Özel Hazırlanmış Kafes Sistemi Kullanarak Farelerde Gönüllü Grup-Konaklama Uyumlu Dışkı Örneği Toplama

Özet

Bu protokol, grup olarak barındırılan farelerden gönüllü, sosyal yardıma uygun, eşzamanlı ve bireysel dışkı örneği toplamak için özel bir kafes sistemini tanımlar.

Özet

Fekal kortikosteron metabolitlerinin güvenilir ölçümü, bireysel hayvanlara atanan ve belirli bir zaman aralığı içinde toplanabilecek dışkı örnekleri gerektirir. Bu, grup evinde bulunan farelerde zordur; çünkü havuzlanmış ev kafesi örnekleri bireysel atamaya izin vermez ve geçici ayrım hayvan refahı ile çalışma sonuçlarını etkileyebilir. Bu protokolün amacı, grup içinde barındırılan farelerden gönüllü, eşzamanlı ve bireysel dışkı örnekleri toplamayı mümkün kılan basit ve uygun fiyatlı bir kafes sistemi sunmaktır. Sistem, üç ayrı toplama kutusuna bağlı kablo kaplamalı, polikarbonat bir ev kafesinden oluşmaktadır. Alışkanlık ve eğitimden sonra, fareler gönüllü olarak kutulara girip küçük bir yiyecek ödülü elde ederler. Kapılar daha sonra kovalamadan, ele geçirmeden veya zorla transfer olmadan kapatılabilir. Dışkı pelletleri her kutudan ayrı ayrı toplanır, böylece örnekler bireysel hayvanlara atalarken örnekleme süresi dışında sosyal konutlar korunur. Bu protokol, invaziv olmayan uzunlamasına örnekleme destekler ve fekal kortikosteron metabolitleri veya diğer dışkı biyobelirteçleri ölçen çalışmalar için uygundur. Tasarım standart kafes malzemesi ve akrilik camdan kolayca yapılabilir, temizlik için sökülebilir ve birkaç kafesin paralel örneklenmesine olanak tanır. Yöntem, kullanım kaynaklı bozulmaları azaltarak ve örnekleme penceresinin standartlaştırılmasını iyileştirerek, grup içinde yaşayan farelerde endokrin izleme için pratik bir iyileştirme sağlar.

Giriş

Plazma kortikosteron konsantrasyonlarının değerlendirilmesinde en büyük zorluklardan biri, örnekleme prosedürünün kendisinin akut kortikosteron artışına neden olabilmesi, böylece ölçümü karıştırması ve çalışma sonuçlarının yorumlanmasını^{etkileyebilir 1,2,3} olmasıdır. Dışkı kortikosteron metabolitlerinin (FCM) ölçülmesi, invaziv olmayan bir alternatif sunar; çünkü FCM konsantrasyonları, örneklemeden birkaç saat önce dolaşımda olan glukokortikoid seviyelerini yansıtır; bu durum tür, suş, cinsiyet ve bağırsak geçiş^{süresine bağlı olarak 4,5}. Ancak, grup olarak barındırılan farelerde güvenilir FCM analizi hâlâ zordur. Ev kafesinden toplanan havuzlanmış dışkı örnekleri bireysel hayvanlara atanamaz ve glukokortikoid salgılamadaki bireyler arası farklılıklar ile tam örnekleme penceresindeki belirsizlik nedeniyle yüksek değişkenlik gösterebilir. Hayvanları uzun süre ayırmak çalışma hedeflerini etkileyebilirken, bireysel numune toplama için kısa süreli ayrım emek yoğun olur, veri verimini sınırlar ve kendisi^{strese neden olabilir 2}.

Grup olarak barındırılan farelerden bireysel dışkı örneklerinin minimum kullanımla toplanmasını mümkün kılmak için, özel olarak hazırlanmış bir dışkı toplama kafesi geliştirildi (Şekil 1A-E). Tasarım, daha önce tanımlanan dikenli^{fareler 6} için dışkı toplama kafesinden uyarlanmış ve laboratuvar fareleriyle kullanım için modifiye edilmiştir. Sistem, hayvanların gönüllü olarak erişebileceği ve sürgülü kapılarla kapatabileceği üç ayrı toplama kutusuna bağlı standart bir polikarbonat tip III kafesten oluşur. Bu düzen, örnekleme süresi boyunca doğrudan işlem olmadan bireysel farelerden dışkı örneklerinin toplanmasına olanak tanır ve birden fazla hayvanın eşzamanlı örneklenmesini sağlar. Bu nedenle, kafes, grup içinde barındırılan farelerde invaziv olmayan, bireysel olarak atfedilebilen FCM örneklemesi için pratik bir yaklaşım sunar.

