Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Liuwei Dihuang Wan, NF-κB sinyalini baskılayarak osteoklastogenezi ve ovariektomi kaynaklı kemik kaybını inhibe eder

115 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/72270

⸱

28 Temmuz 2026

 ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Nankai University, 2School of Basic Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 3Emergency Medical Center, Ningbo Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, 4The Second People's Hospital of Changzhou, the Third Affiliated Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, Liuwei Dihuang Wan (LWDHW) osteoklastın farklılaşmasını ve yumurtalıktomi kaynaklı kemik kaybını, LC-MS/MS analizi, ağ farmakolojisi ve in vivo ile in vitro doğrulama yoluyla NF-κB sinyal yolunu inhibe ederek baskıladığını göstermiştir.

Özet

Liuwei Dihuang Wan (LWDHW), klasik geleneksel Çin tıbbı formülü olup, böbrek eksikliğiyle ilişkili çeşitli hastalıkların tedavisinde yaygın olarak kullanılır ve menopoz sonrası osteoporozda (PMOP) tatmin edici klinik etkinlik göstermiştir. Ancak, farmakolojik mekanizmaları hâlâ net değildir. Bunu çözmek için, önce LWDHW'nin kimyasal bileşenlerini LC-MS/MS kullanarak analiz ettik ve 1.615 bileşen tespit ettik. Ağ farmakolojisi, iltihap ve NF-κB sinyal yolunun LWDHW'nin PMOP üzerindeki etkilerinin altında yatan potansiyel terapötik mekanizmalar olduğunu öngördü. Daha sonra, 27 dişi C57BL/6J fare rastgele olarak Sham, Model ve LWDHW gruplarına atandı. Son iki gruptaki fareler çift taraflı ovariektomi (OVX) geçirdi ve LWDHW grubundakiler 8 hafta boyunca günde 9,75 g/kg oranında oral LWDHW aldı. Serum ve femur örnekleri Enzim Bağlantılı İmmünosorbent Testi (ELISA), Mikro-Bilgisayarlı Tomografi (μCT), histolojik muayene ve immünohistokimya (IHC) için toplandı. Birincil kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMM) LWDHW ile tedavi edilip, ardından TRAP boyama ve qRT-PCR uygulandı. OVX farelerinde LWDHW, kemik kaybını ve kemik mikromimarisinin bozulmasını önemli ölçüde hafifletti; bu durum serum β-CTX seviyelerinin azalması ve femoral dokularda osteoklast sayılarının azalmasıyla birlikte gerçekleşti. IHC boyama, LWDHW ile tedavi edilen farelerin femoral dokularında model grubuna kıyasla TNF-α, IL-1β ve p-P65'in belirgin şekilde daha düşük ekspresyonu ortaya koydu. In vitro TRAP boyama, LWDHW'nin RANKL/M-CSF kaynaklı osteoklast farklılaşmasını inhibe ettiğini ve Ctsk, MMP9 ve Nfatc1 ekspresyonunu azalttığını göstermiştir. Western blot analizi, LWDHW tedavisi sonrası BMM'lerde P65, p-P65, IκBα ve p-IκBα protein seviyelerinin anlamlı şekilde azaldığını gösterdi. Toplu olarak, LWDHW menopoz sonrası osteoporozu hafifleder; muhtemelen NF-κB sinyal aracılı osteoklastogenezi baskılayarak gerçekleşir.

Giriş

Menopoz sonrası osteoporoz (PMOP), kemik kütlesi kaybı ve kemik mikromimarisinin bozulmasıyla karakterize edilen yaygın bir metabolik kemikhastalığıdır 1. Yaşlanan nüfusun artmasıyla birlikte, PMOP sıklığı küresel bir halk sağlığı sorunu haline geldi ve menopoz sonrası kadınların sağlığını ciddi şekilde tehditediyor 2. Çin'de ise PMOP'un genel yaygınlığı %32,1'e kadar çıkmaktadır3. Etkilenen bireyler, kronik sırt ağrısı, omurga deformiteleri ve kırılganlık kırıkları gibi ciddi komplikasyonlara daha yatkın 4,5. Şu anda osteoporoz için FDA onaylı ilaçlar arasında klinik uygulamada yaygın olarak kullanılan bisfosfonatlar6, paratiroid hormonu67 ve denosumab8 bulunmaktadır. Ancak, uzun vadeli uygulamaları genellikle çeşitli yan etkilerlesınırlıdır 9. Bu nedenle, PMOP için daha güvenli ve etkili terapötik ajanların geliştirilmesine acil bir ihtiyaç vardır. Potansiyel alternatifler arasında, Çin bitkisel ilaçları, bilinen etkinlikleri ve olumlu güvenlik profilleri nedeniyle giderek daha fazla ilgi gördü10.

