Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir Fare Miyokard Enfarktüsü Modelinde Anatomik İşaretçiler Kullanarak Sol Ön İnen Koroner Arterin Hassas Ligasyonu

180 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/72336

⸱

18 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Medicine, Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, 2National Traditional Chinese Medicine Clinical Research Base, Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, 3Key Laboratory of Medical Electrophysiology, Ministry of Education & Medical Electrophysiological Key Laboratory of Sichuan Province (Collaborative Innovation Center for Prevention of Cardiovascular Diseases), 4School of Integrated Traditional and Western Medicine, Southwest Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, hassas sütür yerleşimi için tekrarlanabilir bir yüzey referans noktası olarak anterior interventriküler sulkus kullanılarak, kalıcı sol anterior desenden koroner arter ligasyonu yoluyla farelerde miyokard enfarktüsü oluşturur. Enfarktüs; elektrokardiyografi, ekokardiyografi, histolojik boyama ve serum biyobelirteç analizi ile doğrulanır.

Özet

Sol ön descending (LAD) koroner arterin kalıcı ligasyonu, preklinik kardiyovasküler araştırmalarda miyokard enfarktüsü (MI) fare modelleri oluşturmak için en yaygın kullanılan yaklaşımdır. Ancak konvansiyonel protokollerde, ligasyon bölgesi tipik olarak sol atriyal apendiksle belirlenen ve cerrahi sırasında güvenilir şekilde tanımlanması genellikle zor olan bir noktanın 1–2 mm altına yerleştirilir. Fare koroner anatomisindeki belirgin bireysel farklılıklarla birleştiğinde bu durum, sıklıkla hatalı LAD lokalizasyonuna, tutarsız ligasyon bölgelerine ve operatörler arasında düşük tekrarlanabilirliğe yol açar. Bu sınırlamaları gidermek amacıyla bu protokol, LAD ligasyonu için rehber bir referans noktası olarak anterior interventriküler sulcus'u (AIS) tanıtmaktadır. AIS, mikroskop altında doğrudan görülebilen ve LAD'nin hemen altından geçtiği sığ bir yüzey oluğudur. Konvansiyonel yaklaşımların aksine, ligasyon bölgesinin daha tutarlı seçilmesini destekleyen stabil bir anatomik referans sağlar ve deneyimsiz operatörler tarafından tanımlanması daha kolaydır. Protokol, standardize izofluran inhalasyon anesteziyi non-invaziv trakeal entübasyonla birleştirir ve MI'yı elektrokardiyografi, ekokardiyografi, enzim bağlı immünosorbent analiz (ELISA), histopatolojik boyama ve üç boyutlu koroner arter görüntüleme ile doğrular. Bu protokol, MI sonrası patofizyolojik ve immün değişiklikleri araştırmak üzere farelerde MI indüklemek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir deneysel yöntem sunmaktadır.

Giriş

Dünya çapında kardiyovasküler morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenlerinden biri olan miyokard enfarktüsü (MI), insan sağlığına yönelik ciddi bir tehdit oluşturmaktadır1. Ani başlangıcı, kritik klinik seyri ve yüksek ölüm oranı ile karakterize olan MI, temel olarak koroner arterlerin trombotik tıkanıklığından kaynaklanır ve derin miyokard iskemisine, ardından gelen kardiyomiyosit nekrozuna ve aritmi, kalp yetmezliği ve ani kalp ölümü dahil olmak üzere bir dizi komplikasyona yol açabilir2. Klinik kardiyolojideki dikkate değer ilerlemelere rağmen, insan miyokard dokusuna erişimin sınırlı olması, MI'nin altında yatan patofizyolojik mekanizmaların araştırılmasını ve etkili terapötik stratejilerin geliştirilmesini engellemeye devam etmektedir3. Sonuç olarak, MI'nin klinik özelliklerini ve ilerlemesini aslına uygun şekilde tekrarlayan, güvenilir, yeniden üretilebilir ve klinik olarak ilgili in vivo hayvan modelleri, mekanistik çalışmalar ve preklinik terapötik değerlendirmeler için temel öneme sahip olmaya devam etmektedir.

Johns ve Olson'ın 1954'te ilk kez bir fare MI modeli oluşturmasından bu yana, farelerde MI indükleme metodolojileri sürekli bir geliştirme sürecinden geçmiştir4. Sol anterior desendan (LAD) koroner arterin doğrudan mikroskobik görüntüleme altında kalıcı ligasyonu; lokalize miyokardiyal iskemi, miyokardiyal nekroz ve enfarkt sonrası ventriküler yeniden şekillenme dahil olmak üzere insan MI'nın temel patolojik özelliklerini yeniden oluşturduğu için en yaygın kabul gören teknik haline gelmiştir5. Ancak, geleneksel LAD ligasyonu, tipik olarak yalnızca kapsamlı eğitimlerle kazanılan ciddi bir mikrocerrahi uzmanlığı gerektirmekte, bu durum operatörler ve laboratuvarlar arasındaki prosedürel tutarlılığı ve tekrarlanabilirliği sınırlamaktadır6. Ayrıca; kanama, pulmoner yaralanma veya kollaps, ligatürün yanlış yerleştirilmesi ve yetersiz ventilasyon sonucu oluşan mekanik doku hasarı dahil olmak üzere intraoperatif ve postoperatif komplikasyonlar, nispeten yüksek perioperatif mortaliteye katkıda bulunarak bu modelin yaygın uygulamasını daha da kısıtlamaktadır7. Bu sınırlamalara yanıt olarak Gao ve ark., cerrahi prosedürü basitleştiren ve model oluşturulmasındaki teknik engelleri düşüren, kardiyak eversiyon yoluyla LAD ligasyonunu içeren modifiye bir teknik tanıtmışlardır8. Koroner kriyoyaralanma ve miyokardiyal yaralanmanın farmakolojik indüksiyonu dahil olmak üzere ek deneysel yaklaşımlar da spesifik araştırma uygulamaları için geliştirilmiştir9,10. Buna rağmen, doğrudan görüntüleme altında kalıcı LAD ligasyonu, enfarkt boyutunun ve konumunun kontrollü indüksiyonuna izin verirken insan MI'nın temel patofizyolojik özelliklerini en yakın şekilde yeniden oluşturduğu için tercih edilen yöntem olmaya devam etmektedir.

Yaygın kullanımına rağmen, geleneksel LAD ligasyonu; ligasyon bölgesinin değişken tanımlanması, prosedürel tutarsızlıklar, nispeten yüksek perioperatif mortalite ve tekrarlanabilirlikteki laboratuvarlar arası değişkenlik ile sınırlıdır ve tüm bunlar deneysel sonuçların güvenilirliğini ve karşılaştırılabilirliğini etkileyebilir11. Mevcut protokolün genel amacı, damar lokalizasyonu için dışsal bir anatomik işaret olarak anterior interventriküler sulkus (AIS) kullanarak, farelerde kalıcı LAD ligasyonu için daha standardize ve tekrarlanabilir bir yöntem oluşturmaktır. Ligasyon bölgesini sol atriyal apandisin altındaki sabit bir mesafeden tahmin etmek yerine, bu protokol; mikroskobik görüntüleme altında doğrudan görülebilen ve LAD'nin üzerinde yer alan sığ bir yüzey oluğu olan AIS'yi, ligasyona rehberlik edecek sabit bir anatomik referans olarak tanımlar. Geleneksel işaret tabanlı tahmine kıyasla bu yaklaşımın, standart fare MI prosedürleriyle uyumluluğu korurken, ligasyon bölgesinin daha tutarlı seçimini kolaylaştırması, operatöre bağlı değişkenliği azaltması ve deneyimi daha az olan cerrahlar için erişilebilirliği artırması amaçlanmıştır. Bu nedenle protokol; miyokardiyal hasar, ventriküler remodeling, inflamasyon ve ilgili kardiyovasküler hastalık mekanizmalarının çalışmaları için kalıcı MI modelleri oluşturmada tekrarlanabilir bir cerrahi yöntem arayan araştırmacılar için uygundur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvanlarla yapılan tüm deneyler, Southwest Medical University Hayvan Deney Merkezi Etik Kurulu'nun onayıyla gerçekleştirilmiştir (Onay No. SWMU20240146). Bu çalışmada, 8-10 haftalık ve 20,0 ± 3,0 g ağırlığındaki erkek C57BL/6J fareler (spesifik patojen içermeyen [SPF]) kullanılmıştır. Deneylere başlamadan önce fareleri standart laboratuvar koşullarında (22°C ± 2°C; 12 sa ışık/12 sa karanlık döngüsü) 1 hafta boyunca aklimatize edin.

