Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Langendorff Perfüzyonlu Fare Kalplerinde Atriyal ve Ventriküler Mekaniğin Değerlendirilmesi için Optik Sistem

66 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/72264

⸱

14 Ağustos 2026

 , 
1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Unidad Monterrey

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, fare kalbinin çıkarılması ve kanülasyonu prosedürünün yanı sıra Langendorff retrograd perfüzyon sisteminin hazırlanmasını ve konfigürasyonunu açıklamaktadır. Deneysel düzenek, atriyumların ve ventriküllerin doğal dinamiklerini korurken mekanik tepkilerini değerlendirmek için tasarlanmış yüksek çözünürlüklü bir optik sistemle eşleştirilmiştir.

Özet

Fare kalbi, mühendislik teknolojilerindeki ilerlemelerin yardımıyla kardiyovasküler araştırmalarda yaygın olarak kullanılan bir model görevi görmektedir. Ancak, fare kalbinin küçük boyutu nedeniyle atriyal ve ventriküler kontraktilitenin değerlendirilmesi zor olmaya devam etmektedir. Bu çalışma, sağlam, izole bir kalpte kontraktilite ve kalp hızını değerlendirmek için yeni bir metodoloji sunmaktadır. Langendorff perfüzyonlu bir fare kalbinin yüksek çözünürlüklü bir optik sistemle birlikte kullanılması, atriyal ve ventriküler kontraktilitenin değerlendirilmesine olanak tanır. Deneysel kurulum, yüksek çözünürlüklü sinyaller elde ederken küçük kalp boyutu ve hızlı kasılma hızlarıyla ilişkili zorlukları gidermektedir. Dakikada 420 ila 660 atım (bpm) aralığındaki stimülasyon frekansı ile kalp kasılma frekansı arasındaki senkronizasyon, auksotonik yöntemden elde edilen sonuçlarla uyumluydu. Ek olarak, ventriküler kısalma ve atriyal dinamik sinyal ölçümleri, atriyoventriküler kasılmanın belirlenmesine imkan sağlamaktadır. Bu yöntem, farmakolojik veya sistemik etkiler olmaksızın, sağlam, izole bir kalpte kontraktilite ve kalp hızını değerlendirmek için uygundur. Bu sonuçlar, optik sistemin ventriküler ve atriyal kısalma yanıtlarının ölçülmesine olanak tanıdığını göstermektedir.

Giriş

Kardiyak fizyolojide keşfedilecek çok şey vardır; kardiyak pacemaker (kalp pili) aktivitesi ve uyarılma-kasılma eşleşmesi gibi temel süreçler, sürekli olarak araştırılan merkezi ilkelerdir1. Biyolojik gürültünün kardiyak kontraktilite2 ve pacemaker aktivitesi üzerindeki etkileri henüz yeterince anlaşılamamış olsa da1, yeni optik görüntüleme yöntemleri yeni paradigmaların sunulmasına olanak sağlamıştır3,4.

Langendorff sistemini kullanan iki deneysel metodoloji, kardiyak fonksiyonların ölçülmesine paha biçilmez katkılar sağlamıştır. Birincisi, sol ventriküle yerleştirilen küçük bir balondan sinyal elde edilen izovolümetrik kontraksiyon yöntemidir5,6,7. İkincisi, kalbin aksı boyunca auksotonik kontraksiyonları ölçmek için bir ipliğin bir ucunun kalbin apeksine, diğer ucunun ise mekanik bir kayıt cihazına dikilmesiyle sinyal elde edilen auksotonik kayıt yöntemidir2,8. Bununla birlikte, fare kalbinin çok küçük boyutları nedeniyle atriyal ve ventriküler kontraktilitenin değerlendirilmesi zordur. Ayrıca, kalp yaralanmalara karşı hassas olduğundan, hazırlık aşaması belirli bir düzeyde özen ve naziklik gerektirir9,10,11,12,13.

Fare kalplerinin mekanik dinamiklerini değerlendirmek için kullanılan optik sistem, birkaç yeni özelliğe ve avantaja sahiptir. İlk olarak bu yöntem, farmakolojik veya sistemik etkilerin yokluğunda, sağlam ve izole bir kalpte kontraktiliteyi ve kalp hızını değerlendirmek için uygundur. Bu protokol ayrıca farmakolojik, hücre rejenerasyonu veya oksijen tedavisine dayalı tedavilerin incelendiği iskemi-reperfüzyon hasarını değerlendiren deneylerde de etkili bir şekilde kullanılabilir.