Liuwei Dihuang Wan (LWDHW), geleneksel Çin tıbbında (TCM) klasik bir formüldür ve ilk olarak Song Hanedanı döneminde Çocuk Hastalıklarının Tedavi Yöntemi adlı eski metinde belgelenmiştir. Binlerce yıldır LWDHW, böbrek eksikliğine atfedilen çeşitli hastalıkların tedavisinde klinikuygulamada yaygın olarak kullanılmaktadır 11,12,13,14. TCM'nin "böbrek kemiklerini yöneten" teorisine göre, PMOP hastalarında kemik kütle kaybı ve kemik bozulması öncelikle böbrek esansından yetersiz beslenmeden kaynaklanır. 15. Sonuç olarak, LWDHW PMOP'un klinik yönetiminde yaygın olarak kullanılır ve kesin terapötik etkinlikgöstermiştir 16,17. Ancak, hayvan ve klinik çalışmalar LWDHW'ninantioksidatif 18, anti-inflamatuar19 ve antifibrotikaktiviteler 14 dahil olmak üzere birden fazla farmakolojik etki uyguladığını ortaya koymuş olsa da, PMOP'a karşı temel mekanizması büyük ölçüde bilinmemektedir.

Kemik homeostazı, osteoklastların kemik rezorbsiyonu ile osteoblastların kemik oluşumu arasındaki dengeyedayanır 20. Bu denge, osteoklastların farklılaşması ve aktivitesinin inflamatuar koşullarda artmasıyla bozulur ve bu da kemik rezorpsiyonunun hızlanmasınayol açar 21. Bu süreçte, NF-κB yolu çekirdek düzenleyici olarak hizmet verir. TNF-α ve IL-1β gibi inflamatuar faktörler, fosforilasyonu ve IκBα'nin parçalanmasını indükleyebilir, bu da fosforile p65'in (p-P65)22'nin nükleer translokasyonunu tetikleyebilir. Sonuç olarak, Ctsk, Mmp9 ve Nfatc1 dahil olmak üzere aşağı akım osteoklast-spesifik genler, osteoklastogeneziteşvik etmek için aktive edilir 23,24.

Ağ farmakolojisi, bilgisayar bilimi, farmakoloji ve biyoinformatiği bütünleyen disiplinlerarası biralandır 25. Çin bitkilerinin terapötik etkilerinin altında yatan farmakolojik mekanizmaları kapsamlı şekilde incelemede belirgin avantajlar gösterir26. Mevcut çalışmada, LWDHW'nin anti-osteoporotik etkilerinde rol alan potansiyel biyolojik süreçler ve sinyal yollarını tahmin etmek için ağ farmakolojisi kullanılmıştır. Aynı zamanda, LWDHW'nin kimyasal bileşenleri LC-MS/MS kullanılarak analiz edildi. Ayrıca, OVX fare modeli kullanılarak in vivo doğrulama ve primer kemik iliği kaynaklı makrofajlarla (BMM) in vitro deneyler yapılarak LWDHW'nin PMOP'a karşı farmakolojik mekanizmasını daha fazla araştırdı. İş akışı Şekil 1'de sunulmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi (IACUC-202402-07) tarafından onaylandı.

LWDHW'nin Hazırlanması ve LC-MS/MS analizi

LWDHW formülü altı Çin bitkisinden oluşur: Rehmannia glutinosa (Gaertn.), Cornus officinalis (Sieb.), Paeonia suffruticosa (Andr.), Dioscoreae opposite (Thunb.), Poria cocos (Schw.) ve Alisma orientale (Sam.). Bu bitkiler hakkında ayrıntılı bilgiler Tablo 1'de yer almaktadır. Tüm çiğ otlar, Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi'nin (Hangzhou, Çin) Birinci Bağlı Hastanesi tarafından sağlanmış ve 0,1 kg/L ot-su oranında saflaştırılmış suda kaynatılmıştır. Ortaya çıkan sulu ekstrakt, sonraki LC-MS/MS analizleri ve hayvan deneyleri için 0,5 g/mL ile çalışan bir çözeltiye olarak filtrelenerek konsantre edildi. Ayrıca, çalışan çözelti hücre deneyleri için dondurulmuş toza dönüştürüldü.

LC-MS/MS analizinde sıvı kromatografi koşulları şöyleydi: Mobil faz A (sulu) ve mobil faz B (organik), pozitif iyon modu için sırasıyla suda %0,1 formik asit ve asetonitril, negatif iyon modu için ise sırasıyla 5 mM amonyum formatı ve asetonitril içeriyordu. Toplam çalışma süresi 8 dakika idi; akış hızı 0,3 mL/d, sütun sıcaklığı 40 °C ve enjeksiyon hacmi 2 μL'ydi. Kütle spektrometrisi için, veri tam MS-ddMS2 modunda alındı; püskürtme voltajları +3.50 kV (pozitif) ve –2.50 kV (negatif) olarak ayarlandı.

Biyoaktif bileşenler ve hedefler LWDHW tahmini

Altı bileşen bitkinin bireysel isimleri, LWDHW için tam içerik listesini elde etmek amacıyla Geleneksel Çin Tıp Sistemi Farmakolojisi (TCMSP) veritabanına girildi. Biyoaktif bileşenler, daha sonra oral biyoerişilebilirlik (OB) ≥ %30 ve ilaç benzerliği (DL) ≥ 0,18 27,28,29,30 farmakokinetik parametreleri kullanılarak tarandı. Biyoaktif bileşenlerin ilgili proteinleri tanımlandı ve LWDHW'nin son gen hedefleri olarak tanımlanan standartlaştırılmış gen isimlerini almak üzere UniProt'a gönderildi.

