Bu çalışma; standartlaştırılmış bronkoalveoler lavaj sıvısı toplama ve işlemini, yedi belirteçli bir akış sitometrisi panelini, 13 analitli bir multipleks sitokin analizini ve birleştirilmiş bir analiz hattını içeren entegre bir görselleştirme iş akışı sunmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Araştırma makalesi
Bronkoalveoler Lavaj Sıvısında Nötrofil Göçünün ve İnflamatuar Sitokin Profillemesinin Entegre Görselleştirmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Bronkoalveoler lavaj sıvısı (BALF), alt hava yolu inflamasyonunu incelemek için en doğrudan erişilebilir örnekleme matrisidir; ancak geleneksel analizler, bilgi yoğunluğunu sınırlayan ve hücre-faktör eşleşmesini belirsizleştiren, tek belirteçli akış sitometrisinin analiz bazlı enzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) ile birleştirilmesine dayanmaktadır. Bu çalışma; standartlaştırılmış toplama ve ön işleme süreçlerini, yedi belirteçli bir nötrofil ve monosit akış sitometrisi paneli, 13 analizli bir multipleks sitokin deneyi ve uniform manifold approximation and projection (UMAP), FlowSOM meta-kümeleme, hiyerarşik kümeleme, Spearman korelasyon ağları ve temel bileşenler analizi (PCA) tabanlı birleşik bir analiz hattıyla birleştiren entegre bir görselleştirme iş akışı sunmaktadır.
İş akışı, mikrobiyolojik olarak doğrulanmış akciğer enfeksiyonu olan 64 hasta ve 48 enfeksiyon dışı kontrolden oluşan, bronkoskopi uygulanan 12 yetişkinden meydana gelen tek merkezli prospektif bir kohorta uygulanmıştır. Sitolojik ve akış sitometrik okumalar, enfeksiyon sırasında makrofaj baskın bir alveolar profilden nötrofil baskın bir profile belirgin bir kayma olduğunu ortaya koymuş; nötrofil yüzdesi medyan %3,2'den %68,4'e yükselmiş ve mutlak nötrofil konsantrasyonu yaklaşık 50 kat artmıştır. Multiplex profilleme; kemokin, proinflamatuar ve regülatör modüllerin tamamının yukarı regüle olduğu, koordineli üç modüllü bir sitokin yanıtı belirlemiş; CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α ve G-CSF ise çalışma kohortu içinde en güçlü tekli belirteç ayrımını göstermiştir (eğri altında kalan alan [AUC] 0,89 ila 0,94). PCA, bir korelasyon matrisi ve bir ağ grafiği kullanılarak yapılan integratif görselleştirme, katılımcı düzeyinde sıkı bir şekilde eşleşmiş bir nötrofil-kemokin aksını ortaya çıkarmış ve BALF nötrofil sayısı merkezi ağ bağlantı noktası olarak belirlenmiştir.
İş akışı, yalnızca klinik olarak endike BAL'den rutin olarak elde edilen materyalleri kullanır, ek örnek hacmi gerektirmez ve solunum yolu enfeksiyonlarındaki hava yolu inflamasyonunun çözümlenmesi için bilgi yoğun bir çerçeve sunar; bu çerçeve, çok parametreli akış sitometrisi ve multipleks boncuk dizisi platformları ile donanımlı üçüncül bakım laboratuvarlarında uygulanabilir olup boylamsal, tek hücreli ve terapötik değerlendirme çalışmalarına kadar genişletilebilir. Münferit analitlerin biyobelirteç olarak daha geniş klinik kabulü, bağımsız çok merkezli kohortlarda prospektif validasyon gerektirecektir.
Giriş
Aşı stratejileri ve tedavi yöntemlerindeki ilerlemelere rağmen, alt solunum yolu enfeksiyonlarından kaynaklanan enfeksiyöz ölümler küresel mortalitenin önemli bir nedeni olmaya devam etmektedir; bununla birlikte, bu durum özellikle pediatrik ve yaşlı popülasyonlar arasında geçerliliğini korumaktadır1. Nötrofiller, etkilenen solunum sisteminde, istilacı patojenin ortadan kaldırılması için hayati önem taşıyan bir süreç olan doğuştan gelen bağışıklık yanıtının erken evrelerinde bildirilen birincil hücrelerdir; ancak, kontrolsüz nötrofilik inflamasyon, alveoler kapiller bariyerin bozulmasına, dokularda oksidatif hasara ve akut respiratuar distres sendromunun (ARDS) gelişmesine neden olur2,3. Akciğer hava boşluğundaki nötrofiller ayrıca diğer dokulardan farklı olan köşe kinetiği, tutulum modelleri ve efektör davranışlar sergiler ve bu farklılıklar enfeksiyonun iyileşip iyileşmeyeceğini veya şiddetli pnömoniye ilerleyip ilerlemeyeceğini etkiler4.
Bronkoalveoler lavaj sıvısı (BALF), alveoler mikroçevre hakkında önemli bir bilgi kaynağıdır ve bu bölgedeki klinik bağışıklığın en yakın temsilini sunar5. Kemokin CXCL8, CXCL1, CXCL2 ve CXCL5 dahil olmak üzere diğer kemokinlerle birlikte, CXCR1 ve CXCR2 reseptörleri aracılığıyla nötrofillerin akciğerlere çekilmesinde temel bir rol oynar6. IL-1β, IL-6 ve TNF-α sitokinleri bu süreci daha da artırırken, IL-10 karşıt bir sitokin olarak görev yapar. BALF içindeki seviyelerinin, akciğer enfeksiyonlarının şiddetiyle ve bakteriyel, viral ve atipik pnömoniden kaynaklanan akciğer komplikasyonlarının gelişimiyle ilişkili olduğu gösterilmiştir7 ve alt solunum yolu enfeksiyonlarında daha erken tanı ve patojen ayrımı için multipleks BALF biyobelirteç profilleri benimsenmektedir8.
Rutin BALF testleri genellikle testin temelini oluşturan biyolojiyi tam olarak kapsamakta yetersiz kalır. Hücre sayıları, sitospin örneklerindeki hücrelerin manuel olarak ayırt edilmesiyle tahmin edilebilirken, çözünür mediyatörler bireysel enzim bağlantılı immünosorbent assay'ler (ELISA'lar) kullanılarak ölçülür ve sütun grafiği olarak sunulur. Kemokinler, sitokinler ve her bir hücre tipi ayrı değerlendirilir; belirli bir kemokin konsantrasyon gradyanı ile örnekteki etkilediği hücre popülasyonları arasında herhangi bir korelasyon kurulmaz. Sitokin modüllerinin kombinasyonu, kemokin-nötrofil doz-yanıt ilişkileri ve kendi inflamasyon imzalarına sahip hasta alt grupları, çok değişkenli analizlerin yokluğunda sıklıkla göz ardı edilir9.
