Yöntem makalesi

Kritik Boyutlu Cilt Yaralarında Terapötiklerin İncelenmesi İçin Bir Sıçan Eksizyonel Yara Modeli

0 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/72315

⸱

25 Eylül 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hand Surgery, Plastic Surgery and Burns, Linkoping University, 2Center for Biomedical Resources, Linkoping University, 3Basic Medical Sciences Department, College of Medicine, Ajman University, 4Medical Laboratory Science Department, College of Health Sciences, University of Sharjah

Bu makalede

Özet

Bu protokol, nemli bir oda içeren sıçanlarda bir deri eksizyonel yara modelini tanımlamaktadır. Sistem; topikal sıvı formülasyonların, hücre süspansiyonlarının, biyomalzemelerin ve diğer yara terapötiklerinin değerlendirilmesine olanak tanır.

Özet

Cilt yaraları, önemli bir morbidite ve ekonomik yük oluşturarak küresel ölçekte büyük bir sağlık hizmetleri zorluğunu temsil etmektedir. Doku onarım mekanizmalarını araştırmak ve gelişmekte olan terapötik stratejileri değerlendirmek için güvenilir ve klinik olarak ilgili hayvan modelleri esastır. Ancak, geleneksel kemirgen eksizyonel yara modelleri, insan yara iyileşmesinden önemli ölçüde farklı olan panniculus carnosus nedeniyle meydana gelen hızlı yara kontraksiyonu ile sınırlıdır. İnsanlarda iyileşme esas olarak granülasyon dokusu oluşumu ve re-epitelizasyon yoluyla gerçekleşir. Bu çalışma, hassas terapötik müdahaleleri test etmek için korumalı bir ortam sağlarken yara kontraksiyonunu sınırlamak üzere tasarlanmış bir sıçan eksizyonel yara modelini tanımlamaktadır. Sprague Dawley sıçanlarında 10-mm tam kat dorsal eksizyonel yaralar oluşturulmuş ve kesikli sütürlerle sabitlenen bir nitril bütadien kauçuk (NBR) O-ring kullanılarak stabilize edilmiştir. Nemli bir yara ortamı sağlamak amacıyla, hücrelerin, biyomalzemelerin veya farmasötik bileşiklerin topikal uygulamasına uygun bir oda oluşturmak için Eakin koheziv mühür ve şeffaf yapışkan film uygulanmıştır. Hayvanların pansumanı çıkarmasını önlemek için köpük pansuman, yapışkan bant, tübüler bandaj ve çift omuzlu bir tespit sisteminden oluşan ek koruyucu katmanlar kullanılmıştır. Yara iyileşmesi, dijital planimetri ve hematoksilin-eosin boyama kullanılarak yapılan histolojik değerlendirme ile 14 gün boyunca izlenmiştir. İşlem, hayvan başına yaklaşık 30 dakika sürmüş ve tutarlı yara iyileşme sonuçları vermiştir. NBR O-ring, yara kontraksiyonunu sınırlamak için bir splint olarak kullanılmıştır. İyileşme temel olarak granülasyon dokusu oluşumu ve re-epitelizasyon yoluyla gerçekleşmiştir. Pansumanlar, enfeksiyon belirtisi olmaksızın yedi güne kadar bütünlüğünü korumuştur. Histolojik analiz, epidermal rejenerasyon ve inflamatuar hücre infiltrasyonu ile karakterize aktif doku onarımını göstermiştir. Bu model, yara terapötiklerinin ve gelişmiş rejeneratif tedavilerin preklinik değerlendirmesi için bir platform sağlamaktadır.

Giriş

İyileşmesi güç yaralar da dahil olmak üzere deri yaraları, dünya genelinde 40 milyondan fazla hastayı etkilemekte ve 2024 yılı itibarıyla yıllık 22 milyar dolarlık maliyetle sağlık sistemleri üzerinde önemli bir yük oluşturmaktadır. Yalnızca Avrupa'da, her yıl 4 milyon hasta iyileşmesi güç yaralardan muzdariptir ve bu durum mevcut akut yatışların yarısına kadarını doldurmaktadır1. Cerrahi tekniklerdeki, intraoperatif uygulamalardaki ve gelişmiş yara örtülerinin mevcudiyetindeki ilerlemelere rağmen, bazı yaralar dirençlidir ve nihayetinde komplikasyonlar gelişmektedir. Bu nedenle, çok çeşitli topikal materyalleri test etmek için deri yaralarının deneysel bir  hayvan modeline ihtiyaç duyan yeni terapötik yaklaşımlar geliştirmek esastır.

Deneysel deri yarası hayvan modelleri arasında, deri eksizyonu, bir yara iyileşme modeli oluşturmak için en uygulanabilir tekniktir2. Böyle bir model; hemorajinin, inflamatuar reaksiyonların, granülasyonun, re-epitelizasyonun, anjiyogenezin ve doku yeniden şekillenmesinin incelenmesine yardımcı olabilir3. Eksizyonel yaralar, esas olarak hayvanın sırt kısmında, belirlenmiş bir deri alanının cerrahi olarak çıkarılmasıyla oluşturulur. Spontan iyileşmeyi önlemek için yaranın kritik boyutta olması gerekir. Bu kritik boyutlu eksizyonel yara; farklı kimyasalların, hücrelerin veya biyomalzemelerin topikal uygulamasının ve bunların iyileşme sürecindeki rollerinin araştırılması için doğrudan erişim sağlar4,5.