1. Cerrahi öncesi hazırlık

  1. Pensler, oftalmik makaslar, iğne tutucu, mikro-mosquito hemostat, V şeklinde göz kapağı retraktörü, iğneli 3/8 daire 7-0 naylon süturlar, 6-0 naylon süturlar ve 5-0 naylon süturlar da dahil olmak üzere tüm cerrahi aletleri ameliyat gününde hazırlayın ve sterilize edin. Tüm metal aletleri işlemden önce 121°C'de 20 dk boyunca otoklavlayın ve hayvanlar arasında cam boncuklu sterilizatör (250°C'de 15 sn) kullanarak yeniden sterilize edin, ardından steril bir ped üzerinde soğutun. Mühürlü steril paketlerdeki süturları kullanın.
  2. Aseptik tekniği korumak için iki ayrı çalışma alanı kurun. Bir alanı pensler, bir fare trakeal entübasyon kiti ve bir anestezi cihazı ile hazırlayın; ikinci steril cerrahi alanı ise sterilize edilmiş aletler, pamuklu çubuklar, povidon-iyot ve steril gazlı bez ile hazırlayın.
  3. Torasik bölgeye 1 dk boyunca tüy dökücü krem uygulayın. Kremi ve tüyleri, steril su veya salin ile nemlendirilmiş steril gazlı bez kullanarak nazikçe temizleyin.
    1. Sadece tüy alma işlemi cerrahi cilt hazırlığı sayılmaz. Kesin aseptik cilt dezenfeksiyonunu ve steril örtme işlemini, fareyi anestezi altına alıp entübe ettikten ve cerrahi platforma sabitledikten sonra, cilt insizyonundan hemen önce gerçekleştirin (Adım 2.6).
  4. Ameliyattan 1 saat önce intraperitoneal enjeksiyon yoluyla cefazolin (300 mg/kg) uygulayın. Enjeksiyon için cefazolin sodyumu, steril 0.9% salin ile 30 mg/mL çalışma konsantrasyonuna getirin ve hedef doza ulaşmak için 20 g vücut ağırlığı başına yaklaşık 0.2 mL uygulayın. Ameliyat sonrası 5 ardışık gün boyunca günde bir kez uygulamaya devam edin.
    NOT: Bu protokolde sistemik veya topikal farmakolojik hemostatik ajanlar uygulamayın. İntraoperatif hemostazı, steril bir pamuklu çubukla 10–30 sn boyunca veya kanama durana kadar nazik ve sürekli baskı uygulayarak sağlayın.

2. Anestezi İndüksiyonu ve Trakeal Entübasyon

  1. Fareyi anestezi cihazına bağlı indüksiyon haznesine (16 × 10 × 11 cm) yerleştirin. Taşıyıcı gaz akış hızını 0.5 L/min olarak ayarlayın ve %3.5–4.0 isofluran ile anestezi indüksiyonu yapın.
    NOT: Yeterli anesteziyi, pedal çekilme refleksinin yokluğu ile doğrulayın. Bu ayarlarda fare, genellikle 2–4 dk içinde cerrahi anestezi düzeyine ulaşır.
  2. Anestezize edilmiş fareyi, murin trakeal entübasyon platformuna sırt üstü (supine) pozisyonda yerleştirin. Baş ve boyun yaklaşık 45° açıyla ekstansiyonda olacak şekilde, üst kesici dişleri platformun lastiğine takarak fareyi asın. Glottis doğrudan görünür hale gelecek şekilde oral, faringeal ve laringeal eksenleri hizalayın.
  3. Orotrakeal entübasyon gerçekleştirin
    1. Kontrollü mekanik ventilasyonu sağlamak için trakeotomi yapmadan, direkt laringoskopi altında orotrakeal entübasyon gerçekleştirin. Endotrakeal tüp olarak 20 G intravenöz kateter (dış çap yaklaşık 0.9 mm; uzunluk yaklaşık 15 mm) kullanın.
    2. Ağzı açın ve pens yardımıyla dili nazikçe bir yana itin. Küçük hayvan laringoskopunun kanadını dilin dorsumu boyunca yerleştirin ve dil kökünü aşağı bastırın.
    3. Epiglot görünür olana kadar laringoskopu ilerletin. Epiglotu kaldırmak ve V şeklindeki glottik açıklığı ile soluk renkli vokal kordları açığa çıkarmak için laringoskopu tutamağın ekseni boyunca yukarı ve ileri doğru kaldırın.
    4. Vokal kordların doğrudan görsellemesini sürdürürken, inspirasyon sırasında kateteri açık glottisten ilerletin. Kateter glottisten geçtikten sonra laringoskopu çıkarın.
    5. Kateteri yaklaşık 5–7 mm derinliğe kadar ilerletin. Stileti geri çekin ve kateteri ventilatöre bağlayın.
      NOT: Endotrakeal tüpün doğru yerleşimini, ventilatörle senkronize, simetrik bilateral göğüs duvarı hareketlerini gözlemleyerek doğrulayın. Eğer göğüs duvarı hareketi minimal ise ve bunun yerine ritmik abdominal hareketler oluşuyorsa ve buna anestezinin kademeli olarak hafiflemesi eşlik ediyorsa, kateteri özofagustan çıkarın ve entübasyonu tekrarlayın.
    6. Glottis görselleştirilemezse laringoskopu geri çekin ve fareyi, baş ve boyun yaklaşık 45° ekstansiyonda olacak şekilde entübasyon platformunda yeniden konumlandırın. Oral, faringeal ve laringeal eksenleri yeniden hizalayın, orofaringeal sekresyonları steril bir pamuklu çubukla temizleyin ve laringoskopiyi tekrarlayın. Fare anesteziden uyanma belirtileri gösterirse, onu indüksiyon haznesine geri götürün, anesteziyi derinleştirin ve ardından entübasyon girişimini tekrarlayın.
    7. Farede siyanoz, laringeal kanama veya kalıcı apne gelişirse prosedürü durdurun. İsofluran uygulamasını kesin ve fareyi tamamen iyileşene kadar sıcaklık kontrollü bir ısıtma pedine (37°C) yerleştirin.
    8. Trakeal entübasyon başarısız olursa torakotomiye geçmeyin. Prosedürü daha sonraki bir oturuma yeniden planlayın veya hayvanı çalışmadan hariç tutup bunu prosedürel başarısızlık olarak kaydedin.
      NOT: Tekrarlanan entübasyon girişimleri laringeal ödeme neden olarak postoperatif solunum sıkıntısı riskini artırabilir. Çoğu durumda, glottisin doğrudan görsellemesinden sonraki ilk iki girişimde başarılı entübasyon sağlanır. Orotrakeal entübasyonda yetkinlik, uygulama ve tekniğe aşinalık gerektirir.
  4. Taşıyıcı gaz olarak havayı 0.5 L/min akış hızında verin ve anesteziyi %1.5–2.0 isofluran ile sürdürün. Ventilatörü 130 soluk/dak solunum hızı, 2 mL tidal hacim ve 5:4 inspiratuar-ekspiratuar oranına ayarlayın.
    NOT: Ventilatörde ayarlanan tidal hacim, ventilatör devresinin sıkıştırılabilir hacmini ve endotrakeal tüpün ölü boşluğunu kompanse ettiği için vücut ağırlığından tahmin edilen teorik değeri aşar. Prosedür boyunca hayvanı siyanoz ve pnömotoraks ile subkutan amfizem dahil olmak üzere barotravma belirtileri açısından izleyerek ventilasyonu değerlendirin.
    1. Prosedür boyunca anestezi derinliğini sürekli olarak izleyin. Solunum paternini ve pedal çekilme refleksini her 2 dk'da bir değerlendirin. Kalp hızını elektrokardiyogram (EKG) kullanarak sürekli izleyin ve kalp hızını 400–500 atım/dak düzeyinde tutmak için isofluran konsantrasyonunu ayarlayın; genellikle %1.5–2.0 isofluran konsantrasyonu yeterlidir. Prosedür boyunca ventilatöre karşı spontan solunum çabasını, bıyık hareketlerini ve mukoza rengindeki değişiklikleri gözlemleyin.
    2. Pedal çekilme refleksi yeniden ortaya çıkarsa, bıyık hareketi gözlemlenirse veya ventilatöre karşı spontan solunum çabası oluşursa, isofluran konsantrasyonunu maksimum %3.0'a kadar %0.5'lik artışlarla yükseltin. Kalp hızı 350 atım/dak'nın altına düşerse, isofluran konsantrasyonunu minimum %1.0'a kadar %0.5'lik azalışlarla düşürün. Bu belirtiler gözlemlendiğinde cerrahi prosedürü durdurun; kalp hızını, solunum paternini, mukoza rengini ve bıyık hareketlerini izlemeye devam edin ve prosedüre ancak fizyolojik parametreler stabilize olduktan sonra yeniden başlayın.
  5. Sol toraks duvarını açığa çıkarmak için fareyi sol tarafı üstte kalacak şekilde sağ yanına doğru eğin. Dört uzvu ve kuyruğu yapışkan bant kullanarak platforma sabitleyin.
  6. Cerrahi alanı üç ardışık povidon–iyodin uygulamasıyla dezenfekte edin. Her uygulama için, planlanan insizyon bölgesinden başlayarak ve her yönde amaçlanan insizyonun yaklaşık 1 cm ötesine kadar konsentrik bir spiral şeklinde hareket ederek taze steril bir pamuklu çubuk kullanın. Her uygulamadan sonra çubuğu atın ve kullanılmış bir çubuğu cerrahi alanın merkezine geri getirmeyin. Son uygulamanın havada tamamen kurumasına izin verin, ardından cilt insizyonunu yapmadan önce sadece cerrahi alanı açıkta bırakacak şekilde steril bir örtü serin.