LWDHW ve PMOP arasında örtüşen hedefler

PMOP ile ilişkili gen hedefleri, 2 Ekim 2024'te hem GeneCards hem de DisGeNET veritabanlarında "postmenopozal osteoporoz" anahtar kelimesi aramasıyla elde edildi. Hedefler, DisGeNET'te >0.1 ve GeneCards'ta >10 puan eşikleri kullanılarak filtrelendi ve tekrarlanan girişler çıkarılarak PMOP ile ilgili genlerden oluşan tekrarsız bir set elde edildi. Daha sonra, LWDHW'nin bitki kökeni hedefleri ve PMOP ile ilişkili hedefler, LWDHW ile PMOP arasındaki örtüşen hedefleri gösteren bir Venn diyagramı oluşturmak üzere Venny çevrimiçi aracına aktarıldı.

Gen Ontolojisi (GO) ve sinyal yolu zenginleştirme analizi

LWDHW ve PMOP arasındaki örtüşen hedefler, DAVID veritabanı kullanılarak GO zenginleştirme analizine tabi tutuldu. Alınan GO terimleri hücresel bileşen, moleküler fonksiyon ve biyolojik süreç (BP) dahil olmak üzere üç kategoriye ayrılmıştır. FDR < 0.01 filtrelendikten sonra, ilk 30 BP terimi, katlama zenginleştirme sırasına göre azalan bir balon diyagramında listelenmiştir.

Daha sonra, örtüşen hedefler Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) ve Metascape veritabanlarına sinyal yolu zenginleştirme analizi için girildi. KEGG ve Metascape veritabanlarından zenginleştirilmiş yollar, karşılık gelen hedeflerin sayısına göre azalan sırayla sıralandı ve her veritabanından en iyi 25 yol çubuk grafik olarak gösterildi.

Ağ inşaatı

"Formül-Bitkiler-Bileşenler-Hedefler-Hastalık" ve "Hedefler-Yollar" ağları Cytoscape'de bileşenler arasındaki karşılıklı ilişkileri görselleştirmek için oluşturulmuştur. Örtüşen hedeflerin STRING veritabanına girilmesi ile protein-protein etkileşimi (PPI) ağı oluşturuldu. Ağ içindeki merkez hedefleri, derecenin merkeziliği (DC), aralık merkeziliği (BC) ve yakınlık merkeziliği (CC) gibi topolojik özelliklere dayalı tarama ile belirlendi.

Hayvan gruplaması, OVX kaynaklı osteoporoz modeli ve ilaç müdahalesi

Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi (Hangzhou, Zhejiang) Hayvan Deney Merkezi tarafından toplam 27 dişi C57BL/6J fare (2 aylık, 22 ± 2 g ağırlığında) temin edildi. Tüm hayvanlar, belirli patojensiz (SPF) koşullarda, 12 saat ışık/karanlık döngüsü, ortam sıcaklığı 25 °C ve nemin %40 ile %60 arasında tutulması ile serbest yiyecek ve suya erişim sağlandı. 1 haftalık adaptif beslenmenin ardından, fareler rastgele bir sayı tablosu kullanılarak üç gruba (n = 9) ayrıldı: Sham, Model ve LWDHW. Model ve LWDHW gruplarındaki fareler PMOP modelini oluşturmak için çift taraflı ovariektomi (OVX) geçirdi, Sham grubu ise eşdeğer miktarda periovarian yağ dokusunun rezeksiyonunu içeren sahte bir işlem geçirdi. Ameliyattan iki gün sonra, LWDHW grubundaki farelere günlük oral dozda LWDHW çalışma solüsyesi 9,75 g/kg dozda (vücut yüzey alanına göre insan eşdeğer dozundan dönüştürülmüş) verildi; Model ve Sham grupları ise eşit miktarda salin aldı. Serum ve femoral dokular dahil biyolojik örnekler, uygulamadan 8 hafta sonra sonraki analiz için toplandı. Deneysel dönem boyunca hiçbir grupta beklenmedik ölüm veya ölüm yaşanmadı.

Serum enzim bağlantılı immünosorbent testi (ELISA)

Retro-orbital pleksustan tam kan toplandı ve 1000 x g g'de 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjlenerek serum elde edildi. Serum osteokalsin (OCN) ve tip I kollajen (β-CTX) β-C-terminal telopeptidi konsantrasyonları, üreticinin protokollerine göre ilgili ELISA kitleri kullanılarak ölçüldü.

μCT ve biyomekanik analiz

Femoral örnekler, yüksek çözünürlüklü mikro-bilgisayarlı tomografi (μCT) cihazı kullanılarak 10 μm izotropik çözünürlükte tarandı. Distal femurun üç boyutlu (3D) mikroyapısı, NRecon yazılımı kullanılarak alınan görüntülerden yeniden oluşturuldu. Daha sonra, kemik mineral yoğunluğu (BMD, g/mm 3), kemik hacmi fraksiyonu (BV/TV, %), trabeküler kalınlık (Tb.Th, mm) ve trabeküler sayı (Tb.N, 1/mm) dahil olmak üzere aşağıdaki kemik mikromimarisi parametreleri, distal femurun ilgi alanındaki (ROI) içinde nicelendirilmiştir.

