MiR-93-5p, pediatrik Mycoplasma pneumoniae pnömonisinde (MPP) Toll benzeri reseptör 4'ü (TLR4) doğrudan hedefler. Ekspresyonundaki azalma, hastalığın ilerlemesine ve buna eşlik eden sindirim sistemi hasarına katkıda bulunabilir. Bu bulgular, miR-93-5p'nin MPP ve sindirim sistemi hasarlı MPP için potansiyel bir tanısal biyobelirteç olarak hizmet edebileceğini göstermektedir.
Araştırma makalesi
Sindirim Sistemi Hasarı ile Birlikte Mycoplasma pneumoniae Enfeksiyonu Geçiren Çocuklarda miR-93-5p'nin Rolünün Değerlendirilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
MiR-93-5p'nin akut akciğer hasarını modüle ettiği bilinmektedir, ancak sindirim sistemi hasarıyla seyreden pediatrik Mycoplasma pneumoniae pnömonisindeki (MPP) rolü ve tanısal değeri henüz netleşmemiştir. Bu çalışma, çocuklarda MPP ve buna eşlik eden sindirim sistemi komplikasyonları için miR-93-5p'nin potansiyel bir tanısal biyobelirteç olarak rolünü değerlendirmiştir. Klinik örnekler, MPP'li pediatrik hastalardan ve sağlıklı kontrollerden toplanmıştır. MiR-93-5p ekspresyonu, ters transkripsiyon kantitatif PCR ile ölçülmüştür. Hücre canlılığındaki değişiklikleri ve pro-inflamatuar sitokinleri değerlendirmek amacıyla, Mycoplasma pneumoniae (MP) ile enfekte edilmiş A549 hücreleri kullanılarak hücresel bir MPP modeli oluşturulmuştur. miR-93-5p'nin Toll-benzeri reseptör 4'ü (TLR4) hedeflemesi, bir lusiferaz raporlayıcı testi kullanılarak değerlendirilmiştir. Tanısal performans, alıcı işletim karakteristik (ROC) eğrisi analizi ile değerlendirilmiştir. MPP'li hastalarda miR-93-5p düzeyleri, sağlıklı kontrollere kıyasla anlamlı düzeyde azalmıştır (P < 0,001) ve sindirim sistemi hasarı olan MPP'li hastalarda, sadece MPP'si olanlara kıyasla daha da azalmıştır. MP enfeksiyonu hücre canlılığını azaltmış, IL-6 ve TNF-α düzeylerini artırmış, buna karşılık miR-93-5p aşırı ekspresyonu bu etkileri hafifletmiştir. TLR4 ekspresyonu MP enfeksiyonu sonrası artmış ve miR-93-5p tarafından negatif olarak regüle edilmiştir. Klinik olarak, MPP'li hastalardaki sindirim sistemi hasarı, daha düşük miR-93-5p düzeyleri ile ilişkili bulunmuştur. ROC eğrisi analizleri, MPP'li hastaların sağlıklı kontrollerden ve sindirim sistemi hasarlı MPP'li hastaların sadece MPP'si olanlardan ayırt edilmesinde başarılı bir tanısal performans göstermiştir. MiR-93-5p, pediatrik MPP'de TLR4'ü doğrudan hedeflemektedir ve downregülasyonu hastalık ilerlemesine ve buna eşlik eden sindirim sistemi hasarına katkıda bulunabilir. Bu bulgular, miR-93-5p'nin MPP ve sindirim sistemi hasarlı MPP için potansiyel bir tanısal biyobelirteç olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir.
Giriş
Mycoplasma pneumoniae (MP), çocuklarda pnömoniden sorumlu temel bir patojendir1 ve dünya genelinde sıklıkla ciddi solunum sistemi morbiditesine yol açar. MP öncelikle pulmoner enfeksiyona neden olsa da, birden fazla organ sistemini etkileyen ekstrapulmoner komplikasyonlara da yol açabilir2. M. pneumoniae enfeksiyonu sırasında en sık bildirilen gastrointestinal semptomlar arasında bulantı, kusma, ishal ve karın ağrısı yer almaktadır3. Bir dizi gastrointestinal durum ve belirti, M. pneumoniae kaynaklı ekstrapulmoner hastalıkların (MPEPDs) bir parçası olarak tanımlanmıştır2. Sindirim sistemi hasarıyla komplike olmuş M. pneumoniae pnömonisi (MPP) olan pediatrik hastalar, hastalığın şiddetini artırabilecek ve yönetimi zorlaştırabilecek klinik zorluklar ortaya çıkarır4. Ortaya çıkan kanıtlar, bu ilişkinin temelinde yatabilecek pulmoner enfeksiyon ve intestinal disfonksiyon arasındaki bir etkileşime işaret etmektedir5,6. MP enfeksiyonu sırasında immün yanıtların düzensizleşmesi, sindirim sistemi hasarıyla da ilişkili olabilir7.
Tanı yöntemlerindeki ilerlemelere rağmen8, diğer solunum yolu enfeksiyonlarıyla örtüşen klinik belirtiler ve değişken ekstrapulmoner tutulum nedeniyle MPP'nin erken ve doğru bir şekilde tanımlanması zor olmaya devam etmektedir9. Akciğer ve bağırsak, ortak mukoza bağışıklık sisteminin temel bileşenleridir ve bu organlar, akciğer hastalığı sırasında görülen bağırsak bozuklukları ve karşılıklı etkilerle yansıtıldığı üzere, birbirlerinin işlevlerini etkileyebilir; bu fenomen akciğer-bağırsak etkileşimi (lung-gut crosstalk) olarak bilinir10. Ayrıca, pediatrik hemşirelik bakımı öncelikle solunum semptomlarının yönetimine odaklanırken11, gastrointestinal belirtiler yeterince fark edilmeyebilir veya tedavi yan etkilerine bağlanabilir. Bu boşluk, destekleyici hemşirelik girişimlerini optimize etmek için hem pulmoner hem de gastrointestinal değerlendirmeyi entegre eden kapsamlı bir değerlendirme ihtiyacının altını çizmektedir12. Güncel moleküler çalışmalar, MPP'de hem akciğer patolojisinde hem de bağırsak inflamasyonunda rol oynayan inflamatuar sinyal yolaklarının düzenleyicilerini vurgulamıştır12,13.