Hesaplamadaki ilerlemeler, böyle bütünsel bir yaklaşımı giderek daha gerçekçi kılmaktadır. Çok parametreli akış sitometrisi ve spektral akış sitometrisinin, t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) veya uniform manifold approximation and projection (UMAP) gibi boyut indirgeme yaklaşımlarıyla birleştirilmesi, yüksek boyutlu immün fenotiplerin iki boyutlu uzaya haritalanmasına olanak tanır; sitometri verilerine uygulandığında UMAP'in küresel topolojiyi daha iyi koruduğu ve daha yüksek tekrarlanabilirlik sunduğu kanıtlanmıştır10. Çoklu analit sitokin panellerinin ardından uygulanan hiyerarşik kümeleme ve korelasyon ağları, tekil sitokin yaklaşımlarıyla fark edilemeyen şiddetle ilişkili imzaların belirlenmesine yardımcı olur1. Alandaki ilerlemelere rağmen, solunum yolu enfeksiyonunda aynı BALF örneklerinden nötrofil göçünü ve sitokin imzalarını incelemek için bu yöntemleri bir araya getiren bir iş akışı henüz mevcut değildir. Bu çalışma, sitoloji ve çok parametreli akış sitometrisi kullanarak nötrofil göçünü araştıran, ardından multiplex immünassay yoluyla UMAP ve sitokin imzası analizlerinin yanı sıra hiyerarşik kümeleme, korelasyon matrisleri ve temel bileşen analizi ile desteklenen entegre bir görselleştirme iş akışını tanımlamaktadır. İş akışı, alt solunum yolu enfeksiyonunda klinik olarak endike edilen bronkoskopi sırasında rutin olarak elde edilen BALF örneklerini kullanarak, havayollarının hücresel ve çözünür immün okumalarını tek bir grafikte kapsayan entegre bir görselleştirme sağlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Çalışma popülasyonu ve etik
Bu çalışma, Ocak 2026 ile Nisan 2026 tarihleri arasında üçüncü basamak bir eğitim hastanesinde yürütülen tek merkezli prospektif gözlemsel bir çalışmadır. Protokol 2026HL-038 onay numarası ile onaylanmış olup, herhangi bir çalışma prosedürü uygulanmadan önce her katılımcıdan yazılı bilgilendirilmiş onam alınmıştır.
Rutin klinik bakımın bir parçası olarak bronkoalveoler lavaj (BAL) içeren tanısal fleksibil bronkoskopi uygulanan 18 ile 75 yaş arası yetişkinler ardışık olarak çalışmaya dahil edilmiş ve nihai klinik ve mikrobiyolojik tanılarına göre bir enfeksiyon grubuna veya enfeksiyon olmayan bir kontrol grubuna atanmışlardır. Hasta alımından entegre görsel çıktılara kadar olan entegre görselleştirme iş akışının genel görünümü Şekil 1'de gösterilmiştir.
Şekil 1BALF tabanlı nötrofil göçü ve inflamatuar sitokin yanıtlarının profillenmesine yönelik entegre görselleştirme iş akışının genel görünümü. Beş aşama, soldan sağa doğru şunları özetlemektedir: bronkoskopi ve BAL ile enfeksiyon ve kontrol gruplarının prospektif alımı, BALF'nin hücre peleti ve süpernatan fraksiyonu şeklinde ön işlemesi, paralel hücresel (Wright–Giemsa sitolojisi ve çok parametreli akış sitometrisi) ve çözünür (13-plex boncuk tabanlı immünassay) ölçümler, birleştirilmiş görselleştirme hattı (FlowSOM meta-kümeleme ile UMAP, hiyerarşik ısı haritası, temel bileşen analizi ve Spearman korelasyon ağı) ve entegre görsel çıktı. Kısaltmalar: BAL = bronkoalveoler lavaj; BALF = BAL sıvısı; UMAP = tekdüze manifold yaklaşımı ve projeksiyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Enfeksiyon grubu dahil etme kriterleri şu şekildeydi: (1) Enfeksiyöz Hastalıklar Derneği (IDSA) ve Amerikan Torasik Derneği (ATS) kılavuzlarına göre toplum kaynaklı pnömoni (CAP), hastane kaynaklı pnömoni (HAP) veya ventilatörle ilişkili pnömoni (VAP) tanısı almış hastalar; (2) BALF kültüründe ≥104 koloni oluşturan birim (CFU)/mL oranında bir veya daha fazla patojen saptanması, solunum multiplex polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), BALF'nin metagenomik yeni nesil dizilemesi veya eşleştirilmiş solunum/serum örneklerinden yapılan spesifik antijen/antikor testi.
Kontrol grubu kriterleri şu şekildedir: (1) belirsiz bir akciğer nodülünün değerlendirilmesi, enfeksiyonu düşündürmeyen anormal radyoloji sonuçları veya kronik öksürük muayenesi gibi enfeksiyöz olmayan nedenlerle bronkoskopi yapılması; (2) mikrobiyolojik testlerin negatif sonuçları ve bronkoskopi sırasında herhangi bir inflamasyon veya sistemik enfeksiyon belirtisinin olmaması ile akut pulmoner enfeksiyonun saptanmamış olması; ve (3) katılımdan önceki 30 gün içinde antibiyotik kullanılmamış olması. Kontrol grubu, sağlıklı gönüllülerden ziyade klinik olarak endike olan diğer pulmoner durumlar nedeniyle bronkoskopi yapılan hastalardan oluşturulmuştur; bu durum, çalışma merkezinde rutin olarak klinik endikasyonla BAL uygulanan popülasyonu yansıtmaktadır.