Femoral örneklerin biyomekanik özellikleri (grup başına n = 3), Eksenel Torsiyon Yorgunluk Test Sistemi kullanılarak üç noktalı bir bükülme testi ile değerlendirildi. Yapısal arızaya kadar 2 mm/dakika sabit bir yer değiştirme hızıyla orta diafize sıkıştırıcı yük uygulandı. Maksimum yük (N) sistemin yazılımı tarafından otomatik olarak kaydedildi.

Histomorfoloji, immünohistokimya (IHC) ve immünoflüoresans (IF) boyama

%4 paraformaldehit ile fiksasyon, %14 EDTA çözeltisinde kalsifikasyon ve derecelendirilmiş etanol serisi ile dehidrasyon sonrası, femoral örnekler daha önce tarif edildiği gibi 3 μm kalınlığında parafin kesitlerineişlenmiştir 31. Kesitler morfolojik değerlendirme için Alcian Blue Hematoxylin (ABH)/Orange G ile boyandı. Distal femoral metafizdeki trabeküler kemik alanının nicel analizi OsteoMetrics yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi.

Karaciğer ve böbrek örnekleri sabitlendi, parafine gömüldü ve 4 μm kesitlere ayrıldı. Rutin deparafinizasyon ve rehidrasyondan sonra bölümler hematoksilin ve eosin ile boyandı. Histolojik inceleme ışık mikroskobu altında yapıldı.

IHC ve IF testleri, parafinli kesitlerde belirlenmiş prosedürlere göre gerçekleştirildi. Kısa süreliğine, antijen geri kazanımı 0,01 M sitrat tamponunda 60 °C'de 4 saat boyunca kuluçka kesitleriyle gerçekleştirildi. Bölümler daha sonra ALP (1:300), IL-1β (1:500), TNF-α (1:500) ve p-P65 (1:300) gibi birincil antikorlarla gece boyunca 4 °C'de kuluçka edildi. İlgili ikincil antikorlarla 20 dakika kuluçka yaptıktan sonra, bölümler IHC için diaminobenzidin (DAB) çözeltisi ve hematoksilin karşı boyama ile tabi tutuldu veya IF'de nükleer etiketleme için DAPI ile boyandı. Pozitif boyama niceliği için, her örnek için üç doku kesitinden her biri için rastgele seçilmiş dört alan alındı. IHC boyamasında ortalama optik yoğunluk, entegre optik yoğunluğun (IOD) ilgili boşluk alanına oranı olarak tanımlanmıştır ve Image-Pro Plus yazılımı kullanılarak belirlenmiştir. IF boyamasında pozitif boyama alanı alan alanına normalleştirilmiş ve yüzde olarak ifade edilmiştir; nicel ise aynı yazılımla gerçekleştirilmiştir.

Birincil kemik iliği makrofajları (BMM) kültürü ve hücre sayımı testi

2 aylık C57BL/6 farelerinin kemik iliği hücreleri, fosfatla tamponlu tuzlu su (PBS) ile femur ve tibiae'lerden temizlendi. Ortaya çıkan hücre süspansiyonu 70 μm süzgeçten geçirildi ve 200 x g hassasiyetinde 5 dakika boyunca santrifüjlendi. Hücre peleti, %10 fetal sığır serumu içeren α-MEM tam ortamda yeniden süspansiyona getirildi. %5 CO₂ atmosferinde 37 °C sıcaklıkta 24 saat kuluçka sonrası yapışmayan hücreler çıkarıldı. Makrofaj farklılaşmasını sağlamak için, yapışkan hücreler, 50 ng/mL makrofaj koloni uyarıcı faktörü (M-CSF) ve 40 ng/mL RANKL içeren ortamda 5–7 gün boyunca kültürlendi, olgun BMM'ler gözlemlenene kadar.

BMM'ler, 96 kuyruklu plakalarda 3 x 104 hücre/kuyu olarak kaplanmıştı. LWDHW gradyan konsantrasyonlarıyla 24 saat tedavi sonrası, BMM'ler %10 Hücre Sayma Kiti (CCK-8) çalışma solüsyesi ile 37 °C'de 1 saat kuluçka edildi. Her kuyunun emilimi mikroplaka okuyucu kullanılarak 450 nm olarak ölçüldü.

Birincil BMM'lerde nicel gen ifade analizi

BMM'ler, her tabak başına 3 x 106 hücre yoğunluğunda 6 cm büyüklüğünde çanaklara tohumlanıyordu. 500 ve 1.000 μg/mL LWDHW ile 24 saat işlem yaptıktan sonra, üreticinin talimatlarına göre RNA-Hızlı Arıtma Kiti kullanılarak BMM'lerden toplam RNA çıkarıldı. Spektrofotometri ile nicelendirildikten sonra, toplam 500 ng RNA tersi olarak cDNA'ya transkribe edildi. Nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) gen spesifik primerler kullanılarak gerçekleştirildi (Tablo 2) ve PCR döngüsü koşulları şöyleydi: 30 saniye boyunca 95 °C'de başlangıç denatürasyonu, ardından 5 saniye boyunca 95 °C ve 30 saniye 60 °C 40 döngü. Gen ifade seviyeleri, DAHILI referans gen olarak GAPDH ile 2ΔΔCt yöntemiyle analiz edildi.

