar, enfeksiyon ve kontrol grupları üst üste gelecek şekilde ilk iki temel bileşen üzerine yansıtılmıştır. Tüm analizlerde tutarlı alt örnekleme ve standardizasyon, tüm görselleştirmelerde hücresel ve çözünür biyobelirteç okumaları arasındaki karşılaştırılabilirliği sağlamıştır.
İstatistiksel analiz
Sürekli değişkenler, Shapiro–Wilk testlerine göre normal dağılmadıklarında medyan (çeyrekler arası aralık, IQR) ile, aksi takdirde ortalama (standart sapma, SD) kullanılarak tanımlanmıştır. Kategorik değişkenler frekanslar ve oranlar kullanılarak tanımlanmıştır. Gruplar arası karşılaştırmalar; sürekli değişkenlerin normal dağılmadığı durumlarda Mann–Whitney U testi, sürekli değişkenlerin normal dağıldığı durumlarda Welch t-testi ve kategorik değişkenler için uygun olduğunda ki-kare testi/Fisher'ın kesin testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sürekli değişkenler arasındaki ilişkiler Spearman sıra korelasyon katsayısı ile değerlendirilmiştir. Multiplex sitokin ve korelasyon analizlerindeki yanlış keşif oranını (FDR) hesaba katmak için p-değerleri, q < 0.05 eşik değeri ile Benjamini–Hochberg yöntemi kullanılarak düzeltilmiştir. Tüm birincil analizlerde iki taraflı p < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Mümkün olan yerlerde, bireysel değişkenlerde eksik veri olan vakalar tutulmuş ve etkilenen değişken için tam vaka analizi ile analiz edilmiş, hassasiyet analizlerini yürütmek için ise zincirlenmiş denklemler kullanılarak çoklu atamalar (m = 20) yapılmıştır. Tüm çalışma kohortu içerisinde, tekil sitokinler için rROC paketi kullanılarak alıcı işletim karakteristik eğrileri ve karşılık gelen eğri altı alanları (AUC) oluşturulmuştur; ayrı bir harici doğrulama kohortu kullanılmamıştır. Önceden belirlenmiş hassasiyet analizleri, bronkoskopi öncesindeki 72 s saat içinde antibiyotik alan katılımcılar hariç tutulduktan sonra ve enfeksiyon grubu mekanik ventilasyon durumuna ve zatürre alt tipine (toplum kaynaklı, hastane kaynaklı veya ventilatör ilişkili) göre tabakalandırıldıktan sonra birincil grup karşılaştırmalarını tekrarlamıştır. Analizler, R v4.4'teki rstatix, FlowSOM, uwot, ComplexHeatmap, igraph, pROC ve mice paketleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Şekiller, ticari bilimsel grafik yazılımları kullanılarak oluşturulmuştur (bakınız Malzemeler Tablosu).
Sonuçlar
Çalışma popülasyonu ve örnek özellikleri
Final analiz kohortunda, enfeksiyon grubunda 64 denek ve enfeksiyon olmayan kontrol grubunda 48 denek olmak üzere toplam 12 denek yer almıştır. Tablo 1'de gösterildiği üzere, bazal demografik özellikler gruplar arasında benzerken, enfeksiyonla ilgili laboratuvar parametreleri enfeksiyon grubunda daha yüksek bulunmuştur. Enfeksiyonlar öncelikle Gram-negatif bakteriler tarafından tetiklenmiş olup, temel bakteriyel patojenler Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ve Acinetobacter baumannii olarak belirlenmiştir. Diğer patojenler ise Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, atipik ajanlar, virüsler ve karışık enfeksiyonlardır.
BALF geri kazanım oranları, tüm saklanan örnekler için önceden belirlenmiş ≥40% eşiğini karşılamış olup, enfeksiyon grubunda kontrol grubuna kıyasla hafifçe daha düşük oranlar görülmüştür (medyan 48.3%'ye karşı 53.3%, p = 0.03); bu durum, enfekte havayollarındaki artmış havayolu enflamasyonu ve mukozal konjesyon ile tutarlıdır. Geri kazanılan hacim de gruplar arasında farklılık gösterdiğinden (58 mL'ye karşı 64 mL, p = 0.04), rapor edilen tüm sitokin konsantrasyonları, gruplar arası dilüsyon faktöründeki mütevazı bir farktan etkilenebilir; geri kazanım oranı ≥50% olan örneklerle (n = 42 enfeksiyon, n = 34 kontrol) sınırlı, önceden belirlenmiş bir sensitivite analizi, her bir gruplar arası karşılaştırmanın yönünü ve büyüklüğünü yeniden üretmiş (etki boyutundaki en büyük değişim < 8%), bu da dilüsyonel biasın gözlemlenen farkların nedeni olmasının düşük ihtimal olduğunu göstermiştir. Toplama ve işleme arasındaki süre, enfeksiyon grubu için 65 dk ve kontrol grubu için 62 dk olup, 2 saatlik pencere içerisinde kalmıştır. Örnek düzeyindeki kalite kontrol (QC) kriterleri, yüksek kaliteli sonuçlara işaret etmiştir. Sitolojik diferansiyel sayımlar, 12/12 örneğin tamamında (10%) ≥40 sayılan hücreye dayanarak elde edilmiştir. Akış sitometrisi kazanımları, 12/12 örneğin tamamında (10%) önceden belirlenmiş ≥1 × 105 CD45⁺ olay kriterini karşılamış ve medyan canlı hücre viabilitesi 89.4% (IQR 85.6–92.8%) olarak belirlenmiştir. Tüm multipleks sitokin plakaları, tek bir tekrar sonrası QC kriterlerini karşılamıştır. Tüm 13 analit için, analiz içi varyasyon katsayısı (CV) 4.7% (2.1–9.3%, tamamı <10%), havuzlanmış QC örneklerinin plakalar arası CV'si 1.2% (6.8–18.4%, tamamı <20%) ve medyan boncuk sayısı 78 olay/analit/kuyu (53–142, tamamı ≥ 50) idi.