Kemirgenler ve insan derisi; hemostaz, inflamasyon, proliferasyon ve yeniden şekillenme dahil olmak üzere, yara iyileşmesinin  hücresel ve moleküler evrelerinde benzerlikler gösterir. Sıçanlar ve fareler; bulunabilirlikleri, küçük boyutları, genetik manipülasyonun nispeten kolay olması ve uygulama kolaylığı nedeniyle yara modellerinde en yaygın kullanılan türlerdir. Sıçanlar; farelere kıyasla daha büyük vücut boyutu ve farelerinkinden daha fazla keratinosit tabakası içeren daha kalın bir deri gibi çeşitli pratik avantajlar sağlar. Farelerdeki yaralar genellikle 7 gün içinde iyileşirken, sıçanlarda iyileşme süreci yaklaşık 12–14 gün boyunca değerlendirilebilir6.

Gevşek derili kemirgenlerin kullanımına ilişkin temel zorluklardan biri yara kontraksiyonudur.3Kemirgenlerin derisi, panniculus carnosus yaralanmayı takiben, açığa çıkan alanı azaltmak için kasılan tabaka. Buna karşılık, insan yaraları sınırlı bir kasılma kapasitesine sahiptir ve onarım için granülasyona ve re-epitelizasyona bağımlıdır7Hayvan modellerinin kısıtlamalarını aşmanın bir yolu, yara bölgesini çevreleyen derinin fiziksel olarak tespit edilmesini veya splintlenmesini sağlamaktır.8Yara büzülmesini önlemek amacıyla başarıyla geliştirilen cihazlar arasında titanyum yara odacıkları yer alıyordu.9ancak hazne ağırlığına bağlı yüksek hayvan stresi, karmaşık cerrahi yerleştirme, cihazın yerinden çıkma olasılığı, enfeksiyon riski ve yüksek maliyet gibi dezavantajları vardı. Atelleştirilmiş yara modeli kavramı Galiano ve ark. tarafından tanıtılmıştır.10 2004 yılında, yara kenarına sert bir silikon halkanın dikilmesiyle gerçekleştirilmiştir. Bu yaklaşım, yara kontraksiyonunu belirgin şekilde azaltır11ancak başta şunlar olmak üzere çeşitli dezavantajları ve sınırlamaları bulunmaktadır: yumuşak doku hasarı potansiyeli, yüksek atel yer değiştirme oranı ve tutarsız yara iyileşmesi. Ateller (rijit silikon halkalar gibi), özellikle yanlış uygulandığında çevre cilde aşırı basınç uygulayarak iskemi, irritasyon ve nekroza yol açabilir. Silikon ateller, hayvan hareketleri veya tımar alışkanlıkları nedeniyle sıklıkla deforme olur, kırılır veya yerinden çıkar. 8,11Düzensiz dikişler genellikle yara çevresinde düzensiz gerilime yol açarak tutarsız iyileşmeye neden olur. Burada sunulan modelde, bir Nitril Bütadien Kauçuk (NBR) O-ring, halkanın etrafına eşit aralıklarla 8-12 adet basit ayrı poliamid dikiş atılarak cilt yarasının kenarına dikilir. Bu yaklaşımın, yukarıda belirtilen riskleri minimize etmesi ve yara kontraksiyonunu yeterince sınırlayarak, yaranın insan yara iyileşme sürecine benzer şekilde granülasyon dokusu oluşumu ve re-epitelizasyon yoluyla iyileşmesini sağlaması beklenmektedir. Bu iyileşme mekanizması, hayvan modellerinden elde edilen bulguların klinik uygulamalara aktarılmasını kolaylaştıracaktır.

Nemli yara iyileşmesi teorisi, yara bakım ürünü tasarımı için bir konsept olarak 1962 yılında George D. Winter tarafından tanıtılmıştır12. Bu teoriye dayanarak, geçtiğimiz on yıllar boyunca gazlı bezler, şeffaf filmler, köpükler ve hidrojeller gibi çeşitli yara örtüleri geliştirilmiştir13. Öte yandan, sızıntıları önlemek ve bunlara karşı koruma sağlamak amacıyla 1974 yılında şekillendirilebilir bir hidrokolloid ostomi bariyer halka sızdırmazlığı tasarlanmış ve geliştirilmiştir. Bunlar, özellikle stoma bakımı uygulamalarında, yara sınırına uyum sağlamak için kolayca şekillendirilebilir ve kalıplanabilir. Bu modelde, yaranın dış kısmına tutucu bir sızdırmazlık halkası uygulanır ve steril, şeffaf filmlerle birlikte, tedavi gören cilt yaralı hastaların klinik durumunu taklit eden nemli bir oda oluşturarak yaranın epitelizasyonunu teşvik eder ve topikal ajanları (örneğin hücreler, biyomalzemeler, bileşiklar) sızıntılara karşı korur.