Western blot analizi birincil BMM'lerde

6 cm kaplarda her tabak başına 3 x 106 hücre olarak kaplamadan sonra BMM'ler çeşitli müdahalelerle tedavi edildi ve ardından RIPA liz tamponu ile buz üzerinde lizon edildi. Toplam protein toplandı ve BCA Protein Analiz Kiti ile nicelendirildi. Protein örnekleri (şerit başına 30 μg) %12,5 poliakrilamid jel üzerinde SDS-PAGE ile ayrılarak 0,2 μm PVDF membranlarına aktarıldı. 20 dakika bloklamadan sonra, zarlar gece boyunca 4 °C'de aşağıdaki birincil antikorlarla inkübe edildi: P65 (1:1000), p-P65 (1:1000), IκBα (1:1000), p-IκBα (1:1000) ve β-aktin (1:1000). Ertesi gün, zarlar oda sıcaklığında 1 saat boyunca ikincil antikorla kuluçka edildi. Protein bantları, ECL Kemimilüminesans Tespit Kiti kullanılarak görselleştirildi ve Otomatik Kemimilüminesans Görüntü Analiz Sistemi ile yakalandı.

TRAP ile femoral dokuların ve BMM'lerin boyama

Femoral doku kesitleri ve BMM'ler, 24 delikli plakalarda 1 x 105 hücre/kuyu ölçüsünde kaplama, üreticinin protokolüne uygun olarak Tartrat Dirençli Asit Fosfataz (TRAP) boyama kiti kullanılarak boyandı. Doku kesitlerindeki osteoklastla kaplı trabeküler kemik yüzeyi (Oc.S/BS) ve BMM kültürlerindeki osteoklast oluşum alanı, Image-Pro Plus yazılımı kullanılarak nicelendirilmiştir.

İstatistiksel analiz

Tüm veriler ortalama ± standart sapma olarak sunuldu. SPSS'de istatistiksel analiz için tek yönlü ANOVA ve ardından Dunnett testi kullanıldı. *p < 0.05 ve **p < 0.01 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