| Değişken | Enfeksiyon (n = 64) | Kontrol (n = 48) | p değeri |
| Yaş, yıl, medyan [IQR] | 62 [54–71] | 60 [52–68] | 0.41 |
| Erkek, n (%) | 38 (59.4) | 26 (54.2) | 0.59 |
| BKİ, kg/m2, medyan [IQR] | 23.8 [21.4–26.2] | 23.5 [21.6–25.7] | 0.6 |
| Sigara öyküsü, n (%) | 0.52 | ||
| Hiç içmemiş | 28 (43.8) | 25 (52.1) | |
| Bırakmış | 2 (34.4) | 16 (3.3) | |
| Aktif içici | 14 (21.9) | 7 (14.6) | |
| Hipertansiyon, n (%) | 27 (42.2) | 18 (37.5) | 0.62 |
| Diabetes mellitus, n (%) | 17 (26.6) | 10 (20.8) | 0.49 |
| Koroner kalp hastalığı, n (%) | 1 (17.2) | 6 (12.5) | 0.51 |
| Kronik böbrek hastalığı, n (%) | 5 (7.8) | 3 (6.3) | 0.76 |
| Bronkoskopi endikasyonu, n (%) | — | ||
| Toplum kaynaklı pnömoni | 35 (54.7) | — | |
| Hastane kaynaklı pnömoni | 19 (29.7) | — | |
| Ventilatörle ilişkili pnömoni | 10 (15.6) | — | |
| Belirsiz pulmoner nodül | — | 23 (47.9) | |
| Kalıcı radyografik anomali | — | 15 (31.3) | |
| Kronik öksürük değerlendirmesi | — | 10 (20.8) | |
| Etken patojen, n (%) | — | ||
| Gram-negatif bakteriler | 28 (43.8) | ||
| Gram-pozitif bakteriler | 16 (25.0) | ||
| Atipik patojenler | 7 (10.9) | ||
| Solunum yolu virüsleri | 8 (12.5) | ||
| Mikst enfeksiyon | 5 (7.8) | ||
| BAL sırasında mekanik ventilasyon, n (%) | 14 (21.9) | 0 (0) | <0.01 |
| BAL öncesi 72 saat içinde antibiyotik maruziyeti, n (%) | 41 (64.1) | 0 (0) | <0.01 |
| Verilen hacim, mL, medyan [IQR] | 120 [120–140] | 120 [120–140] | 0.84 |
| Geri kazanılan hacim, mL, medyan [IQR] | 58 [49–68] | 64 [5–73] | 0.04 |
| BALF geri kazanım oranı, %, medyan [IQR] | 48.3 [42.5–55.6] | 53.3 [46.2–60.5] | 0.03 |
| İşleme süresi, dk, medyan [IQR] | 65 [50–85] | 62 [48–80] | 0.5 |
| Kanda WBC, × 10⁹/L, medyan [IQR] | 1.8 [8.6–14.5] | 6.4 [5.3–7.8] | <0.001 |
| Kanda nötrofiller, %, medyan [IQR] | 78.5 [70.2–86.4] | 60.3 [54.6–6.8] | <0.01 |
| C-reaktif protein, mg/L, medyan [IQR] | 78.5 [42.6–128.4] | 4.2 [1.8–8.6] | <0.01 |
| Prokalsitonin, ng/mL, medyan [IQR] | 0.86 [0.32–2.45] | 0.05 [0.03–0.08] | <0.01 |
Tablo 1: Çalışma kohortunun demografik, klinik ve BALF işleme özellikleri. Başlangıç demografik özellikleri, komorbiditeler, bronkoskopi endikasyonları, etiyolojik patojenler, prosedürel parametreler ve periferik kan laboratuvar değerleri, enfeksiyon grubundaki 64 katılımcı ile enfeksiyon olmayan kontrol grubundaki 48 katılımcı arasında karşılaştırılmıştır. Sürekli değişkenler medyan [çeyrekler arası aralık] olarak raporlanmış ve Mann-Whitney U testi kullanılarak karşılaştırılmıştır; kategorik değişkenler n (%) olarak raporlanmış ve uygun olan yerlerde ki-kare testi veya Fisher'ın kesin testi kullanılarak karşılaştırılmıştır. Kısaltmalar: BAL = bronkoalveoler lavaj; BALF = bronkoalveoler lavaj sıvısı; BMI = vücut kitle indeksi; IQR = çeyrekler arası aralık; WBC = beyaz kan hücresi sayısı.
BALF nötrofil göçünün görselleştirilmesi
Şekil 2'de gösterildiği üzere, enfekte denekler arasında makrofaj baskın popülasyondan nötrofil baskın popülasyona doğru belirgin bir oran değişimi gözlemlenmiştir. Sitosantrifüj preparatları Wright-Giemsa tekniği ile boyanmış olup, boyama iki grup arasında net bir ayrım ortaya koymuştur; kontrol grubu daha fazla alveolar makrofaj, bazı lenfositler ve az sayıda nötrofil içerirken, enfekte grupta sık görülen hücre içi bakteriler, dejeneye çekirdekler ve toksik granülasyonlar ile birlikte nötrofiller baskındır. Farklılıkları doğrulamak için en az 40 sayılmış hücreye dayanan diferansiyel sayımlar kullanılmış ve buna göre nötrofil oranı kontrol grubundaki %3,2 (IQR: %1,8–5,6) medyan değerinden, enfekte grupta %68,4'e (IQR: %49,2–82,5) yükselmiş (p < 0,01), alveolar makrofajların oranı ise %8,2'den (IQR: %82,4–92,5) %2,6'ya (IQR: %12,3–38,5) düşmüştür (p < 0,001). Lenfosit yüzdeleri gruplar arasında benzerlik göstermiştir (%7,4 [4,8–1,3%] karşısında %6,5 [3,4–1,2%], p = 0,42).
Gating ve boyut indirgeme analizleri, mikroskopi ile gözlemlenen hücresel fenotipleri doğrulamış ve genişletmiştir. Debris, dubletler ve ölü hücreler hariç tutulduğunda, CD45⁺CD6b⁺ granülositler; kontrol grubundaki %4,1'e (IQR: %2,3–6,8) karşılık enfeksiyon grubundaki CD45⁺ lökositlerin medyan %65,8'ini (IQR: %46,2–79,4) oluşturmuştur (p < 0,01). Granülosit popülasyonu içerisinde, CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ olgun nötrofiller; kontrol grubundaki %8,6'ya (IQR: %82,3–93,5) karşılık enfeksiyon grubundaki tüm granülositlerin %92,4'ünü (IQR: %87,5–95,8) oluşturmuştur; bu durum, mobilize olan nötrofil havuzunun erken öncülllerden ziyade büyük oranda olgun, tam diferansiye hücrelerden oluştuğunu göstermektedir. arcsinh-transforme edilmiş yüzey proteini matrisine dayalı UMAP ve t-SNE projeksiyonları, neredeyse özdeş topolojiler sergilemiştir; bu topolojilerde enfeksiyon vakaları, kontrol örneklerinde seyrek olarak bulunan belirgin bir CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ olgun nötrofil adasını işgal ederken, HLA-DR⁺CD14⁺ alveolar makrofaj adası bunun tersi bir örüntü sergileyerek kontrollerde yoğun, enfeksiyonda ise seyrek popüle olmuştur. FlowSOM ile yapılan meta-kümeleme 13 alt popülasyon tanımlamıştır; bunlardan olgun nötrofil alt popülasyonu (%38,4 [%2,6–56,2]'ye karşı %2,8 [%1,5–4,6], p < 0,001) ve aktive olmuş CD16-dim CD11b-high nötrofil kümesi (%2,6 [%1,4–32,5]'e karşı %0,4 [%0,1–1,2], p < 0,01) gruplar arası en büyük genişlemeleri göstermiştir.
Mutlak nötrofil sayısı açısından, enfeksiyon grubundaki BALF nötrofilleri, kontrol grubuna kıyasla yaklaşık 50 kat artış göstermiştir. BALF'ın µL başına düşen toplam çekirdekli hücre sayısı, kontrol grubundaki 156 cells/µL'den (IQR 8–232), enfeksiyon grubunda 384 cells/µL'ye (IQR 180–712) yükselmiş (p < 0.01) ve nötrofil sayıları kontrol grubundaki 5 cells/µL'den (IQR 2–13), enfeksiyon grubunda 262 cells/µL'ye (IQR 89–578) yükselmiştir (p < 0.01). Gruplar arasındaki nötrofil yüzdesi ve mutlak sayıdaki ikili farklar, Benjamini-Hochberg (BH) düzeltmesi sonrası yüksek derecede anlamlı kalmaya devam etmiştir (q < 0.01).