3. Torakotomi ve Kalbin Açığa Çıkarılması

NOT: Hayvan konumlandırma, torakotomi, kalbin açığa çıkarılması, LAD koroner arter ligasyonu, torasik kapatma ve ameliyat sonrası iyileşmeyi içeren genel cerrahi iş akışı Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilmiştir.

Ligasyon noktası ve koroner arterleri içeren kalp anatomi diyagramı; cerrahi bölge görüntüleri.
Şekil 1: Anterior interventriküler sulkus kullanılarak sol anterior descending koroner arter ligasyon bölgesinin anatomik lokalizasyonu. (A) Ligasyon öncesi açığa çıkarılmış fare kalbinin ventral görünümü, anterior interventriküler sulkusu (AIS) göstermektedir. (B) Sol anterior descending (LAD) koroner arter ligasyonundan sonra aynı bölgenin görünümü; daire içine alınmış bölge ligasyon yerini belirtmektedir. (C) AIS ile koroner arterler arasındaki uzamsal ilişkiyi gösteren şema. LAD, AIS boyunca ilerler ve ligasyon noktası sulkusun üst üçte birlik kısmında yer alır. RCA, sağ koroner arter; LCA, sol koroner arter; LCX, sol sirkumfleks koroner arter. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Bir farede cerrahi işlem dizisi, kalp açığa çıkarma, deneysel araştırma, adım adım diyagram.
Şekil 2: Farelerde sol ön inen koroner arterin anterior interventriküler sulkus kılavuzluğunda ligasyonuna yönelik cerrahi işlem. (A) Sol göğüs bölgesi tüylerinden arındırılmış, anestezi altındaki fareyi konumlandırın ve sabitleyin. (B) Sol göğüs duvarı üzerinden bir cilt insizyonu yapın. (C) Pektoral kasları ayırın ve torakotomi için uygun interkostal boşluğu belirleyin. (D,E) Interkostal boşluğu genişletmek ve operasyon alanını açığa çıkarmak için göğüs ekartörünü yerleştirin ve konumlandırın. (F) Açığa çıkan kalbi görüntüleyin ve anterior interventriküler sulkusu (AIS) belirleyin. (G) 7-0 naylon bir sütürü AIS üzerinden ve sol ön inen (LAD) koroner arterin altından geçirin. (H) Kalıcı LAD ligasyonu sağlamak için sütürü sabitleyin. (I) Göğüs ekartörünü çıkarın ve göğüs duvarını kapatın. (J,K) Kas ve cilt katmanlarını sırayla kapatın. (L) Fareyi ameliyat sonrası ısıtma altında iyileşmeye bırakın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Oftalmik makas kullanarak, sol göğüs duvarında, sternumun uzun eksenine paralel ve sol sternal kenarın yaklaşık 2 mm lateralinde 1 cm'lik boylamsal bir cilt insizyonu yapın. Alttaki pektoral kasları açığa çıkarın.
  2. İnce forsepsler kullanarak, pectoralis major ve pectoralis minor kaslarını liflerin yönü boyunca künt olarak ayırın. Kaburgaları ve interkostal aralıkları açığa çıkarmak için kasları lateral yöne çekin ve kanamayı minimize etmek için kasları kesmekten kaçının.
  3. Torasik boşluğu açmadan önce uygun interkostal aralığı belirleyin. Kaburgalara paralel olarak bir interkostal aralık içinde seyreden internal torasik arterin bir dalı olan anterior interkostal arteri yerleştirin ve dördüncü interkostal aralıkta en tutarlı şekilde görünen arterin hemen kranialindeki üçüncü interkostal aralığı belirleyin.
  4. Anterior interkostal arter net bir şekilde görünmüyorsa, birinci kaburgayı palpe edin ve üçüncü ile dördüncü kaburgalar arasındaki aralığı belirlemek için kaudal yönde sayın. Devam etmeden önce, seçilen interkostal aralığın sol atrial apendiks ve sol ventrikülün anterior serbest duvarına doğrudan, engelsiz bir görünüm sağladığını onaylayın.
    NOT: Üçüncü interkostal aralığın doğru belirlenmesi esastır çünkü yanlış torakotomi bölgesi kalbin görüntülenmesini azaltabilir ve prosedürü tehlikeye atabilir.
  5. Sol üçüncü interkostal aralıktan bir torakotomi gerçekleştirin. Sol atrial apendiks ve sol ventrikülün üst üçte biri cerrahi sahada net bir şekilde açığa çıkana kadar V şeklinde bir göz kapağı retraktörü kullanarak interkostal aralığı nazikçe genişletin.
    NOT: Bu aşamada kalp perikard ile örtülü kalır; bu nedenle AIS güvenilir bir şekilde belirlenemez. AIS'yi, Adım 4.2–4.3'te açıklandığı gibi, yalnızca perikard açıldıktan sonra (Adım 3.6) belirleyin.
  6. Perikardı bir çift ince forsepsle nazikçe kavrayın ve miyokarddan yukarı kaldırın. Perikardı yavaşça yırtarak açmak ve kalbi tamamen açığa çıkarmak için ikinci bir çift ince forseps kullanın.

4. Sol Ön İnen Koroner Arterin İşaret Noktası Rehberliğinde Ligasyonu

  1. Göğüs duvarından 6-0 naylon bir sütur geçirin ve operasyon alanını genişletmek için nazikçe traksiyon uygulayın. Ligasyon bölgesini belirlemeden önce AIS'yi tamamen açığa çıkarın (Şekil 1A).
  2. AIS'yi, kardiyak tabandan apeksle doğru eğik şekilde uzanan ve sol ile sağ ventriküller arasındaki yüzey sınırını belirleyen sığ oluk olarak tanımlayın (Şekil 1C). Mikroskop altında, sol atriyum apendiksinin inferior kenarının yaklaşık 1–2 mm altında yer alan yarı dairesel bir çöküntü olarak belirleyin.
  3. AIS'nin tanımlanması zorsa, epikardiyal yüzeyi ılık salin ile nemlendirilmiş bir pamuklu çubukla nazikçe silin. Oluğu daha net belirlemek için operasyon alanını mikroskop altında yeniden inceleyin.
    NOT: Diseksiyon mikroskobu altında AIS, anatomik olarak interventriküler sınırı belirleyen ve hemen altında LAD koroner arterin seyrettiği, kolayca tanımlanabilen sığ bir oluktur. Silme işleminden sonra AIS hala belirsizse, öncelikle torakotominin yeterli marj sağladığından emin olun. Ardından LAD'yi daha önce raporlanmış yöntemlere göre doğrudan tanımlayın: beraberindeki kardiyak vene kıyasla arter, renkte daha pembe, kalibre olarak daha küçük ve belirgin şekilde pulsatildir12.
    1. AIS veya LAD koroner arter tanımlanamazsa, öncelikle torakotominin sol üçüncü interkostal boşluktan yapıldığını doğrulayın. Gerekiyorsa, torakotomini Adım 3.3–3.5'te açıklandığı gibi yeniden konumlandırın, ardından Adım 4.1–4.3'te açıklandığı gibi AIS ve LAD tanımlama işlemini tekrarlayın.
    2. 10 dakikalık dikkatli incelemeden sonra AIS veya LAD tanımlanamazsa, kontrol edilemeyen kanama meydana gelirse, toplam açık göğüs prosedürü 20 dakikayı aşarsa veya anestezik derinlik ayarına rağmen kalp hızı 300 atım/dakika altında kalırsa prosedürü sonlandırın. Fareyi %5 isoflurane ile derinlemesine anesteziye alın, servikal dislokasyon ile ötanazi yapın ve hayvanı cerrahi sonuç analizine dahil etmek üzere prosedür hatası olarak kaydedin.
  4. AIS'nin üst üçte birlik kısmındaki oluğun üzerinden 7-0 naylon bir sütur geçirin (Şekil 1B). İğneyi epikardiyal yüzeye dik olarak yaklaşık 0.5–1 mm derinliğe kadar yerleştirin; giriş ve çıkış noktaları oluğun karşı taraflarında konumlanmalı ve yaklaşık olarak maksimum genişliğini kapsamalıdır.
  5. Ligatürü bir cerrah düğümü kullanarak sabitleyin. İlk düğümden sonra, belirgin bir lokal doku çökmesi olmadan ligasyon bölgesinin distalindeki miyokardda hemen beyazlaşma (blanching) meydana gelene kadar ligatürü ayarlayın.
    NOT: Süturu sadece koroner kan akışını oklüde edecek kadar sıkın. Aşırı gerginlik komşu miyokarda zarar verebilir veya süturun damarı ve çevre dokuyu kesmesine neden olabilir.
  6. Ligasyondan sonraki 1 dakika içinde, ligasyon bölgesinin distalindeki miyokardda yamalı iskemik beyazlaşmayı gözlemleyerek başarılı koroner oklüzyonu doğrulayın12. Oklüzyonu, EKG'de ST segment yükselmesi belirleyerek daha da teyit edin.
  7. İskemik alan aşırı derecede küçükse veya beyazlaşma yoksa, ligatürü gevşetin ve ligasyon prosedürünü tekrarlayın.