Aşağıdaki protokol, bireysel farelerden dışkı örneklerinin toplanmasına ve tanımlanmasına olanak tanıyan, grup konaklaması ortamını koruyarak, temassız dışkı numunesi almak için özel yapılmış kafesler kullanılarak kullanılmasını sağlayan bir dışkı örnekleme sistemini tanımlar.

Protokol

Viyana Tıp Üniversitesi'nin sorumlu hayvan etik komitesine çalışma yapılmadan önce danışıldı ve resmi hayvan deneyi lisansı gerekmediği bildirildi; bu nedenle herhangi bir onay veya protokol numarası mevcut değildir. Çalışma, yalnızca yerleşik yetiştirme ve yetiştirme uygulamalarını ve invaziv olmayan dışkı örneği toplamayı içeriyordu. İnvaziv bir işlem yapılmadı. 2010/63/EU Direktifine uygun olarak, hayvanlar için beklenen yük, iyi veterinerlik uygulamalarına uygun olarak iğne getirilmesiyle oluşan ağrı, acı, sıkıntı veya kalıcı zarar eşiğinin altında değerlendirildi. Tüm hayvanlar kurumsal hayvan refahı standartlarına göre barındırıldı ve bakıma tutuldu.

1. Kafeslerin inşası (bkz. malzeme listesi)

1. 1-4. parçaları 5 mm Plexiglass/akrilik camdan Şekil 2A-C'de gösterilen şablonlara göre kesin.
   NOT: Tam boyutlara sahip şablonlar DIN A3 formatında basılabilir (Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2).
2. Polikarbonat tip II (PTII) kafesinin altını Şekil 2D'de belirtildiği gibi kesin. Bu bölüm daha sonra dışkı toplama kutularının üst kapağı olarak kullanılacaktır.
3. Şekil 2D'de belirtildiği gibi PTII kafesinin eski tabanına delikleri ve yuvaları delin.
   NOT: Kesin boyutlar Ek Şekil 3'te verilmiştir.
4. PTIII kafesinin ön ve kısa taraflarına Şekil 2E'de belirtildiği gibi delikler açın.
   NOT: Tam boyutlar Ek Şekil 4'te verilmiştir.
5. PTIII kafesinin kısa tarafında ve uzun tarafında ilgili sondaj deliklerini işaretlemek için 2. bölümü şablon olarak kullanın.
6. İşareli delikleri delin ve dişli vidalarla PTIII kafesini, PTII kafesini ve 2. kısmı dişli vidalarla bağlayın, Şekil 2F'de gösterildiği gibi.
7. 1. bölümü PTII kafesinin altına yerleştirin. 4a ve 4b bölümlerini 1. bölümü yerinde tutacak şekilde konumlandırın ve örnekleme kafesini ayrı toplama kutularına ayırın. Sıcak yapıştırıcı tabancasıyla onları yerlerine sabitleyin.
8. 4a ve 4b bölümlerinin alt çıkıntılarını 1. bölümün yuvalarına kaydırın. Bu çıkıntılar, toplama kutularının ayaklarını oluşturur.
9. 4a ve 4b bölümlerinin üst çıkıntılarını, PTII kafesinin eski alt kısmı olan üst kapağın üzerinden kaydırarak onu yerinde tutun.
10. Ahşap çubukları veya çubukları, çıkıntılardaki deliklerden geçirerek üstte bir çubuk, alt kısımda iki çubuk kullanarak yapıyı stabilize edin ve sabitleyin.
    NOT: Ahşap malzemeler sadece tek kullanımlıksa, vivariumda kullanılmalıdır, çünkü temizlenebilirler. Eğer durum böyle değilse, alternatif bileşimli çubuklar kullanılmalıdır.
11. Kalan boşlukları veya küçük yanlışlıkları sıcak yapıştırıcı tabancasıyla kapatın. 3a, 3b ve 3c bölümlerini (Şekil 2B) ev kafesi ile toplama kutuları arasında sürdürülen kapı olarak kullanın.
    NOT: Hayvanların keskin kenarları, yapışkan kalıntıları veya çıkıntılı malzeme olmadığından emin olun. Bu prototipte kullanılan akrilik cam/Plexiglass bileşenleri buhar otoklav sterilizasyonu için uygun değildir. Bu nedenle, sistem steril kafesle ilgili malzeme gerektiren SPF tesislerinde kullanılıyorsa, ya kurum tarafından onaylanmış otoklav olmayan dezenfeksiyon prosedürü uygulanmalıdır ya da akrilik bileşenler aynı boyutları koruyarak otoklavlanabilir malzemeyle değiştirilmelidir.

