Bu protokol, grup olarak barındırılan farelerden gönüllü, sosyal yardıma uygun, eşzamanlı ve bireysel dışkı örneği toplamak için özel bir kafes sistemini tanımlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Özel Hazırlanmış Kafes Sistemi Kullanarak Farelerde Gönüllü Grup-Konaklama Uyumlu Dışkı Örneği Toplama
Bu makalede
Özet
Özet
Fekal kortikosteron metabolitlerinin güvenilir ölçümü, bireysel hayvanlara atanan ve belirli bir zaman aralığı içinde toplanabilecek dışkı örnekleri gerektirir. Bu, grup evinde bulunan farelerde zordur; çünkü havuzlanmış ev kafesi örnekleri bireysel atamaya izin vermez ve geçici ayrım hayvan refahı ile çalışma sonuçlarını etkileyebilir. Bu protokolün amacı, grup içinde barındırılan farelerden gönüllü, eşzamanlı ve bireysel dışkı örnekleri toplamayı mümkün kılan basit ve uygun fiyatlı bir kafes sistemi sunmaktır. Sistem, üç ayrı toplama kutusuna bağlı kablo kaplamalı, polikarbonat bir ev kafesinden oluşmaktadır. Alışkanlık ve eğitimden sonra, fareler gönüllü olarak kutulara girip küçük bir yiyecek ödülü elde ederler. Kapılar daha sonra kovalamadan, ele geçirmeden veya zorla transfer olmadan kapatılabilir. Dışkı pelletleri her kutudan ayrı ayrı toplanır, böylece örnekler bireysel hayvanlara atalarken örnekleme süresi dışında sosyal konutlar korunur. Bu protokol, invaziv olmayan uzunlamasına örnekleme destekler ve fekal kortikosteron metabolitleri veya diğer dışkı biyobelirteçleri ölçen çalışmalar için uygundur. Tasarım standart kafes malzemesi ve akrilik camdan kolayca yapılabilir, temizlik için sökülebilir ve birkaç kafesin paralel örneklenmesine olanak tanır. Yöntem, kullanım kaynaklı bozulmaları azaltarak ve örnekleme penceresinin standartlaştırılmasını iyileştirerek, grup içinde yaşayan farelerde endokrin izleme için pratik bir iyileştirme sağlar.
Giriş
Plazma kortikosteron konsantrasyonlarının değerlendirilmesinde en büyük zorluklardan biri, örnekleme prosedürünün kendisinin akut kortikosteron artışına neden olabilmesi, böylece ölçümü karıştırması ve çalışma sonuçlarının yorumlanmasınıetkileyebilir 1,2,3 olmasıdır. Dışkı kortikosteron metabolitlerinin (FCM) ölçülmesi, invaziv olmayan bir alternatif sunar; çünkü FCM konsantrasyonları, örneklemeden birkaç saat önce dolaşımda olan glukokortikoid seviyelerini yansıtır; bu durum tür, suş, cinsiyet ve bağırsak geçişsüresine bağlı olarak 4,5. Ancak, grup olarak barındırılan farelerde güvenilir FCM analizi hâlâ zordur. Ev kafesinden toplanan havuzlanmış dışkı örnekleri bireysel hayvanlara atanamaz ve glukokortikoid salgılamadaki bireyler arası farklılıklar ile tam örnekleme penceresindeki belirsizlik nedeniyle yüksek değişkenlik gösterebilir. Hayvanları uzun süre ayırmak çalışma hedeflerini etkileyebilirken, bireysel numune toplama için kısa süreli ayrım emek yoğun olur, veri verimini sınırlar ve kendisistrese neden olabilir 2.
