Yöntem makalesi

Langendorff Perfüzyonlu Fare Kalplerinde Atriyal ve Ventriküler Mekaniğin Değerlendirilmesi için Optik Sistem

DOI:

10.3791/72264

⸱

14 Ağustos 2026

 , 
1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Unidad Monterrey

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, fare kalbinin çıkarılması ve kanülasyonu prosedürünün yanı sıra Langendorff retrograd perfüzyon sisteminin hazırlanmasını ve konfigürasyonunu açıklamaktadır. Deneysel düzenek, atriyumların ve ventriküllerin doğal dinamiklerini korurken mekanik tepkilerini değerlendirmek için tasarlanmış yüksek çözünürlüklü bir optik sistemle eşleştirilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare kalbi, mühendislik teknolojilerindeki ilerlemelerin yardımıyla kardiyovasküler araştırmalarda yaygın olarak kullanılan bir model görevi görmektedir. Ancak, fare kalbinin küçük boyutu nedeniyle atriyal ve ventriküler kontraktilitenin değerlendirilmesi zor olmaya devam etmektedir. Bu çalışma, sağlam, izole bir kalpte kontraktilite ve kalp hızını değerlendirmek için yeni bir metodoloji sunmaktadır. Langendorff perfüzyonlu bir fare kalbinin yüksek çözünürlüklü bir optik sistemle birlikte kullanılması, atriyal ve ventriküler kontraktilitenin değerlendirilmesine olanak tanır. Deneysel kurulum, yüksek çözünürlüklü sinyaller elde ederken küçük kalp boyutu ve hızlı kasılma hızlarıyla ilişkili zorlukları gidermektedir. Dakikada 420 ila 660 atım (bpm) aralığındaki stimülasyon frekansı ile kalp kasılma frekansı arasındaki senkronizasyon, auksotonik yöntemden elde edilen sonuçlarla uyumluydu. Ek olarak, ventriküler kısalma ve atriyal dinamik sinyal ölçümleri, atriyoventriküler kasılmanın belirlenmesine imkan sağlamaktadır. Bu yöntem, farmakolojik veya sistemik etkiler olmaksızın, sağlam, izole bir kalpte kontraktilite ve kalp hızını değerlendirmek için uygundur. Bu sonuçlar, optik sistemin ventriküler ve atriyal kısalma yanıtlarının ölçülmesine olanak tanıdığını göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyak fizyolojide keşfedilecek çok şey vardır; kardiyak pacemaker (kalp pili) aktivitesi ve uyarılma-kasılma eşleşmesi gibi temel süreçler, sürekli olarak araştırılan merkezi ilkelerdir1. Biyolojik gürültünün kardiyak kontraktilite2 ve pacemaker aktivitesi üzerindeki etkileri henüz yeterince anlaşılamamış olsa da1, yeni optik görüntüleme yöntemleri yeni paradigmaların sunulmasına olanak sağlamıştır3,4.

Langendorff sistemini kullanan iki deneysel metodoloji, kardiyak fonksiyonların ölçülmesine paha biçilmez katkılar sağlamıştır. Birincisi, sol ventriküle yerleştirilen küçük bir balondan sinyal elde edilen izovolümetrik kontraksiyon yöntemidir5,6,7. İkincisi, kalbin aksı boyunca auksotonik kontraksiyonları ölçmek için bir ipliğin bir ucunun kalbin apeksine, diğer ucunun ise mekanik bir kayıt cihazına dikilmesiyle sinyal elde edilen auksotonik kayıt yöntemidir2,8. Bununla birlikte, fare kalbinin çok küçük boyutları nedeniyle atriyal ve ventriküler kontraktilitenin değerlendirilmesi zordur. Ayrıca, kalp yaralanmalara karşı hassas olduğundan, hazırlık aşaması belirli bir düzeyde özen ve naziklik gerektirir9,10,11,12,13.

Fare kalplerinin mekanik dinamiklerini değerlendirmek için kullanılan optik sistem, birkaç yeni özelliğe ve avantaja sahiptir. İlk olarak bu yöntem, farmakolojik veya sistemik etkilerin yokluğunda, sağlam ve izole bir kalpte kontraktiliteyi ve kalp hızını değerlendirmek için uygundur. Bu protokol ayrıca farmakolojik, hücre rejenerasyonu veya oksijen tedavisine dayalı tedavilerin incelendiği iskemi-reperfüzyon hasarını değerlendiren deneylerde de etkili bir şekilde kullanılabilir.

Bu makalede, yüksek çözünürlüklü bir optik sistem kullanarak fare kalp kasılma fonksiyonunun biyofiziksel parametrelerini kaydetmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, sağlam, izole bir kalpte kasılma gücünün ve kalp hızının değerlendirilmesine yardımcı olur. Ayrıca, atriyal ve ventriküler kasılmanın değerlendirilmesine olanak tanır. Langendorff fare kalbi preparatı, kas kasılmalarını engellemeden perfüzyon sıvısı sıcaklığı kaybını ve hareket artefaktlarını en aza indirmek için hafif bir modifikasyon içeren bir iyileştirme sunmaktadır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan prosedürleri, Hayvan Deneyleri ve Bakımı için Federal Düzenlemelere uygun olarak yürütülmüş ve CINVESTAV Hayvan Bakım Komitesi (CINVESTAV Zacatenco, D.F., Meksika) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada, 28–34 g ağırlığında ve 8–14 haftalık C57BL/6J erkek fareler kullanılmıştır. Protokolde kullanılan tüm malzeme ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Ek Dosyalar 1–11; protokol için destekleyici diyagramlar, yazılım kılavuzları, analiz programları, pacing verileri ve uygulama dosyaları sunmaktadır.

1. Stok hazırlama

  1. Önceden iki stok çözelti hazırlayın ve bunları 4 °C'deki bir buzdolabında saklayın: (1) Stok I, 1 L (deiyonize su içinde; g/L cinsinden: 76.13 NaCl, 4.02 KCl, 1 MgCl2(6H2O), 0.4 NaH2PO4) ve (2) Stok II, 0.1 L (deiyonize su içinde; g/L cinsinden: 73.5 CaCl2(2H2O)).
    NOT: Çözeltiler hazırlandıktan sonra 30 güne kadar kullanılabilir. 4 °C'de saklayın.

2. Langendorff sistemi bağlantısı ve temizliği

  1. Şekil 1A'da gösterildiği gibi rezervuarı (1), rezervuar termal banyosunu (2), perfüzyon pompasını (3), serpentini (4), serpentin resirkülatörünü (5), izleme sistemini (6) ve drenaj sistemini (8) bağlayın.
    NOT: İzleme sistemi ile drenaj sistemi arasındaki bağlantı, Ek Dosya 1'de daha ayrıntılı olarak gösterilmiştir.
  2. Langendorff sistemini 50 °C'de 1 L deiyonize su ile doldurun, ardından perfüzyon ve drenaj pompalarını başlatın (Ek Dosya 1, drenaj sistemi). Yaklaşık 20–30 dk sonra sıvıyı sistemden uzaklaştırın, ardından bir sonraki adıma geçin.
    NOT: Sistemde sızıntı veya basınç düşüşü olmadığını doğrulayın. Böyle bir durum oluşursa deneye devam etmeyin.
  3. Sistemi 1 L %1 asetik asit (deiyonize su içinde çözülmüş) ile doldurun, ardından perfüzyon ve drenaj pompalarını kapatıp 60 dk bekleyin ve ardından sıvıyı uzaklaştırmak için pompaları çalıştırın.
  4. 2.2. adımı iki kez tekrarlayın.
  5. Çözelti bileşenlerinin yapışmasını önlemek için sistemi %70 etanol (deiyonize su içinde çözülmüş) ile doldurun.
    NOT: Langendorff perfüzyon sistemi her on deneyde bir veya aylık olarak temizlenmelidir. Deney öncesi temizlik protokolü bölüm 4'te açıklanmıştır; deney sonrası temizlik protokolü ise bölüm 8'de ayrıntılarıyla verilmiştir.