2. Hayvan hazırlığı ve barındırma

1. Çalışma için uygun suş(lar)dan gerekli sayıda fare alın.
   NOT: Temsilci veriler, 20 dişi ve 10 erkekten oluşan 30 sekiz haftalık C57BL/6J faresinden alındı. Fareler, FELASA standartlarına göre spesifik patojenlerden arınmıştı ve Almanya'nın Sulzfeld kentindeki Charles River Laboratuvarlarından temin edildi.
2. Evcil hayvanlar, alışkanlıkla adapte edilmiş polikarbonat tip III kafeslerde, her kafeste maksimum üç yetişkin fare.
   NOT: Ayrılmış erkekler bu çalışma için standart polikarbonat tip II kafeslerde barındırıldı.
3. Hayvan odasını 22 ± 2 °C ve %10 bağıl nemle 55 ± 12 saat ışık/karanlık döngüde sabah 6:00'da ışıklar açık tutun.
4. Standart bir bakım diyeti ve su ile sıvı sağla.
5. Her kafese aspen ağacı yatak takımı, kağıt tuvalet rulosu, kırmızı şeffaf plastik bir ev ve yuva malzemesi olarak kağıt havlular ekleyin.
6. Fareleri öncelikle doğal kuyruk işaretleriyle tanımlayın. Gerekirse, benzer kuyruk işaretlerine sahip hayvanlara tartım sırasında geçici olarak kalem işaretleri uygulanır.

3. Hayvanların alışkanlığı ve eğitimi

NOT: Tamamlanan kafes, üç ayrı toplama kutusu (PTII) ile bir örnekleme kafesine bağlı bir ev kafesi, PTIII'den oluşur. Ev kafesleri, geleneksel kafesler gibi kullanılabilir; yatak takımı, kafes zenginleştirme, harici bağlantı elemasız tel kapak ve yiyecek ile su sağlar. Sistem yıkama için sökülebilir ve sadece örnekleme haftalarında kullanılabilir. Örnekleme yapılmayan haftalarda hayvanlar standart PTIII kafeslerinde barındırılabilir.

1. Hayvanları ilk planlanan örnekleme oturumundan en az iki hafta önce kafes sistemine yerleştirin.
2. Hayvanları toplama kutularına alıştırmak için bir gece boyunca sürgülü kapıları çıkarın, böylece hayvanlar kutuları özgürce keşfetebilirler.
3. İlk örnekleme oturumundan önce üç antrenman seansı yapın. Aynı ışık koşullarında ve günün aynı saatinde eğitim yapılarak daha sonraki örnekleme için planlanın; ideal olarak karanlık dönemin başlamasından kısa bir süre sonra kırmızı ışık altında.
4. Her toplama kutusunun girişinin karşısındaki duvara fındık kreması, fıstık ezmesi, malt ezmesi veya benzeri lezzetli bir yiyecek gibi küçük bir ödül ürününü uygulayın.
5. İlk eğitim gününde kapıları açık bırakın ve hayvanların ödülü gönüllü olarak keşfedip tüketmesine izin verin.
6. İkinci eğitim gününde, bir hayvan toplama kutusuna girip ödülü yalamaya başlayana kadar bekle. Hayvanın arkasındaki sürgülü kapıyı dikkatlice kapatın ve 10 dakika sonra açın.
7. Üçüncü eğitim gününde prosedür tekrarlanır ve hayvanların toplama kutularında kaldığı süreyi kademeli olarak uzatır.
   NOT: Eğitim sakin ve tutarlı olmalı. Hayvanları kutulara kovalamaktan kaçının, çünkü bu stresi artırabilir ve sonraki örnekleme oturumlarında gönüllü katılımı azaltabilir.