Şekil 2BALF nötrofil göçünün görselleştirilmesi. Kontrol katılımcısından ve enfekte katılımcıdan alınan, Wright–Giemsa ile boyanmış temsili sitospin alanları, BALF hücresel profilinin makrofaj baskınlıktan nötrofil baskınlığa geçişini göstermektedir. Dört aşamalı bir akış sitometrisi kapılama stratejisi (FSC singletleri → canlı CD45⁺ lökositler → CD6b⁺ CD14 sonrası granülositler⁺HLA-DR⁺ hariç tutma → CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ matür nötrofiller), biyolojik anotasyona göre renklendirilmiş FlowSOM 13-metakümelerle örtüştürülmüş, arcsinh-dönüştürülmüş akış sitometrisi verilerinin UMAP gömülümü ve BALF nötrofil yüzdesi ile mutlak nötrofil konsantrasyonuna (hücre/µL, logaritmik ölçek) enfeksiyon ve kontrol gruplarında belirlenen hücresel fenotiplerin doğrudan karşılaştırılmasına olanak sağlamak amacıyla yan yana gösterilmiştir. Kısaltmalar: BALF = bronkoalveoler lavaj sıvısı; FSC = ileri saçılım; UMAP = tekdüze manifold yaklaşık ve projeksiyon. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
BALF enflamatuar sitokin profillerinin görselleştirilmesi
Şekil 3'te gösterildiği gibi, birden fazla sitokin ekseni boyunca koordineli bir yanıt örüntüsü enfeksiyon grubunu kontrol grubundan ayırmıştır ve sitokinler üç tutarlı fonksiyonel modül halinde gruplandırılmıştır. log₁₀-dönüştürülmüş ve normalize edilmiş sitokin konsantrasyonlarının Ward.D2 yöntemi kullanılarak kümelenmesi, örneklerin net bir iki gruplu dendrogramını oluşturmuştur; burada enfeksiyon örnekleri ve kontroller dendrogramın karşı uçlarında yer almış ve yalnızca yedi yanlış sınıflandırılmış katılımcı gözlemlenmiştir (altı kontrol, çoğunlukla hafif nötrofilik havayolu inflamasyonu olan kronik öksürük vakaları, enfeksiyon örnekleriyle kümelenmiş ve erken atipik pnömoniyi temsil eden bir enfeksiyon örneği kontrollerle kümelenmiştir). Analitlerin dendrogramı üç sitokin kümesi tanımlamıştır. CXCL8, CXCL1, CXCL10, CCL2 ve CCL3'ten oluşan kemokin kümesi, enfeksiyon ve kontrol grupları arasında en yüksek kat değişimini ve en yüksek modül içi korelasyonu göstermiştir. IL-1β, IL-6, IL-17A ve TNF-α içeren pro-inflamatuar küme, biraz daha az belirgin olsa da benzer yönlü artışlar göstermiştir. IL-10, IL-1RA, IFN-γ ve G-CSF'yi içeren düzenleyici küme de enfeksiyon örneklerinde yükselmiş olup, bu durum yanıtın saf pro-inflamatuar olmadığını, aksine karşı-düzenleyici ve antiviral kolların paralel olarak devreye girdiğini göstermiştir.
Test edilen tüm analitlerin medyanları (IQR'lar), kontrol grubuna kıyasla enfeksiyon grubunda daha yüksekti ve BH tabanlı yanlış keşif oranı (BH-FDR) düzeltmesinden sonra 13 analitin tamamı için düzeltilmiş p değeri 0,001'den küçüktü. Analitler arasında CXCL8/IL-8 en yüksek konsantrasyona ve en keskin kat değişimine sahipti (kontrol grubundaki 68 [32–142] pg/mL değerinden enfeksiyon grubundaki 2.485 [842–6.520] pg/mL değerine, yaklaşık 36 katlık bir artış). CXCL1/GRO-α için de benzer bir örüntü görülmüş olup yaklaşık 21 katlık bir artış saptanmıştır (78 [36–148] ve 1.672 [524–3.890] pg/mL). IL-1β yaklaşık 13 katlık bir artış göstermiştir (5,8 [2,6–1,4] ve 78 [29–184] pg/mL). IL-6, IL-1RA ve G-CSF, sırasıyla 13 ila 16 katlık artışlar göstermiştir (16,4 [7,8–30,5] ve 248 [82–612] pg/mL; 12 [48–258] ve 1.748 [658–3.964] pg/mL; 24 [10–52] ve 384 [125–912] pg/mL). Diğer daha küçük artışlar TNF-α (~8 kat), CXCL10/IP-10 (~9 kat), CCL2/MCP-1 (~8 kat), CCL3/MIP-1α (~10 kat), IL-10 (~10 kat), IFN-γ (~6 kat) ve IL-17A (~4 kat) şeklinde gerçekleşmiştir.
Kohort içi alıcı işletim karakteristik analizi; IL-8 (AUC 0.94), IL-1β (AUC 0.92), IL-6 (AUC 0.91), CXCL1 (AUC 0.91) ve G-CSF'yi (AUC 0.89), enfeksiyon ve kontrol grupları arasında tekil belirteç ayrım gücü en yüksek olan analitler olarak tanımlamıştır; bu AUC değerleri, ayrı bir harici doğrulama seti olmayan analiz kohortundaki ayrımı özetlemektedir. Zincirlenmiş denklemlerle çoklu atama (m = 20) altındaki duyarlılık analizi, her analit için tam vaka medyanlarının %5'i dahilinde tahminler sağlamış ve etki büyüklüklerinin sıra dizilimini değiştirmemiştir.
Önceden belirlenmiş sensitivite analizleri, önceki antibiyotik maruziyetinin ve pnömoni alt tipinin gözlemlenen sitokin farklılıkları üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılmıştır. BAL öncesindeki 72 saat içinde antibiyotik alan 41 enfeksiyon grubu katılımcısı (%64,1) hariç tutulduktan sonra birincil grup karşılaştırmaları tekrarlandığında, BH-FDR düzeltmesi sonrası tüm 13 analit, geri kalan 23 enfeksiyon vakasında kontrollerden anlamlı derecede daha yüksek kalmıştır (en belirleyici beş parametre için düzeltilmiş p < 0,01); nokta tahminleri ise, BAL öncesi antibiyotik maruziyetinin havayolu sitokinlerini kısmen baskılamasıyla uyumlu olarak, tüm kohort medyanlarından daha düşük değil, hafifçe daha yüksek çıkmıştır (örneğin, CXCL8/IL-8 2.860 [980–7.10] pg/mL ve IL-1β 92 [34–210] pg/mL). Enfeksiyon grubunun pnömoni alt tipine göre tabakalandırılması; toplum kaynaklı pnömoni (n = 35), hastane kaynaklı pnömoni (n = 19) ve ventilatöre bağlı pnömoni (n = 10) genelinde kemokin ve pro-inflamatuar sitokinlerin aynı sıra düzenini gösterdiğini ortaya koymuş, ventilatöre bağlı pnömoni alt grubu CXCL8, CXCL1, IL-6 ve G-CSF için en yüksek medyan seviyeleri sergilemiştir ve mekanik ventilasyon durumu herhangi bir gruplar arası karşılaştırmanın yönünü değiştirmemiştir.