3. Deney sırasında Tyrode çözeltisinin hazırlanması

  1. mM cinsinden 1 L çözelti hazırlayın: 130.25 NaCl, 5.4 KCl, 0.53 MgCl2(6H2O), 0.33 NaH2PO4, 1.8 CaCl2(2H2O), 10 D-glucose, 10 HEPES; pH değeri NaOH ile 7.35 ± 0.05 olarak ayarlanmalıdır.
    1. 100 mL Stok I'i, sürekli karıştırma altında 700 mL deiyonize su ile karıştırın, ardından çözeltinin sıcaklığını 37 °C'ye yükseltin; Şekil 1A (1)'de gösterildiği gibi O2 tankını hava taşına bağlayarak çözeltinin oksijenasyonunu sağlayın.
    2. 1.8 mM CaCl2(2H2O) elde etmek için 3.6 mL Stok II ve 96.4 mL deiyonize su ekleyin, ardından pH'ı 7.35 ± 0.05'e ayarlamak için NaOH ekleyin.
    3. 1 L Tyrode çözeltisi elde etmek için deiyonize su ile tamamlayın.
      NOT: Çözeltinin 100 mL'sinin 4 °C'de buzdolabında saklanması önerilir; bu hacim daha sonra 6. adımda gerekecektir.

4. Langendorff sisteminin hazırlanması

NOT: Langendorff sistemi deney günü etanolle doldurulmamışsa, prosedüre devam edilmesi önerilmez; bunun yerine bölüm 2'yi tekrarlayın.

  1. Perfüzyon ve drenaj pompalarını açın. Perfüzyon pompası akış hızını 3 mL/min ve drenaj pompasını 10 mL/min olarak ayarlayın. Sistemi boşaltın.
  2. Sistemi 37 °C'de 1 L deiyonize su ile doldurun, ardından suyu boşaltın.
  3. Sistemi 3. adımda hazırlanan Tyrode çözeltisi ile doldurun ve çözeltiyi fizyolojik sıcaklıkta ve sabit oksijenasyonda tutun.
  4. Rezervuar termal banyolarını ve serpantin resirkülatörünü açın. Çözeltiyi fizyolojik koşullar altında tutmak için rezervuar sıcaklığını (Şekil 1A (2)) 38 °C'ye ayarlayın. Serpantin sıcaklığını (Şekil 1A (5)) 40 °C'ye ayarlayın. Bu, Langendorff sistemi çözeltisindeki sıcaklık kaybını telafi eder.
    NOT: Sistem çıkışındaki Tyrode çözeltisinin sıcaklığı fizyolojik (37 ± 0,5 °C) değilse, serpantin resirkülatör sıcaklığını ayarlayın. Sıcaklık uygun değerde stabilize olana kadar 6. adıma geçilmesi önerilmez.
  5. Basınç monitörünü (Ek Dosya 1, izleme sistemi) açın ve 0–200 mmHg aralığında kalibre edin. Sistemin kalibre edilmesine yardımcı olmak için izleme ve pacing uygulaması mevcuttur (Ek Dosya 3 ve Ek Dosya 11).
    NOT: Sistemde basınç kaybı ve hava kabarcığı olmadığının doğrulanması esastır. Sistemde kabarcıklar varsa, serpantinin alt çıkışını geçici olarak kapatın ve üst valfi açın; bu işlem kolonun dolmasını sağlayarak kabarcıkların dışarı atılmasına izin verecektir. Bu durum doğrulanana kadar deneye devam edilmesi önerilmez.

5. Optik sistem14

  1. CMOS kamerayı monte edin (Şekil 1A, 10), ayarlanabilir kamera lensi (LC) ve aydınlatma sistemi.
    NOT: Aydınlatma sistemi iki LED'den oluşur (Şekil 1A, 9), iki adet plano-konveks aydınlatma lensi (LI), bir aydınlatma kontrolü (Şekil 1A, 11), bir veri toplama kartı (Ek Dosya 1, izleme sistemi) ve 3 boyutlu tasarlanmış destek parçaları (Ek Dosya 1).
  2. Yaklaşık 1.000 mm³ hacminde bir referans nesne yerleştirin3 kameranın lensinden (merkezinden) 100–200 mm uzaklıkta Şekil 1A).
    NOT: Obje, Langendorff sisteminde kalp pozisyonuna yerleştirilmelidir. Bu pozisyon şurada gözlemlenebilir: Şekil 1B, özellikle ışık demetlerinin çarptığı görüntünün merkezinde.
  3. Kamera görüntüleme yazılımını başlatın, ardından kamerayı 4x alt örnekleme (4 piksel = 1 alt piksel) ile ayarlayın. 200 x 200 alt piksel boyutunda bir ilgi alanı (ROI) belirleyin (Ek Dosya 2).
    NOT: Bu konfigürasyon ile saniyede 750 kare (fps) şeklinde bir zamansal çözünürlük mümkündür.
  4. Aydınlatma sistemini açın (Ek Dosya 1), ışık demetlerini referans nesneye odaklanacak şekilde ayarlayın ve homojen aydınlatma sağlayın (Şekil 1B).
  5. Görüntünün aşırı pozlanmasını önlemek için referans nesne üzerindeki ışık şiddetini ayarlayın.
    NOT: Görüntü şu şekilde görünmelidir Şekil 2A (veya Şekil 1C, Kontrol Bilgisayarı). Nesnenin (kalp) yüzeyindeki yansımalar, kontur tanımı kaybolmadan mümkün olduğunca azaltılmalıdır. Bu işlem, Aydınlatma kontrol gücü ayarlanarak veya kamera ayarlarındaki pozlama süresi düşürülerek gerçekleştirilebilir.
  6. Referans nesnenin net bir görüntüsünü elde etmek için kamera lensini odaklayın (Şekil 1C, kontrol bilgisayarı). Referans nesnenin, görüş alanının %80'ini kapladığından emin olun (Şekil 2A) yaklaşık olarak bir dönüştürme ölçeği elde etmek için 61 µm alt piksel başına.
    NOT: Kamera görüntüleme moduna ayarlandığında, optik sistem Aydınlatma sistemini otomatik olarak etkinleştirir (Şekil 1A ve Ek Dosya 2). Aşırı ısınmayı önlemek için, aydınlatma sisteminin kapalı kalması amacıyla kameranın bekleme modunda tutulması ve yalnızca deneysel veri toplama dönemlerinde etkinleştirilmesi önerilir.