MiR-93-5p'nin, downregülasyonunun bozulmuş pulmoner fonksiyon ve şiddetlenmiş inflamatuar yanıtlarla ilişkili olduğu akut akciğer hasarının patogenezinde rol oynadığı bildirilmiştir14,15. Bu bulgulara dayanarak, MPP'li çocukların serumunda miR-93-5p'nin benzer şekilde downregüle olduğu hipotezi kurulmuştur. TargetScan veri tabanı kullanılarak yapılan biyoinformatik analizler, Toll benzeri reseptör 4'ü (TLR4), miR-93-5p'nin potansiyel bir doğrudan hedefi olarak belirlemiştir. TLR4'ün akciğer-bağırsak aksının modülasyonunda önemli bir rol oynadığı rapor edilmiştir16,17 ve bu nedenle MPP'deki gastrointestinal komplikasyonlarla potansiyel olarak ilişkili olduğu düşünülmüştür. Buna uygun olarak, bu çalışma, sindirim sistemi hasarıyla komplike olmuş MPP'li pediatrik hastalarda miR-93-5p'nin rolünü araştırmıştır.
Protokol
Bu çalışma, Yangzhou Üniversitesi Bağlı Hastanesi Etik Kurulu tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır (Onay No. 2023-YKL01-(16); 17 Ocak 2023). İlgili laboratuvar analizleri için her katılımcıdan periferik venöz kan örnekleri toplanmıştır. Katılım öncesinde, tüm katılımcıların yasal vasilerinden bilgilendirilmiş onam alınmıştır. Bu protokolde kullanılan reaktifler, ekipmanlar ve araçlar Materyaller Tablosunda listelenmiştir.
1. Klinik örnek toplama
Şubat 2023 ile Aralık 2024 tarihleri arasında Yangzhou Üniversitesi Bağlı Hastanesi'nde 2-14 yaşları arasında toplam 108 çocuk çalışmaya dahil edildi. 108 çocuğun tamamına, göğüs görüntülemesi ve nazofaringeal örneklerde MP DNA'sı için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) testi ile doğrulanmış MPP tanısı konuldu. Nazofaringeal sürüntülerdeki MP DNA'sı, MP'ye özgü P1 adezin genini hedefleyen kantitatif gerçek zamanlı PCR ile tespit edildi.
Hastalar, hastalık durumuna göre iki gruba ayrılmıştır: DSI olmayan MPP (n = 60) ve DSI olan MPP (n = 48). DSI, rebound hassasiyeti olsun veya olmasın ishal (günde ≥3 kez, >24 saat süren gevşek veya sulu dışkılama), mide bulantısı, kusma veya kalıcı abdominal ağrı dahil olmak üzere en az bir gastrointestinal semptomun varlığına ek olarak, en az bir anormal laboratuvar parametresi ve/veya doğrulayıcı abdominal görüntüleme bulgusunun eşlik etmesi şeklinde tanımlanmıştır. Anormal laboratuvar parametreleri arasında yükselmiş serum transaminazlar, amilaz veya lipaz ve/veya D-laktat ve endotoksin gibi artmış bağırsak geçirgenlik belirteçleri yer almıştır. Doğrulayıcı abdominal görüntüleme bulguları arasında ultrasonografi veya bilgisayarlı tomografi ile saptanan bağırsak duvarı kalınlaşması, büyümüş mezenterik lenf nodları veya peritonal efüzyon yer almıştır. Ayrıca, rutin muayene gören 60 sağlıklı çocuk kontrol grubu olarak hizmet etmiştir.
- Dahil etme kriterleri
Gastrointestinal semptomların yanı sıra laboratuvar veya görüntüleme anormallikleri sergileyen hastalar DSI grubuna dahil edildi. - Hariç tutma kriterleri
Hariç tutma kriterleri arasında viral veya bakteriyel pnömoni, tüberküloz, çalışma ilaçlarına karşı ilaç alerjisi öyküsü, bağışıklık sistemi bozuklukları, malnütrisyon, böbrek fonksiyon bozukluğu, gastrointestinal malformasyonlar ve yatış öncesi antibiyotik tedavisi yer aldı.
2. Hücre kültürü ve MPP modeli
Mycoplasma pneumoniae standart suşu ATCC 15531, PPLO besiyerinde kültüre edildi. İnsan alveoler epitel A549 hücreleri, %10 fetal bovine serum içeren RPMI-1640 besiyerinde, nemlendirilmiş koşullarda, 37 °C'de ve %5 CO₂ altında kültüre edildi.
MPP'nin in vitro modelini oluşturmak için, A549 hücreleri 1:100 enfeksiyon çokluğu (MOI) ile M. pneumoniae süspansiyonları ile enfekte edildi18. Enfeksiyonun ardından, kültür ortamı değiştirilerek bağlanmamış bakteriler uzaklaştırıldı. Enfeksiyon verimliliği, enfeksiyon sonrası kültür süpernatantlarında qPCR ile MP DNA deteksiyonu yapılarak doğrulandı.
3. Plazmid yapımı ve transfeksiyon
MiR-93-5p taklitçileri, TLR4 aşırı ekspresyon (oe-TLR4) plazmidleri ve bunlara karşılık gelen negatif kontroller ticari olarak sentezlenmiştir. MP enfekte A549 hücreleri, lipid tabanlı bir transfeksiyon reaktifi kullanılarak transfekte edilmiştir. Transfeksiyon verimliliği, transfeksiyondan 48 saat sonra ters transkripsiyon kantitatif PCR (RT-qPCR) ile değerlendirilmiştir.
4. RT-qPCR analizi
Toplam RNA, deneylerin sonunda toplanan A549 hücrelerinden ekstrakte edildi. Hücreler, fosfat tamponlu salin (PBS) kullanılarak lizlendi ve homojenize edildi. Toplam RNA, fenol tabanlı bir RNA ekstraksiyon reaktifi kullanılarak saflaştırıldı. miR-93-5p'nin ters transkripsiyonu için bir ters transkripsiyon kiti kullanılırken, mRNA analizi için komplemanter DNA, ticari olarak mevcut bir ters transkripsiyon reaktifi kullanılarak sentezlendi. RT-qPCR analizi, SYBR Green kimyası kullanılarak gerçekleştirildi.
5. MTT analizi
Her bir deney grubundaki transfekte edilmiş A549 hücreleri hasat edildi ve kuyuk başına 2 × 103 hücre yoğunluğunda 96 kuyucuklu plakalara ekildi. Ardından, her bir kuyucuğa 20 µL metiltiyazolildifeniltetrazolyum bromür (MTT) reaktifi eklendi. 37 °C'de 2 saatlik ek bir inkübasyonun ardından, süpernatanlar dikkatlice uzaklaştırıldı. Metabolik olarak aktif hücreler tarafından oluşturulan formazan kristalleri, analiz talimatlarına uygun olarak çözündürüldü. Hücre canlılığı, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak 490 nm'de optik yoğunluk (OD) ölçülerek dolaylı olarak belirlendi.