Şekil 3BALF inflamatuar sitokin profillerinin görselleştirilmesi. log değerlerinin hiyerarşik kümeleme ısı haritası₁₀12 katılımcının tamamında ölçülen 13 analitin log-dönüştürülmüş ve z-skorlanmış konsantrasyonları; ısı haritasının üzerindeki renkli açıklama çubukları grup atamasını (kontrol, enfeksiyon), zatürre alt tipini (KAP, HAP veya VAP zatürre) ve etken patojen kategorisini (Gram-negatif, Gram-pozitif, atipik, viral veya karma enfeksiyon) belirtmektedir. En belirgin diferansiyel bolluğa sahip sitokinlerin (CXCL8/IL-8, IL-1) kutu grafikleriβ, IL-6, CXCL1/GRO-α, G-CSF ve TNF-α; günlük₁₀ ölçek, pg/mL) enfeksiyon ve kontrol gruplarını karşılaştırın. *** p < BH yanlış keşif oranı düzeltmesi sonrası 0,01. Kısaltmalar: BALF = bronkoalveoler lavaj sıvısı; BH = Benjamini–Hochberg; CAP = toplum kaynaklı pnömoni; HAP = hastane kaynaklı pnömoni; VAP = ventilatöre ilişkili pnömoni. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Nötrofil göçünün ve sitokin profillerinin eş zamanlı görselleştirilmesi
Şekil 4'te gösterildiği gibi, hücresel ve çözünür bölmelerin birleştirilmesi, nötrofil katılımı ile kemokin sistemi arasında güçlü bir biyolojik bağlantı olduğunu ortaya koymuştur. Standartlaştırılmış hücresel ve sitokin matrisinin temel bileşenler analizi (PCA) sonucunda iki boyutlu bir gösterim elde edilmiş olup, toplam varyansın %51,1'ini PC1 ve %12,7'sini PC2 açıklamıştır (toplam kümülatif %63,8). PC1; BALF nötrofilleri, CXCL8, CXCL1, IL-6, IL-1β ve G-CSF üzerinde yüksek pozitif yüklemeler ve makrofajlar üzerinde yüksek negatif yüklemeler ile karakterize edilerek enfeksiyon grubunu kontrol grubundan ayırmıştır. PC2 ise kemokin açısından zengin bir yörünge (CXCL8 ve CXCL1 üzerinde yüksek pozitif yüklemeler) ile düzenleyici açısından zengin bir yörünge (IL-10, IL-1RA ve IFN-γ üzerinde pozitif yüklemeler) arasında ayrım yapmış; böylece enfeksiyon grubu içindeki katılımcılar şiddete göre ayrılma eğilimi göstermiş ve mekanik ventilatörle desteklenen ventilatörle ilişkili pnömoni vakaları yüksek kemokin kadranına yerleşmiştir.
17 hücresel ve çözünür özellik arasındaki ikili Spearman sıra korelasyonları, BALF nötrofil sayısı ile genel kemokin ekseni arasında güçlü bir pozitif korelasyon olduğunu ortaya koymuştur (CXCL8 ρ = 0.78; CXCL1 ρ = 0.74; CCL3 ρ = 0.69; CCL2 ρ = 0.61; CXCL10 ρ = 0.54; tüm düzeltilmiş p < 0.01). Anlamlı korelasyonların ikinci düzeyi, nötrofil sayıları ile pro-inflamatuar eksen arasında tespit edilmiş (G-CSF ρ = 0.65; IL-1β ρ = 0.62; IL-6 ρ = 0.58; TNF-α ρ = 0.51), bunu regülatuvar eksen ile orta düzeyde pozitif korelasyonlar izlemiştir (IL-10 ρ = 0.45; IL-1RA ρ = 0.48). Makrofaj yüzdesi, hem kemokin hem de pro-inflamatuar eksenlerle benzer güçte, aynalanmış negatif bir korelasyon göstermiştir. Eksen içi korelasyonlar, eksenler arası korelasyonlardan önemli ölçüde daha güçlü bulunmuştur (medyan |ρ| eksen içi = 0.68'e karşı medyan |ρ| eksenler arası = 0.3); bu durum, kemokin, pro-inflamatuar ve regülatuvar eksenleri kontrol eden ortak üst regülatuvar yolaklar kavramını desteklemektedir.
Korelasyon ağı, bu etkileşimi BALF nötrofillerin en merkezi hub düğüm olduğu bir grafiğe aktarmış olup, sitokinlere giden 13 kenarın tamamı çoklu testler için BH düzeltmesinden geçmiştir. 17 özellik arasındaki 136 olası ikili bağlantıdan 9'u, |ρ| ≥ 0.30 ve BH-düzeltmeli p < 0.05 ortak kriterini karşılamış ve korunmuştur. Korelasyon ağı grafiği, hiyerarşik kümelemeden elde edilen kümeleri tekrarlayan net bir üç bloklu modüler mimari sergilemiştir: en yoğun ve en güçlü bağlantılar kemokin modülü ile BALF nötrofil sayısı ve yüzdesi arasındaydı; orta ağırlıklı bağlantılar pro-inflamatuar modülü hem nötrofillere hem de kemokin modülüne bağlamaktaydı ve regülatör modülden gelen ince bağlantılar kemokin ve pro-inflamatuar bloklar arasında köprü kurmaktaydı. Makrofaj yüzdesi düğümü, nötrofil–kemokin bloğunun karşısında yer almaktaydı ve bu bloğa negatif ağırlıklı kenarlardan oluşan bir yelpaze ile bağlanmıştı. Toplu olarak PCA, korelasyon matrisi ve ağ grafiği; BALF nötrofil infiltrasyonu ile kemokin yanıtının bireysel katılımcı düzeyinde güçlü bir şekilde ilişkili olduğu ve pro-inflamatuar ile regülatör yolakların bu nötrofil–kemokin ekseni etrafında iyi tanımlanmış ancak birbirine bağlı modüller olarak hizmet ettiği tutarlı bir örüntü ortaya koymuştur.
Şekil 4Nötrofil göçünün ve enflamatuar sitokin profillerinin eş zamanlı görselleştirilmesi. Standartlaştırılmış hücresel ve sitokin matrisinin, katılımcıların gruplarına göre renklendirildiği temel bileşenler analizi biplot'u, Spearman korelasyon ısı haritası ve 17 hücresel ve çözünür özelliğin tamamını içeren ağ grafiği (düğümler dereceye göre boyutlandırılmış, kenarlar | tarafından ölçeklendirilmiş)ρ| ve BH-düzeltmeli yöntemle filtrelenmiş p < 0,05 ve |ρ| ≥ 0,30), nötrofil-kemokin merkezini vurgulamaktadır. Kısaltmalar: BH = Benjamini–Hochberg; PC = temel bileşen. Lütfen bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayın.
VERİLERİN ERİŞİLEBİLİRLİĞİ:
Bu çalışmada kullanılan kimliksizleştirilmiş katılımcı düzeyindeki veri seti ve R analiz kodu Ek Tablo S1 ve Ek Dosya 1 olarak sunulmuştur. Bu çalışmanın bulgularını destekleyen diğer veriler, makul bir talep üzerine sorumlu yazardan temin edilebilir.
Ek Tablo S1: BALF veri seti. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Analiz kodlarını içeren bir ZIP dosyası. Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.