LWDHW'nin kimyasal bileşenleri LC-MS/MS ile analiz edildi

LWDHW sulu çözeltinin kimyasal profili, LC-MS/MS analiziyle karakterize edilmiştir. Toplam 1615 bileşen tanımlandı; bunların 968'i pozitif iyonizasyon modunda, 647'si negatif iyonizasyon modunda tespit edildi (Şekil 2A). Her iyonizasyon modundan en iyi 10 bileşenin detayları Şekil 2B,C'de listelenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Küresel nüfusun yaşlanmasıyla birlikte, PMOP her yıl milyonlarca kadını etkileyen ciddi bir sağlık sorunu halinegeldi 36. Mevcut anti-osteoporotik ilaçların yan etkileri göz önüne alındığında, daha güvenli ve etkili tedavi stratejileri geliştirmek zorunludur. LWDHW, TCM'de klasik bir böbrek tonlaştırıcı formüldür ve çeşitli kemik hastalıklarının tedavisinde alternatif bir tıp olarak hizmeteder 37,38. Klini...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Tüm yazarlar rekabet eden finansal veya finansal olmayan çıkarlar belirtmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (ZCLQN25H2701) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.01 M sitrat tamponuSolarbioC1010IHC ve IF boyama için femoral kesitlerin antijen geri kazanımı için Protokol Adım 10
0.2 μm PVDF membranlarBioRad1620177SDS-PAGE'den membranlara protein elektrotransferi için Protokol Adım 13
12.5% poliakrilamid jelleriEpizyme BiotechPG113SDS-PAGE ile protein ayrımı için Protokol Adım 13
ALP antikoruARIGOARG57422Protokol Adım 10'da femoral kesitlerde IHC tespiti için
Otomatik Kimyalüminesans Görüntü Analiz SistemiTanon5200Protokol Adım 13'te Western blot bant görselleştirmesi için
Aksiyel-Torsiyonel Yorulma Test SistemiInstronmodel 5569R1412Protokol Adım 9'da femoral örneklerin biyomekanik testi için
BCA Protein Assay KitiBeyotimeP0010SWestern blot öncesi protein niceliği için Protokol Adım 13
CCK-8BeyotimeC0039Protokol Adım 11'de BMM'lerin hücre canlılığı ölçümü için
CytoscapeUygulanmazUygulanmazVersiyon 3.8.0
DAVID veritabanıUygulanmazUygulanmazVersiyon 6.8; https://david.ncifcrf.gov/home.jsp
DisGeNET veritabanıUygulanmazUygulanmazhttps://www.disgenet.org/
ECL Kimyalüminesans Tespit KitiVazymeE411-04Protokol Adım 13'te Western blot sinyallerinin kimyalüminesan tespiti için
OCN ELISA kitiMEIMIANMM-0551M1Protokol Adım 8'de serum osteokalsin seviyelerinin ölçümü için
β-CTX ELISA kitiMEIMIANMM-44858M1Protokol Adım 8'de serum β-CTX seviyelerinin ölçümü için
GeneCards veritabanıUygulanmazUygulanmazhttps://www.genecards.org/
Green Premix Ex Taq II FASTTakaraCN830AProtokol Adım 12'de qRT-PCR amplifikasyonu için
Yüksek çözünürlüklü mikro bilgisayarlı tomografi (μCT) ekipmanlarıBrukerSkyscan 1176Protokol Adım 9'da femoral kemik mikro yapısının yüksek çözünürlüklü μCT görüntülenmesi için
IL-1β antikoruBIOSSbs6319RProtokol Adım 10'da femoral kesitlerde IHC tespiti için
IκBαantikoruCST4812Protokol Adım 13'te Western blot tespiti için
Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) veritabanıUygulanmazUygulanmazhttps://www.kegg.jp/
M-CSFAMIZONAAMK1001-S1Protokol Adım 11'de BMM'lerin farklılaşmasının indüksiyonu için
Metascape veritabanıUygulanmazUygulanmazhttps://metascape.org/
Orbitrap Exploris 120Thermo Fisher ScientificBRE725531Protokol Adım 2'de LWDHW için LC-MS/MS analizi için
P65 antikoruCST8242Protokol Adım 13'te Western blot tespiti için
p-IκBα antikoruCST2859Protokol Adım 13'te Western blot tespiti için
p-P65 antikoruCST3033SProtokol Adım 13'te Western blot tespiti için
p-P65 antikoruSuzhou RuiyingRLP0187Protokol Adım 10'da femoral kesitlerde IHC tespiti için
PrimeScript RT Reaktanı KitiTakaraRR047ABMM'ler için toplam RNA'nın qRT-PCR analizi için ters transkripsiyonu için Protokol Adım 12
QuantStudio 5 sistemiApplied BiosystemsA28573Protokol Adım 12'de osteoklast belirteç genlerinin qRT-PCR analizi için
RANKLAMIZONAAMK1001-S1Protokol Adım 11'de BMM'lerin farklılaşmasının indüksiyonu için
RIPA lizis tamponuEpizyme BiotechPC101Protokol Adım 13'te BMM'lerden toplam protein ekstraksiyonu için
RNA-Quick Saflaştırma KitiTransGen BiotechER501-01-V2Protokol Adım 12'de BMM'lerden toplam RNA ekstraksiyonu için
SPSS yazılımıIBMversiyon 26Protokol Adım 15'te deneysel verilerin istatistiksel analizi için
STRING veritabanıUygulanmazUygulanmazhttps://string-db.org/
Tartrat Dirençli Asit Fosfataz (TRAP) boyama kitiAMIZONAAMK1001-S1Protokol Adım 14'te osteoklastların tanımlanması ve nicelliği için TRAP boyaması için
Thermo Vanquish UPLC sistemiThermo Fisher ScientificTSLC-002Protokol Adım 2'de LWDHW için LC-MS/MS analizi için
TNF-αantikoruSuzhou RuiyingRLM3472Protokol Adım 10'da femoral kesitlerde IHC tespiti için
Geleneksel Çin Tıbbı Sistemi Farmakolojisi (TCMSP) veritabanıUygulanmazUygulanmazhttp://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php
UniProt veritabanıUygulanmazUygulanmazhttps://www.uniprot.org/
UPLC KolonWatersACQUITY HSS T3Protokol Adım 2'de LWDHW için LC-MS/MS analizi için
Venny online aracıUygulanmazUygulanmazhttps://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html
β-aktin antikoruAbcam