6. Enzim bağlı immünosorbent assay
İnterlökin-6 (IL-6) ve tümör nekroz faktör-α (TNF-α) seviyelerini ölçmek için ticari enzim bağlı immünosorbent assay (ELISA) kitleri kullanılmıştır. Analizler, üreticinin talimatlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Doğruluğu ve tekrarlanabilirliği sağlamak amacıyla ölçümler, iki bağımsız deneysel tekrar boyunca üç tekrarlı (triplicate) olarak yapılmıştır.
7. Dual-lüsiferaz raporlayıcı analiz
TLR4'ün 3′ çevrilmeyen bölgesi (UTR) içindeki MiR-93-5p bağlanma bölgeleri TargetScan veri tabanı kullanılarak tahmin edildi. Yabanı tip (WT) veya mutasyona uğramış (MUT) dizileri içeren fragmanlar bir lüsiferaz raporlayıcı vektöre klonlandı. A549 hücrelerine, lipid bazlı bir transfeksiyon reaktifi kullanılarak 500 ng WT veya MUT konstrüktü ile birlikte miR-93-5p mimikleri veya kontrolleri ko-transfekte edildi. 48 saat sonra, çift lüsiferaz raporlayıcı deneyi kullanılarak lüsiferaz aktivitesi ölçüldü. Transfeksiyon verimliliğini hesaba katmak için ateş böceği lüsiferaz aktivitesi, Renilla lüsiferaz aktivitesine göre normalize edildi.
8. Western blotting analizi
Western blotting için hücre lizatları yükleme tamponu ile karıştırılmış ve 10,000 × g'de 3 dk boyunca santrifüj edilmiştir. Süpernatanlar sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezine tabi tutulmuş ve proteinler poliviniliden florür membranlara aktarılmıştır. Membranlar oda sıcaklığında 1 saat boyunca %5 sığır serum albümini (BSA) ile bloke edilmiş ve ardından Tween 20 ile %5 BSA içeren Tris tamponlu salin içinde 1:1000 seyrelmede gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) ve inhibitör kappa B alfa (IκBα) karşıtı primer antikorlarla 4 °C'de gece boyunca inkübe edilmiştir. Üç yıkama işleminden sonra membranlar oda sıcaklığında 1 saat boyunca HRP-konjuge keçi anti-tavşan IgG (1:500) ile inkübe edilmiştir. Ek yıkamaların ardından protein bantları, gelişmiş kemilüminesans substrat kullanılarak görselleştirilmiş ve bir kemilüminesans görüntüleme sistemi ile görüntülenmiştir. Hedef proteinlerin ve GAPDH'nin bant yoğunlukları, görüntü analiz yazılımı kullanılarak üç bağımsız deneyden nicelleştirilmiştir.
9. İstatistiksel analiz
İstatistiksel analizler, istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ölçüm verilerinin normalliği Shapiro-Wilk testi ile değerlendirilmiştir. Normal dağılım gösteren veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuş ve iki grup için bağımsız örneklemler t-testi veya çoklu gruplar için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak karşılaştırılmıştır. ANOVA genel bir anlamlı fark gösterdiğinde, ikili karşılaştırmalar için Tukey post hoc testi kullanılmıştır. Normal dağılım göstermeyen veriler Mann-Whitney U testi ile analiz edilmiştir. Kategorik değişkenler sayı ve yüzde olarak ifade edilmiş ve ki-kare testleri ile karşılaştırılmıştır. MPP veya DSI ile seyreden MPP'yi öngörmede miR-93-5p'nin tanısal potansiyelini değerlendirmek için alıcı işletim karakteristik (ROC) eğrisi analizi kullanılmıştır. DSI ile seyreden MPP ile ilişkili öngördürücü faktörleri belirlemek için çok değişkenli lojistik regresyon uygulanmıştır. Modele dahil edilen değişkenler arasında yaş, cinsiyet, ateş süresi, antibiyotik kullanım süresi ve medyan değerine göre ikiye ayrılmış miR-93-5p ekspresyonu yer almıştır. İki yönlü P değeri <0.05 olan sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.
Sonuçlar
Pediyatrik MPP'de MiR-93-5p azalmıştır
Pediyatrik MPP'de bir biyobelirteç olma potansiyelini araştırmak amacıyla miR-93-5p'nin diagnostik performansı değerlendirilmiştir. Şekil 1A'da gösterildiği üzere, miR-93-5p ekspresyonu, sağlıklı kontrollere kıyasla MPP'li pediyatrik hastalarda anlamlı derecede azalmıştır. İki grubun demografik ve hematolojik özellikleri Tablo 1'de özetlenmiştir. Gruplar arasında yaş veya cinsiyet dağılımında istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlenmemiştir (P > 0.05). Ancak, MPP grubunda periferik beyaz kan hücresi sayısı (WBC), nötrofil yüzdesi (Net%) ve C-reaktif protein (CRP) seviyeleri, sağlıklı kontrollere kıyasla anlamlı derecede yüksek bulunmuştur (P < 0.001).
miR-93-5p'nin MPP'li hastaları sağlıklı çocuklardan ayırt etmedeki tanısal performansını daha ayrıntılı değerlendirmek için alıcı işletim karakteristiği (ROC) eğrisi analizi gerçekleştirilmiştir (Şekil 1B). Eğri altındaki alan (AUC) 0,9009 [%95 güven aralığı (GA): 0,8537–0,9482] olup, duyarlılık %80,56 ve özgünlük %88,33 olarak belirlenmiştir. Bu bulgular, serum miR-93-5p seviyelerindeki azalmanın pediatrik MPP ile ilişkili olduğunu göstermektedir.
miR-93-5p'nin MPP hücre modelleri üzerindeki etkisi
MPP hücre modelinde miR-93-5p'nin etkisini değerlendirmek için bir dizi in vitro deney gerçekleştirilmiştir. Kontrol hücreleriyle karşılaştırıldığında, MPP hücre modelinde miR-93-5p ekspresyonunun azaldığı görülmüştür (Şekil 2A). MP enfeksiyonu aynı zamanda A549 hücrelerinin canlılığındaki azalma ile ilişkilendirilmiştir (Şekil 2B). Ayrıca, MPP modelinde pro-inflamatuar sitokinler IL-6 ve TNF-α seviyelerinin kontrollere kıyasla arttığı belirlenmiştir (Şekil 2C).
miR-93-5p'nin fonksiyonel etkisini daha ayrıntılı değerlendirmek için, MP enfekte A549 hücrelerinde bir miR-93-5p aşırı ekspresyon modeli oluşturuldu (Şekil 2D). miR-93-5p aşırı ekspresyonu, miR-93-5p aşırı ekspresyonu olmayan MPP modeline kıyasla hücre canlılığını önemli ölçüde artırdı (Şekil 2E). Bu bulgularla uyumlu olarak, artan miR-93-5p ekspresyonuna IL-6 ve TNF-α üretiminde azalma eşlik etti (Şekil 2F). Bu sonuçlar, MP enfeksiyonu sırasında azalmış miR-93-5p ekspresyonunun düşük hücre canlılığı ve artmış inflamatuar yanıtlar ile ilişkili olduğunu, miR-93-5p aşırı ekspresyonunun ise bu değişiklikleri hafiflettiğini göstermektedir.