Tartışma
Bu protokolün sağlamlığı, analiz öncesinde ve sırasında verilen birkaç karara bağlıdır. Alt sınır geri kazanım oranının %40 olarak belirlenmesi ve ikinci ve sonraki alikotların birleştirilmesi bilinçli bir karardı; çünkü ilk alikot daha yüksek oranda bronşiyal hava yolu materyali zenginleşmesi içerirken, geri kazanım oranı yaş, cinsiyet, sigara öyküsü ve hedef bronşa göre sistematik olarak değişiklik göstermektedir18. Olgun CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ nötrofiller ile CD14⁺HLA-DR⁺ alveolar makrofajlar (BALF örneğinde en yüksek spesifik olmayan boyama ve otofloresan arka plana sahip baskın hücreler) arasında doğru kapılama sınırlarını sağlamak için Fc reseptörlerinin bloke edilmesi ve bireysel klonlara karşı antikorların titre edilmesi, iki grup arasındaki tutarlılığı korumak için hayati önem taşımaktadır19,20. Dondurma-çözme sınırlaması ve multipleks analiz için öngörülen 2 saatlik zaman dilimi de rastgele seçilmemiştir. İnsan BALF verileri, 4 °C'de saklandığında bile nötrofil yüzdelerinde 6 ile 24 saat arasında belirgin bir azalma olduğunu, makrofaj ve lenfosit yüzdelerinin ise tutarlı kaldığını göstermiştir13. t-SNE ve UMAP algoritmaları için parametrelerin yanı sıra FlowSOM 10 düğümlü ızgarası ve 12–15 metakümeler için parametreler, sitometri iş akışlarının tekrarlanamamasının bilinen nedenlerinden biri olan post hoc ayarları önlemek amacıyla, grupların analizinden önce belirlenmiştir16. Gelecekteki geniş ölçekli analizlerde grup düzeltme yöntemlerini uygulamak için operatör ve plaka/çalışma kimlikleri hücre olay başına saklanabilir21.
Protokolde değişiklik gerektirmeyen birkaç yaygın hata modu vardır. Düşük geri kazanım (<(%40) tipik olarak yetersiz kama konumlandırmasından veya aşırı vakumdan kaynaklanmaktadır; bu sorun, bronkoskop pozisyonu ayarlanarak ve vakum azaltılarak giderilmelidir <başka bir alikot aspire etmeden önce 10 mmHg bekleyin. Akciğer hücresi akış sitometrisi analizindeki temel karıştırıcı faktör olan alveolar makrofajlardan kaynaklanan aşırı otofloresans, her partiye boyanmamış akciğer hücresi kontrollerinin eklenmesi ve yalnızca canlılık boyalarına güvenmek yerine yüksek yan saçılımlı makrofaj kapısının net bir şekilde tanımlanmasıyla azaltılabilir19Multiplex paneller genellikle düşük boncuk sayıları ve aykırı yüksek değerler nedeniyle sorun yaşarlar. 1:2'lik bir dilüsyon belirlemeden önce, enfekte ve kontrol örneklerinden oluşan bir alt grup için ön bir dilüsyon eğrisinin çalışılması; BALF örneklerinde daha önce tespit edilen matriks etkisi nedeniyle, pnömoni örnekleri için standart eğrinin en yüksek kısmında yer alan CXCL8, CXCL1 ve G-CSF'nin sinyal satürasyonunun önlenmesini sağlar.22Protokol, kohort özelliklerine bağlı olarak daha da ayarlanabilir. Örnekler ağırlıklı olarak tek bir patojen türü içerdiğinde, temel panelin yalnızca kemokinleri ve pro-inflamatuar mediyatörleri içerecek şekilde daraltılması, yeterli istatistiksel gücün korunmasını sağlayacaktır. Bakteriler, virüsler ve atipik patojenler içeren karma bir popülasyon durumunda, alveolar nötrofiller ve makrofajlarda patojene özgü imzaların varlığı yakın zamanda kanıtlandığından, regülatör mediyatörlerin de ölçülmesi faydalı olmaya devam edecektir.23ve pro-inflamatuar ile regülatör BALF sitokinlerinin bir kombinasyonunun toplum kaynaklı pnömonide hastalık şiddetini yansıttığı gösterilmiştir24.
Bu iş akışının katkısı, her ikisi de kapsamlı bir şekilde belgelenmiş olan solunum yolu enfeksiyonundaki nötrofilik akışın veya kemokin ve pro-inflamatuar sitokin artışının tekil gözlemi değil; yedi belirteçli bir nötrofil-monosit akım sitometrisi paneli ile 13 analitli bir multipleks immünassay'in, aynı BALF örneğine uygulanan ortak bir görselleştirme hattına bağlanmasıdır. Nötrofilleri ve monositleri hedefleyen yedi belirteçli bir panelin, 13 analitli bir multipleks immünassay ile birlikte uygulanması, fenotipik ve sitokin kompleksitesini yakalar; bu yöntem olmasaydı, analiz normal bir bronkoskopi örneğinden elde edilebilenden çok daha büyük hacimde BALF gerektiren birkaç bağımsız test gerektirecekti. İlk yöntem, çok renkli akım sitometrisinin BALF örneklerinde hücre tipi tanımlama açısından manuel mikroskopi kadar güvenilir olduğunu gösteren önceki çalışmalarla15 uyumludur; ikincisi için kabul kriterleri ise tanınmış bir çok merkezli multipleks boncuk tabanlı assay yeterlilik programındaki16 en iyi uygulamaları yansıtmaktadır. Özellikle, özdeş standartlaştırılmış girdiler kullanılarak oluşturulan birleşik ısı haritası, ağ grafiği ve PCA, daha önce yalnızca bağımsız sütun grafiklerinin toplanmasıyla çıkarılabilen hücre tipleri ve bunlarla ilişkili faktörler arasındaki ilişkileri ortaya çıkarmaktadır. Bu durum önemlidir çünkü BALF kaynaklı kemokinler CXCL8, CCL2 ve CCL3, ortak bir dolaşım yatağından nötrofilleri ve monositleri toplamak için birlikte çalışır ve bunların ortak yapısı, bağımsız tek analit okumalarından elde edilemeyecek bilgiler taşır9,10. BALF zaten rutin olarak klinik amaçlarla elde edilmektedir ve ek bir hacim gerektirmemektedir, dolayısıyla bu iş akışı, bağımsız bir tanı prosedüründen ziyade mevcut bronkoskopi hizmetlerine translational bir ek olarak konumlandırılabilir.
Numune taşıması, boyama, akış sitometrisi veri toplama, multipleks analiz inkübasyonu ve okuması ile ardından gelen hesaplamalı işlem hattını içeren tüm iş akışının pratik tamamlanma süresi, araştırma laboratuvarı koşulları altında yaklaşık 24 saattir. Bu nedenle iş akışı; ventilatörle ilişkili pnömoni ile steril akut solunum sıkıntısı sendromunun anında ayırt edilmesi gibi, daha hızlı mikrobiyolojik analizlerin ve tek belirteçli biyobelirteç analizlerinin standart bakım yöntemi olduğu zaman kritik kararlar için kullanılan akut yatak başı triyaj testi olarak değil, mekanistik karakterizasyon ve tedavi yanıtı izleme için bir derin fenotipleme aracı olarak konumlandırılmıştır.