Grup olarak barındırılan farelerden bireysel dışkı örneklerinin minimum kullanımla toplanmasını mümkün kılmak için, özel olarak hazırlanmış bir dışkı toplama kafesi geliştirildi (Şekil 1A-E). Tasarım, daha önce tanımlanan dikenlifareler 6 için dışkı toplama kafesinden uyarlanmış ve laboratuvar fareleriyle kullanım için modifiye edilmiştir. Sistem, hayvanların gönüllü olarak erişebileceği ve sürgülü kapılarla kapatabileceği üç ayrı toplama kutusuna bağlı standart bir polikarbonat tip III kafesten oluşur. Bu düzen, örnekleme süresi boyunca doğrudan işlem olmadan bireysel farelerden dışkı örneklerinin toplanmasına olanak tanır ve birden fazla hayvanın eşzamanlı örneklenmesini sağlar. Bu nedenle, kafes, grup içinde barındırılan farelerde invaziv olmayan, bireysel olarak atfedilebilen FCM örneklemesi için pratik bir yaklaşım sunar.
Aşağıdaki protokol, bireysel farelerden dışkı örneklerinin toplanmasına ve tanımlanmasına olanak tanıyan, grup konaklaması ortamını koruyarak, temassız dışkı numunesi almak için özel yapılmış kafesler kullanılarak kullanılmasını sağlayan bir dışkı örnekleme sistemini tanımlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Viyana Tıp Üniversitesi'nin sorumlu hayvan etik komitesine çalışma yapılmadan önce danışıldı ve resmi hayvan deneyi lisansı gerekmediği bildirildi; bu nedenle herhangi bir onay veya protokol numarası mevcut değildir. Çalışma, yalnızca yerleşik yetiştirme ve yetiştirme uygulamalarını ve invaziv olmayan dışkı örneği toplamayı içeriyordu. İnvaziv bir işlem yapılmadı. 2010/63/EU Direktifine uygun olarak, hayvanlar için beklenen yük, iyi veterinerlik uygulamalarına uygun olarak iğne getirilmesiyle oluşan ağrı, acı, sıkıntı veya kalıcı zarar eşiğinin altında değerlendirildi. Tüm hayvanlar kurumsal hayvan refahı standartlarına göre barındırıldı ve bakıma tutuldu.
1. Kafeslerin inşası (bkz. malzeme listesi)
- 1-4. parçaları 5 mm Plexiglass/akrilik camdan Şekil 2A-C'de gösterilen şablonlara göre kesin.
NOT: Tam boyutlara sahip şablonlar DIN A3 formatında basılabilir (Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2). - Polikarbonat tip II (PTII) kafesinin altını Şekil 2D'de belirtildiği gibi kesin. Bu bölüm daha sonra dışkı toplama kutularının üst kapağı olarak kullanılacaktır.
- Şekil 2D'de belirtildiği gibi PTII kafesinin eski tabanına delikleri ve yuvaları delin.
NOT: Kesin boyutlar Ek Şekil 3'te verilmiştir. - PTIII kafesinin ön ve kısa taraflarına Şekil 2E'de belirtildiği gibi delikler açın.
NOT: Tam boyutlar Ek Şekil 4'te verilmiştir. - PTIII kafesinin kısa tarafında ve uzun tarafında ilgili sondaj deliklerini işaretlemek için 2. bölümü şablon olarak kullanın.
- İşareli delikleri delin ve dişli vidalarla PTIII kafesini, PTII kafesini ve 2. kısmı dişli vidalarla bağlayın, Şekil 2F'de gösterildiği gibi.
- 1. bölümü PTII kafesinin altına yerleştirin. 4a ve 4b bölümlerini 1. bölümü yerinde tutacak şekilde konumlandırın ve örnekleme kafesini ayrı toplama kutularına ayırın. Sıcak yapıştırıcı tabancasıyla onları yerlerine sabitleyin.
- 4a ve 4b bölümlerinin alt çıkıntılarını 1. bölümün yuvalarına kaydırın. Bu çıkıntılar, toplama kutularının ayaklarını oluşturur.
- 4a ve 4b bölümlerinin üst çıkıntılarını, PTII kafesinin eski alt kısmı olan üst kapağın üzerinden kaydırarak onu yerinde tutun.
- Ahşap çubukları veya çubukları, çıkıntılardaki deliklerden geçirerek üstte bir çubuk, alt kısımda iki çubuk kullanarak yapıyı stabilize edin ve sabitleyin.