5. Kapatma ve Ameliyat Sonrası İyileşme

  1. V şeklindeki göz kapağı retraktörünü dikkatlice çıkarın. Üçüncü interkostal alanı yeniden yaklaştırmak için iğneyi bitişik üçüncü ve dördüncü kaburgaların etrafından geçirerek torakotomiyi tekli kesintili 5-0 naylon sütür ile kapatın. İnterkostal nörovasküler demete zarar vermemek için iğneyi kaburga yüzeyine yakın tutun. Sütürü bağlamadan önce, rezidüel intratorasik havayı tahliye etmek için ekspirasyon sonunda toraksı hafifçe sıkıştırın, ardından sütürü cerrah düğümü ile sabitlerken sıkıştırmayı sürdürün.
  2. Cilt insizyonunu 5-0 naylon sütürler kullanarak katmanlar halinde kapatın. Devam etmeden önce yara kenarlarının tamamen karşı karşıya geldiğinden emin olun.
  3. Fareyi sıcaklık kontrollü bir ısıtma pedine (37°C) yerleştirin, izofluran uygulamasını kesin ve spontan solunum başlayana kadar mekanik ventilasyona devam edin. Kuyruk veya bıyık hareketleri ve yaklaşık 150 nefes/dakika düzeyinde düzenli bir solunum paterninin geri gelmesi dahil olmak üzere hayvanın anesteziden uyanışını gözlemleyin.
  4. Düzenli spontan solunumu, ventilatör döngüsüyle senkronize görülebilir göğüs duvarı hareketini ve ekstremitelerin veya bıyıkların amaçlı hareketlerini doğrulayarak ekstubasyon için hazır olduğunu teyit edin. Endotrakeal tüpü ekspirasyon fazında yavaşça geri çekin, ardından solunum sıkıntısı olmadığını doğrulamak için fareyi ısıtma pedi üzerinde 3–5 dak daha izlemeye devam edin.
    NOT: Ekstubasyon sonrası solunum sıkıntısı, en yaygın olarak interkostal alanın yetersiz kapatılmasından kaynaklanan pnömotoraks nedeniyle oluşur. Solunum sıkıntısı meydana gelirse, fareyi geçici olarak yeniden anesteziye alın ve ventile edin, cilt sütürlerini yeniden açın, interkostal kapatmayı inceleyin ve ekstubasyon prosedürünü tekrarlamadan önce hava kaçağı olan herhangi bir bölgeye ek sütürler yerleştirin.
  5. Anesteziden uyanma sonrası fareyi kendi kafesine geri döndürün. Ameliyattan hemen sonra ve ilk 48 saat boyunca her 4–6 saatte bir buprenorfin (0.1 mg/kg, subkütan) uygulayın.
  6. Postoperatif ilk 3 gün boyunca her fareyi günde en az iki kez, sonrasında ise günde bir kez izleyin. Vücut ağırlığını, postürü, aktiviteyi, solunum paternini ve cerrahi yarayı değerlendirin; kalıcı zorlu solunum, yiyecek veya suya erişememe veya stimülasyona yanıt vermeyen kambur, hareketsiz postür dahil olmak üzere önceden tanımlanmış insani sonlanma noktalarını karşılayan her hayvanı ötanize edin.

6. Elektrokardiyografik (EKG) Değerlendirme

  1. EKG amplifikatörü ile donatılmış çok kanallı bir fizyolojik kayıt sistemi kullanarak elektrokardiyografik sinyalleri kaydedin. Fareye üç adet subkütan ekstremite-lead elektrodu yerleştirerek; pozitif girişi (VIN+) sol arka bacağa, negatif girişi (VIN−) sağ ön bacağa ve topraklamayı (GND) sağ arka bacağa bağlayın.
  2. EKG amplifikatör modülünü veri toplama ünitesine bağlayın. Notch filtresini 50 Hz'e (veya yerel şebeke frekansına göre 60 Hz'e) ayarlayın, ardından toplama yazılımını açın ve analog kanal ayarları altından yeni bir EKG amplifikatör modülü ekleyin.
    1. Amplifikatörü şu parametrelerle yapılandırın: kazanç = 2000, mod = normal, alçak geçiren filtre = 150 Hz ve yüksek geçiren filtre = 0.05 Hz. Toplama ayarlarını açın, örnekleme hızını 1 kHz olarak ayarlayın ve kurulum penceresini kapatın.
    2. Elektrotları yerleştirdikten sonra, kayda başlamak için Start düğmesine tıklayın. Görüntüleme zaman tabanını ana bölme başına 0.5 s ve dikey ölçeği ana bölme başına 0.25 mV olarak ayarlayın, ardından EKG'yi en az 30 s boyunca sürekli olarak kaydedin. Analiz ve temsili sunum için stabil, artefakt içermeyen bir segment seçin.
  3. Fare %1.5 izofluran anestezisi altında tutulurken ve bir ısıtma pedi üzerinde normotermi korunurken, ligasyondan hemen sonra EKG kaydı yapın. Hem MI hem de normal kontrol (NC) gruplarından, benzer anestezik koşullar altında aynı zaman noktasında EKG kayıtları alın.

7. Ekokardiyografi

  1. Görüntülemeden 1 gün önce ön torasik bölgedeki tüyleri depilatuar krem kullanarak temizleyin. Muayene boyunca fareyi %1,5 isofluran ile anestezi edin.
  2. Fareyi ısıtmalı bir platforma sırtüstü yerleştirin, dört uzvunu EKG elektrotlarına sabitleyin ve prekordiuma ultrason jeli uygulayın. Kalp hızını 400 vuru/dk'nın üzerinde tutmak için isofluran konsantrasyonunu gerektiği şekilde ayarlayın.
  3. Ultrason probunu sol sternal kenar boyunca üçüncü ila dördüncü interkostal boşluğa yerleştirin. Prob işaretçisini yaklaşık 30°'lik bir açıyla sağ ön uzva doğru yönlendirin ve probu kalbin uzun ekseniyle hizalayın.
  4. Tüm görüntülemeleri; 30 MHz merkez iletim frekansına, 20–46 MHz bant genişliğine ve 50 μm aksiyel çözünürlüğe sahip lineer-array bir transdüser kullanarak gerçekleştirin. İletim gücünü %100'e, görüntü derinliğini 13 mm'ye, görüntü genişliğini 11 mm'ye, dinamik aralığı 60 dB'ye ve iki boyutlu kazancı 40 dB'ye ayarlayın. 210 kare/s kare hızında B-mod sinema döngüleri edinin.
  5. Bu edinim parametrelerini bir sistem ön ayarı olarak kaydedin. Tüm hayvanlar ve tüm görüntüleme oturumları için aynı transdüseri, ön ayarı, iletim gücünü, dinamik aralığı, görüntü derinliğini ve görüntü genişliğini kullanın; NC ve MI grupları arasında görüntü derinliğini değiştirmeyin.
  6. Aynı uzun eksen görünümü içinde, M-mod örnekleme hattını mid-ventriküler seviyeye, interventriküler septuma ve sol ventrikül posterior duvarına dik olacak şekilde, örnekleme kapısı sol ventrikülün tüm anteroposterior çapını kapsayacak şekilde konumlandırın. Sonraki analizler için M-mod izlemesini kaydedin.
  7. Sol ventrikül, sol atrium ve aort kökünün net bir şekilde görselleştirildiği B-mod görüntüleri edinin ve sonraki analizler için sinema döngülerini kaydedin. Aynı görüntüleme düzleminde karşılık gelen M-mod görüntülerini edinin.
  8. Elde edilen görüntülerden sol ventrikül end-diyastolik iç çapını (Dd), sol ventrikül end-sistolik iç çapını (Ds) ve interventriküler septal kalınlığı ölçün. Beş ardışık kardiyak döngü edinin ve ortalama değerleri raporlayın.
    NOT: Sol ventrikül end-diyastolik hacmini (LVEDV) ve sol ventrikül end-sistolik hacmini (LVESV) görüntüleme yazılımını kullanarak otomatik olarak hesaplayın. Fraksiyonel kısalmayı (FS) FS = (Dd − Ds) / Dd × 100% ve ejeksiyon fraksiyonunu (EF) EF = (LVEDV − LVESV) / LVEDV × 100% olarak hesaplayın.