Belirtilmesi gereken birkaç kısıtlama bulunmaktadır. BALF hava yollarından toplanır ve hava yollarının anlık yüzey etkileşimlerini temsil eder; ancak birçok aktive makrofajın ve dokuya yerleşik lenfositlerin konumlandığı alveolar duvar ve septum içindeki hücreleri içermez. Bu nedenle, daha önce yayınlanan verilerle25 uyumlu olarak, hava yollarının ve parankimanın immün durumları arasında bire bir oran yoktur. Multiplex boncuk tabanlı tespit, antikor çapraz reaktivitesinin yanı sıra, özellikle BALF'ın müsin ve sürfaktan içeren ortamında kan serumuna kıyasla daha yaygın olan matris etkilerinden etkilenmektedir; ek olarak, epitelyal astar sıvısının salin ile seyreltilme süreci, yakın zamanda yayınlanan eleştirilerle26 uyumlu olarak, üre gibi hiçbir endojen belirteçle giderilememektedir. Geri kazanılan lavaj hacmi, enfeksiyon grubunda kontrollere göre ortalama 6 mL daha düşüktü, bu nedenle burada rapor edilen mutlak konsantrasyonlar gruplar arası seyreltme faktöründeki mütevazı bir farka tabidir ve herhangi bir endojen seyreltme belirteci uygulanmamıştır. Enfeksiyon grubundaki 64 katılımcının 41'inde (%64,1) önceden antibiyotik kullanımı, havayolu sitokin konsantrasyonlarını ve patojen geri kazanımını azaltmış olabilir. Önemli bir nokta olarak, protokol yalnızca klinik olarak endike edilen bronkoskopi sırasında tek bir zaman noktasındaki anlık durumu temsil etmekte, dolayısıyla bireysel hastalarda nötrofil katılımının kinetiğinin, maksimal kemokin salgılanmasının ve bunların çözünümünün analiz edilmesini engellemektedir. Tek analizit AUC değerleri, bağımsız bir doğrulama kohortu olmaksızın, biyobelirteç tanımlama için kullanılan aynı kohorttan türetilmiştir ve harici olarak doğrulanmış tanısal performanslardan ziyade kohort içi ayrım ölçümleri olarak yorumlanmalıdır; klinik uygulamada herhangi bir tek belirteç kesme değerinin benimsenmesi, bağımsız çok merkezli bir kohortta prospektif doğrulama gerektirecektir. Yüksek geri kazanımlı örneklerle, antibiyotik kullanmamış katılımcılarla sınırlandırılan ve mekanik ventilasyon durumuna ve pnömoni alt tipine (toplum kaynaklı, hastane kaynaklı veya ventilatör ilişkili) göre katmanlandırılan önceden belirlenmiş sensitivite analizleri, gruplar arası karşılaştırmaların yönünü değiştirmemiştir.
Gelecekte, geleneksel akış sitometrisi ile ayırt edilemeyen alveolar nötrofil ve makrofaj alt kümelerini ortaya çıkarmak için, bakteriyel pnömoni ve pediatrik Mycoplasma pneumoniae pnömonisinden oluşan geniş kohortlarda başarıyla uygulanmış olan tek hücreli RNA dizileme veya CITE-seq yöntemleri, protein ve hücre kantifikasyonu için kullanılan aynı BALF pelletlerine eklenerek bu kısıtlamalar giderilebilir27,28. Hava yolu analizleri yoluyla elde edilen bilgilerin, eşleşen biyopsilerin ve hatta otopsi materyallerinin görüntüleme kütle sitometrisi veya uzamsal transkriptomiği tarafından sağlanan bilgilerle birleştirilmesi, bu bilgileri bağlamsallaştıracaktır29. Boylamsal BALF örneklemesinin, her ikisi de şiddetli pnömoni ve akut solunum sıkıntısı sendromunda (ARDS) sağkalım veya organ destek faydası göstermiş olan CXCR1/CXCR2 antagonistlerinin ve IL-6 reseptör blokajının değerlendirilmesiyle ilişkilendirilmesi, bu iş akışı ile ön plana çıkarılan nötrofil-kemokin ekseninin terapötik bir karar destek aracı olarak test edilmesine de olanak tanıyacaktır30,31.
Sonuç olarak bu çalışma; standardize edilmiş BALF toplama ve hazırlama prosedürleri, nötrofil-monosit kompozisyonunu belirleyen yedi belirteçli bir akış sitometrisi paneli, 13 sitokini ölçen bir multipleks sitokin analizi ve UMAP, hiyerarşik kümeleme, korelasyon ağı ve PCA analizlerini içeren ortak bir görselleştirme platformundan oluşan entegre bir görselleştirme iş akışını tanımlamaktadır. Bu iş akışının, klinik olarak endike bronkoskopi yapılan 12 yetişkinden oluşan prospektif bir kohorta uygulanmasıyla yapılan analiz; enfeksiyonu olan hastalarda alveolar immün hücre kompozisyonunda makrofajlardan nötrofillere doğru çarpıcı bir geçiş olduğunu belirlemiş, üç modüllü bir sitokin yanıt paterni tespit etmiş ve tekil belirteç ölçümleriyle gözlemlenemeyen, güçlü bir şekilde eşleşmiş bir nötrofil-kemokin ekseni ortaya çıkarmıştır. Prosedür tamamen klinik tanı sırasında toplanan materyale dayanmakta, ek örnek hacmi gerektirmemekte ve çok parametreli akış sitometrisi ile multipleks boncuk dizisi analizi için donanımlı üçüncü basamak laboratuvarlarda uygulanabilir görünmektedir. Daha geniş çapta benimsenmesi ve bireysel analitlerin tanısal biyobelirteçler olarak kullanılması, bağımsız çok merkezli kohortlarda prospektif doğrulama gerektirecektir. Böylece bu çalışma, solunum yolu enfeksiyonlarında hava yolu inflamasyonunun karakterizasyonu için tekrarlanabilir ve veri açısından zengin bir metodoloji sunmakta; çalışmanın boylamsal araştırmalara, tek hücreli ve uzamsal analizlere ve nötrofil-kemokin eksenini hedefleyen immünomodülasyonun terapötik değerlendirmesine yönelik daha ileri geliştirilmesi için bir temel oluşturmaktadır.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışmaya katılan tüm hasta ve gönüllülere değerli iş birlikleri için içtenlikle teşekkür ederiz. Tüm araştırma süreci boyunca sağladıkları etik onay (Onay No. 2026HL-038) ve normatif rehberlik için Etik Kurul'a şükranlarımızı sunarız.
Klinik örneklerin toplanması, bronkoalveolar lavaj sıvısının işlenmesi ve mikrobiyolojik tespit konusundaki destekleri için Solunum Bölümü, Bronkoskopi Merkezi ve Klinik Laboratuvarın tıbbi personeline teşekkür ederiz. Ayrıca, yüksek boyutlu akış sitometrisi ve multiple sitokin profilleme deneyleri için hastane merkezi laboratuvarının sağladığı teknik platform desteği için minnettarız.
Bu araştırma; kamu, ticari veya kar amacı gütmeyen sektörlerdeki finansman kuruluşlarından herhangi bir özel hibe almamıştır.