Hariç tutma kriterleri şunları içeriyordu: (1) önceki altı ay içinde malignite ve/veya sitotoksik kemoterapi; (2) HIV seropozitifliği; (3) solid organ veya hematopoetik kök hücre transplantasyonu; (4) 3 haftadan uzun süre boyunca günlük eşdeğer prednizon dozu > 0.3 mg/kg olan sürdürülen immünsupresif tedavi; (5) hamile/emziren kadınlar; (6) kanama diyatezi öyküsü veya fleksibil bronkoskopiye karşı herhangi bir kontrendikasyon; (7) önceden mevcut şiddetli kronik solunum yolu hastalığı (kronik obstrüktif akciğer hastalığı [KOAH] Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease [GOLD] evre III/IV, idiyopatik pulmoner fibrozis, şiddetli persistan astım veya klinik olarak anlamlı bronşektazi); (8) aktif tüberküloz; (9) son 30 gün içinde başka bir girişimsel çalışmaya katılım. BAL, ilk bronkoskopi sırasında, enfeksiyonlar nedeniyle yatıştan sonraki 72 saat içinde ve enfeksiyonlu mekanik ventilasyon uygulanan hastalarda entübasyondan sonraki 48 saat içinde gerçekleştirildi.
Örneklem büyüklüğü hesaplamaları, temel hücresel sonuç olan gruplar arası BALF'taki nötrofil sayısı üzerine odaklanmıştır. Enfekte ve enfekte olmayan hava yolları arasında beklenen 0,6 SD etki büyüklüğü göz önünde bulundurularak ve %15'lik bir fire payı hesaba katılarak, iki yönlü α = 0,05 ve %80 istatistiksel güç için grup başına minimum 45 denekle örneklem büyüklüğüne ihtiyaç duyulmuştur. Uygun görülen 156 adaydan 27'si uygunluk gereksinimlerini karşılamamıştır (18'i, temel olarak belirlenen süre içerisinde hastalıklarına neden olan patojenik ajanın tespit edilememesi veya prosedürün kendisiyle ilgili mutabakat sağlanamaması nedeniyle dahil etme kriterlerini karşılayamamıştır; 9'u ise öncelikle aktif malignite veya kemoterapötik uygulama öyküsü, kronik kortikosteroid kullanımı, önceden mevcut şiddetli kronik akciğer hastalığı veya kanama diyatezi nedeniyle dışlama kriterlerine takılmıştır). Geriye kalan 129 katılımcıya bronkoskopi uygulanmıştır. Sonrasında, 17 denek çalışmadan çıkarılmıştır (7'si yetersiz BALF verimi nedeniyle < %40; hastanede yatan süreçte onamlarını geri çektikleri için 4 kişi ve final mikrobiyolojik değerlendirme sonrası deneklerin yeniden sınıflandırılması nedeniyle 6 kişi (kültür sonuçlarına göre gizli enfeksiyon tanısı alan 4 kontrol adayı ve kültür analizi sonrası enfeksiyon kanıtı bulunmayan 2 enfeksiyon adayı) hariç tutulmuştur. Çalışmanın nihai denek havuzu; 64'ü enfeksiyonlu ve 48'i enfeksiyonsuz olmak üzere toplam 12 katılımcıdan oluşmuştur.
BALF toplama ve ön işleme
Bronkoskopi, bronkoalveolar lavaj için yayınlanmış teknik önerilerle12 uyumlu şekilde, standart kurumsal protokol kullanılarak deneyimli operatörler tarafından gerçekleştirilmiştir. Topikal olarak lidokain kullanılmış ve hastalara orta düzeyde intravenöz sedasyon uygulanırken, oksijen satürasyonunu (SpO₂) >92% seviyesinde tutmak için destekleyici oksijen sağlanmıştır. Fleksibil bronkoskop yerleştirilerek radyolojik anomalilerin bulunduğu bronkopulmoner segmente konumlandırılmıştır. Radyolojik anomalilerin yaygın olduğu veya lokalize edilemediği durumlarda sağ orta lob veya sol lingular segmentler seçilmiştir. Her instilasyonun ardından, < 10 mmHg negatif basınçla nazik manuel aspirasyon uygulanmıştır. 37 °C'deki steril salin ile her biri 20–40 mL olmak üzere toplam 10–150 mL hacminde, toplam üç ila beş instilasyon yapılmıştır. Geri kazanım oranı, instile edilen hacme oranla geri kazanılan hacim olarak hesaplanmış ve analiz için yalnızca geri kazanımı ≥40% olan örnekler dikkate alınmıştır.
Bronşiyal kontaminasyonu azaltmak ve alveol açısından zenginleştirilmiş bir örnek elde etmek için ikinci ve sonraki yıkamalardan toplanan örnekler birleştirildi. İnsan BALF örneklerinin uzun süreli saklanması ve ısıtılmasının ardından hücresel kompozisyonda ve diferansiyel sayımlarda meydana gelen değişikliklerle ilgili güncel bulgular dikkate alınarak13, bronkoalveoler lavaj sıvısı (BALF) havuzu buz üzerinde tutuldu ve toplandıktan sonra 2 saat içinde işlendi. Mukusu süzmek için 70 mikron gözenek boyutuna sahip steril bir naylon ağ kullanılarak filtrasyon işlemi gerçekleştirildi; pilot testler, yüzey epitop bütünlüğünde ölçülebilir bir kayıp olmadan mukus kümelerini uzaklaştırmak için ditiotreitol gibi ek bir mukolitik veya topaklanma önleyici ajan olmadan yalnızca mekanik geçişin yeterli olduğunu gösterdiğinden bu yöntem tercih edildi. Ardından sıvı, 4 °C'de 10 dakka boyunca 40 × g hızında santrifüj işlemine tabi tutuldu. Süpernatant dekante edilerek sitokin analizi için düşük protein bağlayıcı kriyoviyallere paylaştırıldı ve hücreler, %0,5 sığır serum albümini ve 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren fosfat tamponlu salin (PBS) içinde süspanse edildi; hücrelerin bir kısmı sitoloji ve akış sitometrisi için saklandı. Sitokin örnekleri sıvı azot içinde donduruldu, –80 °C'de saklandı ve kullanımdan önce en fazla bir dondurma-çözme döngüsüne tabi tutuldu.