NOT: Ahşap malzemeler sadece tek kullanımlıksa, vivariumda kullanılmalıdır, çünkü temizlenebilirler. Eğer durum böyle değilse, alternatif bileşimli çubuklar kullanılmalıdır. - Kalan boşlukları veya küçük yanlışlıkları sıcak yapıştırıcı tabancasıyla kapatın. 3a, 3b ve 3c bölümlerini (Şekil 2B) ev kafesi ile toplama kutuları arasında sürdürülen kapı olarak kullanın.
NOT: Hayvanların keskin kenarları, yapışkan kalıntıları veya çıkıntılı malzeme olmadığından emin olun. Bu prototipte kullanılan akrilik cam/Plexiglass bileşenleri buhar otoklav sterilizasyonu için uygun değildir. Bu nedenle, sistem steril kafesle ilgili malzeme gerektiren SPF tesislerinde kullanılıyorsa, ya kurum tarafından onaylanmış otoklav olmayan dezenfeksiyon prosedürü uygulanmalıdır ya da akrilik bileşenler aynı boyutları koruyarak otoklavlanabilir malzemeyle değiştirilmelidir.
2. Hayvan hazırlığı ve barındırma
- Çalışma için uygun suş(lar)dan gerekli sayıda fare alın.
NOT: Temsilci veriler, 20 dişi ve 10 erkekten oluşan 30 sekiz haftalık C57BL/6J faresinden alındı. Fareler, FELASA standartlarına göre spesifik patojenlerden arınmıştı ve Almanya'nın Sulzfeld kentindeki Charles River Laboratuvarlarından temin edildi. - Evcil hayvanlar, alışkanlıkla adapte edilmiş polikarbonat tip III kafeslerde, her kafeste maksimum üç yetişkin fare.
NOT: Ayrılmış erkekler bu çalışma için standart polikarbonat tip II kafeslerde barındırıldı. - Hayvan odasını 22 ± 2 °C ve %10 bağıl nemle 55 ± 12 saat ışık/karanlık döngüde sabah 6:00'da ışıklar açık tutun.
- Standart bir bakım diyeti ve su ile sıvı sağla.
- Her kafese aspen ağacı yatak takımı, kağıt tuvalet rulosu, kırmızı şeffaf plastik bir ev ve yuva malzemesi olarak kağıt havlular ekleyin.
- Fareleri öncelikle doğal kuyruk işaretleriyle tanımlayın. Gerekirse, benzer kuyruk işaretlerine sahip hayvanlara tartım sırasında geçici olarak kalem işaretleri uygulanır.
3. Hayvanların alışkanlığı ve eğitimi
NOT: Tamamlanan kafes, üç ayrı toplama kutusu (PTII) ile bir örnekleme kafesine bağlı bir ev kafesi, PTIII'den oluşur. Ev kafesleri, geleneksel kafesler gibi kullanılabilir; yatak takımı, kafes zenginleştirme, harici bağlantı elemasız tel kapak ve yiyecek ile su sağlar. Sistem yıkama için sökülebilir ve sadece örnekleme haftalarında kullanılabilir. Örnekleme yapılmayan haftalarda hayvanlar standart PTIII kafeslerinde barındırılabilir.
- Hayvanları ilk planlanan örnekleme oturumundan en az iki hafta önce kafes sistemine yerleştirin.
- Hayvanları toplama kutularına alıştırmak için bir gece boyunca sürgülü kapıları çıkarın, böylece hayvanlar kutuları özgürce keşfetebilirler.
- İlk örnekleme oturumundan önce üç antrenman seansı yapın. Aynı ışık koşullarında ve günün aynı saatinde eğitim yapılarak daha sonraki örnekleme için planlanın; ideal olarak karanlık dönemin başlamasından kısa bir süre sonra kırmızı ışık altında.