MiR-93-5p, TLR4'yü hedefler
miR-93-5p ve TLR4 arasındaki düzenleyici ilişkiyi açıklığa kavuşturmak için yapılan biyoinformatik analiz, TLR4 mRNA'sının 3′ translate edilmeyen bölgesinde (UTR) öngörülen bir miR-93-5p bağlanma bölgesi belirlemiştir (Şekil 3A). Kontrollerle karşılaştırıldığında, MP hücre modelinde TLR4 ekspresyonu artış göstermiştir (Şekil 3B). Öngörülen etkileşim daha sonra bir lusiferaz raporlayıcı testi ile değerlendirilmiştir. miR-93-5p mimikleri ile birlikte yapılan ko-transfeksiyon, vahşi tip konstrüktun lusiferaz aktivitesini azaltmış ve bu durum öngörülen bölgeye spesifik bağlanmayı göstermiştir (Şekil 3C).
MP ile enfekte edilmiş hücrelerde miR-93-5p'nin aşırı ekspresyonu, mimic tedavisi uygulanmamış enfekte kontrollere kıyasla TLR4 ekspresyonunu azaltmıştır (Şekil 3D). TLR4 modülasyonu ile ilişkili downstream etkileri daha ayrıntılı incelemek için TLR4 aşırı ekspresyonu olan A549 hücre modelleri oluşturulmuştur (Şekil 3E). Western blot analizi, TLR4 aşırı ekspresyonunu takiben IκBα seviyelerinde artış olduğunu göstermiştir (Şekil 3F).
Kontrol hücrelerine kıyasla, TLR4 aşırı ekspresyonu MP enfeksiyonu sonrası hücre canlılığını belirgin şekilde azaltırken, miR-93-5p'nin eş zamanlı aşırı ekspresyonu bu azalmayı geri çevirmiştir (Şekil 3G). İnflamatuar sitokinlerin ölçümü, TLR4 aşırı ekspresyonunun pro-inflamatuar medyatör seviyelerini artırdığını, miR-93-5p aşırı ekspresyonunun ise TLR4 aşırı ekspresyonu varlığında bile bu değişiklikleri hafiflettiğini göstermiştir (Şekil 3H). Bu bulgular, miR-93-5p'nin TLR4 ekspresyonunu negatif olarak regüle ettiğini ve MP enfeksiyonu ile ilişkili hücresel değişiklikleri hafiflettiğini göstermektedir.
MPP ve DSI eşlik eden MPP'de miR-93-5p'nin tanısal değeri
Önceki raporlar, TLR4'ün akciğer ve kolon dokularındaki rolünü tanımlamıştır16. Bu nedenle, miR-93-5p ile MPP'deki sindirim sistemi hasarı arasındaki potansiyel ilişki klinik olarak değerlendirilmiştir. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, miR-93-5p ekspresyonu MPP+DSI grubunda, MPP grubuna kıyasla azalmıştır.
Demografik ve hematolojik özellikler Tablo 2'de özetlenmiştir. Gruplar arasında yaş veya cinsiyet açısından anlamlı bir fark gözlemlenmemiştir. Ancak, eş zamanlı DSI olan hastalarda ateş süresi ve antibiyotik kullanımı anlamlı derecede daha uzundur (P < 0.05).
DSI olan MPP vakalarının DSI olmayanlardan ayırt edilmesinde miR-93-5p'nin tanısal değeri, ROC eğrisi analizi kullanılarak değerlendirilmiştir. AUC değeri 0,7866 (95% CI: 0,6889–0,8843) (Şekil 4B), %85,71 duyarlılık ve %57,45 özgüllük olarak belirlenmiştir.
Çok değişkenli lojistik regresyon analizi; düşük miR-93-5p ekspresyonu, uzamış ateş süresi ve uzun süreli antibiyotik kullanımının, MP enfeksiyonu sırasında sindirim sistemi hasarıyla ilişkili faktörler olduğunu belirlemiştir (Tablo 3; P < 0.05).
Şekil 1: Sağlıklı kontrollerde (n = 60) ve MPP hastalarında (n = 108) miR-93-5p ekspresyonu ve tanısal değeri. (A) MPP'li hastalarda miR-93-5p ekspresyonu azalmıştır. (B) miR-93-5p'nin ROC eğrisi analizi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: MP enfekte hücre modelinde miR-93-5p'nin fonksiyonel etkileri. (A) MP enfekte modelde miR-93-5p ekspresyonu azalmıştır. (B) MP enfekte modelde hücre canlılığı azalmıştır. (C) MP enfekte modelde TNF-α ve IL-6 seviyeleri artmıştır. (D) miR-93-5p mimic'in transfeksiyon verimliliği. (E) miR-93-5p aşırı ekspresyonu sonrası hücre canlılığı artmıştır. (F) miR-93-5p aşırı ekspresyonu sonrası TNF-α ve IL-6 seviyeleri azalmıştır. n = 3. P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: MiR-93-5p doğrudan TLR4'yi hedefler. (A) miR-93-5p ve TLR4 arasındaki tahmin edilen bağlanma bölgesi. (B) MP ile enfekte modelde TLR4 ekspresyonu. (C) Dual-lusiferaz raporlayıcı testi. (D) miR-93-5p tarafından TLR4'nün negatif regülasyonu. (E) TLR4 aşırı ekspresyon verimliliği. (F) IκBα'nın Western blot analizi. (G) Hücre canlılığı. (H) TNF-α ve IL-6 seviyeleri. n = 3. P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: MPP'li hastalarda (n = 60) ve DSI olan MPP'li hastalarda (n = 48) miR-93-5p ekspresyonu ve tanısal değeri. (A) MPP+DSI grubunda miR-93-5p ekspresyonu. (B) miR-93-5p'nin ROC eğrisi analizi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Değişken | Sağlıklı (n = 60) | MPP (n = 108) | P |
| yaş (yıl) | 6.81± 3.14 | 7.12 ± 3.55 | 0.559 |
| cinsiyet (erkek/dişi) | 28/32 | 49/59 | 0.872 |
| WBC (× 109/L) | 7.27 ± 0.89 | 9.86 ± 1.36 | <0.001 |
| CRP (mg/L) | 2.35 ± 0.17 | 11.53 ± 2.01 | <0.001 |
| Net % | 42.55 ± 5.62 | 56.51 ± 15.40 | <0.001 |
Tablo 1: Sağlıklı kontroller ile MPP hastalarının demografik özellikleri ve rutin kan parametrelerinin karşılaştırılması.Bu tablo; yaş, cinsiyet, WBC, nötrofil yüzdesi, eozinofil yüzdesi, bazofil yüzdesi ve CRP dahil olmak üzere sağlıklı kontrollerin ve MPP hastalarının demografik özelliklerini ve rutin hematolojik parametrelerini özetlemektedir. Gruplar arası karşılaştırmalar ve karşılık gelen P değerleri sunulmuştur.