Nötrofil sitolojisi ve akış sitometrik kantifikasyon
Sitopatoloji açısından, BALF hücre süspansiyonunun 10 µL'si bir sitosantrifüj (Materyaller Tablosu'na bakınız) kullanılarak 30 × g hızında 5 dk boyunca cam slayta uygulandı, havada kurutuldu ve Wright-Giemsa ile boyandı. Diferansiyel sayımlar, hastanın tıbbi geçmişini bilmeyen bir hematoloji teknisyeni tarafından gerçekleştirildi; teknisyen slayt başına minimum 40 hücre saydı ve makrofajların, lenfositlerin, nötrofillerin ve eozinofillerin yüzdelerini hesapladı. Pulmoner infiltratı olan hastalarda enfeksiyöz akciğer hastalıklarını enfeksiyöz olmayanlardan ayırt etmedeki yararlılıklarını öne süren mevcut kanıtlar nedeniyle14, BALF nötrofil yüzdeleri sitopatoloji için birincil sonuç ölçütü olarak kabul edildi.
Akım sitometrisi nicelik belirleme protokolü, dört renkli bronkoalveoler lavaj sıvısı (BALF) lökosit farklılaştırma protokolünün yakın zamanda yapılan bir doğrulamasın dayandırılmış15 ve nötrofilleri tanımlamak için ek belirteçler içermiştir. Spesifik olarak, BALF'den izole edilen yaklaşık 5 × 105 hücre, insan Fc reseptör bloklama reaktifi (Malzemeler Tablosu'na bakınız) ile 4 °C'de 10 dk boyunca bloke edilmiş ve ardından bir fikslenebilir canlılık boyasına (Malzemeler Tablosu'na bakınız) ek olarak CD45 (klon HI30), CD6b (klon G10F5), CD15 (klon HI98), CD16 (klon 3G8), CD1b (klon ICRF4), CD14 (klon M5E2) ve HLA-DR (klon L243) antikorları ile 4 °C'de 20 dk boyunca boyanmıştır. Eritrosit lizisi için, ticari bir eritrosit liz çözeltisi (Malzemeler Tablosu'na bakınız) oda sıcaklığında 10 dk boyunca kullanılmıştır. Eritrosit lizisinden sonra hücreler, %2 fetal dana serumu eklenmiş PBS ile iki kez yıkanmış ve akış tamponunda yeniden süspande edilmiş, ardından çok renkli bir akım sitometresi (Malzemeler Tablosu'na bakınız) ile analiz edilmiştir. Kompanzasyon, tek renk boyanmış kompanzasyon boncukları (Malzemeler Tablosu'na bakınız) kullanılarak gerçekleştirilmiş ve her panel için floresan-eksi-bir ile boyanmamış tüpler eklenmiştir.
Her örnek için en az 1 × 105 CD45⁺ olay elde edildi. Önce FSC-A/FSC-H grafiğindeki singletler kapılandı, ardından canlı (viyabilite boyası⁻) CD45⁺ lökositler seçildi ve sonrasında yüksek yan saçılımlı CD6b⁺ granülositleri seçmek için CD14⁺HLA-DR⁺ monosit-makrofajların dışlanması gerçekleştirildi. Nötrofiller daha sonra granülosit popülasyonu içinde CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ olaylar olarak tanımlandı. Bu birincil CD6b⁺ granülosit kapısı, CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ sınırı ile kısıtlanmak yerine tüm yüksek yan saçılımlı olayların etrafına geniş bir şekilde çizildi; böylece CD16-dim, CD1b-high aktive nötrofiller ve diğer daha az olgun granülosit formları toplam otomatik nötrofil sayımı dahilinde kaldı; daha katı olan CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ tanımı yalnızca sonraki kümeleme analizlerinde ayrı olarak raporlanan olgun nötrofil alt grubunu karakterize etmek için uygulandı. BALF'deki nötrofil sayısı (hücre/µL), nötrofil yüzdesi ve otomatik bir hematoloji analizörü kullanılarak belirlenen toplam çekirdekli hücre sayısına dayalı olarak tahmin edildi (bkz. Materyaller Tablosu). Kompanzasyon matrisleri, kapılama stratejisi ve bireysel örnek kalite kontrol raporları arşivlendi ve analizciler, elde etme ve analiz süreci boyunca katılımcı grup atamalarına karşı kör tutuldu.
Multipleks inflamatuar sitokin profilleme
BALF süpernatantları ıslak buz üzerinde bir kez çözülmüş, ardından kısa süreli vorteksleme uygulanmış ve 10.0 × Sadece "g" karakterini gönderdiniz. Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni paylaşın. 5 dakika boyunca, ... derecede/sıcaklıkta 4 °C analizden hemen önce. Üç fonksiyonel kategoriye ayrılmış 13 analitin ölçümü, özel bir manyetik boncuk paneline sahip çoklu (multiplex) boncuk tabanlı bir immünolojik analiz platformu kullanılarak gerçekleştirilmiştir (bakınız Materyal TablosuPro-inflamatuar grup IL-1β, IL-6, IL-17A ve TNF-α'dan; kemokin grubu CXCL8/IL-8, CXCL1/GRO-α, CXCL10/IP-10, CCL2/MCP-1 ve CCL3/MIP-1α'dan; düzenleyici grup ise IL-10, IFN-γ, IL-1RA ve G-CSF'den oluşmuştur. Analit seçimi, pnömoni/şiddetli solunum yolu enfeksiyonu çalışmalarındaki BALF veya serum sitokinlerinin multipleks analizlerinde en yaygın olarak bilgilendirici olduğu rapor edilenlere dayanmaktadır.7,11Dilüsyon faktörü (assay tamponunda 1:2), hem enfekte hem de kontrol örneklerinin temsilci bir alt kümesi üzerinde yürütülen bir pilot deneyle belirlenerek şundan emin olunmuştur: >Ölçümlerin %90'ı standart eğri dahilinde kalmıştır.