Kaynaklar

  1. Liang H, et al. Global epidemiology and burden of osteoporosis among postmenopausal women: insights from the Global Burden of Disease Study 2021. NPJ Aging. 2025;11(1):78.
  2. Yi YT, Zhao HF, Wang WZ, Li X. Osteosarcopenia: epidemiology, molecular mechanisms, and management. Front Endocrinol (Lausanne). 2025;16:1577758.
  3. Wang J, et al. The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis. Front Public Health. 2023;11:1084005.
  4. Peris P, et al. Effect of gender on the evolution of pain and quality of life after treatment of symptomatic vertebral fragility fractures. Osteoporos Int. 2024;35(3):515-21.
  5. McClung MR. Sequential and long-term therapy for osteoporosis. Curr Osteoporos Rep. 2025;23(1):15.
  6. Tamechika S, Ohmura S, Maeda S, Naniwa T. Efficacy of denosumab on bisphosphonate-treated osteoporosis and osteopenia in systemic rheumatic disease patients receiving glucocorticoids. J Bone Miner Metab. 2023;41(2):203-11.
  7. Fuggle N, et al. Parathyroid hormone receptor agonists in the management of osteoporosis. Nat Rev Rheumatol. 2025;21(10):599-611.
  8. Curtis JR, et al. Comparative effectiveness of denosumab vs alendronate among postmenopausal women with osteoporosis. J Bone Miner Res. 2024;39(7):826-34.
  9. Thomasius F, et al. Clinical practice guideline: the diagnosis and treatment of osteoporosis. Dtsch Arztebl Int. 2025;122(1):12-18.
  10. Tan M, Li Q, Yang B, Wang S, Chen Z. Insight of Chinese herbal medicine in treating osteoporosis: achievements from 2013 to 2023. Am J Chin Med. 2024;52(5):1303-28.
  11. Qiu Z, et al. Liuwei Dihuang Pills alleviate the polycystic ovary syndrome with improved insulin sensitivity through PI3K/Akt signaling pathway. J Ethnopharmacol. 2020;250:111965.
  12. Zheng W, Wang G, Zhang Z, Wang Z, Ma K. Research progress on classical traditional Chinese medicine formula Liuwei Dihuang pills in the treatment of type 2 diabetes. Biomed Pharmacother. 2020;121:109564.
  13. Song J, et al. Liuwei Dihuang improved cognitive functions in SAMP8 mice by inhibiting COX-2 expression and subsequent neuroinflammation. J Ethnopharmacol. 2022;296:115491.
  14. Wang H, et al. Liu Wei Di Huang Decoction alleviates renal fibrosis by inhibiting endothelial mesenchymal transitions via upregulating Sirt1 expression and inhibiting the Wnt/β-catenin signaling pathway. Drug Des Devel Ther. 2025;19:6587-603.
  15. Zhou Z, et al. Transcriptional sequencing analysis reveals the potential use of deer antler for "tonifying the kidney and strengthening bone". J Orthop Surg Res. 2022;17(1):419.
  16. Liu Y, et al. Liuwei Dihuang Decoction for primary osteoporosis: a protocol for a systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2019;98(16):e15282.
  17. Long Z, et al. Research on the mechanism of Liuwei Dihuang Decoction for osteoporosis based on systematic biological strategies. Evid Based Complement Alternat Med. 2022;2022:7017610.
  18. Liu B, et al. Liuwei Dihuang Decoction alleviates cognitive dysfunction in mice with D-galactose-induced aging by regulating lipid metabolism and oxidative stress via the microbiota-gut-brain axis. Front Neurosci. 2022;16:949298.
  19. Perry B, Zhang J, Saleh T, Wang Y. Liuwei Dihuang, a traditional Chinese herbal formula, suppresses chronic inflammation and oxidative stress in obese rats. J Integr Med. 2014;12(5):447-54.
  20. Wang L, You X, Zhang L, Zhang C, Zou W. Mechanical regulation of bone remodeling. Bone Res. 2022;10(1):16.
  21. Luo J, et al. Oxidative stress and inflammation: roles in osteoporosis. Front Immunol. 2025;16:1611932.
  22. Jing R, et al. Toll-like receptor 7 promotes periodontal inflammation and alveolar bone resorption through the NF-κB signaling pathway. J Periodontal Res. 2025;60(8):823-34.
  23. Tao H, et al. Urolithin A suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis and postmenopausal osteoporosis by suppressing inflammation and downstream NF-κB-activated pyroptosis pathways. Pharmacol Res. 2021;174:105967.
  24. Xue C, et al. Aconine attenuates osteoclast-mediated bone resorption and ferroptosis to improve osteoporosis via inhibiting NF-κB signaling. Front Endocrinol (Lausanne). 2023;14:1234563.
  25. Zhang P, et al. Network pharmacology: towards the artificial intelligence-based precision traditional Chinese medicine. Brief Bioinform. 2023;25(1).
  26. Zhao L, et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 2023;309:116306.
  27. Xia C, Zhu H, Li J, Jin H, Fu D. Network pharmacology-based mechanism prediction and pharmacological validation of Bushenhuoxue formula attenuating postmenopausal osteoporosis in ovariectomized mice. J Orthop Surg Res. 2023;18(1):200.
  28. Gu Y, et al. Exploring the efficacious constituents and underlying mechanisms of Sini Decoction for sepsis treatment through network pharmacology and multi-omics. Phytomedicine. 2024;123:155212.
  29. Tian M, Wang K, Chen D. Efficacy and mechanisms of Xiangsha Liujunzi Decoction for gastroesophageal reflux disease: a study integrating meta-analysis, network pharmacology and molecular docking. Phytomedicine. 2026;151:157766.
  30. Ma Y, et al. Multi-omics and experimental validation reveal the mechanism of Danxia Tiaoban Decoction in treating atherosclerosis. Phytomedicine. 2025;147:157216.