Yara pansumanı, yara yatağını fiziksel travmalardan ve mikrobiyal enfeksiyonlardan korumak için hayati önem taşır. Sıçanların pansumana karşı toleranslarının düşük olması nedeniyle, sıçanlarda yara pansumanı her zaman zorlayıcı olmuştur. Sıçanlar, anesteziden kurtulur kurtulmaz pansumanları ısırarak ve yırtarak sıklıkla çıkarır veya tahrip ederler. Bu durum, hücreler ve farmasötikler gibi topikal ajanların tutulmasını oldukça güçleştirirken, yaraların dış patojenlerden ve kontaminanlardan korunmasını imkansız hale getirir. Bu durum, özellikle biyolojiklerin test edilmesi, hücre tabanlı terapi ve gelişmiş terapötik tıbbi ürünler gibi steril ortam gerektiren çalışmalarda, kemirgen modellerinde çözülmesi gereken bir başka zorluktur. Burada sunulan modelde, nemli bölmeyi kapatmak için köpük pansuman ve yapışkan bant kullanılmıştır. Ardından, sıçanların bandajları çıkarmasını veya onlara zarar vermesini önlemek amacıyla, elastik tüp bandaj, tespit bandajı ve mikropor cerrahi bant kullanılarak çift omuz çapraz pansuman uygulanmıştır.

Burada rapor edilen model, farklı protokollerden birçok unsuru birleştirmektedir ve birkaç yıl boyunca geliştirilmiştir. Amaç, hayvan tarafından iyi tolere edilen nemli bir oda kullanarak sıçanlarda bir eksizyonel yara modeli oluşturmak ve özellikle sıvı formdaki hassas topikal maddelerin test edilmesini kolaylaştırmaktır.

Protokol

Aşağıda sunulan tüm hayvan prosedürleri, Linköping Etik Kurulu (Dnr 5163-2023), İsveç tarafından onaylanmıştır. Kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Deney​zihinsel hayvanlar

  1. 8–14 haftalık yetişkin erkek Sprague Dawley sıçanları kullanın.
  2. Deneyden önce, sıçanları standart bir diyetle, 12 saatlik ışık/karanlık döngüsünde en az 1 hafta boyunca alıştırın.

2. Cerrahi öncesi hazırlık

  1. Hayvanı, 1,0–1,5 L/min oksijen ile karıştırılmış %1,5–%2,5 izofluran (%4,5 indüksiyon için) kullanarak anestezi altına alın. Hayvanı sıcak tutmak için bir ısıtma pedinin üzerinde yüzüstü pozisyona getirin. Gözleri korumak için oftalmik lubrikant uygulayın ve ameliyat sonrası ağrı yönetimi için hayvanın sırtına, salin içinde seyreltilmiş 0,05 mg/kg vücut ağırlığında Buprenorphine deri altından uygulayın.
    NOT: Hayvan ile ped arasında ince bir tabaka tek kullanımlık altlık izolasyonu olması önemlidir.
    DİKKAT: İzofluran, merkezi sinir sistemi depresanı ve solunum yolu irritanıdır. Buhar maruziyetini önlemek için aktif bir atık gaz tahliye sistemine sahip kalibre edilmiş bir vaporizatör kullanın.
  2. Ense tabanından başlayarak yaklaşık 10 cm aşağıya kadar sırt bölgesini elektrikli tıraş makinesi ile tıraş edin. Tıraş edilen bölgeyi klorheksidin ve %70 etanol ile iki kez iyice temizleyin, ardından hayvanı sadece temizlenen bölgeyi açıkta bırakan pencereli bir cerrahi örtü ile örtün.

3. Eksizyonel yaranın oluşturulması

  1. Makas ve pens gibi uygun sterilize cerrahi aletler kullanın.
  2. Boyun tabanının yaklaşık 4 cm kaudaline, cerrahi kalıcı bir marker ve şablon kullanarak 10 mm çapında bir daire çizin.
  3. İşaretli derinin merkezini pensle tutun ve işaretli deri dokusunu makasla eksize edin. Yara derinliği yüzeysel fasyaya kadar inmelidir. Bu, derinin tam kalınlığının serbest bırakılması ve kası örten yarı şeffaf fasyanın görselleştirilmesiyle tespit edilebilir.
  4. Deri yarasının kenarına bir NBR O-ring uygulayın ve 8-12 dikiş atarak konumunu sabitleyin. Ring fiksasyonunun amacı deri kontraksiyonunu önlemektir. Birincil dikişlerin saat 12 konumunda, ardından saat 6, saat 3 ve sonra saat 9 konumunda olduğundan emin olun. 8 dikiş durumunda, her bir dikişi iki birincil dikiş arasındaki boşluğun ortasına atın (Şekil 1A).
  5. Steril şeffaf ve yapışkan filmle birlikte nemli bir bölme oluşturmak için, yapışkan özelliklerini kullanarak NBR O-ring'in dışına kohezif sızdırmazlık malzemesi uygulayın (Şekil 1B). Bu aşamada, yara NBR O-ring ile sabitlenmiş olup uygulama bölmesinin yan duvarları hem deri kenarı hem de kohezif sızdırmazlık malzemesi tarafından oluşturulur; tabanı açık yara yüzeyi, tavanı ise şeffaf film oluşturur.
  6. Yarayı bir kat filmle kapatın ve ardından tedavi solüsyonunu (hücre solüsyonu veya bileşik solüsyonu) film üzerinden yara yüzeyine uygulayın. Tarif edilen boyuttaki bölme, 100 µL hacmi kolayca alır.
  7. Tedavinin sızmasını önlemek için enjeksiyon bölgesini bir kat daha filmle kapatın (Şekil 1C).
  8. Filmi korumak için üzerine yumuşak silikon bir bandaj kapatın (Şekil 1D).
  9. Yapışkan bantlar uygulayın (Şekil 1E), ardından sabitleme bandajı ve mikropor cerrahi bantlarla sıçanın etrafına çift omuz konfigürasyonunda elastik tübüler bandaj sarın (Şekil 1F–H).
  10. Sıçanların pansumanı yırtıp atmalarını önlemek için tırnaklarını kesin.
  11. Hayvanı anesteziden çıkarmadan önce, salin ile seyreltilmiş karprofeni (5 mg/kg vücut ağırlığı) deri altına uygulayın.