8. Doku Toplama, Histolojik Boyama ve ELISA

  1. Doku toplama
    1. MI indüksiyonundan sonraki 7. günde, her fareye ekokardiyografi uygulayın. Fareyi %4 isofluran ile anestezi edin, retro-orbital kanama yoluyla yaklaşık 1,5 mL kan toplayın, fareyi servikal dislokasyon ile ötanize edin ve kalbi çıkarın.
    2. Kan örneklerinin 4°C'de gece boyunca pıhtılaşmasını sağlayın. Örnekleri 4°C'de 10 dakika boyunca 2000 × g'de santrifüj edin, serumu toplayın ve analiz edilene kadar −80°C'de saklayın.
  2. Enzim bağlı immünosorbent assay (ELISA)
    1. Serum B tipi natriüretik peptid (BNP), interlökin-1β (IL-1β), tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) ve nükleer faktör-κB p65 (NF-κB p65) miktarlarını enzim bağlı immünosorbent assay (ELISA) kitleri kullanarak belirleyin.
      1. Tüm reaktifleri ve serum örneklerini oda sıcaklığına getirin ve çalışma çözeltilerini kit talimatlarına göre hazırlayın. Serum örneklerini fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1:5 oranında seyreltin; yani bir birim serum artı dört birim PBS.
      2. Standart, sıfır ve örnek kuyucuklarına sırasıyla 50 μL standart, PBS ve seyreltilmiş serum örnekleri ekleyin, boş (blank) kuyucuğu boş bırakın. Boş kuyucuk hariç tüm kuyucuklara 100 μL horseradish peroksidaz (HRP)-konjuge deteksiyon antikoru ekleyin, plakayı kapatın ve karanlıkta 37°C'de 60 dakika inkübe edin.
      3. Her kuyucuğun içeriğini boşaltın ve plakayı yıkama tamponu ile beş kez yıkayın; her yıkama döngüsünde tamponun her kuyucukta 20 saniye kalmasını sağlayın. Plakayı tüy bırakmayan kağıt üzerinde kurutun.
      4. Her kuyucuğa 100 μL taze hazırlanmış substrat (1:1 hacim oranında karıştırılmış Çözelti A ve B) ekleyin. Kapatılmış plakayı karanlıkta 37°C'de 15 dakika inkübe edin, 50 μL durdurma çözeltisi ekleyin ve optik yoğunluğu 450 nm'de ölçün.
    2. Boş kuyucuk optik yoğunluğunu her ölçümden çıkarın ve dört parametreli lojistik (4PL) regresyon modeli kullanarak bir standart eğri oluşturun. Her örneğin konsantrasyonunu uydurulan eğriden hesaplayın, değeri 5'lik dilüsyon faktörü ile çarpın ve duble kuyucuklardan elde edilen ortalama değeri raporlayın.
  3. Doku işleme, gömme ve kesit alma
    1. Kalıntı kanı uzaklaştırmak için çıkarılan her kalbi buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin ile kısa sürede durulayın. Dokuyu oda sıcaklığında en az 24 saat boyunca %4 paraformaldehit içinde fikse edin.
    2. Her kalbi, düz bir kısa eksen yüzeyi açığa çıkacak şekilde düzeltin ve etiketli bir doku kasetine yerleştirin. Dokuyu dereceli bir etanol serisi ileye (4 saat %75 etanol, 2 saat %85 etanol, 2 saat %90 etanol, 1 saat %95 etanol ve her biri 30 dakika olmak üzere iki kez mutlak etanol değişimi)dehidrate edin. Dokuyu 5–10 dakika boyunca bir etanol–ksilen karışımından geçirin, her biri 10 dakika olmak üzere iki kez ksilen değişimi ile şeffaflaştırın ve her biri 1 saat olmak üzere üç kez eritilmiş parafin değişimi ile infiltre edin.
    3. Her kalbi, kısa eksen blok yüzeyine bakacak şekilde gömün. Mid-papiller seviyede seri 3 μm kesitler alın, kesitleri 40°C'lik bir su banyosunda yüzdürün, lamlar üzerine monte edin ve 60°C'de kurutun.
    4. Kesitleri, her biri 15 dakika olmak üzere iki kez ksilen değişimi, ardından her biri 5 dakika olmak üzere üç kez mutlak etanol değişimi, %75 etanol (5 dakika) ve ters osmoz (RO) suyu (5 dakika) ile deparafinize edin.
      UYARI: Paraformaldehit muhtemel bir karsinojendir, solunum ve cilt tahriş edicidir; ksilen ise yanıcıdır ve nörotoksiktir. Bu reaktifleri aseptik tıbbi eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruması takarak kimyasal çeker ocak altında kullanın ve atıkları kurumun tehlikeli atık prosedürlerine göre bertaraf edin. Etanol ve n-butanol yanıcıdır; tutuşma kaynaklarından uzak tutun.
  4. Histolojik boyama
    1. Hematoksilin ve eozin boyama
      1. Deparafinize edilmiş ve rehidrate edilmiş kesitleri 3–5 dakika boyunca hematoksilin içinde bekletin. Kesitleri su ile durulayın.
      2. Kesitleri %1 asit alkol ile diferansiye edin ve su ile durulayın. Kesitleri %0,5 sulu amonyak ile mavileştirin ve tekrar durulayın.
      3. Kesitleri sırasıyla %85 etanol, %95 etanol ve mutlak etanol içinde her biri 5 dakika bekletin. Kesitleri 3–5 dakika boyunca eozin ile karşıt boyayın.
      4. Kesitleri, her biri 5 dakika olmak üzere üç kez mutlak etanol değişimi ve ardından 5 dakika n-butanol ile dehidrate edin. Kesitleri, her biri 5 dakika olmak üzere üç kez ksilen değişimi ile şeffaflaştırın ve nötral rezin ile monte edin.
        NOT: Çekirdekler mavi, sitoplazma ve hücre dışı matris ise kırmızı görünür.
    2. Masson trikrom boyama
      1. Deparafinize edilmiş ve rehidrate edilmiş kesitleri, oda sıcaklığında yaklaşık 15 saat boyunca gece boyunca %2,5 potasyum dikromat çözeltisinde mordanlayın. Kesitleri, sarı renk kaybolana kadar yaklaşık 30 saniye boyunca akan su altında durulayın.
      2. Doku parlak kırmızı görünene kadar kesitleri 6 dakika boyunca Ponceau–asit fuksin çözeltisinde boyayın. Renk soluk kalırsa boyama süresini uzatın ve kesitleri akan su altında süzüntü renksiz olana kadar durulayın.
      3. Kesitlerin kurumasına izin vermeden fazla suyu süzün. Kollajen soluk görünene ve kas lifleri kırmızı kalana kadar kesitleri 1–2 dakika boyunca sulu fosfomolibdik asit ile diferansiye edin.
      4. Kesitleri durulamadan doğrudan anilin mavisi çözeltisine aktarın. Kesitleri 6–30 saniye inkübe edin.
      5. Kesitleri, her değişim için yaklaşık 8 saniye olmak üzere üç ila beş kez %1 asetik asit değişimi ile diferansiye edin. Kesitleri sırasıyla yaklaşık 3, 5 ve 5 saniye olmak üzere üç kez mutlak etanol değişimi ile hızla dehidrate edin.
      6. Kesitleri 5 dakika n-butanol ve ardından 5 dakika ksilen ile şeffaflaştırın. Kesitleri nötral rezin ile monte edin.
        NOT: Kollajen lifleri mavi, kas lifleri, fibrin ve eritrositler ise kırmızı görünür.
    3. Sirius Red boyama
      1. Deparafinize edilmiş ve rehidrate edilmiş kesitleri 65°C'lik fırında 30 dakika boyunca Sirius Red çözeltisi A içinde inkübe edin. Kesitleri sarı renk kaybolana kadar akan su altında yıkayın.
      2. Fazla sıvıyı kurulayın ve kesitleri 2 dakika boyunca Sirius Red çözeltisi B içinde bekletin. Kesitleri kısa süreli yıkayın ve fazla sıvıyı kurulayın.
      3. Kesitleri 30 dakika boyunca Sirius Red çözeltisi C içinde bekletin. 1–2 saniye boyunca kısa süreli durulayın.
      4. Kesitleri, her biri yaklaşık 3 saniye olmak üzere üç kez mutlak etanol değişimi ile dehidrate edin. Her biri 5 dakika olmak üzere üç kez ksilen değişimi ile şeffaflaştırın ve nötral rezin ile monte edin.
        NOT: Aydınlık alan (brightfield) aydınlatması altında kollajen lifleri sarı bir arka plan üzerinde kırmızı görünür.
  5. Görüntü edinimi ve kantifikasyon
    1. Tüm histolojik görüntüleri dijital bir lam tarayıcı kullanarak edinin. Tüm gruplardan alınan tüm kesitler için aynı aydınlatma, beyaz dengesi, pozlama ve büyütme ayarlarını kullanın ve her görüntüye bir kalibrasyon ölçek çubuğu ekleyin.
    2. Görüntü analizinden önce mekansal ölçeği kalibre edin. Çalışma görüntüleriyle aynı çözünürlükte ve piksel boyutlarında edinilmiş ölçek çubuğunu içeren bir referans görüntüsü yükleyin. Measure > Calibration > Set System sekmesi altında yeni bir mekansal kalibrasyon oluşturun, birimi μm olarak ayarlayın, kalibrasyon noktalarını ölçek çubuğu ile hizalayarak pikselden mikrometreye dönüşümü tanımlayın, kalibrasyonu kaydedin ve tüm görüntülere uygulayın.
    3. Masson trikrom boyalı bir kesit yükleyin ve düzensiz ilgi alanı (AOI) aracını kullanarak sol ventrikülü ana hatlarıyla belirleyin. Ventrikül boşluğunu, sağ ventrikülü ve doku işleme artefaktlarını hariç tutun, ardından toplam sol ventrikül alanını kaydedin.
    4. Measure > Count/Size sekmesini açın ve segmentasyon diyaloğunu açmak için Select Colors'ı seçin. Color Cube Based segmentasyonu seçin ve parametreleri şu şekilde ayarlayın: sensitivity = 4, expand selection by 1 color index, minimum color size = 1 piksel ve kernel size = 3 × 3. Aynı segmentasyon ayarlarını tüm kesitlere uygulayın.
    5. Tohum noktaları olarak damlalık aracını kullanarak mavi kollajen-pozitif pikselleri seçin. Yalnızca belirgin kollajen-pozitif bölgelerden örnek alın, bir önizleme görüntüsü oluşturun ve maskenin, kırmızı boyalı miyokardiyumu, ventrikül boşluğunu ve arka planı hariç tutarken kollajen-pozitif alanları kapsadığını doğrulayın. Maskeyi uygulamadan önce gerekirse tohum noktalarını ayarlayın.
      NOT: Kesitler arasındaki küçük boyama yoğunluğu farklarını hesaba katmak için her kesit için tohum pikselleri yeniden seçin. Tüm görüntüler için aynı segmentasyon parametrelerini (hassasiyet, genişleme derecesi, minimum renk boyutu ve çekirdek boyutu) koruyun ve segmentasyonu yalnızca önizleme, kollajen dışı yapıları hariç tutup kollajen-pozitif alanların tamamen kapsandığını gösterdiğinde kabul edin.
    6. Segmentasyon maskesini uygulayın ve diyaloğu kapatın. Measure > Select Measurements sekmesi altında Area'yı seçin, Count'a tıklayın, View > Statistics sekmesini açın ve toplanmış kollajen-pozitif alanı kaydedin.
    7. Kollajen-pozitif alanın toplam sol ventrikül alanına bölünmesiyle kollajen hacim fraksiyonunu (CVF) hesaplayın ve sonucu yüzde olarak ifade edin.