Standart eğrileri, her plakada duble olarak hazırlanan, arka planı çıkarmak için bir boş kuyucuk da içeren, üreticinin rekombinant standartlarının yedi noktalı seri dilüsyonları kullanılarak belirlenmiştir. Eğri uydurma işlemi, cihazın tescilli veri toplama ve analiz yazılımı (bkz. Malzeme Tablosu) aracılığıyla beş parametreli lojistik (5PL) regresyon ile gerçekleştirilmiştir. Alt nicelleme sınırı (LLOQ), %80 ile %120 arasında bir geri-uydurma geri kazanımı ve ≤ %20'lik bir analiz içi varyasyon katsayısı (CV) veren en küçük standart miktarı olarak hesaplanmıştır. LLOQ'nun altında kalan değerler LLOQ/√2 ile değiştirilmiştir. Uzun vadeli performansı takip etmek için, biri temsilci bir enfekte hastadan ve diğeri etkilenmemiş bir denekten alınan iki havuzlanmış bronkoalveoler lavaj sıvısı (BALF) kalite kontrol örneği alikotlanarak her plakaya eklenmiştir. Kalite güvence standartları, duble kuyucuklarda analiz içi CV ≤ %10, kalite kontrol için plakalar arası CV ≤ %20 ve kuyucuk başına analit başına ≥ 50 minimum boncuk sayısı gereksinimlerini içeren, 12 yıllık çok merkezli multipleks boncuk tabanlı bir analiz yeterlilik programından16 türetilen en iyi uygulama önerilerine dayandırılmıştır. Yukarıdaki kriterleri karşılamayan plakalar yeniden çalıştırılmıştır. Analiz, tek bir kit lotu kullanılarak, enfeksiyon ve kontrol örneklerinin rastgele sıralandığı tek bir seri halinde dört hafta içinde gerçekleştirilmiştir.
Görüntüleme analiz hattı
Akış Sitometrisi Standardı (FCS) dosyaları, önce canlı CD45⁺ singletlerin kompanzasyonu ve kapılanması (gating) için ticari akış sitometrisi yazılımı kullanılarak analiz edildi (bkz. Materyal Tablosu) ve ardından R v4.4'te tarafsız analiz için dışa aktarıldı. Her örnek için 10.0 CD45⁺ olay alt örnekleme ile seçilip birleştirildi ve sinyal yoğunlukları 150 kofaktörlü arcsinh fonksiyonu kullanılarak dönüştürüldü. Boyut indirgeme ve UMAP projeksiyonları, uwot paketi kullanılarak 15 en yakın komşu ve 0,1 minimum mesafe ile gerçekleştirildi; buna paralel olarak Rtsne paketi ile 30 perplexity değerinde t-SNE gömmeleri yapıldı10. Fenotip kümeleri, 10 kendi kendine organize olan harita (SOM) düğümlü FlowSOM kullanılarak tanımlandı ve ardından, yüksek boyutlu sitometri verileri için yakın zamanda doğrulanmış optimizasyon tabanlı bir yaklaşımla meta-kümeleme yoluyla 12–15 kümeye ayrıldı17. Her küme, soy hattı ve aktivasyon markörlerinin medyan ekspresyonuna göre anotasyonlandı ve manuel kapılarla karşılaştırılarak gözden geçirildi.
Multiplex sitokin verilerinin analizi için, ham değerler önce log₁₀ ile dönüştürülmüş ve ardından ek analizlerden önce z-skorlama yoluyla analitler arasında standartlaştırılmıştır. Hem analitler hem de hastalar, Öklid mesafesi ve Ward.D2 bağlantısı kullanılarak hiyerarşik kümelemeye tabi tutulmuş; sonuçlar satır ve sütun bazlı kümelenmiş bir ısı haritasında görüntülenmiştir. Böyle bir yaklaşım, ko-eksprese edilen sitokin modüllerini tespit etmek ve multiplex inflamatuar kohortlarda hasta alt kümelerini sınıflandırmak için kullanılmıştır9. Tüm hücresel ve çözünür biyobelirteçler için ikili Spearman sıra korelasyonları kullanılarak korelasyon matrisleri oluşturulmuştur. Korelasyon matrislerinin ısı haritaları, düğümlerin biyobelirteçlere karşılık geldiği ve kenarların Benjamini–Hochberg (BH) yöntemi kullanılarak çoklu test düzeltmesinden geçen korelasyonları belirttiği bir ağ ile birlikte çizilmiştir. Kenar genişliği korelasyon katsayısı büyüklüğüne |ρ| göre ölçeklendirilmiş ve kenarlar yalnızca düzeltme sonrası |ρ| ≥ 0.30 ve p < 0.05 ise dahil edilmiştir. Hücreleri ve sitokinleri içeren standartlaştırılmış matris üzerinde, birim varyans ölçeklendirmeli prcomp() fonksiyonu kullanılarak Temel Bileşen Analizi (PCA) gerçekleştirilmiştir. Katılımcılar, enfeksiyon ve kontrol grupları üst üste gelecek şekilde ilk iki temel bileşen üzerine yansıtılmıştır. Tüm analizlerin tutarlı şekilde alt örneklendirilmesi ve standartlaştırılması, tüm görselleştirmelerde hücresel ve çözünür biyobelirteç okumaları arasındaki karşılaştırılabilirliği sağlamıştır.
İstatistiksel analiz
Sürekli değişkenler, Shapiro–Wilk testlerine göre normal dağılım göstermedikleri durumlarda medyan (çeyrekler arası aralık, IQR) ve aksi takdirde ortalama (standart sapma, SD) kullanılarak tanımlanmıştır. Kategorik değişkenler ise frekanslar ve oranlar kullanılarak tanımlanmıştır. Gruplar arası karşılaştırmalar, sürekli değişkenlerin normal dağılmadığı durumlarda Mann–Whitney U testi, sürekli değişkenlerin normal dağıldığı durumlarda Welch t-testi ve kategorik değişkenler için uygun olduğunda ki-kare testi/Fisher'ın kesin testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sürekli değişkenler arasındaki ilişkiler Spearman sıra korelasyon katsayısı ile değerlendirilmiştir. Multiplex sitokin ve korelasyon analizlerindeki yanlış keşif oranını (FDR) hesaba katmak için p-değerleri, q < 0.05 kesme değeri ile Benjamini–Hochberg yöntemi kullanılarak düzeltilmiştir. Tüm birincil analizlerde iki yönlü p < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Mümkün olan yerlerde, bireysel değişkenlerde eksik verisi olan vakalar tutulmuş ve etkilenen değişken için tam vaka analizi (complete-case analysis) ile analiz edilmiş; duyarlılık analizlerini yürütmek için ise zincirlenmiş denklemler kullanılarak çoklu atamalar (m = 20) yapılmıştır. Tam çalışma kohortu içinde, pROC paketi kullanılarak bireysel sitokinler için alıcı işletim karakteristik eğrileri ve ilgili eğri altı alan (AUC) oluşturulmuştur; ayrı bir harici doğrulama kohortu kullanılmamıştır. Önceden belirlenmiş duyarlılık analizleri, bronkoskopi öncesindeki 72 saat içinde antibiyotik alan katılımcılar hariç tutulduktan sonra ve enfeksiyon grubu mekanik ventilasyon durumu ile pnömoni alt tipine (toplum kaynaklı, hastane kaynaklı veya ventilatör ilişkili) göre tabakalandırıldıktan sonra birincil grup karşılaştırmalarını tekrarlamıştır. Analizler, R v4.4'te rstatix, FlowSOM, uwot, ComplexHeatmap, igraph, pROC ve mice paketleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Şekiller, ticari bilimsel grafik yazılımı kullanılarak oluşturulmuştur (bkz. Materyaller Tablosu).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Çalışma popülasyonu ve örnek özellikleri