4. Ameliyat sonrası prosedürler

  1. Hayvanı, anesteziden ayılana kadar bir battaniye ile örtülü şekilde ısıtma pedinin üzerinde tutun. Hayvanların birbirini ısırmasını ve pansumanı çıkarmasını önlemek için onları ayrı kafeslere veya bölmeli tek bir kafese yerleştirin.
  2. Ameliyat sonrası ağrıyı yönetmek için ertesi sabah, salin ile seyreltilmiş 5 mg/kg vücut ağırlığında karprofeni deri altına uygulayın. Sıçanlar, ameliyat sonrası ağrı veya kilo kaybı açısından günlük olarak izlenmeli ve gerekirse ek bir analjezik doz uygulanmalıdır.

5. Yara ölçümleri ve pansuman değişimleri

  1. Yara cerrahisinden sonraki ilk hafta boyunca her hayvanı günlük olarak muayene edin . Hayvanların hareket etmekte zorlandığı veya rahatsızlık gösterdiği durumlarda pansuman kontrol edilmeli ve düzeltilmelidir.
  2. 7. günde, hayvan adım 2.1'de açıklandığı şekilde anestezi altındayken pansumanı değiştirin.
  3. Pansuman örtüsünü ciltten nazikçe çıkarın. Ölçeklendirme için bir cetvel eşliğinde yaranın fotoğrafları çekilir. Yara yüzey alanını değerlendirmek amacıyla görüntüler Fiji/ImageJ yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir.
  4. Araştırmacının gereksinim duyduğu ölçümleri veya diğer işlemleri gerçekleştirin.
  5. Adım 3.8–3.11'de olduğu gibi temiz bir pansuman uygulayın ve hayvanın adım 4.1'de açıklandığı şekilde iyileşmesini sağlayın.

6. Yara örneği toplama ve ötanazi

  1. 14. günde, 2.1 numaralı maddede belirtildiği şekilde veya özel deney planına uygun olarak anestezi uygulayın. Pansumanı çıkarın ve yara bölgelerinin fotoğraflarını çekin.
  2. Pansumanı çıkarın ve yara bölgelerinin fotoğraflarını çekin.
  3. Yara deri dokusunu toplayın. Bir skalpel kullanarak, bir miktar sağlıklı dokuyu da kapsayacak şekilde yaranın etrafındaki deriyi eksize edin.
  4. Eksize edilen parçayı 2 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve daha sonraki moleküler analizler için sıvı azotla hızlı dondurun veya histoloji için oda sıcaklığında %4 tamponlu formaldehit içinde saklayın. Alternatif olarak, her iki analizi de gerçekleştirmek için eksize edilen parçayı ikiye bölün.
  5. Yara dokusunu çıkardıktan sonra, etik onaya uygun olarak CO2 inhalasyonu veya alternatif bir yöntemle hayvanı ötanize edin.
    UYARI: CO2 bilinç kaybı öncesinde ağrıya, strese ve mukoz membranların hızla asidifiye olmasına neden olur. Hazne havasını tahliye etmek için regüle bir debimetreden faydalanın.

7. Histokimyasal boyama: Yara fiksasyonu, gömme ve kesit alma

  1. Yara dokusu biyopsilerini oda sıcaklığında 3 sa boyunca %4'lük formaldehit çözeltisinde sabitleyin, ardından gece boyunca 4 °C'de muhafaza edin.
    UYARI: Formaldehit toksiktir, güçlü bir sensitize edicidir ve bilinen bir insan kanserojenidir. Çözeltiyi, kişisel koruyucu donanım giyerek kimyasal çeker ocak içerisinde kullanın.
  2. Biyopsileri, her biri 30 dakika sürecek şekilde iki kez PBS ile yıkayın.
  3. PBS'i etanol (%70) ile değiştirin ve 4 °C'de saklayın.
  4. Antijen kaybını önlemek için biyopsileri işlemeden önce maksimum 24–48 saat, basit histolojik karakterizasyon için ise 1–2 hafta boyunca saklayın.
  5. Kalıntı formaldehiti uzaklaştırmak için biyopsileri akan musluk suyu ile iyice yıkayın.
  6. Dokuyu şu sırayla etanol banyolarındayehidre edin: 20 dakika boyunca %70 etanol; her biri 20 dakika olacak şekilde 2 kez %95 etanol değişimi; her biri 20 dakika olacak şekilde 2 kez %100 etanol değişimi.
  7. Biyopsileri parafin banyosunda 65 °C'de tutun.
  8. Erimiş parafini belirlenen kalıba boşaltın, biyopsileri merkeze yerleştirin ve soğuyup katılaşmasını bekleyin. Kesit alındığında tüm cilt katmanlarının görülebilmesi için biyopsiler kalıp yüzeyine dik olarak konumlandırılmalıdır.
  9. Parafin gömülü doku bloğunu mikrotom ile 5 μm kalınlığında kesin ve deiyonize su içeren 39 °C'lik su banyosunda yüzdürün.
  10. Kesitleri lamların üzerine aktarın ve dokunun lam yüzeyine yapışmasını sağlayarak kurutun. Lamlar, daha sonra kullanılmak üzere 4 °C'de saklanabilir veya histokimyasal boyama için hemen işleme alınabilir.