6. Cerrahi ve kanülasyon prosedürleri

  1. Heparinizasyon ve anestezi
    1. Tiletamin-zolazepam (40 mg/kg fare vücut ağırlığı) ve ksilazin (10 mg/kg fare vücut ağırlığı) içeren bir anestezik karışım hazırlayın, ardından salin solüsyonu ile 200 µL'ye seyreltin.
    2. Anestezik karışımı 27 G iğne kullanarak intraperitonal olarak enjekte edin. Fareyle derin anesteziye girmesini bekleyin.
      NOT: Uzuvlarda veya kuyrukta bir uyarana yanıt olarak refleksin olmadığını doğrulayın (genellikle 10 dk yeterlidir).
    3. 27 G iğne kalibri kullanarak 200 UI fraksiyone edilmemiş heparini intraperitonal olarak enjekte edin ve deneye devam etmek için yaklaşık 5 dk bekleyin.
  2. Ekstraksiyon ve kanülasyon
    1. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin, göğüs bölgesindeki tüyleri ve deriyi cerrahi makasla temizleyin.
    2. Diyaframın altında, bütünlüğünü koruduğundan emin olarak bir abdominal insizyon yapın.
    3. Diyaframda transvers bir insizyonla devam edin ve kaburgalar üzerinden hızlıca bilateral asendan torakotomi gerçekleştirin, ardından kaburga duvarını çıkarın.
      NOT: Kalbe zarar vermemeye dikkat edin. İşlem sırasında kalp zarar görürse veya bozulursa, deneyin devam ettirilmemesi önerilir.
    4. Kalbin üst yapılarını, aortik arkı ve bitişik damarları ince cımbızlar kullanarak nazikçe tutun. Alttan yukarıya doğru bir kesi yapmak için nazikçe kaldırın ve kalp ile akciğerleri birlikte çıkarın.
    5. İlk yıkama için kalbi, 4 °C'de 50 mL Tyrode solüsyonu içeren bir petri kabına hızlıca transfer edin.
      NOT: Diyafram kesildiği andan itibaren hayvan solunum sıkıntısı çekmeye başlayacaktır; bu noktadan itibaren 6.2.3–6.2.6 arasındaki adımları gerçekleştirmek için 60 s'lik bir pencere vardır. Bu süre sınırının aşılması iskemik hasara yol açabilir.
    6. Stereoskopik mikroskop ve ince makas kullanarak, aortik arkı açığa çıkarmak için akciğerleri ve fazla adipoz dokuyu temizleyin.
      NOT: Dokuyu temizlerken aortik arkın zarar görmediğinden emin olun. Aort, brakiyosefalik arterin altından kesilirse kanülasyon zorlaşacak ve potansiyel olarak basınç sızıntılarına yol açacaktır.
    7. Kalbi, 4 °C'de 50 mL Tyrode tamponu içeren özel yapım kanülasyon tabanına transfer edin ve aortik ekstremiteyi 20 G iğneden özel olarak yapılmış kanülaya yerleştirin (Ek Dosya 1).
      NOT: Aort kapağına zarar vermemeye dikkat edin. Kapak bozulursa kalp şişer ve koroner dolaşım düzgün şekilde yıkanmaz.
    8. 4/0 ipek sütür kullanarak iki kanülasyon düğümü atın: birincisi kanüla ucunun distalindeki çentikte ve ikincisi brakiyosefalik trunkustan önce (Ek Dosya 1).
    9. Oda sıcaklığındaki tamponla doldurulmuş 1 mL şırınga kullanarak yavaşça Tyrode solüsyonu uygulayın. İyi bir kanülasyonu doğrulamak için koroner dokunun berraklaştığını kontrol edin.
    10. Ventriküllere ve atriyumlara erişim sağlamak için adipoz dokuyu temizleyin.
      NOT: Kalp canlılığını korumak için kanülasyon süresinin 5 dk'yı aşmamasını sağlayın.
    11. Kalbi bir Langendorff sistemine transfer edin ve 30 dk boyunca stabilize olmasını bekleyin.
      NOT: Kalp, sistemin merkezine (Şekil 1A,B) dikey olarak asılı şekilde yerleştirilir. Kalbi asarken hava kabarcıkları oluşmasını önlemek için aşırı dikkatli olun. Bu durum gerçekleşirse basınç 140 mmHg'nin üzerine çıkacak, kalp şişmeye başlayacak ve artık canlı olmayacaktır.
      NOT: Kalp mekanik olarak stabil bir yanıt, yaklaşık 360 atım/dakika (BPM) doğal bir osilasyon frekansı ve 60 ile 110 mmHg arasında bir perfüzyon basıncı sergilediğinde Langendorff düzeneği tamamlanmış olur.

7. Adımlama protokolü ve video kaydı

  1. Kalp canlılığı
    1. 3 mL/min perfüzyon pompası ile koroner basıncın 60–110 mmHg aralığında olduğunu doğrulayın. Koroner perfüzyon basıncı 60 mmHg'nin altına düşerse, perfüzyon pompası akış hızını hafifçe artırın (düşük basınç, kalbin soluklaşmasına ve gevşemesine neden olur). Aksine, basınç 110 mmHg'yi aşarsa, pompa akış hızını hafifçe azaltın (aşırı basınç, doku ödemine ve kalp durması gerçekleşene kadar basınçta artan bir yükselmeye yol açacaktır).
      NOT: Perfüzyon basıncının bahsedilen optimal aralığın dışında uzun süre tutulması, kalp canlılığını geri dönülemez şekilde bozacaktır.
    2. Kalbi, kamerada tam karşıdan bir görünüm elde edilecek şekilde frontal pozisyonda yerleştirin. Her iki atriumun da kamerada görünür olması için pozisyonu ayarlayın (Şekil 2A).
    3. Platin elektrotları, sağ atriumun üst kısmındaki pacemaker düğümüne yüzeysel olarak nazikçe yerleştirin. Elektrotları görüş alanına getirmek için kamera görüntüsünü rehber olarak kullanın. Elektrodu, sağ atriumu engellemeyecek şekilde konumlandırın. Kameradan canlı görüntüyü izlerken, aşırı baskı uygulamamaya (bu durum görüntüde sağ atriumu düzleştirecektir) dikkat ederek, elektrodu atrium dokusuna temas edene kadar yavaşça ilerletin.
      NOT: Doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, kamera görünümü Şekil 2A'ya benzeyecektir.
    4. İzleme ve pacing uygulamasını (Ek Dosya 11) başlatın ve veri toplama kartını açın (Şekil 1A (6)). Stimülasyon parametre değerlerini ayarlayın: genlik 2 V, frekans 420, 540 ve 720 pulses per minute (PPM), 7 ms görev döngülü kare dalga şeklinde (Şekil 2A'nın iç eki).
    5. En düşük frekanstan başlayarak, 20 s'lik stimülasyon süresi ve olaylar arasında 20 s'lik bir recovery süresi (dinlenme süresi) kullanarak canlılık stimülasyonlarını uygulayın.
      NOT: Kalp canlılığını kamera izlemesi yoluyla değerlendirin. Organ fizyolojik olarak fonksiyonel ise, uygulanan stimülasyon ile kardiyak yanıt arasında bir senkronizasyon ve kalp odacıkları arasında uygun bir koordinasyon gözlemlenecektir. Aksine, canlılık eksikliği, odacık koordinasyonunun kaybı veya sadece izole atrium kontraksiyonlarının varlığı ile kendini gösterecektir.
    6. Deney oda ışığına ve termal dalgalanmalara karşı duyarlı olduğu için hazne kapağını kapatın (Şekil 1C).
      NOT: Hazne kapağı deney süresince kapalı kalmalıdır. Kalp canlılığını kamera ve perfüzyon basıncı ile izleyin.
  2. Veri kaydı
    1. 30 s süreindeki kare dalga trenlerinden oluşan ve ardından 30 s boyunca sinyal uygulanmayan pacing protokolünü uygulayın. Her pacing trenindeki stimülasyon parametre değerlerini ayarlayın: genlik 2 V, 7 ms görev döngüsü ve 360 ile 720 PPM aralığında frekans.
      NOT: Pacing protokolü 360 PPM ile başlar ve her zaman noktasında 60 PPM artar (Şekil 2A'nın iç eki).
    2. Kamera veri toplama yazılımını (Ek Dosya 2) kullanarak kalbin frontal görünümündeki dinamiklerin videolarını sürekli olarak .avi formatında kaydedin. Her pacing treni için 20 s'lik bir video kaydı yapın. Pacing sonrası 5 saniye ile başlayan 20 s'lik segmenti kaydedin. Temsili bir ham kayıt Ek Video 1'de sunulmuştur.
      NOT: Bir bilgisayar, izleme ve pacing uygulaması ile kamera veri toplama yazılımı tarafından sırasıyla oluşturulan, her bir kaydedilen videoya (.avi) karşılık gelen uygulanan pacing trenini (.xls, Ek Dosya 9) eş zamanlı olarak kaydeder (Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3).
    3. Stimülasyon protokolü başlamadan önce kaydedilen ilk video ile protokol uygulandıktan sonra kaydedilen ikinci videoyu karşılaştırarak kalp canlılığını doğrulayın (Şekil 2B).