- Her toplama kutusunun girişinin karşısındaki duvara fındık kreması, fıstık ezmesi, malt ezmesi veya benzeri lezzetli bir yiyecek gibi küçük bir ödül ürününü uygulayın.
- İlk eğitim gününde kapıları açık bırakın ve hayvanların ödülü gönüllü olarak keşfedip tüketmesine izin verin.
- İkinci eğitim gününde, bir hayvan toplama kutusuna girip ödülü yalamaya başlayana kadar bekle. Hayvanın arkasındaki sürgülü kapıyı dikkatlice kapatın ve 10 dakika sonra açın.
- Üçüncü eğitim gününde prosedür tekrarlanır ve hayvanların toplama kutularında kaldığı süreyi kademeli olarak uzatır.
NOT: Eğitim sakin ve tutarlı olmalı. Hayvanları kutulara kovalamaktan kaçının, çünkü bu stresi artırabilir ve sonraki örnekleme oturumlarında gönüllü katılımı azaltabilir.
4. Dışkı örneklerinin toplanması
- Örnek toplama zamanlaması
- Örnekleme süresini, biyolojik soruya ve plazma kortikosteron ile fekal kortikosteron metabolit salınımı arasındaki beklenen gecikmeye göre planlayın. Farelerde, fekal kortikosteron metabolitleri genellikle örneklemeden yaklaşık 8-10 saat önce dolaşımdaki glukokortikoid seviyelerini yansıtır.
NOT: Kesin zamanlama kritik ise, kullanılan spesifik suş, cinsiyet ve deneysel koşullarda FCM salgısının zaman seyrini belirlemek için pilot çalışma yapın. Bu pilot eğitim seanslarıyla birleştirilebilir. - Yüksek dışkı çıkışı döneminde numune almayı planlayın. Örnekleme genellikle karanlık ve aktif fazanın başında en verimli olur.
- FCM seviyelerinin günlük ritminden kaynaklanan değişimi azaltmak için tüm örnekleme oturumlarını günün aynı saatinde gerçekleştirin.
NOT: Deneyimimize göre, sabah saat 10:00 civarında gerçekleşen olaylar, hayvan odasının ışık programına bağlı olarak, örnekleme 18:00 ile 20:00 arasında planlandığında iyi yansıtılır.
- Örnekleme süresini, biyolojik soruya ve plazma kortikosteron ile fekal kortikosteron metabolit salınımı arasındaki beklenen gecikmeye göre planlayın. Farelerde, fekal kortikosteron metabolitleri genellikle örneklemeden yaklaşık 8-10 saat önce dolaşımdaki glukokortikoid seviyelerini yansıtır.
- Örnekleme prosedürü ve pratik tavsiyeler
- Numune almadan önce hayvanları tek tek işaretleyin. Kulak işaretleri veya bireysel kuyruk işaretleri kullanın.
NOT: Kırmızı ışık altında kutuların içinde parmak işaretleri ve renk kodları tanınması zor olabilir. - Ödülü her kutunun arka duvarına uygulayarak ışık aşamasında toplama kutularını hazırlayın.
NOT: Kutuların gün içinde hazırlanması, deneycinin görünürlüğünü artırır ve hayvanların numune almadan önce ödülü koklamasına olanak tanır. - Planlanan örnekleme zamanında, toplama kutularını açın ve hayvanların gönüllü olarak girmesini bekleyin.
- Bir fare toplama kutusuna girdikten sonra, arkasındaki sürgülü kapıyı dikkatlice kapatın.
- Tüm hayvanlar bir kutuya girdikten sonra, her farenin kimliğini ve konumunu hazırlanmış bir örnekleme sayfasına kaydedin.
- Bir oturumda 10'dan fazla kafes örneklenirse, hayvan tanımlama, kapı kullanımı ve dokümantasyonu desteklemek için ikinci bir deneyciyi dahil et.
- Hayvanları, beklenen dışkı çıktısı ve çalışma tasarımına bağlı olarak, genellikle 30 dakika ile 2 saat arasında, planlanan örnekleme süresi boyunca toplama kutularında tutun.