8. Hematoksilin ve Eozin (HE) boyama

  1. Slaytları 60 °C'deki ısıtıcı plakalarda 30 dk boyunca dewaks işlemine tabi tutun, ardından 5'er dakika süreyle 3 kez ksilen (veya herhangi bir alternatifi) ile değiştirin ve ardından 2 dk boyunca 1 kez PBS ile değiştirin.
    UYARI: Ksilen toksiktir ve yüksek derecede yanıcıdır. Çözeltiyi, standart kişisel koruyucu önlemleri uygulayarak bir çeker ocak içerisinde kullanın.
  2. Sırasıyla %100 etanol, %96 etanol ve ardından dH2O ile 5'er dakika boyunca rehidrasyon işlemini gerçekleştirin.
  3. Hematoksilin boyamasını 5 dk boyunca uygulayın, ardından 5 dk boyunca akan musluk suyunda yıkayın.
  4. %0,3'lük asit alkol (%70 etanol içinde %0,3 hidroklorik asit) ile birkaç kez daldırıp çıkararak diferansiyasyon yapın, ardından 5 dk boyunca akan musluk suyuyla yıkayın.
  5. Eosin Y (%0,2) ile 30 sn boyunca boyayın, ardından 5 dk boyunca akan musluk suyunda yıkayın.
  6. %96 etanolde 1 dk, %100 etanolde 1 dk boyunca دهیدrasyon yapın.
  7. Birkaç damla kapatma medyumu uygulayın ve ardından lameli yerleştirin.
  8. Slaytları ışık mikroskobu altında gözlemleyin ve dijital fotoğraflarını çekin.

Sonuçlar

Sıçan eksizyonel yara modeli cerrahisi, verimli bir şekilde uygulandığında hayvan başına yaklaşık 30 dk sürmüştür. Model oluşturma, O-ring sabitleme ve pansumanun farklı aşamaları Şekil 1'de gösterilmektedir.

Şekil 2, 7. ve 14. günlerdeki yara iyileşme sürecini göstermektedir. Yara yarıçapı mm cinsinden ölçülmüş ve yüzey alanı (alan = πr2) formülüyle hesaplanmıştır; burada 0. günde r = 5 mm'dir. Yara kapanma ilerlemesi, 14. gündeki açık alanın oluşturulan yara alanına yüzde oranı olarak ifade edilmiştir. Fiji/ImageJ yazılımı kullanılarak yara alanının dijital bir görüntüsü analiz edilmiş ve ölçek, görüntüde yer alan bir cetvel yardımıyla 10 mm'ye kalibre edilmiştir (Şekil 2D). Yara alanı sınırlandırılıp ölçüldükten sonra, alan mm2 cinsinden sunulmuştur. 14. gündeki kalan yara alanı (%29,4 ± %10,1; n = 7), Şekil 3'te sunulmuştur.

14. gündeki deri yarasının HE boyaması Şekil 4'te sunulmuştur. Kesitler, biyopsilerin deri yaralarının çevreden merkeze doğru doğal iyileşme sürecini takip ettiğini göstermiştir. Yara iyileşmesi eksik kalmış olup, merkezde ince bir epidermal tabaka ile birlikte normal klasik multilameller düzen bulunmamaktadır. Dermiste, fizyolojik iyileşme süreci için önemli olan bol miktarda enflamatuar hücre infiltrasyonu gözlenmiştir. Genel olarak model, deri kontraksiyonunun engellenmesi ve eksik ancak fizyolojik bir iyileşme ile hayvanlar tarafından iyi tolere edilmiştir.

figure-results-1
Şekil 1: Eksizyonel yara oluşturma ve pansuman prosedürü. (A) Sıçanın dorsal yüzeyinde oluşturulan eksizyonel yara ve yara kenarı boyunca dikilen O-ring. (B) O-ring çevresine uygulanan şekillendirilebilir hidrokolloid bariyer halkası. (C) Hidrokolloid bariyer halkası üzerine uygulanan iki kat şeffaf yapışkan film pansumanı. (D) Şeffaf yapışkan film pansumanı üzerine yerleştirilen köpük pansuman. (E) Pansumanı sabitlemek için uygulanan elastik yapışkan bant. (F–H) Sıçanın çevresine uygulanan tübüler tutucu bandaj, ardından pansumanı sabitlemek için çift omuz konfigürasyonunda düzenlenen bir tespit bandajı ve cerrahi bant. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Yara iyileşmesinin temsilci görüntüleri. (A) 7. günde elde edilen temsilci yara görüntüsü. (B–D) 14. günde elde edilen; O-ring yerindeyken (B) ve O-ring çıkarıldıktan sonraki (C,D) temsilci yara görüntüleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: 14. gündeki yara alanının kantifikasyonu. Yara boyutundaki azalmayı gösteren, 14. gündeki kalan yara alanının yüzdesi. Veriler ortalama ± standart sapma (SD) (n = 7) olarak sunulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: 14. gündeki yara iyileşmesinin histolojik değerlendirmesi. Yara dokusunun 10×, 20× ve 40× büyütmedeki temsili hematoksilin ve eozin (HE) boyalı kesitleri. Yara merkezinde eksik re-epitelizasyon görülürken, yara kenarları fizyolojik epidermal iyileşme göstermiştir. Dermiste, normal yara iyileşme yanıtı ile uyumlu bol miktarda inflamatuar hücre bulunmaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