Bu makalede, yüksek çözünürlüklü bir optik sistem kullanarak fare kalp kasılma fonksiyonunun biyofiziksel parametrelerini kaydetmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, sağlam, izole bir kalpte kasılma gücünün ve kalp hızının değerlendirilmesine yardımcı olur. Ayrıca, atriyal ve ventriküler kasılmanın değerlendirilmesine olanak tanır. Langendorff fare kalbi preparatı, kas kasılmalarını engellemeden perfüzyon sıvısı sıcaklığı kaybını ve hareket artefaktlarını en aza indirmek için hafif bir modifikasyon içeren bir iyileştirme sunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Hayvan Deneyleri ve Bakımı için Federal Yönetmeliklere uygun olarak yürütülmüş ve CINVESTAV Hayvan Bakım Komitesi (CINVESTAV Zacatenco, D.F., Meksika) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada, 28–34 g ağırlığında ve 8–14 haftalık C57BL/6J erkek fareler kullanılmıştır. Protokolde kullanılan tüm materyaller ve ekipmanlar Materyaller Tablosunda listelenmiştir. Ek Dosyalar 1–11, protokol için destekleyici diyagramlar, yazılım kılavuzları, analiz programları, pacing verileri ve uygulama dosyaları sunmaktadır.

1. Stok hazırlama

  1. Önceden iki stok çözelti hazırlayın ve bunları 4 °C'de buzdolabında saklayın: (1) Stok I, 1 L (deiyonize su içerisinde; g/L cinsinden: 76,13 NaCl, 4,02 KCl, 1 MgCl2(6H2O), 0,4 NaH2PO4) ve (2) Stok II, 0,1 L (deiyonize su içerisinde; g/L cinsinden: 73,5 CaCl2(2H2O)).
    NOT: Çözeltiler hazırlandıktan sonra 30 güne kadar kullanılabilir. 4 °C'de saklayın.

2. Langendorff sisteminin bağlantısı ve temizliği

  1. Şekil 1A'da gösterildiği gibi rezervuarı (1), rezervuar termal banyosunu (2), perfüzyon pompasını (3), serpentini (4), serpentin resirkülatörünü (5), izleme sistemini (6) ve drenaj sistemini (8) bağlayın.
    NOT: İzleme sistemi ile drenaj sistemi arasındaki bağlantı Ek Dosya 1'de daha ayrıntılı olarak gösterilmiştir.
  2. Langendorff sistemini 50 °C'de 1 L deiyonize su ile doldurun, ardından perfüzyon ve drenaj pompalarını başlatın (Ek Dosya 1, drenaj sistemi). Yaklaşık 20–30 dk sonra sıvıyı sistemden uzaklaştırın, ardından bir sonraki adıma geçin.
    NOT: Sistemde sızıntı veya basınç düşüşü olmadığını doğrulayın. Böyle bir durum oluşursa deneye devam etmeyin.
  3. Sistemi 1 L %1 asetik asit (deiyonize suda çözünmüş) ile doldurun, ardından perfüzyon ve drenaj pompalarını kapatın ve 60 dk bekleyin, daha sonra sıvıyı uzaklaştırmak için pompaları çalıştırın.
  4. 2.2 numaralı adımı iki kez tekrarlayın.
  5. Çözelti bileşenlerinin yapışmasını önlemek için sistemi %70 etanol (deiyonize suda çözünmüş) ile doldurun.
    NOT: Langendorff perfüzyon sistemi her on deneyde bir veya ayda bir temizlenmelidir. Deney öncesi temizleme protokolü bölüm 4'te açıklanmıştır. Deney sonrası temizleme protokolü ise bölüm 8'de ayrıntılı olarak verilmiştir.

3. Deney sırasında Tyrode çözeltisinin hazırlanması

  1. mM cinsinden şu bileşenleri içeren 1 L çözelti hazırlayın: 130,25 NaCl, 5,4 KCl, 0,53 MgCl2(6H2O), 0,33 NaH2PO4, 1,8 CaCl2(2H2O), 10 D-glukoz, 10 HEPES; pH değeri NaOH ile 7,35 ± 0,05'e ayarlanmalıdır.
    1. 100 mL Stok I'i, sürekli karıştırma altında 700 mL deiyonize su ile karıştırın, ardından çözeltinin sıcaklığını 37 °C'ye yükseltin; O2 tüpünü Şekil 1A (1)'de gösterildiği gibi hava taşına bağlayarak çözeltinin oksijenlenmesini sağlayın.
    2. 1,8 mM CaCl2(2H2O) elde etmek için 3,6 mL Stok II ve 96,4 mL deiyonize su ekleyin, ardından pH'ı 7,35 ± 0,05'e ayarlamak için NaOH ekleyin.
    3. 1 L Tyrode çözeltisi elde etmek için deiyonize su ile tamamlayın.
      NOT: Çözeltinin 100 mL'sinin 4 °C'de buzdolabında saklanması önerilir; bu hacim daha sonra 6. adımda gerekecektir.

4. Langendorff sisteminin hazırlanması

NOT: Eğer Langendorff sistemi deney gününde etanol ile doldurulmamışsa, prosedüre devam edilmesi önerilmez; bunun yerine bölüm 2 tekrarlanmalıdır.