Final analiz kohortunda, 64 deneğin enfeksiyon grubunda ve 48 deneğin enfeksiyon olmayan kontrol grubunda olmak üzere toplam 12 denek yer almıştır. Tablo 1'de gösterildiği üzere, başlangıç demografik özellikleri gruplar arasında benzerken, enfeksiyonla ilişkili laboratuvar parametreleri enfeksiyon grubunda daha yüksek bulunmuştur. Enfeksiyonlar öncelikle Gram-negatif bakteriler nedeniyle oluşmuş olup, temel bakteriyel p...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokolün sağlamlığı, analiz öncesinde ve sırasında verilen birkaç karara bağlıdır. Alt sınır geri kazanım oranının %40 olarak belirlenmesi ve ikinci ve sonraki alikotların birleştirilmesi bilinçli bir karardı; çünkü ilk alikot daha yüksek oranda bronşiyal hava yolu materyali zenginleşmesi içerirken, geri kazanım oranı yaş, cinsiyet, sigara öyküsü ve hedef bronşa göre sistematik olarak değişiklik göstermektedir18. Olgun CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ nötrofiller ile CD14⁺HLA-DR⁺ alveolar makrofajlar (BALF ö...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışmaya katılan tüm hasta ve gönüllülere değerli iş birlikleri için içtenlikle teşekkür ederiz. Tüm araştırma süreci boyunca sağladıkları etik onay (Onay No. 2026HL-038) ve normatif rehberlik için Etik Kurul'a şükranlarımızı sunarız.
Klinik örneklerin toplanması, bronkoalveolar lavaj sıvısının işlenmesi ve mikrobiyolojik tespit konusundaki destekleri için Solunum Bölümü, Bronkoskopi Merkezi ve Klinik Laboratuvarın tıbbi personeline teşekkür ederiz. Ayrıca, yüksek boyutlu akış sitometrisi ve multiple sitokin profilleme deneyleri için hastane merkezi laboratuvarının sağladığı teknik platform desteği için minnettarız.
Bu araştırma; kamu, ticari veya kar amacı gütmeyen sektörlerdeki finansman kuruluşlarından herhangi bir özel hibe almamıştır.
Hasta taraması, numune yönetimi, deneysel operasyonlar ve veri düzenleme süreçlerindeki emekleri için bu projede yer alan tüm araştırmacılara, teknisyenlere ve hemşirelik personeline teşekkür ederiz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Anti-human CD1b antikoru, Brilliant Violet 421, klon ICRF4 | BioLegend | Kat. No. 301323 | Nötrofil aktivasyon belirteci; menekşe lazer kanalı Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni buraya yapıştırın. https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD14 antikoru, APC/Cyanine7, klon M5E2 | BioLegend | Kat. No. 301820 | Monosit-makrofaj dışlama belirteci; kırmızı lazer kanalı Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD15 antikoru, PE, klon HI98 | BioLegend | Kat. No. 301906 | Nötrofil soy hattı belirteci; mavi lazer kanalı Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD16 antikoru, Brilliant Violet 510, klon 3G8 | BioLegend | Kat. No. 302048 | Nötrofil olgunlaşması ve NK hücresi belirteci; menekşe lazer kanalı Lütfen çevirilecek metni sağlayın. https://www.biolegend.com |
| Anti-insan CD45 antikoru, PerCP, klon HI30 | BioLegend | Kat. No. 304026 / RRID: AB_8938 | Pan-lökosit belirteci; mavi lazer kanalı Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://antibodyregistry.org/AB_8938 |
| Anti-insan CD66b antikoru, FITC, klon G10F5 | BioLegend | Kat. No. 305103 | Granülosit belirteci; mavi lazer kanalı Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://www.biolegend.com |
| Anti-insan HLA-DR antikoru, PerCP/Cyanine5.5, klon L243 | BioLegend | Kat. No. 307629 | Antijen sunan hücre belirteci; mavi lazer kanalı Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://www.biolegend.com |
| Otomatik hematoloji analizörü (Sysmex XN-10) | Sysmex Corporation | Cihaz (model XN-10) | Mutlak nötrofil hesaplaması için toplam çekirdekli hücre sayısını belirlemede kullanılır Lütfen çevrilmesini istediğiniz kaynak metni sağlayın. https://www.sysmex.com |
| Sığır serum albümini | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Kat. No. A7906 | Akış sitometrisi boyama tamponunda (PBS içinde %0,5 w/v, 2 mM EDTA ile) kullanıldı Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a7906 |
| ComplexHeatmap paketi (R/Bioconductor) | Bioconductor Projesi | v2.20 (açık kaynaklı) | Multiplex sitokin verilerinin hiyerarşik kümeleme ısı haritaları için kullanılır Lütfen çevrilecek metni sağlayın. Metni gönderdiğinizde, JoVE standartlarına uygun, akademik ve teknik olarak doğru bir Türkçe çeviri sunacağım. https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| Sitosantrifüj (Cytospin 4) | Thermo Fisher Scientific | Kat. No. A78303 | BALF hücre süspansiyonundan sitoloji lamları hazırlamak için kullanılır Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A78303 |
| Eritrosit lizleme solüsyonu (BD FACS Lysing Solution, 10X konsantre) | BD Biosciences | Kat. No. 349202 | Yüzey boyamasından sonra eritrosit lizizi için kullanılır Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni sağlayın. https://www.bdbiosciences.com |
| Etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 0,5 M pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Kat. No. AM9260G | Akış sitometrisi boyama tamponunda 2 mM konsantrasyonda kullanılır Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni sağlayın. Invitrogen™ G-Protein Coupled Receptor (GPCR) Assay Kit (G protein kenetli reseptör (GPCR) analiz kiti) |
| Sabitleyilebilir canlılık boyası (Zombie NIR Fixable Viability Kit) | BioLegend | Kat. No. 423105 | Gating öncesi canlı-ölü ayrımı; kırmızı lazer kanalı Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://www.biolegend.com |
| Esnek videobronkoskop | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | Cihaz (model BF-1TQ290) | Orta düzeyde sedasyon altında BAL için kullanılır Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://www.olympus-global.com |
| Çok renkli akış sitometresi (CytoFLEX LX) | Beckman Coulter Life Sciences | Cihaz (model CytoFLEX LX, altı lazerli konfigürasyon) | Yedi belirteçli nötrofil/monosit akış paneli kazanımı için kullanılır Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://www.beckman.com |