İyileşmesi güç cilt yaraları, beklenen zaman dilimi içerisinde normal iyileşme aşamaları boyunca ilerlemeyen yaralardır; bunlar vasküler yetmezlik, diyabet ve obezite dahil olmak üzere birçok diğer sağlık sorununa ikincil olarak gelişebileceği gibi cerrahi işlemlerin, travmaların ve alerjik reaksiyonların bir sonucu da olabilir14. Çeşitli yönetim yöntemlerinin mevcut olmasına rağmen birçok hastada iyileşme düzgün gerçekleşmez. Hücre tabanlı tedaviler, kimyasallar, bitki ekstraktları ve yeni keşfedilen bileşikler gibi yeni tedavi yollarının araştırılması, özgün yönetim stratejilerinin belirlenmesi açısından kritik öneme sahiptir. Bu model, geniş bir yara iyileşmesi çalışması yelpazesine uygulanabilir. İlaçların, hücrelerin ve biyolojik tedavilerin test edilmesi için standartlaştırılmış bir protokolün oluşturulması, preklinik yara iyileşmesi araştırmalarını kolaylaştırabilir. Burada açıklanan eksizyonel yara modeli ve protokolü, sıçan cilt yara modelinin araştırmalardaki temel kısıtlamalarını, yani cilt kontraksiyonu ve yara pansumanı sorunlarını ele almaktadır.

Titanyum splintler, fare eksizyonel yara modellerinde yara kontraksiyonunu azaltmak için yaygın olarak kullanılır; ancak uygulamalarının bazı sınırlamaları vardır. Splintin rijitliği, yaranın ve çevre dokunun mekanik ortamını değiştirerek hücresel yanıtları, inflamasyonu ve matriks yeniden şekillenmesini etkileyebilir. Sonuç olarak iyileşme, tedavi edilmemiş kemirgen derisindekinden farklı koşullar altında gerçekleşir. Kontraksiyonun sınırlandırılması, insan yara kapanmasıyla karşılaştırılabilirliği artırsa da, splintin getirdiği mekanik kısıtlamalar iyileşme sürecini etkileyen artefaktlara da yol açabilir ve deneysel bulgular yorumlanırken bunlar göz önünde bulundurulmalıdır15.

Bu amaçla, modelde deri kontraksiyonunu sınırlamak için NBR O-ringler kullanılmış ve orijinal yara kenarına sabitlenmiştir. Ringler hayvanlar tarafından iyi tolere edilmiş ve deneyin 14 günü boyunca konumlarında sabit kalmıştır. Herhangi bir hayvanda nitel olarak belirgin bir yara kontraksiyonu gözlemlenmese de, yara kenarının dövme yöntemiyle işaretlenmesi veya diğer nicel yöntemler, gelecekteki çalışmalarda yara kontraksiyonu değerlendirmesini güçlendirecektir. Bu nedenle, dövme işlemi bu protokolde isteğe bağlı bir adım olarak değerlendirilebilir.

Pansuman uygulaması, deri yara iyileşmesi modelleri için kritik olan yara bölgesindeki tedaviyi sürdürürken yaraları kontaminasyondan ve enfeksiyondan korumuştur. Ancak, bazı hayvanların farklı pansuman türlerini çıkarması rastlanmayan bir durum değildir. Sıçanlar yara bölgesini sıklıkla temizler ve kurcalar; bu durum, yapışkan filmler veya ikincil sabitleme yöntemleri kullanılmasına rağmen pansumanın yerinden oynamasına veya tamamen çıkarılmasına yol açabilir. Pansuman örtüsünün kaybı, yara ortamını değiştirebilir, tedavinin uygulanmasını etkileyebilir ve hayvanlar arasındaki değişkenliği artırabilir16. Burada sunulan modelde pansuman, hayvanlar tarafından çıkarılmadan veya hasar görmeden 7 güne kadar sağlam kalmıştır. Deneysel hayvanların hiçbirinde deri yara enfeksiyonu belirtisi görülmemiştir. Hayvanlar büyüyüp kilo aldıkça pansumanın uyumu sıkılaştığı için pansumanların haftalık olarak değiştirilmesi önerilir. Pansumanın çok gevşek olup hayvanlar tarafından çıkarılamayacağından emin olunurken, güvenli sabitleme ile hayvan hareketliliği arasında bir denge kurulmasına dikkat edilmelidir.

Protokol esnek ve özelleştirilebilir niteliktedir. Hızlı iyileşme ve yüksek güvenilirliği nedeniyle izofluran inhalasyonunu önersek de, araştırmacılar izofluran vaporizer bulunmadığı durumlarda alternatif olarak ketamin/ksilazin gibi enjekte edilebilir anestezi yöntemlerini kullanabilirler. Bu çalışmada yalnızca erkek sıçanlar kullanılmış olsa da, protokol aynı şekilde dişi sıçanlar için de uygulanabilir.