  1. Perfüzyon ve drenaj pompalarını açın. Perfüzyon pompası akış hızını 3 mL/min ve drenaj pompasını 10 mL/min olarak ayarlayın. Sistemi boşaltın.
  2. Sistemi 37 °C'de 1 L deiyonize su ile doldurun, ardından suyu boşaltın.
  3. Sistemi adım 3'te hazırlanan Tyrode çözeltisi ile doldurun ve çözeltiyi fizyolojik sıcaklıkta ve sabit oksijenasyon altında tutun.
  4. Rezervuar termal banyolarını ve serpentin resirkülatörünü açın. Çözeltiyi fizyolojik koşullar altında tutmak için rezervuar sıcaklığını (Şekil 1A (2)) 38 °C'ye ayarlayın. Serpentinin sıcaklığını (Şekil 1A (5)) 40 °C'ye ayarlayın. Bu, Langendorff sistemi çözeltisindeki sıcaklık kaybını telafi eder.
    NOT: Sistem çıkışındaki Tyrode çözeltisinin sıcaklığı fizyolojik (37 ± 0.5 °C) değilse, serpentin resirkülatör sıcaklığını ayarlayın. Sıcaklık uygun değerde stabilize olana kadar 6. adıma geçilmesi önerilmez.
  5. Basınç monitörünü açın (Ek Dosya 1, izleme sistemi) ve 0–200 mmHg aralığında kalibre edin. Sistemin kalibrasyonuna yardımcı olmak için izleme ve pacing uygulaması mevcuttur (Ek Dosya 3 ve Ek Dosya 11).
    NOT: Sistemde basınç kaybı ve hava kabarcığı olmadığından emin olmak esastır. Sistemde hava kabarcıkları varsa, serpentinin alt çıkışını geçici olarak kapatın ve üst vanayı açın; bu, kolonun dolmasını sağlayarak kabarcıkların dışarı salınmasına izin verecektir. Bu durum doğrulanana kadar deneye devam edilmesi önerilmez.

5. Optik sistem14

  1. CMOS kamerayı monte edin (Şekil 1A, 10), ayarlanabilir kamera lensi (LC) ve aydınlatma sistemi.
    NOT: Aydınlatma sistemi iki LED'den oluşur (Şekil 1A, 9), iki plano-konveks aydınlatma lensi (LI), bir aydınlatma kontrolü (Şekil 1A, 11), bir veri toplama kartı (Ek Dosya 1, izleme sistemi) ve 3D tasarımlı destek parçaları (Ek Dosya 1).
  2. Hacmi yaklaşık 1.000 mm³ olan bir referans nesne yerleştirin3 kamera lensinden 100–200 mm uzağa (merkezine Şekil 1A).
    NOT: Nesne, Langendorff sisteminde kalp konumuna yerleştirilmelidir. Bu konum şurada gözlemlenebilir: Şekil 1B, özellikle ışık demetlerinin çarptığı görüntü merkezinde.
  3. Kamera veri toplama yazılımını başlatın, ardından kamerayı 4x alt örnekleme (4 piksel = 1 alt piksel) ile ayarlayın. 200 x 200 alt piksel boyutunda bir ilgi alanı (ROI) belirleyin (Ek Dosya 2).
    NOT: Bu konfigürasyon ile saniyede 750 kare (fps) zamansal çözünürlük mümkündür.
  4. Aydınlatma sistemini açın (Ek Dosya 1), ışık demetlerini referans nesneye odaklanacak şekilde ayarlayın ve homojen aydınlatma sağlayın (Şekil 1B).
  5. Görüntünün aşırı pozlanmasını önlemek için referans nesne üzerindeki ışık yoğunluğunu ayarlayın.
    NOT: Görüntü şuna benzemelidir Şekil 2A (veya Şekil 1C, Kontrol Bilgisayarı). Nesnenin (kalp) yüzeyindeki yansımalar, kontur tanımı kaybı yaşanmadan mümkün olduğunca azaltılmalıdır. Bu işlem, Aydınlatma kontrol gücü ayarlanarak veya kamera ayarlarındaki pozlama süresi kısaltılarak gerçekleştirilebilir.
  6. Referans nesnenin net bir görüntüsünü elde etmek için kamera lensini odaklayın (Şekil 1C, kontrol bilgisayarı). Referans nesnesinin görüş alanının %80'ini kapladığından emin olun (Şekil 2A) yaklaşık olarak bir dönüşüm ölçeği elde etmek için 61 µm alt piksel başına.
    NOT: Kamera görüntüleme moduna ayarlandığında, optik sistem aydınlatma sistemini otomatik olarak etkinleştirir.Şekil 1A ve Ek Dosya 2). Aşırı ısınmayı önlemek için, aydınlatma sisteminin kapalı kalması amacıyla kameranın bekleme modunda tutulması ve yalnızca deneysel veri toplama dönemlerinde etkinleştirilmesi önerilir.