| Akış sitometrisi analiz yazılımı (FlowJo) | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | FCS dosyalarının kompanzasyonu ve manuel kapılaması (manual gating) için kullanılır Lütfen çevrilmesini istediğiniz kaynak metni sağlayın. https://www.flowjo.com |
| FlowSOM paketi (R/Bioconductor) | Bioconductor Projesi | v2.12 (açık kaynaklı) | Akış sitometrisi verilerinin kendi kendini organize eden harita (self-organising-map) kümelemesi ve meta-kümelemesi için kullanılır Lütfen çevirmemi istediğiniz metni sağlayın. https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism (istatistiksel grafikleme yazılımı) | GraphPad Yazılımı (Dotmatics) | v10 | Final şekillerin oluşturulmasında kullanılmıştır Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://www.graphpad.com |
| İnsan Fc reseptör bloklama reaktifi (Human TruStain FcX) | BioLegend | Kat. No. 42301 / RRID: AB_2818986 | Antikor boyama öncesinde Fc reseptör bloklaması Lütfen çevirmek istediğiniz metni sağlayın. https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| igraph paketi (R) | CRAN | v2.0 (açık kaynak) | Korelasyon ağı grafiğini oluşturmak ve görselleştirmek için kullanılır Lütfen çevirilecek metni sağlayın. https://cran.r-project.org/package=igraph |
| Düşük protein bağlayıcı kriyojenik tüpler, 2,0 mL | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | Kat. No. 375418 | Sitokin analizi için BALF süpernatant alikotlarında kullanılır Lütfen çevirmek istediğiniz metni sağlayın. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/375418 |
| Luminex çoklu (multiplex) boncuk tabanlı immunassay platformu (MAGPIX) | Luminex Corporation (DiaSorin) | Cihaz (MAGPIX modeli) | Multiplex sitokin analizinin kazanımı için kullanılır Lütfen çevirmek istediğiniz metni sağlayın. https://www.luminexcorp.com |
| May-GrünwaldüLeishman-Giemsa boyama çözeltisi | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Kat. No. GS50 | Sitospin diferansiyel hücre sayımı için kullanılır Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni sağlayın. https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/gs50 |
| mice paketi (R) | CRAN | v3.16 (açık kaynaklı) | Hassasiyet analizinde zincirlenmiş denklemlerle çoklu atama için kullanılır Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni sağlayın. https://cran.r-project.org/package=mice |
| Multiplex manyetik boncuk sitokin/kemokin paneli (13-plex, özel; MILLIPLEX MAP İnsan Sitokin/Kemokin) | Merck / MilliporeSigma | Kat. No. HCYTOMAG-60K | Bölüm 2.4'te açıklanan 13 analiti ölçen özel panel Lütfen çevrilecek kaynak metni sağlayın. https://www.merckmillipore.com |
| Naylon gözenekli hücre süzgeci, 70 µm | Corning (Falcon) | Kat. No. 352350 | Mukus kümelenmelerini uzaklaştırmak amacıyla BALF'nin mekanik filtrasyonunda kullanılır Lütfen çevirmemi istediğiniz metni sağlayın. Metni gönderdiğinizde, belirttiğiniz tüm akademik ve teknik standartlara uygun olarak profesyonelce Türkçeye çevireceğim. https://www.corning.com |
| Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | Kat. No. 101023 | Hücre resüspansiyonu ve boyama için temel tampon çözelti Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni sağlayınız. Katalog Numarası: 101023 Ürün Adı:Invitrogen™ Trizol™ Reagent Trizol™ Reagent, toplam RNA'nın, DNA'nın ve proteinlerin tek bir homojenize edilmiş örnekten aynı anda izole edilmesi için tasarlanmış, tek aşamalı bir yöntem sunan tek fazlı bir çözücüdür. Trizol™ Reagent, hücrelerin ve dokuların parçalanmasını sağlar ve RNA'yı proteinlerden ve DNA'dan ayırarak yüksek saflıkta elde edilmesine olanak tanır. Bu yöntem, RNA'nın bütünlüğünü korumak için optimize edilmiştir ve birçok farklı örnek tipinde etkili sonuçlar verir. Özellikler: - RNA, DNA ve proteinlerin eş zamanlı izolasyonu için tek aşamalı yöntem. - RNA bütünlüğünü koruyan yüksek verimlilik. - Çok çeşitli hücre ve doku tipleriyle uyumlu. Uygulama Alanları: - Toplam RNA izolasyonu. - Gen ekspresyon analizleri. - RT-qPCR ve Northern Blotting çalışmaları. - Proteomik ve genomik analizler için ön hazırlık. Saklama Koşulları: Oda sıcaklığında saklayınız. |
| pROC paketi (R) | CRAN | v1.18 (açık kaynaklı) | ROC eğrileri ve AUC değerleri oluşturmak için kullanılır Lütfen çevirmemi istediğiniz metni sağlayın. https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R (istatistiksel hesaplama ortamı) | R Core Team | v4.4 (açık kaynaklı) | İstatistiksel analizler ve görselleştirme platformu Lütfen çevirmemi istediğiniz metni sağlayın. https://www.r-project.org |
| rstatix paketi (R) | CRAN | v0.7 (açık kaynaklı) | Grup karşılaştırmaları ve korelasyon istatistikleri için kullanılır Lütfen çevrilmesini istediğiniz kaynak metni sağlayın. https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| Rtsne paketi (R) | CRAN | v0.17 (açık kaynaklı) | t-SNE gömmeleri için kullanılır Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| Tek boyalı kompanzasyon boncukları (UltraComp eBeads Compensation Beads) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Kat. No. 01-2-42 | Tek renkli kompanzasyon kontrolleri için kullanılır Lütfen çevirmem gereken metni sağlayın. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/01-2-42 |
| Enjeksiyonluk sodyum klorür çözeltisi, %0,9 (steril salin) | Baxter International | Kat. No. 2B1324 | BAL instilasyonu için kullanılır (10–150 mL, 20–40 mL'lik alikotlar halinde 37 °C) Lütfen çevirmek istediğiniz metni sağlayın. https://www.baxter.com |
| uwot paketi (R) | CRAN | v0.2 (açık kaynaklı) | UMAP boyut indirgeme için kullanılır Lütfen çevrilecek metni sağlayın. https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT (multipleks analiz veri toplama ve eğri uydurma yazılımı) | Luminex Corporation (DiaSorin) | v4.3 | 5PL standart eğri uydurma için cihaza özgü yazılım Lütfen çevirisini istediğiniz metni giriniz. https://www.luminexcorp.com |
Kaynaklar
- Yu X, et al. Estimating the global and regional burden of lower respiratory infections attributable to leading pathogens and the protective effectiveness of immunization programs. Int J Infect Dis. 2024;149:107268.