Ağrı kesici etkinliğini artıran carprofen ile birlikte buprenorphine analjezik uygulanmasını öneriyoruz. Buprenorphine, nispeten uzun etki süresi nedeniyle tek başına da yeterli post-operatif analjezi sağlayabilir. Bu ilaç, diğer opioidlerle karşılaştırıldığında bağışıklık fonksiyonu üzerinde minimum etkiye sahiptir, bu da inflamatuar süreçle uyumlu olarak yara iyileşmesi için bir avantaj sağlar17. İnflamasyonu baskılayan ve ağrıyı azaltan nonsteroidal anti-inflamatuar ilaçlardan, inflamasyon araştırılırken kaçınılmalıdır. Bu çalışmada hayvan başına bir yara oluşturulmuş olsa da, araştırmacılar etik onayları ve deneysel tasarımları doğrultusunda aynı protokolü kullanarak ek yaralar oluşturabilirler. Hayvan refahı mülahazaları ve 3R ilkeleri dikkatle değerlendirilmelidir. Araştırmacılar, hayvan modelleri kullanırken 3R ilkelerine (yerine koyma, azaltma ve iyileştirme) uymalı ve hayvan refahına saygı göstermelidir. Cerrahi prosedürler kılavuzlarla uyumlu olmalı ve onaylanmış hayvan protokolünü kesinlikle takip etmelidir. Bu çalışmada yara iyileşmesi, yara alanı ölçümleri ve histolojik değerlendirme ile değerlendirilmiş olup, re-epitelizasyon iyileşme yanıtının bir bileşenini temsil etmektedir. Ring fiksasyonuna göre sütürlerin varlığı, lokal iyileşmeyi engelleyebilir. Sütür sayısı hayvanlar arasında tutarlı olmalıdır. Yara alanı değerlendirmesi, sütür bölgeleri dahil olmak üzere tüm ham alanları kapsamalıdır18. Bu model; iskemi, diyabet ve yaşlanma gibi cilt yaralarıyla ilişkili çeşitli altta yatan durumları içerecek şekilde geliştirilebilir. Bu çalışmanın temel sınırlılıkları, splintlenmemiş bir kontrol grubunun olmaması, yara kontraksiyonunun kantitatif değerlendirmesinin eksikliği ve yara alanı değerlendirmesi ile tanımlayıcı histolojinin ötesindeki sınırlı kantitatif biyolojik sonuç ölçümleriydi. Bu modelin geliştirilmesi sırasında çeşitli teknik zorluklar ve sorun giderme işlemleri belirginleşmiştir. Koruyucu yeleğin/pansumanın uygun şekilde yerleştirilmesi, hayvan refahı ve başarılı yara iyileşmesi için esastır. Gevşek bir pansuman, anestezi sonrası uyanmanın ardından hayvan tarafından çıkarılabilir; aşırı sıkı bir pansuman ise hareketi kısıtlayabilir, dolaşımı bozabilir veya solunumu etkileyebilir. Pansuman, pansuman ile cilt arasında bir parmak (küçük sıçanlar için serçe parmak) kadar yeterli boşluk bırakmalıdır. Hayvanlar günlük olarak izlenmeli ve rahatsızlık belirtileri, hareket kısıtlılığı veya anormal duruş gözlemlendiğinde pansuman ayarlanmalıdır. Post-operatif ağrı yönetimi, analjezik duyarlılıktaki farklılıklar nedeniyle bireysel hayvanlar arasında değişiklik gösterebilir. Hayvanlar; kamburlaşma, aktivite azalması, iştah kaybı ve kilo kaybı dahil olmak üzere ağrı ile ilgili belirtiler açısından düzenli olarak değerlendirilmelidir. Kurumsal kılavuzlara göre gerektiğinde ek analjezi sağlanmalıdır. Yara kontraksiyonunu önlemek için ringin tutarlı fiksasyonu kritiktir. Gerilimi eşit dağıtmak ve kalkmayı veya deformasyonu önlemek için 8–12 basit ayrı sütür, ring çevresine eşit aralıklarla yerleştirilmelidir. İyileşme sürecinde gevşemeyi en aza indirmek için her sütür bir cerrah düğümü ile sabitlenmelidir. Son olarak, varyasyonu en aza indirmek için belirli bir çalışma kapsamında aynı strain, yaş, vücut ağırlığı ve cinsiyetteki sıçanların kullanılmasını öneriyoruz. Ayrıca, tüm cerrahi prosedürler aynı deneyimli araştırmacı tarafından gerçekleştirilebilir. Yanlılığı önlemek için, histolojik ve moleküler analizlerde çift körleme yönteminin kullanılmasını öneriyoruz.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, bu araştırmayı finanse eden Region Östergötland'a teşekkürlerini sunar. Yazarlar; hayvan modelinin kurulmasındaki önerileri, destekleri ve yardımları için Linköping Üniversitesi, CBR'den Bay Anders Delleskog'a teşekkür eder. Yazarlar ayrıca; deri dokusunun gömülmesi, kesilmesi ve HE boyaması konusundaki destek ve rehberliği için Linköping Üniversitesi, Core Facility'den Dr. Maria Ntzouni'ye teşekkür eder. R'deki Sallam Abdallah'a özel teşekkürler...&Cilt ve kültürlenmiş hücreler için #38;D ünitesi, Linköping Üniversitesi, cilt örneği hazırlama ve HE boyaması için.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BuprenorfinSalfarm Scandinavia451790              Kons. 0,3 mg/mL
KarprofenZoetis Animal Health191380              Rimadyl 50 mg/mL
Eakin sızdırmazlık halkasıSwemed2076152              Kalınlık 3 mm
Gömme istasyonu Leica BiosystemsEG1150 H&C              
Eozin Histolab1650              %0,2'lik renk çözeltisi
Mutlak etanolSolveco1015              Analitik saflıkta
Fiksasyon bandajıSwemed2048934              4 cm x 4 m PA/viskoz
FormaldehitHistolab2176              %4'lük PBS içinde, pH 7,2-7,4
Saç kesiciSwevetF95000              Kesim uzunluğu: 0,5 mm
HematoksilinHistolab1800              Harris HTX
Histolab-ClearHistolab14250              Ksilen alternatifi
İzofluranVM Pharma448210              Attane vet 1000 mg/g
LekotapeSwemed2056774
MepilexSwemed2059125              7,5x8,5 cm 
Mepore filmSwemed2057753               çerçeve ile 6x7 cm
Mikro gözenekli cerrahi bant Swemed2063856               1,2 cm x 9,1 m 
MikrotomThermo Fisher Scientific387861               Microm HM355S
Kapatma medyumu Histolab00840-05               Pertex
O-RingRuilogodB0B1TRQBRT               11 mm iç çap, 1 mm et kalınlığı
Sütür (ethilon 4-0)Scandivet21274-A               Emilmeyen poliamid     
Dokunun suyunun uzaklaştırılması Leica Biosystems Leica TP1020               
Tubifast 2 yönlü esnemeSwemed2069292               7,5 cm x 10 m PES/PA