6. Cerrahi ve kanülasyon prosedürleri

  1. Heparinizasyon ve anestezi
    1. Tiletamin-zolazepam (40 mg/kg fare vücut ağırlığı) ve ksilazin (10 mg/kg fare vücut ağırlığı) içeren bir anestezik karışım hazırlayın, ardından salin solüsyonu ile 200 µL'ye seyreltin.
    2. Anestezik karışımı 27 G iğne kullanarak intraperitonal olarak enjekte edin. Fareyle derin anesteziye girmesini bekleyin.
      NOT: Uzuvlarda veya kuyrukta bir uyarana yanıt olarak refleksin olmadığını doğrulayın (genellikle 10 dk yeterlidir).
    3. 200 UI fraksiyone edilmemiş heparini 27 G iğne kullanarak intraperitonal olarak enjekte edin ve deneye devam etmek için yaklaşık 5 dk bekleyin.
  2. Ekstraksiyon ve kanülasyon
    1. Fareyi sırt üstü pozisyona getirin, torasik bölgedeki kürk ve deriyi cerrahi makasla temizleyin.
    2. Diyaframın altına, bütünlüğünü koruduğunuzdan emin olarak abdominal bir insizyon yapın.
    3. Diyaframda transvers bir insizyonla devam edin ve kaburgalar üzerinden hızlıca bilateral asendan torakotomi gerçekleştirip kaburga duvarını kaldırın.
      NOT: Kalbe zarar vermemeye dikkat edin. İşlem sırasında kalp zarar görürse veya hasar alırsa, deneye devam edilmemesi önerilir.
    4. Kalbin üst yapılarını, aort arkusunu ve bitişik damarları ince cımbızlar kullanarak nazikçe tutun. Alttan yukarıya doğru bir kesi yapmak için nazikçe kaldırın; kalp ve akciğerleri birlikte çıkarın.
    5. Kalbi, ilk yıkama için 4 °C'de 50 mL Tyrode solüsyonu içeren bir petri kabına hızlıca aktarın.
      NOT: Diyafram kesildiği andan itibaren hayvan solunum sıkıntısı çekmeye başlayacaktır; bu noktadan itibaren adım 6.2.3–6.2.6'yı gerçekleştirmek için 60 s'lik bir süre vardır. Bu süre sınırının aşılması iskemik hasara yol açabilir.
    6. Stereoskopik mikroskop ve ince makaslar kullanarak, aort arkusunu açığa çıkarmak için akciğerleri ve fazla yağ dokusunu temizleyin.
      NOT: Dokuyu temizlerken aort arkusunun zarar görmediğinden emin olun. Aorta brakiyosefalik arterin altından kesilirse, kanülasyon zorlaşacak ve potansiyel olarak basınç sızıntılarına yol açacaktır.
    7. Kalbi, 4 °C'de 50 mL Tyrode tamponu içeren özel yapım kanülasyon tabanına aktarın ve aort ucunu 20 G iğneden özel olarak yapılmış kanülün içine yerleştirin (Ek Dosya 1).
      NOT: Aort kapağına zarar vermemeye dikkat edin. Kapak zarar görürse kalp şişer ve koroner sirkülasyon düzgün şekilde yıkanmaz.
    8. 4/0 ipek sütür kullanarak iki kanülasyon düğümü atın: birincisini kanül ucunun distalindeki çentiğe ve ikincisini brakiyosefalik trunkus öncesine (Ek Dosya 1).
    9. Oda sıcaklığındaki tamponla dolu 1 mL'lik bir şırınga kullanarak yavaşça Tyrode solüsyonu uygulayın. İyi bir kanülasyonu doğrulamak için koroner dokunun berraklaştığını kontrol edin.
    10. Ventriküllere ve atriyumlara erişim sağlamak için yağ dokusunu temizleyin.
      NOT: Kalp canlılığını korumak için kanülasyon süresinin 5 dk'yı aşmamasını sağlayın.
    11. Kalbi bir Langendorff sistemine aktarın ve 30 dk boyunca stabilize olmasını bekleyin.
      NOT: Kalp, sistemin merkezine (Şekil 1A,B) dikey olarak asılı şekilde yerleştirilir. Kalbi asarken hava kabarcığı oluşmasını önlemek için azami dikkat gösterin. Eğer hava kabarcığı oluşursa, basınç 140 mmHg'nin üzerine çıkacak, kalp şişmeye başlayacak ve artık canlılığını yitirecektir.
      NOT: Kalp mekanik olarak stabil bir yanıt, yaklaşık 360 atım/dakika (BPM) doğal bir osilasyon frekansı ve 60 ile 110 mmHg arasında bir perfüzyon basıncı sergilediğinde Langendorff düzeneği tamamlanmış olur.