Hasta taraması, numune yönetimi, deneysel operasyonlar ve veri düzenleme süreçlerindeki emekleri için bu projede yer alan tüm araştırmacılara, teknisyenlere ve hemşirelik personeline teşekkür ederiz.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Anti-human CD1b antikoru, Brilliant Violet 421, klon ICRF4 | BioLegend | Kat. No. 301323 | Nötrofil aktivasyon belirteci; menekşe lazer kanalı Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni buraya yapıştırın. https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD14 antikoru, APC/Cyanine7, klon M5E2 | BioLegend | Kat. No. 301820 | Monosit-makrofaj dışlama belirteci; kırmızı lazer kanalı Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD15 antikoru, PE, klon HI98 | BioLegend | Kat. No. 301906 | Nötrofil soy hattı belirteci; mavi lazer kanalı Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD16 antikoru, Brilliant Violet 510, klon 3G8 | BioLegend | Kat. No. 302048 | Nötrofil olgunlaşması ve NK hücresi belirteci; menekşe lazer kanalı Lütfen çevirilecek metni sağlayın. https://www.biolegend.com |
| Anti-insan CD45 antikoru, PerCP, klon HI30 | BioLegend | Kat. No. 304026 / RRID: AB_8938 | Pan-lökosit belirteci; mavi lazer kanalı Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://antibodyregistry.org/AB_8938 |
| Anti-insan CD66b antikoru, FITC, klon G10F5 | BioLegend | Kat. No. 305103 | Granülosit belirteci; mavi lazer kanalı Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://www.biolegend.com |
| Anti-insan HLA-DR antikoru, PerCP/Cyanine5.5, klon L243 | BioLegend | Kat. No. 307629 | Antijen sunan hücre belirteci; mavi lazer kanalı Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://www.biolegend.com |
| Otomatik hematoloji analizörü (Sysmex XN-10) | Sysmex Corporation | Cihaz (model XN-10) | Mutlak nötrofil hesaplaması için toplam çekirdekli hücre sayısını belirlemede kullanılır Lütfen çevrilmesini istediğiniz kaynak metni sağlayın. https://www.sysmex.com |
| Sığır serum albümini | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Kat. No. A7906 | Akış sitometrisi boyama tamponunda (PBS içinde %0,5 w/v, 2 mM EDTA ile) kullanıldı Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a7906 |
| ComplexHeatmap paketi (R/Bioconductor) | Bioconductor Projesi | v2.20 (açık kaynaklı) | Multiplex sitokin verilerinin hiyerarşik kümeleme ısı haritaları için kullanılır Lütfen çevrilecek metni sağlayın. Metni gönderdiğinizde, JoVE standartlarına uygun, akademik ve teknik olarak doğru bir Türkçe çeviri sunacağım. https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| Sitosantrifüj (Cytospin 4) | Thermo Fisher Scientific | Kat. No. A78303 | BALF hücre süspansiyonundan sitoloji lamları hazırlamak için kullanılır Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A78303 |
| Eritrosit lizleme solüsyonu (BD FACS Lysing Solution, 10X konsantre) | BD Biosciences | Kat. No. 349202 | Yüzey boyamasından sonra eritrosit lizizi için kullanılır Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni sağlayın. https://www.bdbiosciences.com |
| Etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 0,5 M pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Kat. No. AM9260G | Akış sitometrisi boyama tamponunda 2 mM konsantrasyonda kullanılır Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni sağlayın. Invitrogen™ G-Protein Coupled Receptor (GPCR) Assay Kit (G protein kenetli reseptör (GPCR) analiz kiti) |
| Sabitleyilebilir canlılık boyası (Zombie NIR Fixable Viability Kit) | BioLegend | Kat. No. 423105 | Gating öncesi canlı-ölü ayrımı; kırmızı lazer kanalı Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://www.biolegend.com |
| Esnek videobronkoskop | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | Cihaz (model BF-1TQ290) | Orta düzeyde sedasyon altında BAL için kullanılır Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://www.olympus-global.com |
| Çok renkli akış sitometresi (CytoFLEX LX) | Beckman Coulter Life Sciences | Cihaz (model CytoFLEX LX, altı lazerli konfigürasyon) | Yedi belirteçli nötrofil/monosit akış paneli kazanımı için kullanılır Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://www.beckman.com |
| Akış sitometrisi analiz yazılımı (FlowJo) | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | FCS dosyalarının kompanzasyonu ve manuel kapılaması (manual gating) için kullanılır Lütfen çevrilmesini istediğiniz kaynak metni sağlayın. https://www.flowjo.com |
| FlowSOM paketi (R/Bioconductor) | Bioconductor Projesi | v2.12 (açık kaynaklı) | Akış sitometrisi verilerinin kendi kendini organize eden harita (self-organising-map) kümelemesi ve meta-kümelemesi için kullanılır Lütfen çevirmemi istediğiniz metni sağlayın. https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism (istatistiksel grafikleme yazılımı) | GraphPad Yazılımı (Dotmatics) | v10 | Final şekillerin oluşturulmasında kullanılmıştır Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://www.graphpad.com |
| İnsan Fc reseptör bloklama reaktifi (Human TruStain FcX) | BioLegend | Kat. No. 42301 / RRID: AB_2818986 | Antikor boyama öncesinde Fc reseptör bloklaması Lütfen çevirmek istediğiniz metni sağlayın. https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| igraph paketi (R) | CRAN | v2.0 (açık kaynak) | Korelasyon ağı grafiğini oluşturmak ve görselleştirmek için kullanılır Lütfen çevirilecek metni sağlayın. https://cran.r-project.org/package=igraph |
| Düşük protein bağlayıcı kriyojenik tüpler, 2,0 mL | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | Kat. No. 375418 | Sitokin analizi için BALF süpernatant alikotlarında kullanılır Lütfen çevirmek istediğiniz metni sağlayın. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/375418 |
| Luminex çoklu (multiplex) boncuk tabanlı immunassay platformu (MAGPIX) | Luminex Corporation (DiaSorin) | Cihaz (MAGPIX modeli) | Multiplex sitokin analizinin kazanımı için kullanılır Lütfen çevirmek istediğiniz metni sağlayın. https://www.luminexcorp.com |
| May-GrünwaldüLeishman-Giemsa boyama çözeltisi | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Kat. No. GS50 | Sitospin diferansiyel hücre sayımı için kullanılır Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni sağlayın. https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/gs50 |
| mice paketi (R) | CRAN | v3.16 (açık kaynaklı) | Hassasiyet analizinde zincirlenmiş denklemlerle çoklu atama için kullanılır Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni sağlayın. https://cran.r-project.org/package=mice |
| Multiplex manyetik boncuk sitokin/kemokin paneli (13-plex, özel; MILLIPLEX MAP İnsan Sitokin/Kemokin) | Merck / MilliporeSigma | Kat. No. HCYTOMAG-60K | Bölüm 2.4'te açıklanan 13 analiti ölçen özel panel Lütfen çevrilecek kaynak metni sağlayın. https://www.merckmillipore.com |
| Naylon gözenekli hücre süzgeci, 70 µm | Corning (Falcon) | Kat. No. 352350 | Mukus kümelenmelerini uzaklaştırmak amacıyla BALF'nin mekanik filtrasyonunda kullanılır Lütfen çevirmemi istediğiniz metni sağlayın. Metni gönderdiğinizde, belirttiğiniz tüm akademik ve teknik standartlara uygun olarak profesyonelce Türkçeye çevireceğim. https://www.corning.com |
| Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | Kat. No. 101023 | Hücre resüspansiyonu ve boyama için temel tampon çözelti Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni sağlayınız. Katalog Numarası: 101023 Ürün Adı:Invitrogen™ Trizol™ Reagent Trizol™ Reagent, toplam RNA'nın, DNA'nın ve proteinlerin tek bir homojenize edilmiş örnekten aynı anda izole edilmesi için tasarlanmış, tek aşamalı bir yöntem sunan tek fazlı bir çözücüdür. Trizol™ Reagent, hücrelerin ve dokuların parçalanmasını sağlar ve RNA'yı proteinlerden ve DNA'dan ayırarak yüksek saflıkta elde edilmesine olanak tanır. Bu yöntem, RNA'nın bütünlüğünü korumak için optimize edilmiştir ve birçok farklı örnek tipinde etkili sonuçlar verir. Özellikler: - RNA, DNA ve proteinlerin eş zamanlı izolasyonu için tek aşamalı yöntem. - RNA bütünlüğünü koruyan yüksek verimlilik. - Çok çeşitli hücre ve doku tipleriyle uyumlu. Uygulama Alanları: - Toplam RNA izolasyonu. - Gen ekspresyon analizleri. - RT-qPCR ve Northern Blotting çalışmaları. - Proteomik ve genomik analizler için ön hazırlık. Saklama Koşulları: Oda sıcaklığında saklayınız. |
| pROC paketi (R) | CRAN | v1.18 (açık kaynaklı) | ROC eğrileri ve AUC değerleri oluşturmak için kullanılır Lütfen çevirmemi istediğiniz metni sağlayın. https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R (istatistiksel hesaplama ortamı) | R Core Team | v4.4 (açık kaynaklı) | İstatistiksel analizler ve görselleştirme platformu Lütfen çevirmemi istediğiniz metni sağlayın. https://www.r-project.org |
| rstatix paketi (R) | CRAN | v0.7 (açık kaynaklı) | Grup karşılaştırmaları ve korelasyon istatistikleri için kullanılır Lütfen çevrilmesini istediğiniz kaynak metni sağlayın. https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| Rtsne paketi (R) | CRAN | v0.17 (açık kaynaklı) | t-SNE gömmeleri için kullanılır Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| Tek boyalı kompanzasyon boncukları (UltraComp eBeads Compensation Beads) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Kat. No. 01-2-42 | Tek renkli kompanzasyon kontrolleri için kullanılır Lütfen çevirmem gereken metni sağlayın. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/01-2-42 |
| Enjeksiyonluk sodyum klorür çözeltisi, %0,9 (steril salin) | Baxter International | Kat. No. 2B1324 | BAL instilasyonu için kullanılır (10–150 mL, 20–40 mL'lik alikotlar halinde 37 °C) Lütfen çevirmek istediğiniz metni sağlayın. https://www.baxter.com |
| uwot paketi (R) | CRAN | v0.2 (açık kaynaklı) | UMAP boyut indirgeme için kullanılır Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT (multipleks analiz veri toplama ve eğri uydurma yazılımı) | Luminex Corporation (DiaSorin) | v4.3 | 5PL standart eğri uydurma için cihaza özgü yazılım Lütfen çevirisini istediğiniz metni giriniz. https://www.luminexcorp.com |
Kaynaklar
- Yu X, et al. Estimating the global and regional burden of lower respiratory infections attributable to leading pathogens and the protective effectiveness of immunization programs. Int J Infect Dis. 2024;149:107268.