4. Dışkı örneklerinin toplanması

1. Örnek toplama zamanlaması
   1. Örnekleme süresini, biyolojik soruya ve plazma kortikosteron ile fekal kortikosteron metabolit salınımı arasındaki beklenen gecikmeye göre planlayın. Farelerde, fekal kortikosteron metabolitleri genellikle örneklemeden yaklaşık 8-10 saat önce dolaşımdaki glukokortikoid seviyelerini yansıtır.
      NOT: Kesin zamanlama kritik ise, kullanılan spesifik suş, cinsiyet ve deneysel koşullarda FCM salgısının zaman seyrini belirlemek için pilot çalışma yapın. Bu pilot eğitim seanslarıyla birleştirilebilir.
   2. Yüksek dışkı çıkışı döneminde numune almayı planlayın. Örnekleme genellikle karanlık ve aktif fazanın başında en verimli olur.
   3. FCM seviyelerinin günlük ritminden kaynaklanan değişimi azaltmak için tüm örnekleme oturumlarını günün aynı saatinde gerçekleştirin.
      NOT: Deneyimimize göre, sabah saat 10:00 civarında gerçekleşen olaylar, hayvan odasının ışık programına bağlı olarak, örnekleme 18:00 ile 20:00 arasında planlandığında iyi yansıtılır.
2. Örnekleme prosedürü ve pratik tavsiyeler
   1. Numune almadan önce hayvanları tek tek işaretleyin. Kulak işaretleri veya bireysel kuyruk işaretleri kullanın.
      NOT: Kırmızı ışık altında kutuların içinde parmak işaretleri ve renk kodları tanınması zor olabilir.
   2. Ödülü her kutunun arka duvarına uygulayarak ışık aşamasında toplama kutularını hazırlayın.
      NOT: Kutuların gün içinde hazırlanması, deneycinin görünürlüğünü artırır ve hayvanların numune almadan önce ödülü koklamasına olanak tanır.
   3. Planlanan örnekleme zamanında, toplama kutularını açın ve hayvanların gönüllü olarak girmesini bekleyin.
   4. Bir fare toplama kutusuna girdikten sonra, arkasındaki sürgülü kapıyı dikkatlice kapatın.
   5. Tüm hayvanlar bir kutuya girdikten sonra, her farenin kimliğini ve konumunu hazırlanmış bir örnekleme sayfasına kaydedin.
   6. Bir oturumda 10'dan fazla kafes örneklenirse, hayvan tanımlama, kapı kullanımı ve dokümantasyonu desteklemek için ikinci bir deneyciyi dahil et.
   7. Hayvanları, beklenen dışkı çıktısı ve çalışma tasarımına bağlı olarak, genellikle 30 dakika ile 2 saat arasında, planlanan örnekleme süresi boyunca toplama kutularında tutun.
      NOT: Bireysel kimlik kesin olarak atanamıyorsa, dışkı pelletleri başka bir hayvanın idrarı, yatak veya dışkısıyla kirlenmişse, örnekleme süresi planlanan zaman aralığından önemli ölçüde sapıyorsa veya dışkı miktarı FCM analizi için yeterli değilse, örnekleri hariç tutun.
      NOT: 50 mg kullanımı standart protokolümüzdür ve bu miktar tüm doğrulamalarda ve diğer^{tüm makalelerde 5,7,8} kullanılmıştır. Normalde kolayca elde edilebilir.
   8. Örnekleme süresinin sonunda, sürgülü kapıları açın ve farelerin ev kafesine dönmesine izin verin.
   9. Fareler ayrıldıktan hemen sonra toplama kutularını kapatarak yeniden giriş ve çapraz kontaminasyon önlenmesini önleyin.
   10. Her toplama kutusundan dışkı pelletlerini uzun forseps kullanarak çıkarın ve bunları ayrı etiketlenmiş toplama tüplerine aktarın.
   11. Numuneleri FCM testinin daha fazla hazırlanmasına kadar -20 °C'de depolayın.
       NOT: Kutular güvenli bir şekilde kapalıysa ve fareler tarafından tekrar girilemezse, dışkı pellet toplama işlemi bir sonraki ışık aşamasına kadar ertelenebilir. Ancak, bu bir çalışma içinde tutarlı şekilde yapılmalıdır.
   12. Hayvanları bir sonraki kafes değişimine kadar ev kafesi bölümünde (PTIII) tutun. Sonra sökülüp sıradan bir kafes çamaşır makinesinde yıkanabilirler.

Sonuçlar

Fekal kortikosteron metabolitleri (FCM'ler), kalıcı ve aralıklı olarak yetiştirilen fareleri karşılaştıran uzunlamasına bir çalışmada özel olarak hazırlanmış dışkı numuneleriyle toplanan örneklerden başarıyla nicelendirilmiştir. Temsilli FCM analizi 30 hayvanı içerdi: kalıcı olarak yetiştirilen grup, n = 5 kafeste 15 hayvan; aralıklı olarak yetiştirilen grup, n = 10 hayvan 5 kafeste, 5 erkek tek başına barındırılmış, 3 üreme olayında dişilerle birlikte taşınmışlardır. Örnekler, kafes değişim günlerinde ve hafta sonları 19 iki haftada bir saat noktasında toplandı. Çoğu hayvanın kutuya girmesine kadar olan ortalama süre 7,5 dakika (SD = 3,07) olup, hayvanların çoğu ortalama 27,6 (SD = 1,44) toplam 30 fareden oluşuyordu. Tüm fareler kutuya ortalama 11,69 dakika (SD = 3,29) girmişti. Tüm farelerin ortalama hapse süresi 24,56 dakika (SD = 15,51) ve kutuya ilk giren farenin çıkış başlamasına kadar olan ortalama süre 43,14 dakika (SD = 8,51) idi. Ortalama salınım süresi 14,86 dakika (SD = 22,82), tüm işlemin ortalama süresi ise 68,00 dakika (SD = 11,87) idi. 19 örneklemden (3 deneme + 16 normal), 480 örnek bekleniyordu, iki örnek eksik çünkü fareler hapse sırasında dışkı yapmadı, üç örnek alınamadı, fareler ya çok hamileydi ya da doğumdan kısa bir süre sonra oldu, 5 fare ise içeri girmek için nazik destek gerektirdi. İlk üç örneklemden alınan örneklerin ortalama ağırlığı 51,16 mg (SD = 25,39) idi. Toplanan tüm örneklerden (475) 473'ü analiz edilip sonuç alındı.