7. Adımlama protokolü ve video kaydı

  1. Kalp canlılığı
    1. 3 mL/min perfüzyon pompası ile koroner basıncın 60–110 mmHg aralığında olduğunu doğrulayın. Koroner perfüzyon basıncı 60 mmHg'nin altına düşerse, perfüzyon pompası akış hızını hafifçe artırın (düşük basınç, kalbin soluklaşmasına ve gevşemesine neden olur). Aksine, basınç 110 mmHg'yi aşarsa, pompa akış hızını hafifçe azaltın (aşırı basınç doku ödemine ve kardiyak arrest meydana gelene kadar basınçta kademeli bir artışa yol açacaktır).
      NOT: Perfüzyon basıncının yukarıda belirtilen optimal aralık dışında uzun süre tutulması, kalp canlılığını geri döndürülemez şekilde bozacaktır.
    2. Kamerada tam frontal bir görüntü elde edilecek şekilde kalbi frontal pozisyona yerleştirin. Her iki atriyum da kamerada görünecek şekilde konumu ayarlayın (Şekil 2A).
    3. Platin elektrotları, sağ atriyumun üst kısmındaki pacemaker düğümüne yüzeysel olarak nazikçe yerleştirin. Elektrotları görüş alanına getirmek için kamera beslemesini kılavuz olarak kullanın. Elektrodu sağ atriyumu engellemeyecek şekilde konumlandırın. Kamera canlı görüntüsünü izlerken, aşırı kompresyon uygulamamaya (bu durum görüntüde sağ atriyumu düzleştirir) dikkat ederek, elektrot atriyal dokuyla temas edene kadar yavaşça ilerletin.
      NOT: Doğru şekilde uygulandığında, kamera görüntüsü Şekil 2A'ya benzeyecektir.
    4. İzleme ve pacing uygulamasını başlatın (Ek Dosya 11) ve acquisition kartını açın (Şekil 1A (6)). Stimülasyon parametre değerlerini ayarlayın: genlik 2 V, frekans 420, 540 ve 720 pulses per minute (PPM), 7 ms duty-cycle kare dalga pulse ile (Şekil 2A'nın iç eki).
    5. En düşük frekanstan başlayarak, 20 s stimülasyon süresi ve olaylar arasında 20 s toparlanma süresi (dinlenme süresi) kullanarak canlılık stimülasyonlarını uygulayın.
      NOT: Kalp canlılığını kamera izlemesi yoluyla değerlendirin. Organ fizyolojik olarak işlevselse, uygulanan stimülasyon ile kardiyak yanıt arasında bir senkronizasyon gözlemlenecek ve kalp odacıkları arasında uygun koordinasyon sağlanacaktır. Aksine, canlılık eksikliği, odacık koordinasyonunun kaybıyla veya yalnızca izole atriyal kontraksiyonların varlığıyla kendini gösterecektir.
    6. Deney oda ışığına ve termal dalgalanmalara karşı hassas olduğundan hazne kapağını kapatın (Şekil 1C).
      NOT: Deney süresince hazne kapağı kapalı tutulmalıdır. Kalp canlılığını kamera ve perfüzyon basıncı ile izleyin.
  2. Veri kaydı
    1. 30 s süreli kare dalga pulse trenleri ve ardından 30 s sinyal yokluğundan oluşan pacing protokolünü uygulayın. Her pacing trenindeki stimülasyon parametre değerlerini ayarlayın: genlik 2 V, 7 ms duty cycle ve frekans 360 ile 720 PPM aralığında.
      NOT: Pacing protokolü 360 PPM ile başlar ve her zaman noktasında 60 PPM artar (Şekil 2A'nın iç eki).
    2. Kamera acquisition yazılımını (Ek Dosya 2) kullanarak kalbin frontal görünüm dinamiklerinin videolarını sürekli olarak .avi formatında kaydedin. Her pacing treninin 20 s'lik bir video kaydını yapın. Pacing başladıktan 5 s sonra başlayan 20 s'lik segmenti kaydedin. Temsili bir ham kayıt Ek Film 1'de sunulmuştur.
      NOT: Bir bilgisayar, izleme ve pacing uygulaması ile kamera acquisition yazılımı tarafından sırasıyla oluşturulan, her kaydedilen videoya (.avi) uygulanan pacing trenini (.xls, Ek Dosya 9) eş zamanlı olarak kaydeder (Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3).
    3. Stimülasyon protokolü başlamadan önce kaydedilen ilk video ile protokol uygulandıktan sonra kaydedilen ikinci videoyu karşılaştırarak kalp canlılığını doğrulayın (Şekil 2B).

8. Langendorff perfüzyon sistemi deney sonrası temizliği

  1. Stimülasyon ve EKG platin elektrotlarını çıkarın. Kalbi sistemden çıkarın ve tüm kalıntı Tyrode çözeltilerini boşaltın.
  2. Optik sistemi kapatın ve O2 valfini kapatın.
  3. Sistemi 37 °C'de 1 L deiyonize su ile durulayın ve sistemi boşaltın.
  4. 2.4 ve 2.5 numaralı adımları tekrarlayın.
  5. Tüm sistemleri ve ekipmanları kapatın.