9. Doku Saydamlaştırma ve Üç Boyutlu Koroner Arter Görüntüleme

  1. Koroner Vaskülatürün Floresan Etiketlenmesi
    1. Koroner vaskülatürü etiketlemek için lateral kuyruk venine 200 µL %2'lik Evans Blue çözeltisi enjekte edin. Boyanın sistemik dolaşımına izin vermek için fareyi 60 dk boyunca kafesine geri koyun.
    2. Fareyi anestezi cihazına bağlı indüksiyon kamarasına (16 × 10 × 11 cm) yerleştirin ve %4 isofluran ile anesteziyi indükleyin. Fareyi servikal dislokasyonla ötanize edin, torasik boşluğu açın, sağlam kalbi çıkarın, PBS ile durulayın ve 4°C'de 24 sa boyunca %4 paraformaldehit (PFA) içinde fikse edin.
      UYARI: PFA muhtemel bir kanserojendir; solunum yollarını ve cildi tahriş eder. PFA'yı aseptik tıbbi eldivenler, laboratuvar önlüğü ve göz koruması takarak kimyasal çeker ocak altında kullanın ve atıkları kurumsal tehlikeli atık prosedürlerine göre imha edin.
    3. Saf su içinde %3'lük bir agaroz çözeltisi hazırlayın ve fikse edilmiş kalbi, ligasyon bölgesi görüntüleme için uygun şekilde yönlendirilmiş olarak gömün. Mikrolitre şırınga kullanarak ligasyon alanını çevreleyen sekiz farklı noktaya 1 µL DAPI çözeltisi enjekte edin ve örneği oda sıcaklığında 2 gün boyunca inkübe edin.
  2. Doku berraklaştırma
    1. Üretici talimatlarına uygun olarak, bir FDISCO (üstün floresan koruma kapasitesine sahip, solventle berraklaştırılmış organların üç boyutlu görüntülemesi) doku berraklaştırma kiti kullanarak doku berraklaştırmayı gerçekleştirin. Kit altı reajenden (A–F) oluşur: Reajen A, B, C, D ve E sırasıyla su içinde %50, %70, %80, %100 ve %100 tetrahidrofuran (THF) içerir ve Reajen F dibenzil eterdir.
      UYARI: THF yüksek derecede yanıcıdır, depolama sırasında patlayıcı peroksitler oluşturur; solunum yollarını ve cildi tahriş eder. Dibenzil eter cilt ve göz tahriş edicidir. Tüm reajenleri, aseptik tıbbi eldivenler, laboratuvar önlüğü ve göz koruması dahil uygun kişisel koruyucu ekipmanlar takarak kimyasal çeker ocak altında kullanın. Atıkları kurumsal tehlikeli atık prosedürlerine göre imha edin.
    2. Her bir kalbi sırasıyla Reajen A, B, C, D ve E içinde reajen başına 6 sa boyunca inkübe edin. Kalp başına her reajenden 10 mL kullanın; bu, minimum 1:5 örnek-reajen hacim oranına karşılık gelir.
    3. Örneği Reajen F'ye aktarın ve doku optik olarak şeffaf hale gelene kadar, tipik olarak yaklaşık 1 sa boyunca inkübasyona devam edin.
    4. Tüm berraklaştırma adımlarını 6°C–8°C'de hafif ajitasyonla gerçekleştirin. Floresan özelliğini korumak için örneği alüminyum folyoya sarılı cam bir kaba yerleştirin ve işlem boyunca ışıktan koruyun.
  3. Işık sayfası floresan görüntüleme
    1. Berraklaştırılmış örneği örnek tutucuya monte edin. 4× objektif lens (nümerik açıklık = 0.28; çalışma mesafesi = 20.0 mm) ile donatılmış bir ışık sayfası floresan mikroskobu kullanın.
    2. Monte edilmiş örneği görüntüleme kamarası içindeki dibenzil etere daldırın. Spesimeni her iki taraftan aydınlatın ve sırasıyla DAPI'yi 405 nm'de ve Evans Blue'yu 647 nm'de uyarın.
    3. Kazanım parametrelerini şu şekilde ayarlayın: 405 nm kanalı için 3.000 arbitrer birim lazer yoğunluğu ve 30 ms pozlama süresi; 647 nm kanalı için 4.000 arbitrer birim lazer yoğunluğu ve 30 ms pozlama süresi kullanın. Tüm görüntüleri 6 μm z-adım boyutu ve 1,024 × 1,024 piksel görüntü çözünürlüğü kullanarak edinin.
    4. Kamera kazanım modunu, görüntüleme yazılımı tarafından yapılandırıldığı üzere, önce lateral (XY) görüntülerin alındığı, ardından sırasıyla kanal kazanımının (C), aksiyel adımlamanın (Z) ve zaman noktası kazanımının (T) yapıldığı XYCZT olarak ayarlayın.
  4. Görüntü veri işleme ve üç boyutlu rekonstrüksiyon
    1. Mikroskopla birlikte verilen görüntü işleme yazılımını kullanarak ham TIFF görüntü dosyalarını birleştirin (stitch). Birleştirilmiş görüntü dosyalarını Dosya > Imaris'e Dönüştür seçeneğini belirleyerek IMS formatına dönüştürün.
    2. Dönüştürülmüş IMS dosyalarını üç boyutlu analiz yazılımına aktarın. Varsayılan render ayarlarını kullanarak hacimsel render edilmiş rekonstrüksiyonlar oluşturun ve Snapshot modülünü kullanarak temsili görüntüleri dışa aktarın.
      NOT: Üç boyutlu rekonstrüksiyonlar, yazılımın varsayılan render hattı kullanılarak herhangi bir modifikasyon yapılmadan oluşturulmuştur. Görüntü segmentasyonu, eşikleme, gürültü giderme, arka plan çıkarma veya başka bir ön işleme uygulanmamıştır. Rekonstrüktif görüntüler, koroner vaskülatürün kalitatif görselleştirilmesi için kullanılır ve kantitatif analiz için amaçlanmamıştır.