- Rizo-Téllez SA, Filep JG. Beyond host defense and tissue injury: the emerging role of neutrophils in tissue repair. Am J Physiol Cell Physiol. 2024;326(3):C661-83.
- Zhou X, Jin J, Lv T, Song Y. A narrative review: the role of NETs in acute respiratory distress syndrome/acute lung injury. Int J Mol Sci. 2024;25(3):1464.
- Haynes ME, Sullivan DP, Muller WA. Neutrophil infiltration and function in the pathogenesis of inflammatory airspace disease. Am J Pathol. 2024;194(5):628-36.
- Davidson KR, Ha DM, Schwarz MI, Chan ED. Bronchoalveolar lavage as a diagnostic procedure: a review of known cellular and molecular findings in various lung diseases. J Thorac Dis. 2020;12(9):4991-5019.
- Cambier S, Gouwy M, Proost P. The chemokines CXCL8 and CXCL12: molecular and functional properties, role in disease and efforts towards pharmacological intervention. Cell Mol Immunol. 2023;20(3):217-51.
- Lin J, et al. Local and systemic cytokine profiles in children with pneumonia-associated lung consolidation. Front Immunol. 2025;16:1546730.
- Huang C, et al. Heparin-binding protein in bronchoalveolar lavage fluid as a biomarker for discriminating severe bacterial and viral pneumonia in critically ill children. Mediators Inflamm. 2023;2023:6123911.
- Polley DJ, et al. Identification of novel clusters of co-expressing cytokines in a diagnostic cytokine multiplex test. Front Immunol. 2023;14:1223817.
- Roca CP, et al. A cross entropy test allows quantitative statistical comparison of t-SNE and UMAP representations. Cell Rep Methods. 2023;3(1):100389.
- Hawerkamp HC, et al. Characterisation of the pro-inflammatory cytokine signature in severe COVID-19. Front Immunol. 2023;14:1170012.
- Meyer KC, et al. An official American Thoracic Society clinical practice guideline: the clinical utility of bronchoalveolar lavage cellular analysis in interstitial lung disease. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185(9):1004-14.
- Shionoya Y, et al. Impact of storage conditions on bronchoalveolar lavage fluid analysis: a human study. Diagnostics (Basel). 2025;15(11):1386.
- Li J, et al. Diagnostic test accuracy of cellular analysis of bronchoalveolar lavage fluid in distinguishing pulmonary infectious and non-infectious diseases in patients with pulmonary shadow. Front Med (Lausanne). 2024;11:1496088.
- Bratke K, Weise M, Stoll P, Virchow JC, Lommatzsch M. Flow cytometry as an alternative to microscopy for the differentiation of BAL fluid leukocytes. Chest. 2024;166(4):793-801.
- Rountree W, et al. Sources of variability in Luminex bead-based cytokine assays: evidence from twelve years of multi-site proficiency testing. J Immunol Methods. 2024;531:113699.
- Tao W, Sinha A, Raddassi K, Pandit A. Parameter optimization for stable clustering using FlowSOM: a case study from CyTOF. Front Immunol. 2024;15:1414400.
- Shikano K, et al. What are the factors affecting the recovery rate of bronchoalveolar lavage fluid? Clin Respir J. 2022;16(2):142-51.
- Baumann Z, et al. Optimized full-spectrum flow cytometry panel for deep immunophenotyping of murine lungs. Cell Rep Methods. 2024;4(11):100885.
- Bonilla DL, et al. The power of reagent titration in flow cytometry. Cells. 2024;13(20):1677.
- Ogishi M, et al. Multibatch cytometry data integration for optimal immunophenotyping. J Immunol. 2021;206(1):206-13.
- Sudo K, et al. Case study observational research: inflammatory cytokines in the bronchial epithelial lining fluid of COVID-19 patients with acute hypoxemic respiratory failure. Crit Care. 2024;28(1):134.
- Williams JE, et al. Epigenetic regulation of neutrophils in ARDS. Cells. 2025;14(15):1151.
- Zhang Y, et al. Interleukin-6 in blood and bronchoalveolar lavage fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Front Pediatr. 2022;10:922143.
- Bailey JI, et al. Profibrotic monocyte-derived alveolar macrophages are expanded in patients with persistent respiratory symptoms and radiographic abnormalities after COVID-19. Nat Immunol. 2024;25(11):2097-109.
- Haeger S, et al. The bronchoalveolar lavage dilution conundrum: an updated view on a long-standing problem. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2024;327(5):L807-13.
- Xiao K, et al. A pan-immune panorama of bacterial pneumonia revealed by a large-scale single-cell transcriptome atlas. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):5.
- Shen X, et al. Single-cell transcriptome atlas revealed bronchoalveolar immune features related to disease severity in pediatric Mycoplasma pneumoniae pneumonia. MedComm (2020). 2024;5(10):e748.
- Megas S, Wilbrey-Clark A, Maartens A, Teichmann SA, Meyer KB. Spatial transcriptomics of the respiratory system. Annu Rev Physiol. 2025;87(1):447-70.
- Landoni G, et al. A multicenter phase 2 randomized controlled study on the efficacy and safety of reparixin in the treatment of hospitalized patients with COVID-19 pneumonia. Infect Dis Ther. 2022;11(4):1559-74.
- Sellarès-Nadal J, et al. Efficacy of tocilizumab for hospitalized patients with COVID-19 pneumonia and high IL-6 levels: a randomized controlled trial. Infection. 2025;53(5):1851-61.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.