9. Video işleme

  1. Her bir videonun hesaplama yazılımına aktarılması ve bir video normalizasyon fonksiyonunun uygulanmasıyla başlayın15.
  2. Kalp bölgesini içeren bir ilgi alanı (ROI) seçin. Arka plan gürültüsünü, elektrotları ve kanülü temizlemek için görüntü segmentasyonu gerçekleştirin (Ek Dosya 4).
    NOTKaldırılacak görüntü alanının doğru şekilde seçilmesi için lütfen şuraya bakınız: Ek Dosya 10.
  3. küresel mekanik dinamik analizi gerçekleştirin (Ek Dosya 5). Destekleyici değişkenlik ve sinyal örnekleri şurada gösterilmiştir: Ek Şekil S1, Ek Şekil S2ve Ek Şekil S3.
    1. Kalp çevresini tespit etmek için her bir video karesine morfolojik operatörler uygulayın, ardından bir maske oluşturmak için kare doldurma algoritması uygulayın15.
    2. Her karedeki segmente edilmiş alan içindeki pikselleri sayın, ardından dinamik bir sinyal oluşturmak için bu sayıyı görüntüdeki toplam piksel sayısına oranlayarak normalize edin (eklenmiş görüntü Şekil 2B ve Ek Şekil S3).
    3. Yüksek frekanslı gürültüyü ve perfüzyon damlama artefaktlarını bastırmak için elde edilen sinyale 3 ile 100 Hz arasında 5. derece çift yönlü Butterworth filtresi uygulayın.15.
    4. Kaydedilen maksimum ve minimum değerleri kullanarak tüm videolardaki sinyalleri normalize edin.
    5. Her bir dinamik ve stimulus sinyali için iki maksimum genlik değeri arasındaki aralığı (IAA (s)) hesaplayarak kalp hızını belirleyin.
    6. Aşağıdaki formül ile BPM cinsinden frekansı elde edin:
      Kalp hızının BPM cinsinden olduğu, frekans hesaplama denklemi: BPM = 60 / IAA.
    7. Kısa ve uzun dönemli değişkenliği göstermek için IAA verilerinden Poincaré haritaları oluşturun16,17,18 (Ek Şekil S1 ve Ek Şekil S2).
      NOT: Daha detaylı bilgi için lütfen şuraya başvurun: Ek Dosya 10.
  4. Ventriküler mekanik dinamiklerin segmental analizini gerçekleştirin (Ek Dosya 6).
    1. Görüntü ikilemesi uygulayın. İlgili alanı (ROI) bozmadan, ventriküler alanı belirlemek için morfolojik operatörler kullanın ve alanı eliptik bir geometriye göre ayarlayın.15.
    2. Her karedeki ventriküler alana minimum bir elips uydurun. Bir karedeki bir dizi distal noktanın koordinatlarını çıkarın. Y ekseni boyunca her iki uç noktada 10–20 noktalık bir set kullanın (Şekil 3A). Temsili bir elips kestirim çıktısı şurada sunulmuştur: Ek Video 2.
    3. Ventriküler kısalmayı, her videodaki Y ekseni boyunca uç noktalar arasındaki ortalama mesafe olarak hesaplayın19.
    4. Yüksek frekanslı gürültüyü ve perfüzyon damlama artefaktlarını bastırmak için elde edilen sinyale 3 ile 100 Hz arasında 5. derece çift yönlü Butterworth filtresi uygulayın15.
    5. Ventriküler kısalma sinyalini her bir stimülasyon için elde edilen tüm videolara göre normalize edin ve kalp hızını ve gecikmeyi adım 9.3.5–9.3.6'daki gibi hesaplayın.
      NOT: Ventriküler döngü süresi (DVE), gevşeme süresi (DVW), interventriküler aralık (IVV) ve ventriküler genlik (VA) gibi parametreler elde edilir (Şekil 3A).
      NOT: Daha ayrıntılı bilgi için lütfen şuraya başvurun: Ek Dosya 10.
  5. atriyumların mekanik dinamiklerinin segmental analizini gerçekleştirin (Ek Dosya 7).
    1. Atriyumları sınırlandırmak için iki ROI kullanın (Şekil 3C).
    2. Her bir atriumu ayrı ayrı analiz edin.
      1. ROI'yı bozmadan ayarlama yaparken, atriyumları belirlemek için morfolojik operatörler kullanın15Her bir atriumu belirlemek için kontrast artırma algoritması kullanın.20,21.
      2. Atriyum dinamik sinyalini elde etmek için görüntü ikileştirme uygulayın ve kare başına sıfırdan farklı olan piksel sayısını nicelleştirin.
      3. Yüksek frekanslı gürültüyü ve perfüzyon damlama artefaktlarını bastırmak için elde edilen sinyallere 3 ile 100 Hz arasında 5. dereceden çift yönlü bir Butterworth filtresi uygulayın15.
      4. İki atriyal sinyalin ortalamasını hesaplayın (Şekil 3D).
    3. Atriyal kısalma sinyalini, her bir pacing için elde edilen tüm videolara göre normalize edin; kalp hızını ve gecikmeyi 9.3.5–9.3.6. adımlarında olduğu gibi hesaplayın.
      NOT: Atriyal döngü süresi (DAE), atriyal-atriyal aralık (IAT) ve atriyal amplitüd (AA) gibi parametreler elde edilir (Şekil 3D). Daha ayrıntılı bilgi için Ek Dosya 10'a bakınız.
  6. Elektro-mekanik bir analiz gerçekleştirin13,22 (Ek Dosya 8).