  31. Xia C, et al. β-catenin inhibition disrupts the homeostasis of osteogenic/adipogenic differentiation leading to the development of glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head. Elife. 2024;12.
  32. He Q, et al. Amlexanox enforces osteogenic differentiation and bone homeostasis through inhibiting ubiquitin-dependent degradation of β-catenin. Int J Biol Sci. 2024;20(13):5254-71.
  33. Feng X, et al. CX3CL1 promotes M1 macrophage polarization and osteoclast differentiation through NF-κB signaling pathway in ankylosing spondylitis in vitro. J Transl Med. 2023;21(1):573.
  34. Wang X, et al. Isoliquiritigenin alleviates periodontitis by suppressing inflammation via NF-κB signaling pathway of immune cell. J Inflamm Res. 2025;18:6133-48.
  35. Guo Q, et al. NF-κB in biology and targeted therapy: new insights and translational implications. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):53.
  36. Walker MD, Shane E. Postmenopausal osteoporosis. N Engl J Med. 2023;389(21):1979-91.
  37. Liang B, et al. Liuwei Dihuang pills attenuate ovariectomy-induced bone loss by alleviating bone marrow mesenchymal stem cell senescence via the Yes-associated protein-autophagy axis. Pharm Biol. 2024;62(1):42-52.
  38. Liu MM, et al. Therapeutic potential of Liuwei Dihuang pill against KDM7A and Wnt/β-catenin signaling pathway in diabetic nephropathy-related osteoporosis. Biosci Rep. 2020;40(9).
  39. Xie Y, et al. Clinical practice guideline for postmenopausal osteoporosis with traditional Chinese medicine. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2021;46(22):5992-8.
  40. Li YQ, et al. Astragaloside IV modulates oxidative stress and osteoimmune-Wnt signaling in ovariectomized rats: an integrated study of RNA sequencing, molecular docking, and experimental validation. Front Nutr. 2026;13:1785452.
  41. Zhao J, et al. Yishen Qianggu Mixture formulation suppresses osteometabolic inflammation by modulating the IL-17/NF-κB/MAPK signaling axis. J Ethnopharmacol. 2026;358:121011.
  42. Chen C, et al. Hydrolyzed egg yolk peptide prevented osteoporosis by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway in ovariectomized rats. Sci Rep. 2024;14(1):10227.
  43. Yang Y, et al. Nrf2 mitigates RANKL and M-CSF induced osteoclast differentiation via ROS-dependent mechanisms. Antioxidants (Basel). 2023;12(12).
  44. Wang Y, et al. Xian Huang Fang inhibits the PKCδ/MAPK signaling pathway to attenuate renal tubular epithelial cell senescence and thereby delay renal interstitial fibrosis. Drug Des Devel Ther. 2025;19:6991-7004.
  45. Niu MY, et al. Fanlian Huazhuo Formula alleviates high-fat diet-induced non-alcoholic fatty liver disease by modulating autophagy and lipid synthesis signaling pathway. World J Gastroenterol. 2024;30(30):3584-608.
  46. Huang G, et al. Artemisia capillaris Thunb. water extract attenuates adriamycin-induced renal injury by regulating apoptosis through the ROS/MAPK axis. J Food Biochem. 2022;46(2):e14065.
  47. Zhao J, et al. Liuwei Dihuang Pills enhance osteogenic differentiation in MC3T3-E1 cells through the activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway. Pharmaceuticals (Basel). 2024;17(1).
  48. Zhang X, Xu D, Zhang R, Wang H, Yang G. Interaction between diabetes and osteoporosis: imbalance between inflammation and bone remodeling. Osteoporos Int. 2025;36(12):2401-9.
  49. Zhao W, et al. Osteoclast activation and inflammatory bone diseases: focusing on receptors in osteoclasts. J Inflamm Res. 2025;18:3201-13.
  50. Zeng J, et al. Comparison of donepezil, memantine, melatonin, and Liuwei Dihuang Decoction on behavioral and immune endocrine responses of aged senescence-accelerated mouse resistant 1 mice. Front Pharmacol. 2020;11:350.
  51. Wu Y, et al. Effect of Bifidobacterium on osteoclasts: TNF-α/NF-κB inflammatory signal pathway-mediated mechanism. Front Endocrinol (Lausanne). 2023;14:1109296.
  52. Zulfiqar Z, et al. Zn glycine attenuates LPS-induced inflammatory bone loss in geese through suppression of osteoclastogenesis via reducing TLR-4/NFκB signaling. Ecotoxicol Environ Saf. 2026;309:119655.
  53. Kingeter LM, Lin X. C-type lectin receptor-induced NF-κB activation in innate immune and inflammatory responses. Cell Mol Immunol. 2012;9(2):105-12.
  54. Zhao Y, et al. Trimethylamine-N-oxide promotes osteoclast differentiation and oxidative stress by activating NF-κB pathway. Aging (Albany NY). 2024;16(10):9251-63.
  55. Zhang Q, et al. Activation of Nrf2/HO-1 signaling: an important molecular mechanism of herbal medicine in the treatment of atherosclerosis via the protection of vascular endothelial cells from oxidative stress. J Adv Res. 2021;34:43-63.
  56. Tseng YT, Chang FR, Lo YC. The Chinese herbal formula Liuwei Dihuang protects dopaminergic neurons against Parkinson's toxin through enhancing antioxidative defense and preventing apoptotic death. Phytomedicine. 2014;21(5):724-33.
  57. Xu Y, et al. Pharmacology-based molecular docking of 4-methylcatechol and its role in RANKL-mediated ROS/Keap1/Nrf2 signalling axis and osteoclastogenesis. Biomed Pharmacother. 2023;159:114101.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

BiyolojiSayı 233Postmenopozal osteoporozNF-κB Sinyal Yolağıinflamasyon
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.