NOT: Bireysel kimlik kesin olarak atanamıyorsa, dışkı pelletleri başka bir hayvanın idrarı, yatak veya dışkısıyla kirlenmişse, örnekleme süresi planlanan zaman aralığından önemli ölçüde sapıyorsa veya dışkı miktarı FCM analizi için yeterli değilse, örnekleri hariç tutun.
NOT: 50 mg kullanımı standart protokolümüzdür ve bu miktar tüm doğrulamalarda ve diğertüm makalelerde 5,7,8 kullanılmıştır. Normalde kolayca elde edilebilir. - Örnekleme süresinin sonunda, sürgülü kapıları açın ve farelerin ev kafesine dönmesine izin verin.
- Fareler ayrıldıktan hemen sonra toplama kutularını kapatarak yeniden giriş ve çapraz kontaminasyon önlenmesini önleyin.
- Her toplama kutusundan dışkı pelletlerini uzun forseps kullanarak çıkarın ve bunları ayrı etiketlenmiş toplama tüplerine aktarın.
- Numuneleri FCM testinin daha fazla hazırlanmasına kadar -20 °C'de depolayın.
NOT: Kutular güvenli bir şekilde kapalıysa ve fareler tarafından tekrar girilemezse, dışkı pellet toplama işlemi bir sonraki ışık aşamasına kadar ertelenebilir. Ancak, bu bir çalışma içinde tutarlı şekilde yapılmalıdır. - Hayvanları bir sonraki kafes değişimine kadar ev kafesi bölümünde (PTIII) tutun. Sonra sökülüp sıradan bir kafes çamaşır makinesinde yıkanabilirler.
- Numune almadan önce hayvanları tek tek işaretleyin. Kulak işaretleri veya bireysel kuyruk işaretleri kullanın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Fekal kortikosteron metabolitleri (FCM'ler), kalıcı ve aralıklı olarak yetiştirilen fareleri karşılaştıran uzunlamasına bir çalışmada özel olarak hazırlanmış dışkı numuneleriyle toplanan örneklerden başarıyla nicelendirilmiştir. Temsilli FCM analizi 30 hayvanı içerdi: kalıcı olarak yetiştirilen grup, n = 5 kafeste 15 hayvan; aralıklı olarak yetiştirilen grup, n = 10 hayvan 5 kafeste, 5 erkek tek başına barındırılmış, 3 üreme olayında dişilerle birlikte taşınmışlardır. Örnekler, kafes değ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, grup olarak yerleştirilen farelerden bireysel olarak atanabilen dışkı örnekleri toplamak için basit bir kafes sistemini tanımlar. Yöntemin temel avantajı, bireysel örnek attıfını, sosyal konutun temel yönlerinin, özellikle kafes arkadaşlarıyla görsel ve koku temasının korunmasıyla birleştirmesidir. Bu önemlidir çünkü grup barınması genellikle hayvan refahı için gereklidir ve deneysel tasarımın bir parçasıolabilir 10. Havuzlu ev kafesi örneklemesine ka...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını belirtirler.
Teşekkürler
Bu makalenin yayımlanmasını desteklediği için Prof. Pollak'a teşekkür ederiz.