8. Langendorff perfüzyon sisteminin deney sonrası temizliği

  1. Stimül ve EKG platin elektrotlarını çıkarın. Kalbi sistemden çıkarın ve tüm kalıntı Tyrode solüsyonlarını boşaltın.
  2. Optik sistemi kapatın ve O2 vanasını kapatın.
  3. Sistemi 37 °C'de 1 L deiyonize su ile durulayın ve sistemi boşaltın.
  4. 2.4 ve 2.5 numaralı adımları tekrarlayın.
  5. Tüm sistemleri ve ekipmanları kapatın.

9. Video işleme

  1. Her bir videoyu hesaplamalı yazılıma aktararak ve bir video normalleştirme fonksiyonu uygulayarak başlayın15.
  2. Kalp bölgesini içeren bir ilgi alanı (ROI) seçin. Arkaplan gürültüsünü, elektrotları ve kanülü çıkarmak için görüntü segmentasyonu gerçekleştirin.Ek Dosya 4).
    NOTSilinecek görüntü alanını doğru şekilde seçmek için lütfen şuraya bakın: Ek Dosya 10.
  3. küresel mekanik dinamik analizi gerçekleştirin (Ek Dosya 5). Destekleyici değişkenlik ve sinyal örnekleri şurada gösterilmiştir: Ek Şekil S1, Ek Şekil S2ve Ek Şekil S3.
    1. Kalp çevresini saptamak için her bir video karesine morfolojik operatörler uygulayın, ardından bir maske oluşturmak için kare doldurma algoritmasını uygulayın15.
    2. Her karedeki segmente edilmiş alan içindeki pikselleri sayın, ardından dinamik bir sinyal oluşturmak için bu sayıyı görüntüdeki toplam piksel sayısına bölerek normalize edin (eklenmiş görünüm Şekil 2B ve Ek Şekil S3).
    3. Yüksek frekanslı gürültüyü ve perfüzyon damlatma artefaktlarını bastırmak için elde edilen sinyale 3 ile 100 Hz arasında 5. derece çift yönlü bir Butterworth filtresi uygulayın.15.
    4. Kayıt altına alınan maksimum ve minimum değerleri kullanarak tüm videolardaki sinyalleri normalize edin.
    5. Her bir dinamik ve stimulus sinyali için, iki maksimum genlik değeri arasındaki aralığı (IAA (s)) hesaplayarak kalp atış hızını belirleyin.
    6. Aşağıdaki formülle BPM cinsinden frekansı elde edin:
      figure-protocol-1
    7. Kısa ve uzun dönemli değişkenliği göstermek için IAA verilerinden Poincaré haritaları oluşturun16,17,18 (Ek Şekil S1 ve Ek Şekil S2).
      NOT: Daha ayrıntılı bilgi için lütfen şuraya bakınız: Ek Dosya 10.
  4. Ventriküler mekanik dinamiklerin segmental analizini gerçekleştirin (Ek Dosya 6).
    1. Görüntü binarizasyonu uygulayın. ROI'den ödün vermeden, ventriküler alanı belirlemek için morfolojik operatörler kullanın ve alanı eliptik bir geometriye göre ayarlayın.15.
    2. Her karedeki ventriküler alana minimum bir elips uydurun. Bir karedeki bir dizi distal noktanın koordinatlarını çıkarın. Y ekseninin her iki ekstreminde 10–20 noktalık bir set kullanın (Şekil 3A). Temsili bir elips tahmin çıktısı şurada verilmiştir: Ek Video 2.
    3. Her videodaki Y ekseni boyunca ekstrem noktalar arasındaki ortalama mesafe olarak ventriküler kısalmayı hesaplayın.19.
    4. Yüksek frekanslı gürültüyü ve perfüzyon damlatma artefaktlarını bastırmak için elde edilen sinyale 3 ila 100 Hz arasında 5. derece çift yönlü bir Butterworth filtresi uygulayın.15.
    5. Her bir pacing için elde edilen tüm videolara göre ventriküler kısalma sinyalini normalize edin ve 9.3.5–9.3.6. adımlarında olduğu gibi kalp hızını ve gecikmeyi hesaplayın.
      NOT: Ventriküler döngü süresi (DVE), relaksasyon süresi (DVW), interventriküler aralık (IVV) ve ventriküler amplitüd (VA) gibi parametreler elde edilir (Şekil 3A).
      NOT: Daha detaylı bilgi için lütfen şuraya başvurun: Ek Dosya 10.
  5. atriyumların mekanik dinamiklerinin segmental analizini gerçekleştirin (Ek Dosya 7).
    1. Atriyumları sınırlandırmak için iki ROI kullanın (Şekil 3C).
    2. Her bir atriumu ayrı ayrı analiz edin.
      1. ROI'yi (ilgi alanı) bozmadan ayarlamalar yaparak atriyumları belirlemek için morfolojik operatörler kullanın15Her bir atriyumu belirlemek için kontrast artırıcı bir algoritma kullanın.20,21.
      2. Görüntü ikilemesi uygulayın ve atrial dinamik sinyali elde etmek için kare başına sıfırdan farklı piksel sayısını nicelleştirin.
      3. Yüksek frekanslı gürültüyü ve perfüzyon damlama artefaktlarını bastırmak için elde edilen sinyallere 3 ile 100 Hz arasında 5. derece çift yönlü bir Butterworth filtresi uygulayın15.
      4. İki atriyal sinyalin ortalamasını hesaplayın (Şekil 3D).
    3. Her bir pacing için elde edilen tüm videolara göre atrial kısalma sinyalini normalize edin ve 9.3.5–9.3.6. adımlarında olduğu gibi kalp hızını ve gecikmeyi hesaplayın.
      NOT: Atriyal döngü süresi (DAE), atriyal-atriyal aralık (IAT) ve atriyal amplitüd (AA) gibi parametreler elde edilir (Şekil 3D). Daha ayrıntılı bilgi için Ek Dosya 10'a bakınız.
  6. Elektromekanik analiz gerçekleştirin13,22 (Ek Dosya 8).
    1. Stimülasyon verilerini atriyal ve ventriküler sinyallerle karşılaştırın (Şekil 3D).
    2. Kalp iletim sistemindeki iletim süresini hesaplayarak, atrium ve ventrikül olayları arasındaki gecikmeyi elde edin (AVD), uygulanan stimülüsü referans alarak.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyak mekanik fonksiyon deneyleri, Şekil 1A(Üst)'da gösterildiği gibi Langendorff aparatı kullanılarak gerçekleştirilir. İzleme ve optik sistemler, Şekil 1A(Alt)'da gösterildiği gibi, aydınlatma kontrolü tetiklendiğinde video kaydı yapılmasına olanak tanır. Şekil 1C, kalbi ortamdaki termal dalgalanmalardan ve ışıktan izole etmek için tasarlanmış olan termostatik kontrollü kabinin dış görünümünü göstermektedir. Şekil 1B'de betimlendiği gibi, izole edilen kalp; Langendorff, optik sistem ve stimülasyon sistemlerinden oluşan deneysel kurulumda bir referans nesne olarak konumlandırılır.