Bireysel hayvanlar biyolojik kopyalar olarak kabul edildi. Sekiz haftalık çalışma süresi boyunca aynı hayvanlardan toplanan tekrarlayan dışkı örnekleri, bağımsız biyolojik kopyalar olarak değil, uzunlamasına tekrarlanan ölçümler olarak ele alınmıştır. Analiz, cinsiyet, üreme grubu, örnekleme günü ve kafesteki fare sayısını sabit etkiler olarak, kafes ise rastgele bir kesimleme olarak kullanılan doğrusal karışık etkiler modeli kullanılarak gerçekleştirildi. Cinsiyet, üreme grubu ve örnekleme günü arasındaki etkileşimler modele dahil edilmiştir. Kafes başına fare sayısı ek sabit bir etki olarak dahil edildi ancak etkileşim açısından test edilmedi, çünkü bu değişken, özellikle aralıklı olarak yetiştirilen erkeklerde deneysel tasarımla kısmen çelişti.

Model, cinsiyetin FCM konsantrasyonları üzerinde net bir etkisi gösterdi (Şekil 3A-D). Dişiler, üreme koşulları ve örnekleme günlerinde erkeklere göre daha yüksek FCM konsantrasyonlarına sahipti; tahmin = 28.30, SE = 2.58, t = 10.98, P < 0.0001. Sonradan yapılan karşılaştırmalar, bu cinsiyet farkını her iki üreme grubunda ve her iki seçme gününde doğruladı. Kalıcı olarak yetiştirilen hayvanlarda, dişilerin FCM konsantrasyonları erkeklere göre Pazar günleri daha yüksekti; tahmin = 53.41, SE = 8.28, P < 0.0001, Çarşamba günleri ise tahmin = 55.27, SE = 8.37, P < 0.0001. Aynı desen, aralıklı olarak yetiştirilen hayvanlarda da gözlemlendi: tahmin = 58.04, SE = 12.00, P < 0.0001, Çarşamba günleri ise tahmin = 59.68, SE = 9.88, P < 0.0001.

Model ayrıca üreme grubunun önemli bir ana etkisini gösterdi: tahmin = 11.59, SE = 4.65, t = 2.49, P = 0.0227. Ancak, Tukey ile ayarlanmış sonradan yapılan karşılaştırmalar, bireysel cinsiyet/gün kombinasyonlarında kalıcı ve aralıklı olarak yetiştirilen hayvanlar arasında anlamlı farklar ortaya koymadı. Dişilerde, kalıcı ve aralıklı olarak yetiştirilen hayvanlar Pazar günleri (tahmin = 24.51, SE = 12.20, P = 0.2085) veya Çarşamba günleri tahmin = 17.31, SE = 12.20, P = 0.4950 olarak anlamlı farklılık göstermemiştir. Benzer şekilde, erkeklerde pazar günleri tahmin = 29.14, SE = 14.00, P = 0.1708 veya Çarşamba günleri tahmin = 21.72, SE = 13.30, P = 0.3682 tarihlerinde önemli bir üreme grubu farkı tespit edilmedi. Yetiştirme grubunun önemli ana etkisi bu nedenle genel model düzeyinde bir etki olarak yorumlanmalıdır; oysa cinsiyet ve örnekleme gününde daha spesifik Tukey ile ayarlanmış post hoc karşılaştırmalar, sağlam bir çift grup farkı tespit etmemiştir.

Erkeklerde önemli bir üreme grubu farkının olmaması özellikle önemlidir, çünkü erkekler pazar günleri her zaman tek evde kalır. Dolayısıyla, erkeklerde yapılan Pazar karşılaştırması, örnekleme yönteminin en azından erkek farelerde FCM konsantrasyonlarını artırmadığını gösteriyor. Dışkı örnekleme kafesleri, kirli yatak nöbetçi farelerindeki FCM'leri kontrol fareleriyle karşılaştıran başka bir çalışmada^{da kullanılmıştır 9}.