| Değişken | MPP (n = 60) | MPP+DSI (n = 48) | P |
| yaş (yıl) | 6.88 ± 3.87 | 7.42 ± 3.11 | 0.441 |
| cinsiyet (erkek/dişi) | 31/29 | 28/20 | 0.494 |
| WBC ( × 10⁹/L) | 8.9 ± 0.89 | 11.05 ± 0.76 | <0.001 |
| CRP (mg/L) | 10.94 ± 1.62 | 12.27 ± 2.22 | <0.001 |
| Net % | 55.87 ± 14.75 | 57.32 ± 16.29 | 0.629 |
| Ateş süresi (gün) | 4.60 ± 1.83 | 7.26 ± 1.04 | <0.001 |
| Antibiyotik kullanım süresi (gün) | 4.65 ± 1.147 | 6.29 ± 0.771 | <0.001 |
Tablo 2: MPP'li hastalar ile MPP+DSI'lı hastalar arasındaki demografik özelliklerin ve rutin kan parametrelerinin karşılaştırılması.Bu tablo, yalnızca MPP'li hastalar ile DSI ile komplike olmuş MPP'li hastalar arasındaki demografik özellikleri, rutin hematolojik parametreleri ve ilgili klinik özellikleri karşılaştırmaktadır. Gruplar arası karşılaştırmalar ve karşılık gelen P değerleri sunulmuştur.
| Değişken | VEYA | %95 GA | p değeri | |
| alt | üst | |||
| miR-93-5p (Düşük ve Yüksek) | 6.702 | 1.487 | 30.211 | 0.013 |
| yaş | 1.126 | 0.286 | 4.437 | 0.866 |
| cinsiyet | 1.071 | 0.27 | 4.248 | 0.923 |
| Ateş süresi | 73.416 | 15.018 | 358.895 | <0.001 |
| Antibiyotik kullanım süresi | 7.921 | 1.877 | 33.421 | 0.005 |
Tablo 3: Sindirim sistemi hasarıyla komplike olmuş MP enfeksiyonlu çocukların lojistik regresyon analizi.Bu tablo, MP enfeksiyonu olan çocuklarda sindirim sistemi hasarıyla ilişkili faktörleri değerlendiren lojistik regresyon analizinin sonuçlarını sunmaktadır. Analiz, her bir değişken için OR, %95 CI ve P değerini içermektedir.
Kısaltmalar: Baso%, bazofil yüzdesi; CI, güven aralığı; CRP, C-reaktif protein; DSI, sindirim sistemi hasarı; Eos%, eozinofil yüzdesi; IκBα, inhibitör kappa B alfa; IL-6, interlökin-6; MP, Mycoplasma pneumoniae; MPP, Mycoplasma pneumoniae pnömonisi; NC, negatif kontrol; Net%, nötrofil yüzdesi; oe-TLR4, TLR4 aşırı ekspresyonu; OR, odds oranı; ROC, alıcı işletim karakteristiği; TLR4, Toll benzeri reseptör 4; TNF-α, tümör nekroz faktörü-α; WBC, beyaz kan hücresi sayısı.
VERİ KULLANILABİLİRLİĞİ:
Şekillerin ve tabloların temelini oluşturan ham sayısal veriler Ek Tablo 1 olarak sunulmuştur.
Ek Tablo 1: Şekiller ve tablolar için ham sayısal veriler. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tartışma
Öncelikle pulmoner bir patojen olarak kabul edilse de, MP enfeksiyonu akciğerlerin ötesinde birden fazla organ sistemini etkileyen çeşitli ekstrapulmoner komplikasyonlara neden olabilir19,20. Yeni kanıtlar, pulmoner patoloji sırasında salınan inflamatuar mediyatörlerin bağırsak florası dengesini21 ve bağırsak fonksiyonunu22 bozduğu, akciğer-bağırsak aksı boyunca bir etkileşim olduğunu göstermektedir. Bu çift yönlü etkileşim, hem solunum semptomlarını hem de gastrointestinal sağlığı ele alan kapsamlı hasta değerlendirmesinin önemini vurgulamaktadır. Bu nedenle, dolaşımdaki serum biyobelirteçleri, potansiyel tanısal veya prognostik değere sahip minimal invaziv araçlar olarak giderek daha fazla dikkat çekmektedir23,24. MiRNA'lar, stabiliteleri ve MP patogenezinde yer alan inflamasyonla ilişkili sinyal yolaklarını düzenlemedeki rolleri nedeniyle gelecek vaat eden adaylar olarak ortaya çıkmıştır25,26,27. Bu çalışma, özellikle sindirim sistemi hasarıyla komplike olan pediatrik MPP'de miR-93-5p'nin rolünü ve klinik önemini sistematik olarak araştırmıştır. MPP'li çocuklarda miR-93-5p seviyeleri sağlıklı kontrollere kıyasla azalmış ve sindirim sistemi hasarı olanlarda daha da düşmüştür. Bu bulgular, miR-93-5p disregülasyonunun pulmoner patolojide potansiyel bir rolü olduğunu ve ekstrapulmoner manifestasyonlar için olası bir biyobelirteç olabileceğini göstermektedir.
MiRNA'ların, vaat edici sensitivite, spesifite ve genel tanısal doğruluk oranlarıyla ağır pnömonide tanısal değeri olduğu gösterilmiştir28,29. Klinik olarak, DSI ile komplike olmuş MPP'li çocuklar, sindirim sistemi komplikasyonu olmayanlara kıyasla daha uzun süreli ateş ve uzatılmış antibiyotik tedavisi geçirmişlerdir. Çok değişkenli lojistik regresyon analizinde, düşük miR-93-5p seviyeleri, bu klinik parametrelerin yanı sıra sindirim sistemi tutulumu ile bağımsız olarak ilişkili bulunmuştur. Ayrıca, ROC eğrisi analizi, serum miR-93-5p'nin, DSI olan MPP'li hastaları DSI olmayanlardan ayırt etmede başarılı bir tanısal performans sergilediğini göstermiştir. Bu nedenle, miR-93-5p ölçümü, pediatrik MP enfeksiyonunda erken tanımlama ve risk sınıflandırması için ek değer sağlayabilir.