Gösterildiği gibi Şekil 2Aizole kalp, retrograd perfüzyon altında atriyumların ve ventriküllerin net bir frontal görünümünü elde edecek şekilde konumlandırılmıştır. Drenaj tabanının kullanımı (Ek Dosya 1, drenaj sistemi) damlayan perfüzyon sıvısının oluşturduğu hareket artefaktlarını azaltmak ve elde edilen sinyalleri stabilize etmek için gereklidir. Stimülasyon protokolleri, her biri 30 saniye süren, 360 ila 720 bpm arasında değişen frekanslarda darbe trenlerinden (2 V, 7 ms) oluşmuştur.

Optik sistem, kalp bölgesindeki (HA) değişiklikleri kaydeder. Bu dinamik sinyal, aynı zamanda pikler arasındaki zaman aralığının (IAA) elde edilmesini sağlar (Şekil 2B'deki iç yerleştirme). Model canlılığı, n = 6 kalpten oluşan bir kohortta, stimülasyon protokolü öncesindeki (Başlangıç) ve sonrasındaki (Bitiş) ortalama kalp hızları karşılaştırılarak değerlendirilmiştir. Ortalama kalp hızlarında anlamlı bir fark saptanmamıştır (Başlangıç: 385 ± 38 BPM'e karşı Bitiş: 372 ± 18 BPM, Student's t-testi P > 0.05); bu durum, deneysel prosedürün kardiyak fonksiyonu etkilemediğini göstermektedir (Şekil 2B).

Şekil 2C, kalbin yedi farklı stimülasyon frekansına verdiği frekans yanıtını sunmakta ve net bir doğrusal ilişkiyi ortaya koymaktadır2 (R2 = 0.98 ± 0.01, 1:1 mod). Minimum pacing değeri, farenin fizyolojik özellikleri ile sınırlıdır (360 bpm)22,23. Langendorff perfüzyonuna tabi tutulmuş kalp, taşikardik bir profil sergilemektedir. Temsili pacing stimülasyonları ve bunlara karşılık gelen yanıtlar Şekil 2C'nin iç eklerinde gösterilmiştir.

Ardından, kalp odacıklarının dinamiklerini değerlendirmek için spesifik segmentasyon teknikleri uygulanır. Ventriküler kısalma parametreleri optik kayıtlardan elde edilmiştir (Şekil 3A). Şekil 3A'daki ek pencere, normalize edilmiş ventriküler kısalmayı göstermektedir. Bu dinamik sinyalden dört parametre elde edilir: ventriküler kısalma genliği (VA), ventriküler kasılmalar arasındaki zaman aralığı (IVV), ventriküler kasılma süresi (DVE) ve ventriküler gevşeme süresi (DVW).

Şekil 3B yedi farklı pacing değeri için ventriküler kısalma genliğini göstermektedir. Mavi çubuklar bu çalışmayı temsil etmektedir. Turuncu çubuklar, auxotonic kayıt yöntemiyle2 elde edilen verilere karşılık gelmektedir. İki yönlü ANOVA ve ardından Sidak testi kullanılarak yapılan istatistiksel analiz uygulanmıştır. Daha yüksek pacing değerleri olan 600 PPM ve 660 PPM için ventriküler kısalma genliği (VA), sırasıyla anlamlı derecede artmaktadır (P < 0.05*, P < 0.005**). VA (ref. 15'e karşı 360 P > 0.05, ref. 15'e karşı 420 P > 0.05, ref. 15'e karşı 480 P > 0.05, ref. 15'e karşı 540 P > 0.05, ref. 15'e karşı 600 P < 0.005, ref. 15'e karşı 660 P < 0.05, ref. 15'e karşı 720 P > 0.05).

Atrial alanı elde etmek için özel segmentasyon teknikleri uygulanır (Şekil 3C). Her bir atriumda bir ROI tanımlanır. Şekil 3D atrial ortalama sinyali ve ventriküler kısalmayı göstermektedir. Bu dinamik sinyalden iki parametre elde edilir: atrial amplitüd (AA) ve atrial kontraksiyonlar arasındaki zaman aralığı (IAT). Ventriküler ve atrial sinyaller karşılaştırılarak, atria ile ventriküler olaylar arasındaki gecikme (AVD) elde edilir.