Kaynaklar

  1. Europe advanced wound care market size & share 2025-2034: market size by product, by application, by end use, regional forecast. Global Market Insights. Available from: https://www.gminsights.com/industry-analysis/europe-advanced-wound-care-market.
  2. Nauta AC, Gurtner GC, Longaker MT. Adult stem cells in small animal wound healing models. In: Gourdie RG, Myers TA, editors. Wound Regeneration and Repair Methods and Protocols. New York (NY): Humana Press; 2013. p. 81-98.
  3. Masson-Meyers DS, et al. Experimental models and methods for cutaneous wound healing assessment. Int J Exp Pathol. 2020;101(1-2):21-37.
  4. Wong VW, et al. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J Biomed Biotechnol. 2011;2011:969618.
  5. Shahin H, et al. MicroRNA-155 mediates multiple gene regulations pertinent to the role of human adipose-derived mesenchymal stem cells in skin regeneration. Front Bioeng Biotechnol. 2024;12:1328504.
  6. Ojeh N, et al. The Wound Reporting in Animal and Human Preclinical Studies (WRAHPS) guidelines. Wound Repair Regen. 2024;33(1):e13232.
  7. Flynn K, et al. Chronic wound healing models. ACS Pharmacol Transl Sci. 2023;6(5):783-801.
  8. Davidson JM, Yu F, Opalenik SR. Splinting strategies to overcome confounding wound contraction in experimental animal models. Adv Wound Care (New Rochelle). 2013;2(4):142-148.
  9. Nuutila K, et al. Titanium wound chambers for wound healing research. Wound Repair Regen. 2016;24(6):1097-1102.
  10. Galiano RD, Michaels J, Dobryansky M, Levine JP, Gurtner GC. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 2004;12(4):485-492.
  11. Miller AW, Anderson AR, Suarez-Arnedo A, Segura T. Wound healing splinting devices for faster access and use. JID Innov. 2024;5(2):100332.
  12. Winter GD. Formation of the scab and the rate of epithelialization of superficial wounds in the skin of young domestic pig. Nature. 1962;193:293-294.
  13. Laurano R, Boffito M, Ciardelli G, Chiono V. Wound dressing products: a translational investigation from the bench to the market. Eng Regen. 2022;3(2):182-200.
  14. Rhea L, Dunnwald M. Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis. J Vis Exp. 2020;(162):61616.
  15. Davidson JM, Yu F, Opalenik SR. Splinting strategies to overcome confounding wound contraction in experimental animal models. Adv Wound Care (New Rochelle). 2013;2(4):142-148.
  16. Bae SH, Bae YC, Nam SB, Choi SJ. A skin fixation method for decreasing the influence of wound contraction on wound healing in a rat model. Arch Plast Surg. 2012;39(5):457-462.
  17. DeMarco GJ, Nunamaker EA. A review of the effects of pain and analgesia on immune system function and inflammation: relevance for preclinical studies. Comp Med. 2019;69(6):520-534.
  18. Jorgensen LB, Sorensen JA, Jemec GBE, Yderstraede KB. Methods to assess area and volume of wounds: a systematic review. Int Wound J. 2016;13(4):540-553.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Sıçan Yara ModeliCilt Yara İyileşmesiGranülasyon DokusuYara KontraksiyonuRe-epitelizasyonHistolojik DeğerlendirmeDijital PlanimetriKlinik Öncesi Yara TedavileriEpidermal Rejenerasyon
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.