Şekil 1: Özel yapılmış dışkı örnekleme kafesinin genel bakışı. Kafes sistemi, grup kafesinde tutulan bireysel farelerden doğrudan numune almadan dışkı örneklerinin toplanmasına olanak tanır. (A) Ev kafesi ve bağlı dışkı örnekleme kafesinden oluşan tamamen monte edilmiş kafes sistemi. (B) Bağlı örnekleme kafesinin yan görünümü. (C) Bireysel toplama kutularına üç ayrı girişi gösteren üst görünüm. (D) Ev kafesinin içinden örnekleme kutularının girişlerine doğru görüntü. (E) Açık örnekleme kafesi, böylece boşaltma kutularına giriş, dışkı pellet çıkarımı ve temizliği için erişim sağlandı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Dışkı örnekleme kafesinin inşaat planı ve montajı. (A-C) Akrilik cam parçalar, örnekleme kafesinin zemini, yan duvarları, sürgülü kapıları ve bölücülerini inşa etmek için kullanılır. (D) Polikarbonat tip II kafesinin alt kısmı çıkarılarak ve toplama kutusu kapağı için delikler ve yuvalar açılarak modifiye edilmesi. (E) Polikarbonat tip III ev kafesinin ön tarafa üç giriş deliği açılarak modifiye edilmesi. (F) Monte edilmiş kafes sisteminin şematik yan görünümü, polikarbonat tip III ev kafesinin modifiye edilmiş polikarbonat tip II örnekleme kafesine bağlı olduğunu ve 1, 2 ve 4. bölümlerin konumlandırılmasını gösteriyor. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Özel hazırlanmış kafes kullanılarak dışkı örneği topladıktan sonra temsil edilen FCM verileri. Dışkı kortikosteron metabolitleri (FCM'ler), özel olarak hazırlanmış dışkı örnekleme kafesi kullanılarak grup olarak yerleştirilen farelerden bireysel olarak toplanan dışkı örneklerinde ölçüldü. Değerler, kalıcı ve aralıklı olarak yetiştirilen fareler için sekiz haftalık örnekleme zaman noktası boyunca gösterilir. Örnekler ya kafes değişim günlerinde ya da hafta sonları alındı. Noktalar ve bağlayıcı çizgiler, her zaman noktasında grup ortalamalarını temsil eder. Hata çubukları ve gölgeli şeritler ortalama ± standart sapmayı (SD) gösterir. (A) Kafes değişim günlerinde seçilen dişiler. (B) Hafta sonları seçilen dişiler. (C) Kafes değişim günlerinde örnekler alınan erkekler. (D) Hafta sonları örnekleri alınan erkekler. Şekil, yöntemin tüm gruplar ve zaman noktalarında ölçülebilir FCM yoğunlukları ürettiğini göstermektedir. Dişiler genellikle erkeklere göre daha yüksek FCM konsantrasyonları gösterirken, üreme grupları arasındaki farklar daha az tutarlıydı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Akrilik cam bileşenleri için şablonlar 1-3. Dışkı örnekleme kafesinin inşası için 5 mm akrilik cam/Plexiglass'tan Bölüm 1, 2 ve 3a-c kesim şablonları. Bölüm 1, modifiye polikarbonat tip II kafesinin alt kısmı olarak hizmet verir. 2. bölüm, polikarbonat tip III kafesi polikarbonat tip II kafese bağlamak ve ilgili sondaj deliklerini işaretlemek için kullanılır. 3a-c bölümleri, toplama sisteminin iç bölücülerini/yapısal unsurlarını oluşturur. Beyaz dairesel işaretler hava deliklerini, daha küçük işaretler ise vida deliklerini gösterir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Akrilik cam bileşenleri 4a ve 4b için şablonlar. 5 mm akrilik cam/pleksiglastan 4a ve 4b bölümlerini kesmek için şablonlar. Bu parçalar, alt inserti yerinde tutmak ve örnekleme kafesini ayrı dışkı toplama kutularına bölmek için Bölüm 1'e yerleştirilir. Alt çıkıntılar toplama kutularının ayaklarını oluştururken, üst çıkıntılar üst kapağın içinden geçer ve yapıyı stabilize etmek için ahşap çubuklar veya çubuklarla sabitlenir. Beyaz daireler, çubuklar veya hava delikleri için açıklıkları gösterir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: Polikarbonat tip II kafesinin modifikasiyası. Polikarbonat tip II kafesinin modifiye edilmesi için şematik şablon. Kafesin alt kısmı belirtildiği gibi kesilir ve daha sonra dışkı toplama kutularının üst kapağı olarak kullanılır. Çıkarılan alt bölüme delikler ve yuvalar açılarak 4a ve 4b parçaların yerleştirilmesi ve sabitlenmesi sağlanır. Vida delikleri, polikarbonat tip II kafesi, polikarbonat tip III kafesi ve Bölüm 2'yi bağlamak için kullanılır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 4: Polikarbonat tip III kafes ön kısmının modifikasiyası. Polikarbonat tip III kafesinin ön tarafını delmek için şematik şablon. Ev kafesi ile dışkı örnekleme kafesi arasında erişim sağlamak için kafesin kısa tarafına üç dairesel açıklık açılır. Ek vida delikleri, Bölüm 2 ve polikarbonat tip II kafese sabitleme için kullanılır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokol, grup olarak yerleştirilen farelerden bireysel olarak atanabilen dışkı örnekleri toplamak için basit bir kafes sistemini tanımlar. Yöntemin temel avantajı, bireysel örnek attıfını, sosyal konutun temel yönlerinin, özellikle kafes arkadaşlarıyla görsel ve koku temasının korunmasıyla birleştirmesidir. Bu önemlidir çünkü grup barınması genellikle hayvan refahı için gereklidir ve deneysel tasarımın bir parçası^{olabilir 10}. Havuzlu ev kafesi örneklemesine karşılık, sistem bireysel hayvanlara FCM değerlerinin atanmasına izin verirken, örnek toplama öncesi veya sırasında uzun süreli bireysel barınma önlenir.