10. İstatistiksel Analiz

  1. Tüm verileri ortalama ± ortalamanın standart hatası (SEM) olarak ifade edin. İstatistiksel analizleri GraphPad Prism yazılımı (versiyon 5.0) kullanarak gerçekleştirin.
  2. Deneysel birimi bireysel hayvan olarak tanımlayın. Tüm fonksiyonel, biyobelirteç ve histomorfometrik sonlanım noktaları için grup başına n = 8 fareyi analiz edin.
  3. Veri toplama ve analiz işlemlerini, araştırmacıların grup atamalarına karşı körlüğünü koruyarak kodlanmış örnek tanımlayıcılar üzerinden yürütün. Grup atamalarını ancak tüm nicel analizler tamamlandıktan sonra açıklayın.
  4. Uygun istatistiksel testi seçmeden önce, GraphPad Prism (versiyon 5.0) ile veri normalliğini Shapiro–Wilk testiyle ve varyans homojenliğini Levene testiyle değerlendirin.
  5. Normallik ve eşit varyans varsayımları karşılandığında, iki grubu iki kuyruklu eşleştirilmemiş Student's t-testi ile karşılaştırın. Aksi takdirde, Mann–Whitney U testi uygulayın.
  6. P < 0.05 değerini istatistiksel olarak anlamlı kabul edin. İstatistiksel anlamlılığı P < 0.05, P < 0.01 ve P < 0.001 şeklinde belirtin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