Dolaşan miR-93-5p'nin rutin klinik inflamasyon belirteçlerine göre tanısal performansı ile ilgili olarak bulgular, miR-93-5p'nin geleneksel göstergelerin yerini almaktan ziyade tamamlayıcı bir değer sağlayabileceğini göstermektedir. CRP ve prokalsitonin (PCT), enfeksiyon şiddetini değerlendirmek ve antibiyotik tedavisini yönlendirmek için klinik uygulamada yaygın olarak kullanılan biyobelirteçler olmaya devam etmektedir; meta-analizler, bakteriyel pnömonide PCT'nin CRP'ye kıyasla hafifçe daha üstün bir tanısal doğruluk sergilediğini kanıtlamıştır30. Ancak, bu akut faz reaktanları, çeşitli inflamatuar stimülilere yanıt verdikleri için büyük ölçüde spesifik değildirler ve MP enfeksiyonunu diğer solunum yolu patojenlerinden güvenilir bir şekilde ayıramazlar veya extrapulmoner komplikasyon riskini spesifik olarak yansıtamazlar. Buna karşılık, TLR4/nükleer faktör kappa B (NF-κB) sinyal yolu ile ilişkili düzenleyici bir molekül olan miR-93-5p, geleneksel belirteçleri tamamlayan farklı patofizyolojik bilgiler sağlayabilir. miR-93-5p ile CRP arasındaki korelasyonun nispeten zayıf olduğu (Pearson r = 0,2698) bildirilmiştir; bu da miR-93-5p'nin, inflamatuar yanıtın sistemik akut faz yanıtından farklı bir yönünü yansıtabileceğini düşündürmektedir.
Hayvan modellerinden elde edilen yeni kanıtlar, Mycoplasma pneumoniae enfeksiyonunun yalnızca solunum yolu patolojisini değil, aynı zamanda bağırsak florası tarafından aracılan akciğer-bağırsak ekseni aracılığıyla sindirim sistemi hasarını da tetikleyebildiğini göstermiştir31. MP ile enfekte olan farelerde, hem akciğerlerde hem de kolonda patolojik hasarın yanı sıra, Corynebacterium glutamicum gibi faydalı bakterilerin bolluğundaki azalma ve Lachnospiraceae NK4A136 grubu ile Escherichia-Shigella gibi potansiyel patojenlerin bolluğundaki artış dahil olmak üzere bağırsak mikrobiyota kompozisyonunda değişiklikler gözlenmiş; buna kolon içeriğinde ve kanda yükselmiş lipopolisakkarit (LPS) seviyeleri eşlik etmiştir32. Baikalin'in ayrıca TLR4/NF-κB yolu üzerinden MPP farelerinde pulmoner inflamasyonu iyileştirdiği ve bağırsak florasını düzenlediği bildirilmiştir, bu da söz konusu sinyal kaskadının akciğer-bağırsak etkileşimindeki rolünü desteklemektedir33. Bu bulgular, mevcut çalışmada incelenen miR-93-5p/TLR4 ekseninde NF-κB sinyalizasyonunun olası katılımıyla tutarlılık göstermektedir.
Mekanistik düzeyde, proinflamatuar yanıtlarla ilişkili doğal bağışıklığın temel bir aracısı olan TLR434,35,36,37, MP enfeksiyonu sırasında yukarı regüle edilmiştir. Artmış TLR4 ekspresyonuna, inflamatuar sitokinler IL-6 ve TNF-α seviyelerinin artışı ve epitelyal hücre canlılığının azalması eşlik etmiştir. miR-93-5p'nin aşırı ekspresyonu, TLR4 ekspresyonunu baskılamış, inflamatuar sitokin salınımını azaltmış ve enfeksiyöz koşullar altında hücre sağkalımını iyileştirmiştir. Bu nedenle, MPP'li hastalarda, özellikle sindirim sistemi hasarı olanlarda miR-93-5p'nin aşağı regülasyonu, artmış TLR4 aracılı inflamatuar sinyalleşme ve daha geniş sistemik inflamatuar yanıtlarla ilişkili olabilir. Fosforile IκBα ve p65 değerlendirilmediği için mevcut bulgular, downstream NF-κB yolunun aktivasyonunu kanıtlamamaktadır.
Bu çalışmanın birkaç kısıtlılığı kabul edilmelidir. İlk olarak, bu çalışma, özellikle DSI alt grubu için nispeten küçük bir örneklem boyutuna sahip tek merkezli bir çalışmadır ve bu durum istatistiksel gücü ve genellenebilirliği sınırlayabilir. Bu bulguları doğrulamak ve güvenilir klinik cutoff değerleri belirlemek için daha büyük, çok merkezli kohortlarda harici doğrulama gereklidir. İkinci olarak, IκBα Western blotting ile tespit edilmiş olsa da, MyD88, p-IκBα ve p65 dahil olmak üzere TLR4/NF-κB yolağının diğer aşağı akış bileşenlerinin kapsamlı doğrulaması yapılmamıştır. Bu sinyal bileşenlerinin protein düzeyinde doğrulanması, mekanistik yorumu güçlendirecektir. Üçüncü olarak, gözlemsel tasarım nedensel çıkarımı engellemektedir; miR-93-5p'nin MPP ile ilişkili sindirim sistemine zarar verip vermediğini belirlemek için in vitro veya in vivo olarak miRNA taklitleri (mimics) veya inhibitörleri içeren fonksiyon kaybı ve kazanımı deneyleri gereklidir. Dördüncü olarak, in vitro deneyler A549 akciğer epitelyal hücrelerinde gerçekleştirilmiştir. Bu model, pulmoner bir bağlamda miR-93-5p'nin anti-inflamatuar etkilerini değerlendirmek için uygun olsa da, gastrointestinal patolojiyi doğrudan modelleyemez. Potansiyel olarak akciğer-bağırsak ekseni aracılığıyla iletilen pulmoner miR-93-5p/TLR4 sinyali ile sindirim belirtileri arasındaki önerilen ilişki, Caco-2 hücreleri gibi intestinal epitelyal hücre modellerinde ve MP enfeksiyonunun in vivo hayvan modellerinde doğrudan doğrulanmalıdır. Son olarak, RNA stabilitesi ve normalizasyon stratejileri dahil olmak üzere miRNA tespiti ile ilişkili teknik zorluklar, rutin klinik uygulama önünde engel teşkil etmeye devam etmektedir. Bu kısıtlamalara rağmen, bulgular gelecekteki mekanistik çalışmalara ve geniş ölçekli doğrulama çabalarına temel oluşturmaktadır.