figure-results-1
Şekil 1. Langendorff izole kalp için deneysel düzenek ve bir kabinete monte edilmiş optik sistem. (A) Bir optik sisteme bağlı, sabit akışlı retrograd Langendorff perfüzyon sisteminin şematik diyagramı. Langendorff sistemi (Üst), şunları içerir: (1) sürekli oksijenle zenginleştirilmiş Tyrode çözeltisi içeren bir rezervuar. Perfüzat sıcaklığı, bir (2) termal banyo rezervuarı ve (5) serpantin resirkülatör ile 37 °C'de tutulur. (3) Peristaltik perfüzyon pompası 3 mL/min sabit akışı sağlar. (8) Bir drenaj sistemi çözeltiyi uzaklaştırır. (4) Soğutma bobini hem ısı eşanjörü hem de hava kabarcığı tuzağı olarak hizmet eder. Basınç izlemesi ve elektriksel stimülasyon uygulamaları (6) izleme sistemi tarafından kontrol edilir. Optik sistem (alt), (11) aydınlatma kontrolü, (10) telezentrik lensli yüksek hızlı kamera ve iki ışık kaynağı (LED'ler) arasındaki senkronizasyonu içerir. Kamera lensi 100–200 mm aralığında manuel odaklamaya izin verir. (9) Plano-konveks bir lens (LI) ile eşleştirilmiş iki LED, kalbi homojen bir şekilde aydınlatır. Stimülasyon verileri, izleme ve stimülasyon uygulaması kullanılarak kaydedilir (Ek Dosya 11). (7) Kontrolör PC, verileri (video ve elektriksel stimülasyon) eş zamanlı olarak kaydetmek için kameraya ve izleme ve stimülasyon uygulamasına bağlıdır. (B) Kabinet iç görünümü. Kalbin dikey konumu referans nesne üzerinden gösterilmiştir. Langendorff aparatının diğer elemanları gösterilmektedir. (C) Kabinet dış görünümü. Kabinet termal olarak izole edilmiştir ve siyah iç ve dış duvarlar yansımaları ve ortam ışığını minimize eder. İzleme ve video kayıt uygulamalarını çalıştıran bilgisayar gösterilmiştir. Kısaltmalar: LC = telezentrik lens; LEDs = ışık yayan diyotlar; LI = aydınlatma lensi; PC = kişisel bilgisayar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2. Fare kalbinin yerleştirilmesi ve optik sistem doğrulaması. (A) Atriyumları, ventrikülleri, pacing ve ECG elektrotlarını gösteren frontal kalp görünümü. Görüntü, 420 bpm pacing hızındaki bir kareye karşılık gelmektedir (Ek Video 1). İç resim uygulanan pacing işlemini göstermektedir. Video, stimülasyon protokolünün 5 ve 25 saniyeleri arasında kaydedilmiştir. (B) Kalp canlılık testi. Osilasyon frekansını elde etmek için biri pacing protokolü öncesi, diğeri sonrası olmak üzere iki video kaydedilmiştir. Yanıt frekansı hesaplanmıştır. Student’s t-testi uygulanmıştır (P > 0.05). Gruplar arasındaki fark anlamlı değildir. Veriler ortalama değerler ± standart sapma (n = 6) olarak sunulmuştur. İç resim, protokol adımı 9.3'ten elde edilen kalp alanını (HA) ve uygulanan pacing işlemini göstermektedir. (C) Uygulanan pacing'e karşı kalp hızının yanıtı. Mavi çubuklar, kalbin yedi farklı pacing değerine verdiği yanıtı göstermektedir (R2 = 0.98 ± 0.01). Turuncu çubuklar Peña-Romo tarafından bildirilen verilere karşılık gelmektedir2. İç resim tipik yanıt izlerini göstermektedir. İstatistiksel analiz, iki yönlü ANOVA ve ardından Sidak testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Gruplar arasındaki fark anlamlı değildir (P > 0.05). Veriler ortalama değerler ± standart sapma (n = 6) olarak sunulmuştur. Kısaltmalar: ANOVA = varyans analizi; BPM = dakika başı atım; ECG = elektrokardiyogram; HA = kalp alanı; PPM = dakika başı pals. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3. Atriyal ve ventriküler mekanik yanıtın analizi. (A) Ventriküler kısalma. Görüntü, 420 bpm stimülasyondaki bir kareye karşılık gelmektedir (Ek Film 1). Kırmızı bir elips, ventriküler kısalmanın (VS) tahmin edilmesine olanak tanır (Ek Film 2). VS, ana eksen boyunca 10–20 hattın (NV; turuncu çizgiler) maksimum ve minimum değerlerinin ortalaması alınarak hesaplanır. Normalleştirilmiş ventriküler kısalma iç kutuda gösterilmiştir. Bir dizi parametre elde edilebilir: kısalma süresi (DVE), gevşeme süresi (DVW), ventriküler kontraksiyonlar arasındaki zaman aralığı (IVV) ve ventriküler kısalma genliği (VA). (B) Kardiyak yanıt genliği, VA'nın stimülasyonun bir fonksiyonu olarak gösterimi verilmiştir. Mavi çubuklar bu çalışmayı temsil etmektedir. Turuncu çubuklar, oksotonik kayıt yöntemiyle2 elde edilen verilere karşılık gelmektedir. İki yönlü ANOVA ve ardından Sidak testi kullanılarak gerçekleştirilen istatistiksel analiz uygulanmıştır. Daha yüksek stimülasyon değerleri olan 600 PPM ve 660 PPM için ventriküler kısalma genliği (VA) sırasıyla anlamlı şekilde artmaktadır (P < 0.05*, P < 0.005**). VA (ref. 15 ve 360 P > 0.05, ref. 15 ve 420 P > 0.05, ref. 15 ve 480 P > 0.05, ref. 15 ve 540 P > 0.05, ref. 15 ve 600 P < 0.005, ref. 15 ve 660 P < 0.05, ref. 15 ve 720 P > 0.05). Veriler ortalama değerler ± standart sapma (n = 6) olarak sunulmuştur. (C) Atriyal segmentasyon. Görüntü, 420 bpm stimülasyondaki bir kareye karşılık gelmektedir (Ek Film 1). Görüntü, sağ atriyuma (sarı daire) ve sol atriyuma (mavi daire) uygulanan ilgi alanlarını göstermektedir. Atriyal mekanik sinyal, her iki ROI'nin ortalaması alınarak elde edilir. (D) Atriyal ve ventriküler dinamikler. Ortalama atriyal alan (siyah çizgi), ventriküler kısalma (mavi çizgi) normalleştirilmiş yanıtları ve 420 bpm'de stimülasyon (kırmızı çizgi) gösterilmektedir. Bir dizi parametre elde edilebilir: atriyal kontraksiyonlar arasındaki zaman aralığı (IAT), ortalama atriyal genlik (AA) ve atriyoventriküler gecikme (AVD). Kısaltmalar: AA = atriyal genlik; ANOVA = varyans analizi; AVD = atriyoventriküler gecikme; DVE = ventriküler kısalma süresi; DVW = ventriküler gevşeme süresi; IAT = atriyal-atriyal aralık; IVV = interventriküler aralık; NV = ventriküler hat sayısı; PPM = dakika başına darbe; ROI = ilgi alanı; VA = ventriküler kısalma genliği; VS = ventriküler kısalma. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 1. 420 PPM stimülasyonu altındaki video. İzole edilmiş bir fare kalbinin 200 x 200 alt piksel uzamsal çözünürlükte ve 750 fps zamansal çözünürlükte kaydedilmiş görüntüsü. Kısaltmalar: fps = saniyedeki kare sayısı; PPM = dakika başına nabız sayısı.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 2. Ventriküler kısalma için elips kestiriminin temsilci videosu. Ek Video 1'deki kaydın 75 fps hızında yeniden örneklenerek segmentasyon algoritmasının gösterimi. Kısaltma: fps = saniyedeki kare sayısı.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1. Kalp alanı aralıklarının değişkenlik analizi. (A) Stimülasyonsuz bazal durum, (B) 360 PPM, (C) 420 PPM ve (D) 480 PPM. Kısa dönemli ve uzun dönemli değişkenlik, kırmızı elipsle gösterildiği üzere veri ortalamasına göre dağılım olarak hesaplanmıştır. Kısaltmalar: IAA = kalp alanı aralığı; PPM = dakika başına atım sayısı; SD1 = kısa dönemli değişkenlik; SD2 = uzun dönemli değişkenlik.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S2. Kalp alanı aralıklarının değişkenlik analizi. (A) 540 PPM, (B) 600 PPM, (C) 660 PPM ve (D) 720 PPM. Kısa süreli ve uzun süreli değişkenlik, kırmızı elipsle belirtildiği üzere, veri ortalamasına göre dağılım olarak hesaplanmıştır. Kısaltmalar: IAA = kalp alanı aralığı; PPM = dakika başına nabız; SD1 = kısa süreli değişkenlik; SD2 = uzun süreli değişkenlik.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S3. Kontraktil dinamiklerden elde edilen normalize edilmiş sinyallerin zamansal grafiği. Uygulanan stimülasyon 420 PPM (kırmızı) idi ve yanıtlar genel kalp alanını (siyah), ventriküler kısalmayı (mavi) ve atriyal alan dinamiklerini (sarı) içermektedir. Kısaltma: PPM = dakika başına vuru sayı.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosyalar 1–11. Algoritmalar ve teknik dokümantasyon. Şunları içeren sıkıştırılmış klasör: 1) 3D yazıcıyla basılan parçaların görselleri ve spesifikasyonları. 2) Kamera görüntüleme yazılımı için ayrıntılı kılavuzlar. 3) İzleme ve pacing (uyarıma) uygulamaları için ayrıntılı kılavuzlar. 4) Video normalizasyonu ve segmentasyonu için hesaplama programı (adımlar 9.1–9.2). 5) Kalbin global mekaniğini hesaplamak için hesaplama programı (adım 9.3). 6) Ventriküler mekaniklerin segmentlere ayrılmış hesaplaması için hesaplama programı (adım 9.4). 7) Atriyum mekaniklerinin segmentasyonu için hesaplama programı (adım 9.5). 8) Atriyoventriküler gecikmeyi hesaplamak için hesaplama programı (adım 9.6). 9) Ek Film 1'e uygulanan elektriksel pacing. 10) Hesaplama programlarının çalıştırılmasına ilişkin ayrıntılı kılavuz (Dosyalar 4–7). 11) İzleme ve pacing uygulaması. Ayrıca, hesaplama programlarının çalışması için gerekli olan beş harici fonksiyon (AumCont, filterPeaks, FucCordenada, FucMaskIm, FucPoincare) bulunmaktadır.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare kalbi sıcaklık değişimlerine karşı oldukça hassastır2,9,10,11,22. Bu deneyde, perfüze edilen kalp dikey olarak konumlandırılmıştır. Langendorff perfüzyon yönteminde perfüzat sıcaklığı kaybını ve hareket artefaktlarını en aza indirmek için hafif bir modifikasyon ekledik. Perfüzat sıcaklığı kaybını 37 ± 0.5 °C düzeyinde minimize etmek için serpentin sistemine bir resirkülasyon pompası ve hareket artefaktlarını azaltmak için bir drenaj tabanı eklenmiştir. Ayrıca, Şekil 1'de gösterildiği gibi, optik bir sistem ve kardiyak dokuyu homojen şekilde ışınlamak amacıyla bilateral olarak yerleştirilmiş iki adet ayarlanabilir yoğunluktaki LED ışık kaynağı ile donatılmış termal yalıtımlı bir kabin kullanılmıştır.