Laboratuvar farelerinde dışkı örneği toplama için yaygın kullanılan yöntemler arasında havuzlu ev kafesi örnekleme, temiz kafeslerde geçici bireysel konaklama, metabolik kafesler ve ele alma veya transferden sonra doğrudan toplama yer alır. Havuzlanmış ev kafesi örnekleri kolayca elde edilir, invaziv değildir, ucuzdur ve birçok kafesin paralel örneklemesiyle uyumludur, ancak grup içinde yaşayan hayvanlarda bireysel attributiona izin vermezler. Geçici bireysel barınma veya temiz kafeslere aktarma bireysel örnek atamasını sağlar, ancak hayvanları sosyal gruplarından uzaklaştırır ve müdahale, yenilik veya sosyal ayrım nedeniyle akut stres yaratabilir. Bu özellikle FCM analizi için önemlidir, çünkü kortikosteron ile ilgili ölçümler, örnekleme prosedürünün neden olduğu strese karşı^{hassastır 11}. Metabolik kafesler kontrollü numune toplama sağlar ve dışkı ile idrarın ayrılmasına olanak tanır, ancak özel ekipman gerektirirler, rutin bakım ile daha az uyumludurlar ve genellikle bireysel barınma gerektirirler. Doğrudan ele alma tabanlı toplama da bireysel olarak atfedilebilir örnekler sağlayabilir, ancak hayvanların tekrar tekrar ele alınması veya manipülasyonu gerektirir ve bu nedenle stresle ilgili okumaları etkileyebilir.

Bu mevcut yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, mevcut sistem, tekrarlayıcı, invaziv olmayan, bireysel dışkı örneği için grup komanına uyumlu bir iyileştirme olarak tasarlandı. Alışkanlık ve eğitimden sonra, fareler küçük bir yiyecek ödülü karşılığında gönüllü olarak örnekleme kutularına girerler. Bu nedenle örnekler kovalamadan, ele almadan veya zorla ayrı bir kafese aktarılmadan toplanabilir. Sistem, doğrudan refah önlemleri bu çalışmada dahil edilmediği için, refahı artırdığı veya stresi azalttığı kanıtlanmış olarak yorumlanmamalıdır. Ancak, örnek toplama sırasında sosyal ayrımcılığı azaltmak için tasarlanmıştır ve bu nedenle geleneksel bireysel toplama yöntemlerine göre daha az bozucu olabilir. Ayrıca, birkaç hayvan ve birkaç kafes paralel olarak örneklenebilir, bu da numune alma penceresinin standartlaşmasına yardımcı olur; bu da FCM konsantrasyonlarının sirkadiyen ritme bağlı olması ve örnekleme öncesi glukokortikoid salgısını^{yansıtması nedeniyle önemlidir 5,12}.

Temsil eden sonuçlar, sistemin FCM konsantrasyonları için analiz edilebilecek dışkı örnekleri toplamak için uygun olduğunu göstermektedir. Gruplar ve zaman noktaları arasında ölçülebilir FCM konsantrasyonları elde edildi ve yöntem, kadınlarda erkeklere göre daha yüksek FCM konsantrasyonlarıyla beklenen net cinsiyet farkını tespit etti. Çalışma ayrıca erkeklerde geleneksel tek konut ile iç bir karşılaştırma da içeriyordu. Pazar günleri, aralıklı üreme grubundaki erkekler tek bir evde tutulurken, kalıcı olarak yetiştirilen erkekler yeni geliştirilen toplama sistemi kullanılarak numune alınırdı. FCM yoğunlaşmaları bu gruplar arasında Pazar günleri anlamlı bir fark yaratmadı. Bu, örnekleme kafesine gönüllü girişin ve toplama kutusunda kısa süreli kalmanın geleneksel tek konut toplama ile karşılaştırıldığında FCM konsantrasyonlarını belirgin şekilde artırmadığını göstermektedir. Buna rağmen, bu karşılaştırma erkeklerle sınırlıydı ve özel bir eşdeğerlik veya çapraz doğrulama çalışması olarak tasarlanmamıştı. Bu nedenle, daha ileri çalışmalar, sistemi dengeli deneysel koşullar altında yerleşik bireysel konut veya metabolik kafes yaklaşımlarıyla karşılaştırmalı ve örnekleme sırasında akut stresin davranışsal göstergelerini içermelidir.