Sonuç olarak, miR-93-5p'nin yukarı regülasyonu, TLR4'ün baskılanması yoluyla akciğer epitel hücrelerinde MP kaynaklı inflamasyonu hafifletmiştir. Klinik olarak, dolaşımdaki miR-93-5p seviyelerinin azalması, MPP'li çocuklarda sindirim sistemi hasarı ile ilişkilendirilmiş olup, bu durumun gastrointestinal komplikasyon riski taşıyan hastaların belirlenmesinde yardımcı bir biyobelirteç olarak potansiyel fayda sağlayabileceğini göstermektedir.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| A549 insan alveolar epitel hücreleri | ATCC, USA | Cat# CCL-185; RRID: CVCL_0023 | in vitro MPP modeli için kullanılan insan alveolar epitel hücre hattı |
| Anti-GAPDH antikoru | Hangzhou XianZhi Biological Technology, China | Cat# AB-P-R001; RRID: AB_3096355 | Western blotting'de yükleme kontrolü olarak GAPDH tespiti için kullanılan primer antikor |
| Anti-IκBα antikoru | Beyotime, China | Cat# AG2741; RRID: AB_3731391 | Western blotting ile IκBα tespiti için kullanılan primer antikor |
| Sığır serum albümini (BSA) | Solarbio, China | Cat# A8012 | Western blotting sırasında kullanılan bloklama reaktifi |
| Santrifüj | Thermo Fisher Scientific, USA | Multifuge X4 Pro; Cat# 75016066; RRID: SCR_020726 | Hücre kültürü ve numune hazırlama sırasında kullanılan santrifüj |
| Kemilüminesans görüntüleme sistemi | Tanon, China | 5200Multi; RRID: SCR_027114 | Kemilüminesans Western blot sinyallerini görselleştirmek için kullanılan görüntüleme sistemi |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega, USA | Cat# E1910 | Ateş böceği ve Renilla lusiferaz aktivitelerini ölçmek için kullanılır |
| Fetal sığır serumu (FBS) | Gibco, USA | Cat# A5256701 | Hücre kültürü ortamı için serum takviyesi |
| Keçi anti-tavşan IgG, HRP-konjuge | Cell Signaling Technology, USA | Cat# 7074; RRID: AB_2099233 | Western blotting için kullanılan HRP-konjuge sekonder antikor |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 10.1.2; URL: https://www.graphpad.com | İstatistiksel analiz ve grafiksel sunum için kullanılan yazılım |
| Interlökin-6 (IL-6) ELISA Kiti | Elabscience, China | Cat# E-EL-H6156; RRID: AB_3665145 | IL-6 miktarını belirlemek için kullanılan ELISA kiti |
| Lipofectamine 3000 Transfeksiyon Reaktifi | Thermo Fisher Scientific | Cat# L3000015 | A549 hücrelerinin transfeksiyonu için kullanılan lipid bazlı reaktif |
| Mikroplaka okuyucu | Tecan, Switzerland | Infinite M Plex; RRID: SCR_026522 | 490 nm'de optik yoğunluğu ölçmek için kullanılan mikroplaka okuyucu |
| miR-93-5p mimikleri | Ribobio, China | Cat# miR10000093-1-5 | miR-93-5p aşırı ekspresyonu için kullanılan sentetik miR-93-5p mimiği |
| miR-93-5p negatif kontrol | Ribobio, China | Cat# miR1N0000001-1-5 | miR-93-5p mimiği transfeksiyonu için negatif kontrol |
| MTT Hücre Proliferasyonu ve Sitotoksisite Analiz Kiti | Beyotime, China | Cat# C0009S | Hücre canlılığını değerlendirmek için kullanılır |
| Mycoplasma pneumoniae standart suşu ATCC 15531 | ATCC, USA | Cat# 15531 | Enfeksiyon modelini oluşturmak için kullanılan standart M. pneumoniae suşu |
| pGL3-Basic Luciferase Reporter Vektörü | Promega, USA | Cat# E1751 | Dual-lusiferaz rapor analizinde kullanılan rapor vektörü |
| Fosfat tamponlu salin (PBS) | Solarbio, China | Cat# IP9212 | Hücre yıkama ve numune hazırlama için kullanılan tampon |
| Pierce ECL Western substratı | Thermo Scientific, USA | Cat# 32209 | Western blot tespiti için kullanılan kemilüminesans substrat |
| Pleuropneumonia-like organism (PPLO) ortamı | BD, USA | Cat# 255420 | M. pneumoniae için kullanılan kültür ortamı |
| Poliviniliden florür (PVDF) membran | Bio-Rad | Cat# 1620177 | Western blotting sırasında protein transferi için kullanılan membran |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara Bio Inc., Japan | Cat# RR036A | cDNA sentezi için kullanılan ters transkripsiyon master mix |
| PrimeScript RT Reaktif Kiti | Takara Bio Inc., Japan | Cat# RR037A | Ters transkripsiyon için kullanılan reaktif kiti |
| Real-time PCR sistemi | Applied Biosystems, USA | QuantStudio 3 Real-Time PCR System; RRID: SCR_020238 | qPCR analizi için kullanılan real-time PCR cihazı |
| RPMI-1640 ortamı | Gibco, USA | Cat# 11875135 | A549 hücreleri için kullanılan hücre kültürü ortamı |
| SPSS | IBM | Version 27.0; RRID: SCR_016479 | İstatistiksel analiz için kullanılan yazılım |
| TLR4 aşırı ekspresyon negatif kontrol | Ribobio, China | NA | TLR4 aşırı ekspresyon deneyleri için negatif kontrol |
| TLR4 aşırı ekspresyon plazmidi (oe-TLR4) | Ribobio, China | NA | TLR4 aşırı ekspresyonu için kullanılan plazmid |
| TRIzol Reaktifi | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Cat# 15596026 | Toplam RNA ekstraksiyonu için kullanılan reaktif |
| Tümör Nekroz Faktörü-α (TNF-α) ELISA Kiti | Elabscience, China | Cat# E-EL-H0109; RRID: AB_3665144 | TNF-α miktarını belirlemek için kullanılan ELISA kiti |
| Universal SYBR qPCR Master Mix | Takara Bio Inc., Japan | Cat# BL697A | Kantitatif PCR için kullanılan master mix |
| Western blot jel elektroforez sistemi | Bio-Rad, USA | Mini-PROTEAN Tetra Cell; Cat# 1658004 | Protein ayrımı için kullanılan elektroforez sistemi |
Kaynaklar
- Yan C et al. Current status of Mycoplasma pneumoniae. infection in China. World Journal of Pediatrics. 2024;20(1):1-4.
- Poddighe D. Extra-pulmonary diseases related to Mycoplasma pneumoniae. in children: recent insights into the pathogenesis. Current Opinion in Rheumatology. 2018;30(4). doi:10.1097/BOR.0000000000000494.