Deneysel montajın fizibilitesini incelemek için, farklı pacing koşulları altında kalp alanı değişimlerini izlemek amacıyla bir dizi deney gerçekleştirilmiştir. Pacing ile kalbin frekans cevabı arasında, auxotonic kayıt yöntemini8 kullanan Peña-Romo tarafından bildirilen senkronizasyon bölgesiyle2 uyumlu bir senkronizasyon aralığı elde edilmiştir. Optik deneysel düzeneğin, ventrikül kısalmasına yönelik daha ileri deneysel çalışmaları desteklemek için yeterli olduğu sonucuna varılabilir (Şekil 2).

Ventriküler kısalma ve atriyal alan dinamikleri sinyallerinin, kalbin elektromekanik eşleşmesinin analizine olanak sağlayıp sağlamadığını daha ayrıntılı olarak inceledik. Ventriküler ve atriyal sinyaller, atriyoventriküler kasılmadaki gecikme süresinin (AVD) belirlenmesine imkan tanır. 420 PPM'lik bir stimülasyon frekansında, 53 ± 14 ms (ortalama ± SD) değeri elde edilmiştir. Bu sonuç, bir elektrokardiyogram (ECG) ile ölçülen 44 ± 6 ms'lik bir PR aralığı bildiren VanderBrink'in24 bulgularıyla uyumludur.

Bu yöntemin bazı kısıtlamaları da vardır; Şekil 3B'de gösterildiği üzere, EKG tekniklerine kıyasla atriyoventriküler gecikmedeki ve auxotonic kayıt yönteminden elde edilen sonuçlara kıyasla ventriküler amplituddaki tutarsızlıklar, harici hareket artefaktlarından kaynaklanmış olabilir.

Bu yöntem, sağlam izole bir kalpte farmakolojik veya sistemik etkiler olmaksızın kontraktilitenin ve kalp hızının değerlendirilmesine katkıda bulunur. Bu sonuçlar, optik sistemin kalbin ventriküler ve atriyal kısalma yanıtlarının ölçülmesine olanak tanıdığını kanıtlayarak, atriyoventriküler koordinasyonu bozan aritmi çalışmalarında veya farmakolojik etkilerin değerlendirilmesinde kullanımının yararlılığını vurgulamaktadır.