Fekal kortikosteron metabolitlerinin değerlendirilmesinin ötesinde, sistem kısa süreli bireysel dışkı örnekleri toplamayı gerektiren diğer uygulamalar için de faydalı olabilir. Potansiyel uygulamalar arasında parazitolojik muayeneler, mikrobiyota analizleri, sindirim çalışmaları veya diğer dışkı biyobelirteç testleri yer almaktadır. Küçük teknik değişikliklerle, sistem idrar toplama için de uyarlanabilir; örneğin, delikli bir zemin ve hayvanın altına uygun bir toplama tepsisi yerleştirilerek. Bu uygulamalar için, örnek toplama sırasında kafes eşlerine yakın kalma olasılığı, geleneksel bireysel konut veya metabolik kafes yaklaşımlarına kıyasla avantajlı olabilir. Ancak, sistemin uygunluğu, özellikle kirlenme, örnek hacmi, toplama süresi veya depolama koşulları kritik olduğu her belirli örnek türü ve sonraki analizler için doğrulanmalıdır.

Genel olarak, hayvanlar ilk örnekleme oturumundan önce kutulara alıştırılmalıdır, bireysel işaretler kullanılan ışık koşullarında net görünür olmalı ve örnekleme çalışmanın aynı saatinde yapılmalıdır. Bireysel kimlik belirsizse, pelletler kontamine ise, örnekleme süresi planlanan zaman aralığından önemli ölçüde farklıyse veya dışkı materyali analiz için yetersizse örnekler hariç^{tutulmalıdır 13}. Örnekleme sisteminin uygulanabilirliğini etkileyen birkaç pratik faktör, baskınlık hiyerarşileri, agresif etkileşimler, gıda motivasyonundaki değişkenlik, strain farklılıkları ve obez, yaşlı, hamile, doğum sonrası veya başka şekilde bozukluğu olan hayvanlarda hareket kabiliyetinin azalması veya değişmiş davranış gibi faktörler olabilir. Ancak mevcut grupta gönüllü giriş ve örnekleme başarısı yüksekti. Beklenen 480 düzenli örnekten ikisi farelerin hapse sırasında dışkılamaması nedeniyle eksikti, üçü ise hayvanların ya yüksek hamile olması ya da doğumdan kısa süre sonra gerçekleşmesi nedeniyle toplanamadı. Böylece 475 örnek toplandı ve bunlardan 473'ü analiz edilebilir sonuçlar verdi. Bu veriler, bu çalışmada kullanılan koşullarda kutulara girmeyi reddetmenin ve örnek alınamamanın nadir olduğunu göstermektedir. Buna rağmen, hareket kabiliyeti, vücut durumu, sağlık durumu veya sosyal davranışı değişmiş diğer suşlar, daha büyük gruplar veya hayvanlar için ek alışkanlık veya protokol ayarlamaları gerekebilir. Diğer sınırlamalar ise yöntemin eğitim gerektirmesi ve şu anda üç fareden oluşan küçük gruplar için tasarlanması ile akrilik cam/pleksiglas bileşenlerin buharla otoklavlanabilmesidir.

Kafes ucuzdur, standart kafes malzemesi ve akrilik camdan kolayca yapılır ve elektronik bileşenler gerektirmez. Tasarımı, sökülme, temizlik ve düzenli kafes değiştirme rutinlerine entegre edilebilmesini sağlar; bu da onu tekrar eden uzunlamasına örnekleme için uygundur. Genel olarak, sistem farelerde invaziv olmayan, bireysel olarak atanabilen dışkı örneklemesi için pratik, grup konut uyumlu bir yaklaşımı temsil etmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Delme ucu 5 mm	Craftomat	22380487	5mm çap; Miktar 1
Delme ucu 60 mm	Bosch	32064647	60 mm çap; Miktar 1
Delme ucu 7 mm	Craftomat	22380520	7 mm çap; Miktar 1
Delme makinesi	Makita	25730054	Standart el veya tezgah delme makinesi; Miktar 1
Sıcak tutkal tabancası	Einhell	29051207	Kafes montajı için; Miktar 1
Sıcak tutkal çubukları	Einhell	29049664	Sıcak tutkal tabancasıyla uyumlu; Miktar 5-10
Makrolon kafes	Animalab	31200129	Standart Tip II kafes; Miktar 1
Makrolon kafes	Animalab	31200256	Standart Tip III kafes; Miktar 1
Plexiglas / akrilik cam	Bauhaus	29122352	Yaklaşık 0.25 m² toplam; 5 mm kalınlık; Miktar  2DIN A3 levha
Testere veya freze cihazı	Scheppach	32079641	Küçük bant testere, jigsaw veya CNC freze; Miktar 1
Dişli vidalar	Profi Depot	10807533	20 mm × 3 mm; Miktar 4
Ahşap çubuklar	Ikea	903.429.71	Yuvarlak ahşap çubuklar; Miktar 3