- Schildgen O et al. Clinical manifestations in infants and children with Mycoplasma pneumoniae. infection. PLOS ONE. 2018;13(4). doi:10.1371/journal.pone.0195288.
- Li X et al. Intestinal necrosis due to nonocclusive mesenteric ischemia in a child with Mycoplasma pneumoniae. pneumonia: a case report. BMC Infectious Diseases. 2025;25(1):1049.
- Ran B, Yang Z, Li M. METTL3-mediated miR-4534 maturation promotes IVDD progression by targeting the Sirt6-mediated Nrf2/HO-1 pathway. 2024;21(6):2795-2813.
- Du B et al. The lung-gut crosstalk in respiratory and inflammatory bowel disease. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2023;13. doi:10.3389/fcimb.2023.1218565.
- Jiang Y et al. Intestinal bacteria flora changes in patients with Mycoplasma pneumoniae pneumonia. with or without wheezing. Scientific Reports. 2022;12(1):5683.
- Lin L-J et al. The diagnostic value of serological studies in pediatric patients with acute Mycoplasma pneumoniae. infection. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 2020;53(2):351-356.
- Cui J et al. Integrated microfluidic cartridge for rapid and colorimetric detection of Mycoplasma pneumoniae. Microchimica Acta. 2025;192(9):559.
- Wang X, Starodubtseva MN, Kapron CM, et al. Cadmium, von Willebrand factor and vascular aging. NPJ Aging. 2023;9(1):11.
- Chen J. Efficacy of the PDCA cyclic care model in improving lung function and speed of recovery in children with Mycoplasma pneumonia. American Journal of Translational Research. 2025;17(3):1792-1802.
- Li Y et al. Clinical significance of serum miR-98-5p in children with Mycoplasma pneumoniae. infection complicated with digestive system damage. Immunobiology. 2025;230(4):153101.
- Zhang Y, Wu ZM. LINC02605 involved in paediatric pneumonia complicated with diarrhoea via miR-539-5p/CXCL1 axis. European Journal of Clinical Investigation. 2024;54(9). doi:10.1111/eci.14234.
- Gao H et al. Knockdown of lncRNA MEG3 protects against sepsis-induced acute lung injury in mice through miR-93-5p-dependent inhibition of NF-κB signaling pathway. Pathology - Research and Practice. 2022;239:154142.
- Gao H et al. MicroRNA-93 contributes to the suppression of lung inflammatory responses in LPS-induced acute lung injury in mice via the TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Int J Mol Med. 2020;46(2):561-570.
- Wedgwood S et al. Intestinal dysbiosis and the developing lung: the role of Toll-like receptor 4 in the gut-lung axis. Frontiers in Immunology. 2020;11. doi:10.3389/fimmu.2020.00357.
- Zou N et al. Transcutaneous auricular vagus nerve stimulation as a novel therapy connecting the central and peripheral systems: a review. Int J Surg. 2024;110(8):4993-5006.
- Chen Y et al. Combination of azithromycin and methylprednisolone alleviates Mycoplasma pneumoniae.-induced pneumonia by regulating miR-499a-5p/STAT3 axis. Exp Ther Med. 2022;24(3):578.
- Poddighe D. Mycoplasma pneumoniae.-related extra-pulmonary diseases and antimicrobial therapy. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 2020;53(1):188-189.
- Meyer Sauteur PM, Ramien ML, Theiler M. Mycoplasma pneumoniae.: extrapulmonary manifestations in children with focus on mucocutaneous disease. The Pediatric Infectious Disease Journal. 9900. doi:10.1097/INF.0000000000004946.
- Liu C et al. Mast cells participate in regulation of lung-gut axis during Staphylococcus aureus pneumonia. Cell Proliferation. 2019;52(2).
- Guo J et al. People are an organic unity: gut-lung axis and pneumonia. Heliyon. 2024;10(6).
- Fan F et al. Clinical characteristics and serum inflammatory markers of community-acquired mycoplasma pneumonia in children. The Clinical Respiratory Journal. 2023;17(7):607-617.
- Ding L, Jiang Y. Biomarkers associated with the diagnosis and prognosis of Mycoplasma pneumoniae. pneumonia in children: a review. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2025;15. doi:10.3389/fcimb.2025.1552144.
- Peng W et al. Comparative analysis of the efficacy and safety of different methods for injecting polidocanol in the treatment of venous malformations. Phlebology. 2024;39(9):629-635.
- Wang J et al. Peripheral blood microR-146a and microR-29c expression in children with Mycoplasma pneumoniae. pneumonia and its clinical value. Italian Journal of Pediatrics. 2023;49(1):119.
- Chu C et al. High expression of miR-222-3p in children with Mycoplasma pneumoniae. pneumonia. Italian Journal of Pediatrics. 2019;45(1):163.
- Powell BH, Witwer KW, Meffert MK. Cellular miRNAs and viruses: trends in miRNA sequestering and target de-repression. J Virol. 2025;99(7).
- Gan T, Yu J, He J. miRNA, lncRNA and circRNA: targeted molecules with therapeutic promises in Mycoplasma pneumoniae. infection. Arch Microbiol. 2023;205(8):293.
- Im PK et al. Hyperuricemia, gout and the associated comorbidities in China: findings from a prospective study of 0.5 million adults. The Lancet Regional Health – Western Pacific. 2025;58. doi:10.1016/j.lanwpc.2025.101572.
- Hu J et al. Insight into the pathogenic mechanism of Mycoplasma pneumoniae. Curr Microbiol. 2022;80(1):14.
- Li B et al. Cecropin AD ameliorates pneumonia and intestinal injury in mice with Mycoplasma pneumoniae. by mediating gut microbiota. BMC Vet Res. 2025;21(1):39.
- Song D et al. The mechanism of baicalin in improving pulmonary inflammatory response and injury and regulating intestinal flora in Mycoplasma pneumoniae pneumoni.a mice. Cellular Signalling. 2025;126:111530.
- Coutinho-Wolino KS et al. Bioactive compounds modulating Toll-like 4 receptor (TLR4)-mediated inflammation: pathways involved and future perspectives. Nutrition Research. 2022;107:96-116.
- Thorburn AN et al. TLR2, TLR4 and MyD88 mediate allergic airway disease (AAD) and Streptococcus pneumoniae-induced suppression of AAD. PLOS ONE. 2016;11(6).
- Tang J et al. Effect of gut microbiota on LPS-induced acute lung injury by regulating the TLR4/NF-kB signaling pathway. International Immunopharmacology. 2021;91:107272.
- Jia H et al. Pulmonary epithelial TLR4 activation leads to lung injury in neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 2016;197(3):859-871.