    1. stimülasyon verilerini atriyal ve ventriküler sinyallerle karşılaştırın (Şekil 3D).
    2. Kalp iletim sistemindeki yayılım süresini hesaplayarak atriyum ve ventrikül olayları arasındaki gecikmeyi elde edin (AVD), uygulanan uyaranı referans alarak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Kardiyak mekanik fonksiyon deneyleri, şurada gösterildiği gibi Langendorff aparatı kullanılarak gerçekleştirilir: Şekil 1A (Üst)İzleme ve optik sistemler, gösterildiği üzere aydınlatma kontrolü tetiklendiğinde video kaydına olanak tanır. Şekil 1A (Alt). Şekil 1C kalbin ortamdaki termal dalgalanmalardan ve ışıktan izole tutulması için tasarlanmış, termostatik kontrollü kabinin dış görünümünü gösterme...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Fare kalbi sıcaklık değişimlerine karşı oldukça hassastır2,9,10,11,22. Bu deneyde, perfüze edilen kalp dikey olarak konumlandırılmıştır. Langendorff perfüzyon yönteminde perfüzat sıcaklığı kaybını ve hareket artefaktlarını en aza indirmek için hafif bir modifikasyon ekledik. Perfüzat sıcaklığı kaybını 37 ± 0.5 °C düzeyinde minimize etmek için serpentin sistemi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Bilim, Beşeri Bilimler, Teknoloji ve İnovasyon Sekretaryası'nın (SECIHTI) LN-2025-C-23 numaralı hibesi tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL şırıngaBD Plastipak302485Cerrahi işlem
20 G iğneNIPROAH-2032Aort kanülü
8x-100x büyütmeli 25 mm ayarlanabilir lensGenericN/AOptik sistem kamera lensi; genel olarak ayarlanabilir kamera lensi olarak belirtilmiştir
27 G iğneBD PrecisionGlide302358Cerrahi işlem
3B tasarımlı destek parçalarıCINVESTAVN/AÖzel 3B tasarımlı destek parçaları
4-0 ipek sütürAMERICAN SUTURETGSN0901Aort kanülü
40-A güç kaynağıSTERENPRL-25LED güç kaynağı
Hava taşıN/AN/ATyrode çözeltisi oksijenasyonu
CaCl2 (2H2O)Sigma-AldrichC3306Tyrode çözeltisi
D-GlikozJ.T. Baker1916-01Tyrode çözeltisi
Drenaj pompasıCINVESTAVN/AÖzel drenaj pompası; genel olarak drenaj pompası olarak belirtilmiştir
F = 25,4 mm, plano-konveks lensTHORLABSLA1951-AOptik sistem aydınlatma lensi; genel olarak plano-konveks aydınlatma lensi olarak belirtilmiştir
Buzul asetik asitSigma-Aldrich695092Langendorff sistemi temizliği
HeparinPiSA060M91Antikoagülan
HEPESSigma-AldrichH3375Tyrode çözeltisi
Yüksek güçlü LED'lerLuminiusCBT-90-G-L11-C12LED ışık kaynağı
Aydınlatma sistemiCINVESTAVN/AÖzel aydınlatma sistemi; genel olarak aydınlatma sistemi olarak belirtilmiştir
KClCTR SCIENTIFICCTR02196Tyrode çözeltisi
LabVIEW yazılımı versiyon 2018NATIONAL INSTRUMENTSN/Aİzleme ve pacing uygulamasını çalıştırmak için kullanılan yazılım; genel olarak izleme ve pacing uygulaması olarak belirtilmiştir
MATLAB yazılımıThe MathWorksN/AVideo normalizasyon, segmentasyon ve analiz programları için hesaplama yazılımı; genel olarak hesaplama yazılımı olarak belirtilmiştir
Tıbbi sınıf oksijenGRUPO INFRAN/ATyrode çözeltisi oksijenasyonu
MgCl2 (6H2O)CTR SCIENTIFICCTR02104Tyrode çözeltisi
Değişken akışlı Mini-PompaCONTROL COMPANY3385Perfüzyon pompası
Fare Cerrahi SetiKent ScientificINSMOUSEKITCerrahi işlem
NaClSigma-AldrichS5886Tyrode çözeltisi
NaH2PO4DEQDEQF290400250Tyrode çözeltisi
NaOHCTR SCIENTIFICCTR03108pH ayarı
NI USB-6009NATIONAL INSTRUMENTS779026-01Veri toplama kartı
Platin elektrotlar, çap 0,25 mmSigma-Aldrich349402Elektriksel stimülasyon elektrotları
Güç kaynağı (12 V, 30 A)KarnickPTA-12V30AResirkülatör güç kaynağı
Basınç monitörüCINVESTAVN/AÖzel basınç monitörü; genel olarak basınç monitörü olarak belirtilmiştir
Basınç transdüseriLA BOUVETB17295Langendorff sistemi basınç monitörü
Saf etil alkolSigma-Aldrich493511Sistem temizliği için etanol
Resirkülasyonlu termal banyo (LXC)PolyScienceL113A0412Rezervuar resirkülatörü
Salin çözeltisiPiSA111848%0,9 sodyum klorür (NaCl) çözeltisi
Serpantin termal banyoCINVESTAVN/AÖzel serpantin resirkülatör/termal banyo
StereomikroskopN/AN/ACerrahi işlem
Stereomikroskop aydınlatmasıN/AN/ACerrahi işlem
uEye Cockpit yazılımıIDS Imaging Development System GmBHN/AKamera görüntüleme yazılımı; genel olarak kamera görüntüleme yazılımı olarak belirtilmiştir
UI-3360CP-NIR-GL Rev.2IDSAB00624Yüksek hızlı CMOS kamera; genel olarak CMOS kamera olarak belirtilmiştir
KsilazinPiSA4001211Anestezik
Zoletil 100Virbac83048907Tiletamin-zolepaze anestezik; genel olarak anestezik karışım olarak belirtilmiştir