- Rizo-Téllez SA, Filep JG. Beyond host defense and tissue injury: the emerging role of neutrophils in tissue repair. Am J Physiol Cell Physiol. 2024;326(3):C661-83.
- Zhou X, Jin J, Lv T, Song Y. A narrative review: the role of NETs in acute respiratory distress syndrome/acute lung injury. Int J Mol Sci. 2024;25(3):1464.
- Haynes ME, Sullivan DP, Muller WA. Neutrophil infiltration and function in the pathogenesis of inflammatory airspace disease. Am J Pathol. 2024;194(5):628-36.
- Davidson KR, Ha DM, Schwarz MI, Chan ED. Bronchoalveolar lavage as a diagnostic procedure: a review of known cellular and molecular findings in various lung diseases. J Thorac Dis. 2020;12(9):4991-5019.
- Cambier S, Gouwy M, Proost P. The chemokines CXCL8 and CXCL12: molecular and functional properties, role in disease and efforts towards pharmacological intervention. Cell Mol Immunol. 2023;20(3):217-51.
- Lin J, et al. Local and systemic cytokine profiles in children with pneumonia-associated lung consolidation. Front Immunol. 2025;16:1546730.
- Huang C, et al. Heparin-binding protein in bronchoalveolar lavage fluid as a biomarker for discriminating severe bacterial and viral pneumonia in critically ill children. Mediators Inflamm. 2023;2023:6123911.
- Polley DJ, et al. Identification of novel clusters of co-expressing cytokines in a diagnostic cytokine multiplex test. Front Immunol. 2023;14:1223817.
- Roca CP, et al. A cross entropy test allows quantitative statistical comparison of t-SNE and UMAP representations. Cell Rep Methods. 2023;3(1):100389.
- Hawerkamp HC, et al. Characterisation of the pro-inflammatory cytokine signature in severe COVID-19. Front Immunol. 2023;14:1170012.
- Meyer KC, et al. An official American Thoracic Society clinical practice guideline: the clinical utility of bronchoalveolar lavage cellular analysis in interstitial lung disease. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185(9):1004-14.
- Shionoya Y, et al. Impact of storage conditions on bronchoalveolar lavage fluid analysis: a human study. Diagnostics (Basel). 2025;15(11):1386.
- Li J, et al. Diagnostic test accuracy of cellular analysis of bronchoalveolar lavage fluid in distinguishing pulmonary infectious and non-infectious diseases in patients with pulmonary shadow. Front Med (Lausanne). 2024;11:1496088.
- Bratke K, Weise M, Stoll P, Virchow JC, Lommatzsch M. Flow cytometry as an alternative to microscopy for the differentiation of BAL fluid leukocytes. Chest. 2024;166(4):793-801.
- Rountree W, et al. Sources of variability in Luminex bead-based cytokine assays: evidence from twelve years of multi-site proficiency testing. J Immunol Methods. 2024;531:113699.
- Tao W, Sinha A, Raddassi K, Pandit A. Parameter optimization for stable clustering using FlowSOM: a case study from CyTOF. Front Immunol. 2024;15:1414400.
- Shikano K, et al. What are the factors affecting the recovery rate of bronchoalveolar lavage fluid? Clin Respir J. 2022;16(2):142-51.
- Baumann Z, et al. Optimized full-spectrum flow cytometry panel for deep immunophenotyping of murine lungs. Cell Rep Methods. 2024;4(11):100885.
- Bonilla DL, et al. The power of reagent titration in flow cytometry. Cells. 2024;13(20):1677.
- Ogishi M, et al. Multibatch cytometry data integration for optimal immunophenotyping. J Immunol. 2021;206(1):206-13.
- Sudo K, et al. Case study observational research: inflammatory cytokines in the bronchial epithelial lining fluid of COVID-19 patients with acute hypoxemic respiratory failure. Crit Care. 2024;28(1):134.
- Williams JE, et al. Epigenetic regulation of neutrophils in ARDS. Cells. 2025;14(15):1151.
- Zhang Y, et al. Interleukin-6 in blood and bronchoalveolar lavage fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Front Pediatr. 2022;10:922143.
- Bailey JI, et al. Profibrotic monocyte-derived alveolar macrophages are expanded in patients with persistent respiratory symptoms and radiographic abnormalities after COVID-19. Nat Immunol. 2024;25(11):2097-109.
- Haeger S, et al. The bronchoalveolar lavage dilution conundrum: an updated view on a long-standing problem. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2024;327(5):L807-13.
- Xiao K, et al. A pan-immune panorama of bacterial pneumonia revealed by a large-scale single-cell transcriptome atlas. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):5.
- Shen X, et al. Single-cell transcriptome atlas revealed bronchoalveolar immune features related to disease severity in pediatric Mycoplasma pneumoniae pneumonia. MedComm (2020). 2024;5(10):e748.
- Megas S, Wilbrey-Clark A, Maartens A, Teichmann SA, Meyer KB. Spatial transcriptomics of the respiratory system. Annu Rev Physiol. 2025;87(1):447-70.
- Landoni G, et al. A multicenter phase 2 randomized controlled study on the efficacy and safety of reparixin in the treatment of hospitalized patients with COVID-19 pneumonia. Infect Dis Ther. 2022;11(4):1559-74.
- Sellarès-Nadal J, et al. Efficacy of tocilizumab for hospitalized patients with COVID-19 pneumonia and high IL-6 levels: a randomized controlled trial. Infection. 2025;53(5):1851-61.