Katharina Tillmann, 99 yaşında kafes sisteminin planlanmasına katkıda bulunan, ahşap atölyesini hizmete alan ve zımparalama ile inşaatta yardımcı olan merhum büyükbabası Bruno Wochner'ın desteğini minnettarlıkla takdir ediyor. Zanaatkarlığa ve inşaata olan tutkusu kalıcı bir ilham kaynağı oldu ve burada minnetle hatırlanıyor.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Delme ucu 5 mm | Craftomat | 22380487 | 5mm çap; Miktar 1 |
| Delme ucu 60 mm | Bosch | 32064647 | 60 mm çap; Miktar 1 |
| Delme ucu 7 mm | Craftomat | 22380520 | 7 mm çap; Miktar 1 |
| Delme makinesi | Makita | 25730054 | Standart el veya tezgah delme makinesi; Miktar 1 |
| Sıcak tutkal tabancası | Einhell | 29051207 | Kafes montajı için; Miktar 1 |
| Sıcak tutkal çubukları | Einhell | 29049664 | Sıcak tutkal tabancasıyla uyumlu; Miktar 5-10 |
| Makrolon kafes | Animalab | 31200129 | Standart Tip II kafes; Miktar 1 |
| Makrolon kafes | Animalab | 31200256 | Standart Tip III kafes; Miktar 1 |
| Plexiglas / akrilik cam | Bauhaus | 29122352 | Yaklaşık 0.25 m² toplam; 5 mm kalınlık; Miktar 2DIN A3 levha |
| Testere veya freze cihazı | Scheppach | 32079641 | Küçük bant testere, jigsaw veya CNC freze; Miktar 1 |
| Dişli vidalar | Profi Depot | 10807533 | 20 mm × 3 mm; Miktar 4 |
| Ahşap çubuklar | Ikea | 903.429.71 | Yuvarlak ahşap çubuklar; Miktar 3 |
Kaynaklar
- Abelson KS, Adem B, Royo F, Carlsson HE, Hau J. High plasma corticosterone levels persist during frequent automatic blood sampling in rats. In vivo (Athens, Greece) 2005; 19(5): 815-819.
- Kim S, Foong D, Cooper MS, Seibel MJ, Zhou H. Comparison of blood sampling methods for plasma corticosterone measurements in mice associated with minimal stress-related artefacts. Steroids 2018; 135: 69-72.
- Teilmann AC, Kalliokoski O, Sorensen DB, Hau J, Abelson KS. Manual versus automated blood sampling: impact of repeated blood sampling on stress parameters and behavior in male NMRI mice. Lab Anim 2014; 48(4): 278-291.
- Thanos PK, Cavigelli SA, Michaelides M, Olvet DM, Patel U, Diep MN et al. A non-invasive method for detecting the metabolic stress response in rodents: characterization and disruption of the circadian corticosterone rhythm. Physiological research 2009; 58(2): 219-228.
- Touma C, Sachser N, Möstl E, Palme R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. General and Comparative Endocrinology 2003; 130(3): 267-278.
- Frynta D, Nováková M, Kutalová H, Palme R, Sedláček F. Apparatus for Collection of Fecal Samples from Undisturbed Spiny Mice (Acomys cahirinus) Living in a Complex Social Group. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS 2009; 48(2): 196-201.
- Meyer N, Kroger M, Thummler J, Tietze L, Palme R, Touma C. Impact of three commonly used blood sampling techniques on the welfare of laboratory mice: Taking the animal's perspective. PLoS One 2020; 15(9): e0238895.
- Touma C, Palme R, Sachser N. Analyzing corticosterone metabolites in fecal samples of mice: a noninvasive technique to monitor stress hormones. Hormones and Behavior 2004; 45(1): 10-22.
- Müller K, Lengheimer T, Kral-Pointner JB, Wojta J, Yeghiazaryan L, Krall C et al. Exposure to soiled bedding reduces abnormal repetitive behaviors in mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience 2022; 16.
- Cinque C, Zinni M, Zuena AR, Giuli C, Alemà SG, Catalani A et al. Faecal corticosterone metabolite assessment in socially housed male and female Wistar rats. Endocrine connections 2018; 7(2): 250-257.
- Palme R. Monitoring stress hormone metabolites as a useful, non-invasive tool for welfare assessment in farm animals. Animal Welfare 2012; 21(3): 331-337.
- Kalliokoski O, Jacobsen KR, Teilmann AC, Hau J, Abelson KSP. Quantitative Effects of Diet on Fecal Corticosterone Metabolites in Two Strains of Laboratory Mice. In vivo (Athens, Greece) 2012; 26(2): 213.
- Rowland NE, Toth LA. Analytic and Interpretational Pitfalls to Measuring Fecal Corticosterone Metabolites in Laboratory Rats and Mice. Comparative medicine 2019; 69(5): 337-349.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