Bu yöntemin bazı kısıtlamaları da bulunmaktadır. İlk olarak, 2D bir yaklaşım olduğu için, oksutonik yöntemde olduğu gibi kasılma kuvvetini ölçmek mümkün değildir. Bu yöntem aynı zamanda çözelti damlacıklarından kaynaklanan hareket artefaktlarını azaltmak ve çözelti sıcaklığını kontrol etmek açısından da faydalıdır. İkinci olarak, fare modellerindeki cinsiyet farklılıkları, biyomedikal araştırmaların geçerliliğini, tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini önemli ölçüde etkilemektedir. Tarihsel olarak araştırmacılar, dişi östrus döngülerinin neden olduğu veri değişkenliğinden kaçınmak için ağırlıklı olarak erkek fareleri tercih etmişlerdir; ancak bu varsayımın büyük ölçüde yanlış olduğu daha sonra gösterilmiştir25,26. Çalışma türüne bağlı olarak, bu protokol erkek veya dişi farelerin dahil olduğu çalışmalara uygulanabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Bilim, Beşeri Bilimler, Teknoloji ve İnovasyon Sekretaryası'nın (SECIHTI) LN-2025-C-23 numaralı hibesi tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL şırıngaBD Plastipak302485Cerrahi işlem
20 G iğneNIPROAH-2032Aort kanülü
8x-100x büyütmeli 25 mm ayarlanabilir lensGenericN/AOptik sistem kamera lensi; genel olarak ayarlanabilir kamera lensi olarak belirtilmiştir
27 G iğneBD PrecisionGlide302358Cerrahi işlem
3B tasarımlı destek parçalarıCINVESTAVN/AÖzel 3B tasarımlı destek parçaları
4-0 ipek sütürAMERICAN SUTURETGSN0901Aort kanülü
40-A güç kaynağıSTERENPRL-25LED güç kaynağı
Hava taşıN/AN/ATyrode çözeltisi oksijenasyonu
CaCl2 (2H2O)Sigma-AldrichC3306Tyrode çözeltisi
D-GlikozJ.T. Baker1916-01Tyrode çözeltisi
Drenaj pompasıCINVESTAVN/AÖzel drenaj pompası; genel olarak drenaj pompası olarak belirtilmiştir
F = 25,4 mm, plano-konveks lensTHORLABSLA1951-AOptik sistem aydınlatma lensi; genel olarak plano-konveks aydınlatma lensi olarak belirtilmiştir
Buzul asetik asitSigma-Aldrich695092Langendorff sistemi temizliği
HeparinPiSA060M91Antikoagülan
HEPESSigma-AldrichH3375Tyrode çözeltisi
Yüksek güçlü LED'lerLuminiusCBT-90-G-L11-C12LED ışık kaynağı
Aydınlatma sistemiCINVESTAVN/AÖzel aydınlatma sistemi; genel olarak aydınlatma sistemi olarak belirtilmiştir
KClCTR SCIENTIFICCTR02196Tyrode çözeltisi
LabVIEW yazılımı versiyon 2018NATIONAL INSTRUMENTSN/Aİzleme ve pacing uygulamasını çalıştırmak için kullanılan yazılım; genel olarak izleme ve pacing uygulaması olarak belirtilmiştir
MATLAB yazılımıThe MathWorksN/AVideo normalizasyon, segmentasyon ve analiz programları için hesaplama yazılımı; genel olarak hesaplama yazılımı olarak belirtilmiştir
Tıbbi sınıf oksijenGRUPO INFRAN/ATyrode çözeltisi oksijenasyonu
MgCl2 (6H2O)CTR SCIENTIFICCTR02104Tyrode çözeltisi
Değişken akışlı Mini-PompaCONTROL COMPANY3385Perfüzyon pompası
Fare Cerrahi SetiKent ScientificINSMOUSEKITCerrahi işlem
NaClSigma-AldrichS5886Tyrode çözeltisi
NaH2PO4DEQDEQF290400250Tyrode çözeltisi
NaOHCTR SCIENTIFICCTR03108pH ayarı
NI USB-6009NATIONAL INSTRUMENTS779026-01Veri toplama kartı
Platin elektrotlar, çap 0,25 mmSigma-Aldrich349402Elektriksel stimülasyon elektrotları
Güç kaynağı (12 V, 30 A)KarnickPTA-12V30AResirkülatör güç kaynağı
Basınç monitörüCINVESTAVN/AÖzel basınç monitörü; genel olarak basınç monitörü olarak belirtilmiştir
Basınç transdüseriLA BOUVETB17295Langendorff sistemi basınç monitörü
Saf etil alkolSigma-Aldrich493511Sistem temizliği için etanol
Resirkülasyonlu termal banyo (LXC)PolyScienceL113A0412Rezervuar resirkülatörü
Salin çözeltisiPiSA111848%0,9 sodyum klorür (NaCl) çözeltisi
Serpantin termal banyoCINVESTAVN/AÖzel serpantin resirkülatör/termal banyo
StereomikroskopN/AN/ACerrahi işlem
Stereomikroskop aydınlatmasıN/AN/ACerrahi işlem
uEye Cockpit yazılımıIDS Imaging Development System GmBHN/AKamera görüntüleme yazılımı; genel olarak kamera görüntüleme yazılımı olarak belirtilmiştir
UI-3360CP-NIR-GL Rev.2IDSAB00624Yüksek hızlı CMOS kamera; genel olarak CMOS kamera olarak belirtilmiştir
KsilazinPiSA4001211Anestezik
Zoletil 100Virbac83048907Tiletamin-zolepaze anestezik; genel olarak anestezik karışım olarak belirtilmiştir

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guarina L et al. Biological noise is a key determinant of the reproducibility and adaptability of cardiac pacemaking and EC coupling. J Gen Physiol. 2022;154(9):e202012613.
  2. Peña-Romo A et al. Noise enhanced the electrical stimulation-contractile response coupling in isolated mouse heart. Int J Cardiol. 2016;221:155-60.
  3. Bychkov R et al. Synchronized cardiac impulses emerge from heterogeneous local calcium signals within and among cells of pacemaker tissue. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):907-31.
  4. Clancy CE, Santana LF. Evolving discovery of the origin of the heartbeat: a new perspective on sinus rhythm. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):932-4.
  5. Asamudo EU, Ng YH, Bers DM. Langendorff isolated heart perfusion model for functional studies in mice. In: Chandrasekera DNK, Katare R, editors. Cardiomyocytes: Methods and Protocols. Springer Nature; New York; 2025. p. 111-24.
  6. Louradour J et al. Simultaneous assessment of mechanical and electrical function in Langendorff-perfused ex vivo mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2023;10:1293032.
  7. Noly PE et al. Assessment of ex vivo murine biventricular function in a Langendorff model. J Vis Exp. 2022;(190):e64384.
  8. Beckett PR. The isolated perfused heart preparation: two suggested improvements. J Pharm Pharmacol. 1970;22(11):818-22.
  9. Ihara K et al. Electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping. J Vis Exp. 2018;(132):e56478.
  10. King DR, Hardin KM, Hoeker GS, Poelzing S. Reevaluating methods reporting practices to improve reproducibility: an analysis of methodological rigor for the Langendorff whole heart technique. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2022;323(3):H363-77.
  11. Lang D, Sulkin M, Lou Q, Efimov IR. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. 2011;(55):e3275.
  12. Liao R, Podesser BK, Lim CC. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(2):H156-67.
  13. Sung YL, Tsai YS, Chang CL, Hu YF. Protocol for high-resolution optical mapping of ex vivo rat heart for electrophysiological studies. STAR Protoc. 2025;6(2):103734.
  14. Lee P et al. Low-cost optical mapping systems for panoramic imaging of complex arrhythmias and drug-action in translational heart models. Sci Rep. 2017;7:43217.
  15. Laughner JI et al. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(7):H753-65.
  16. Hao X et al. TGF-β1-mediated fibrosis and ion channel remodeling are key mechanisms in producing the sinus node dysfunction associated with SCN5A deficiency and aging. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2011;4(3):398-406.
  17. Pizzo E et al. Heart rate variability reveals altered autonomic regulation in response to myocardial infarction in experimental animals. Front Cardiovasc Med. 2022;9:843144.
  18. Tayel MB, AlSaba EI. Poincaré plot for heart rate variability. Int J Biomed Biol Eng. 2015;9(9).
  19. Bazan C, Barba DT, Blomgren P, Paolini P. Image processing techniques for assessing contractility in isolated adult cardiac myocytes. Int J Biomed Imaging. 2009;2009:352954.
  20. Christoph J, Luther S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Front Physiol. 2018;9:1483.
  21. Lebert J, Ravi N, Kensah G, Christoph J. Real-time optical mapping of contracting cardiac tissues with GPU-accelerated numerical motion tracking. Front Cardiovasc Med. 2022;9:787627.
  22. Larsen TS et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflugers Arch. 1999;437:979-85.
  23. Vornanen M. Basic functional properties of the cardiac muscle of the common shrew (Sorex araneus) and some other small mammals. J Exp Biol. 1989;145:339-51.
  24. VanderBrink BA et al. Assessment of atrioventricular nodal physiology in the mouse. J Interv Card Electrophysiol. 1999;3(3):207-12.
  25. Shansky RM, Murphy AZ. Considering sex as a biological variable will require a global shift in science culture. Nat Neurosci. 2021;24(4):457-64.
  26. Shansky RM. Are hormones a “female problem” for animal research? Science. 2019;364(6443):825-6.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Langendorff Perf ze KalpFare Kalp ModeliOptik De erlendirmeAtriyal KontraktiliteVentrik ler KontraktiliteKalp H z l mY ksek z n rl kl G r nt lemeVentrik ler K salmaAtriyal DinamiklerKardiyak Mekanik
Video yakında

İlgili makaleler