Kaynaklar

  1. Guarina L et al. Biological noise is a key determinant of the reproducibility and adaptability of cardiac pacemaking and EC coupling. J Gen Physiol. 2022;154(9):e202012613.
  2. Peña-Romo A et al. Noise enhanced the electrical stimulation-contractile response coupling in isolated mouse heart. Int J Cardiol. 2016;221:155-60.
  3. Bychkov R et al. Synchronized cardiac impulses emerge from heterogeneous local calcium signals within and among cells of pacemaker tissue. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):907-31.
  4. Clancy CE, Santana LF. Evolving discovery of the origin of the heartbeat: a new perspective on sinus rhythm. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):932-4.
  5. Asamudo EU, Ng YH, Bers DM. Langendorff isolated heart perfusion model for functional studies in mice. In: Chandrasekera DNK, Katare R, editors. Cardiomyocytes: Methods and Protocols. Springer Nature; New York; 2025. p. 111-24.
  6. Louradour J et al. Simultaneous assessment of mechanical and electrical function in Langendorff-perfused ex vivo mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2023;10:1293032.
  7. Noly PE et al. Assessment of ex vivo murine biventricular function in a Langendorff model. J Vis Exp. 2022;(190):e64384.
  8. Beckett PR. The isolated perfused heart preparation: two suggested improvements. J Pharm Pharmacol. 1970;22(11):818-22.
  9. Ihara K et al. Electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping. J Vis Exp. 2018;(132):e56478.
  10. King DR, Hardin KM, Hoeker GS, Poelzing S. Reevaluating methods reporting practices to improve reproducibility: an analysis of methodological rigor for the Langendorff whole heart technique. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2022;323(3):H363-77.
  11. Lang D, Sulkin M, Lou Q, Efimov IR. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. 2011;(55):e3275.
  12. Liao R, Podesser BK, Lim CC. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(2):H156-67.
  13. Sung YL, Tsai YS, Chang CL, Hu YF. Protocol for high-resolution optical mapping of ex vivo rat heart for electrophysiological studies. STAR Protoc. 2025;6(2):103734.
  14. Lee P et al. Low-cost optical mapping systems for panoramic imaging of complex arrhythmias and drug-action in translational heart models. Sci Rep. 2017;7:43217.
  15. Laughner JI et al. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(7):H753-65.
  16. Hao X et al. TGF-β1-mediated fibrosis and ion channel remodeling are key mechanisms in producing the sinus node dysfunction associated with SCN5A deficiency and aging. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2011;4(3):398-406.
  17. Pizzo E et al. Heart rate variability reveals altered autonomic regulation in response to myocardial infarction in experimental animals. Front Cardiovasc Med. 2022;9:843144.
  18. Tayel MB, AlSaba EI. Poincaré plot for heart rate variability. Int J Biomed Biol Eng. 2015;9(9).
  19. Bazan C, Barba DT, Blomgren P, Paolini P. Image processing techniques for assessing contractility in isolated adult cardiac myocytes. Int J Biomed Imaging. 2009;2009:352954.
  20. Christoph J, Luther S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Front Physiol. 2018;9:1483.
  21. Lebert J, Ravi N, Kensah G, Christoph J. Real-time optical mapping of contracting cardiac tissues with GPU-accelerated numerical motion tracking. Front Cardiovasc Med. 2022;9:787627.
  22. Larsen TS et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflugers Arch. 1999;437:979-85.
  23. Vornanen M. Basic functional properties of the cardiac muscle of the common shrew (Sorex araneus) and some other small mammals. J Exp Biol. 1989;145:339-51.
  24. VanderBrink BA et al. Assessment of atrioventricular nodal physiology in the mouse. J Interv Card Electrophysiol. 1999;3(3):207-12.
  25. Shansky RM, Murphy AZ. Considering sex as a biological variable will require a global shift in science culture. Nat Neurosci. 2021;24(4):457-64.
  26. Shansky RM. Are hormones a “female problem” for animal research? Science. 2019;364(6443):825-6.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Langendorff Perf ze KalpFare Kalp ModeliOptik De erlendirmeAtriyal KontraktiliteVentrik ler KontraktiliteKalp H z l mY ksek z n rl kl G r nt lemeVentrik ler K salmaAtriyal DinamiklerKardiyak Mekanik

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.