AIS, LAD koroner arterinin yerelleştirilmesi ve ligasyon bölgesinin belirlenmesi için anatomik referans noktası olarak kullanılmıştır (Şekil 1A–C). AIS belirlendikten sonra; torakotomi, kalbin açığa çıkarılması, LAD ligasyonu, torasik kapatma ve postoperatif iyileşmeyi içeren MI indüksiyonu için ardışık cerrahi iş akışı, Şekil 2A–L'de gösterildiği gibi uygulanmıştır. Basitleştirilmiş protokol, farelerde MI'nın hızlı ve tekrarlan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Son yıllarda, MI'nın klinik ve deneysel modelleri kardiyovasküler araştırmalarda giderek daha önemli hale gelmiştir; ancak MI'nın patogenezine ve tedavi stratejilerine ilişkin birçok soru hala çözülmemiştir. Bu makale, birkaç kritik prosedürel adımın özel dikkat gerektirdiği, geliştirilmiş bir murine MI modeli kurma yöntemini açıklamaktadır. İlk kritik adım trakeal entübasyondur. Bazı önceki protokoller, entübasyondan önce servikal derinin kesilmesini ve trakeayı açığa çıkarmak için dokuların diseke edilmesini gerektiren...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma; Sichuan Bilim ve Teknoloji Programı (No. 2026NSFSC1823 ve 2022YFS0618), Sichuan Eyaleti Geleneksel Çin Tıbbı İdaresi Projesi (Sichuan Eyaleti Geleneksel Çin Tıbbı İdaresi Ofisi No. 7 [2024]), Sichuan Geleneksel Çin ve Batı Tıbbı Entegrasyon Derneği Projesi (No. ZXY2025019) ve Güneybatı Tıp Üniversitesi Projesi (Hibe No. 2023ZYYQ04 ve 2023ZYYQ17) tarafından verilen hibelerle desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.9% steril salinSichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.–Sefazolin rekonstitüsyonu
3% agarozSigma-AldrichA0169Numune gömme
4% paraformaldehitSigma-Aldrich158127Doku fiksasyonu
Absolüt etanolChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.0170ADoku dehydrasyonu; yanıcı
Asit fuksinAladdinA104916-100gMasson trikrom boyama için Ponceau–asit fuksin çözeltisinin hazırlanması
AcqKnowledge yazılımıBIOPAC SystemsAcqKnowledge 4.0Elektrokardiyogram edinimi ve analizi
Amonyak çözeltisi, 0.5% suluChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.2528AHematoksilen ve eozin boyama sırasında maviye çevirme
Anilin mavisi, asitte çözünürAladdinA111200-100gMasson trikrom boyama için anilin mavisi çözeltisinin hazırlanması
Aseptik tıbbi eldivenlerNanchang Feixiang Latex Products Co., Ltd.–Kimyasal ve biyolojik koruma
BuprenorfinQinghai Pharmaceutical Factory Co., Ltd.H10940181Postoperatif analjezi
Enjeksiyonluk sefazolin sodyumCSPC Zhongnuo Pharmaceutical (Shijiazhuang) Co., Ltd.–Perioperatif antibiyotik profilaksisi
Pamuklu çubuklarShijiazhuang Kangertai Medical Equipment Co., Ltd.–Epikardiyal silme ve aseptik hazırlık
DAPI boyama çözeltisiThermo FisherD1306Nükleer markalama
Tüy dökücü kremVeet–Torasik tüy temizleme
Dijital lam tarayıcı3DHISTECHPannoramic MIDI IITüm lam görüntüleme
EKG amplifikatörüBIOPAC SystemsECG100CElektrokardiyogram amplifikasyonu
Elektrokardiyogram kayıt sistemiBIOPAC SystemsMP160Elektrokardiyogram kaydı
ELISA kiti, fare B-tipi natriüretik peptidQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.RXW202726MSerum BNP kantifikasyonu
ELISA kiti, fare interlökin-1βQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.RX203063MSerum IL-1β kantifikasyonu
ELISA kiti, fare nükleer faktör-κB p65Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.RX201879MSerum NF-κB p65 kantifikasyonu
ELISA kiti, fare tümör nekroz faktörü-αQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.RX202412MSerum TNF-α kantifikasyonu
Gömme kasetleriJiangsu Shitai22022Doku gömme
Endotrakeal kateter, 20 GShenzhen Bailide Biotechnology Co., Ltd.B11103Oral entübasyon; dış çap yaklaşık 0.9–1.0 mm; kullanımdan önce yaklaşık 15 mm'ye kısaltılmış
Eozin Y, alkolde çözünürHefei BASF Biotechnology Co., Ltd.Y0310-100GHematoksilen ve eozin boyama sırasında sitoplazmik karşıt boyama
Evans BlueJarvisbioA312001Koroner vaskülatür markalaması
Hassas pensRWD Life ScienceF12011-10Doku tutma ve perikard açma
Hassas pens, mikrocerrahiRWD Life ScienceFC12002T-08Mikrocerrahi doku tutma
Hassas makasRWD Life ScienceS12000-09Cilt insizyonu ve diseksiyon için oftalmik makas
Glasiyal asetik asitChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.–Masson trikrom diferansiyasyonu için 1% asetik asit hazırlanması
Cam lamlarJiangsu Shitai80312/80302Kesit montajı
Cam boncuk sterilizatörüRWD Life ScienceRS3002Hayvanlar arası alet sterilizasyonu
GraphPad Prism yazılımıGraphPad SoftwareVersiyon 5.0İstatistiksel analiz
Isıtma pediRWD Life Science69020Postoperatif termoregülasyon
Hematoksilen boyama çözeltisiWuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1004Hematoksilen ve eozin boyama sırasında nükleer boyama
Yaban turbu peroksidaz-konjuge deteksiyon antikoruQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.ELISA kitleri ile birlikte sağlanırELISA deteksiyonu
Hidroklorik asitChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.1337AHematoksilen diferansiyasyonu için asit alkol hazırlanması
Image-Pro Plus yazılımıMedia CyberneticsVersiyon 6.0Kolajen hacim fraksiyonu kantifikasyonu
Imaris yazılımıBitplaneVersiyon 7.2.3Üç boyutlu rekonstrüksiyon ve analiz
İzofluranRWD Life ScienceR510-22-10İnhalasyon anesteziği
İzofluran anestezi sistemiRWD Life ScienceTAIJI-IEİzofluran iletimi
Laringoskop, küçük hayvanShanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.SR310-MREntübasyon sırasında doğrudan görselleştirme
Işık-sayfa floresan mikroskobuLight Innovation TechnologyLiToneXLÜç boyutlu floresan görüntüleme
LitScan yazılımıLight Innovation TechnologyVersiyon 3.31Görüntü birleştirme ve dönüştürme
Mekanik ventilatörChengdu Taimeng Software Co., Ltd.HX-101EMekanik ventilasyon; 130 nefes/dak; tidal volüm 2 mL
Mikro-sivrisinek hemostatıRWD Life ScienceFC21001R-12Ligasyon ve kapatma sırasında iğne tutma
Mikrolitre şırıngaShanghai Gaoge Industry and Trade Co., Ltd.–Lokalize DAPI enjeksiyonu
Mikroplaka okuyucuMolecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.SpectraMax iD5450 nm'de optik yoğunluk ölçümü
Mikroskop, diseksiyonMaishidi (Dongguan) Technology Co., Ltd.MSD204İntraoperatif görselleştirme
Mikroskop, dik ışıklıLeicaDM500Histolojik görüntüleme
Mikrotom bıçaklarıEprediaMX35 ULTRAParafin kesit alma
Modifiye Sirius Red boyama kitiWuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1078Kolajen boyama; A, B ve C çözeltilerini içerir
n-BütanolChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.0886AHistolojik dehydrasyon ve şeffaflaştırma; yanıcı
Nötr montaj reçinesiShanghai YiyangYSQN41-91Lam montajı
Naylon sütür, 3/8-daire 7-0 iğneliNingbo Medical Needle Co., Ltd.–Sol anterior desendan koroner arter ligasyonu
Naylon sütür, 5-0Ningbo Medical Needle Co., Ltd.–Torasik ve cilt kapatma
Naylon sütür, 6-0Ningbo Medical Needle Co., Ltd.–Göğüs duvarı ekspozisyonu ve traksiyon
Parafin gömme istasyonuWuhan Junjie ElectronicsJB-L5Doku gömme
Parafin mumuNANADoku infiltrasyonu ve gömme
Fosfat tamponlu salinSigma-AldrichP3813Doku yıkama ve reaktif dilüsyonu
Fosfomolibdik asitTianjin Aopusheng Chemical Co., Ltd.–Masson trikrom diferansiyasyonu
Ponceau 2RAladdinP104989-25gMasson trikrom boyama için Ponceau–asit fuksin çözeltisinin hazırlanması
Potasyum dikromatZhengzhou Paini Chemical Reagent Factory7778-50-9Masson trikrom mordanı
Povidon–iyodürSingleLadyGB26368-2010Cilt dezenfeksiyonu
Ters osmoz suyuLaboratuvar saflaştırmalıUygulanamazÇözelti hazırlama
Rotary mikrotomLeica Instruments (Shanghai)RM2016Parafin kesit alma
Numune tutucu adaptörüLight Innovation TechnologyLiToneXL ile birlikte sağlanırŞeffaflaştırılmış numunelerin ışık-sayfa görüntüleme için montajı
Cilt yapışkan bandıQingdao Schultz Biotechnology Co., Ltd.–Ekstremitelerin ve kuyruğun sabitlenmesi
Lam lamelleriJiangsu Shitai80340-1630Lamel kapatma
Lam kurutucuShaoxing Luyue101-3BLam kurutma
Durdurma çözeltisiQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.ELISA kitleri ile birlikte sağlanırELISA reaksiyon sonlandırma
Substrat çözeltileri A ve BQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.ELISA kitleri ile birlikte sağlanırELISA renk gelişimi
Doku flotasyon banyosuWuhan Junjie ElectronicsJK-5/6Kesit flotasyonu
Doku işlemciWuhan Junjie ElectronicsJT-12SOtomatik doku işleme
Doku şeffaflaştırma kiti, Reaktifler A–FJarvisbioJA11012Solvent bazlı doku şeffaflaştırma
Trakeal entübasyon platformuRWD Life ScienceRe20-MOral entübasyon konumlandırması
Ultrasun analiz yazılımıFujifilm VisualSonicsVevoLAB 3.2.6Ekokardiyografi veri analizi
Ultrasun jeliTianjin Jinya Electronics Co., Ltd.TM-100Ekokardiyografik kuplaj
Ultrasun görüntüleme sistemiFujifilm VisualSonicsVevo 3100Ekokardiyografi
V-şekilli göz kapağı retraktörüSuqian Shengshi Medical Equipment Co., Ltd.SS5009Gİnterkostal ve kaburga retraksiyonu
Yıkama tamponuQuanzhou Ruixin Biological Technology Co.ELISA kitleri ile birlikte sağlanırELISA plaka yıkama
Su saflaştırma sistemiSichuan ULUPURE Ultrapure Technology Co., Ltd.UPT-II-20TTers osmoz suyu üretimi
KsilenChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.05.001.0586ADoku şeffaflaştırma ve deparafinizasyon; yanıcı ve nörotoksik

Kaynaklar

  1. Thygesen K, et al. Fourth universal definition of myocardial infarction (2018). J Am Coll Cardiol. 2018;72(18):2231-2264.
  2. Lindahl B, Mills NL. A new clinical classification of acute myocardial infarction. Nat Med. 2023;29(9):2200-2205. doi:10.1038/s41591-023-02513-2.
  3. De Villiers C, Riley PR. Mouse models of myocardial infarction: comparing permanent ligation and ischaemia-reperfusion. Dis Model Mech. 2020;13(11):dmm046565.
  4. Johns TNP, Olson BJ. Experimental myocardial infarction. I. A method of coronary occlusion in small animals. Ann Surg. 1954;140(5):675-682.
  5. Christia P, et al. Systematic characterization of myocardial inflammation, repair, and remodeling in a mouse model of reperfused myocardial infarction. J Histochem Cytochem. 2013;61(8):555-570.
  6. Martin TP, et al. Preclinical models of myocardial infarction: from mechanism to translation. Br J Pharmacol. 2022;179(5):770-791.
  7. Kumar M, et al. Animal models of myocardial infarction: mainstay in clinical translation. Regul Toxicol Pharmacol. 2016;76:221-230.
  8. Gao E, et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 2010;107(12):1445-1453.
  9. van den Bos EJ, et al. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005;289(3):H1291-H1300.
  10. Pinelli A, et al. Isoproterenol-induced myocardial infarction in rabbits. Protection by propranolol or labetalol: a proposed non-invasive procedure. Eur J Pharm Sci. 2004;23(3):277-285.
  11. Maruyama K, et al. Surgical protocol for permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice to generate a model of myocardial infarction. STAR Protoc. 2021;2(3):100775.
  12. Johny E, Dutta P. Left coronary artery ligation: a surgical murine model of myocardial infarction. J Vis Exp. 2022;(186).
  13. Kolk MVV, et al. LAD-ligation: a murine model of myocardial infarction. J Vis Exp. 2009;(32):1438.
  14. Lugrin J, Parapanov R, Krueger T, Liaudet L. Murine myocardial infarction model using permanent ligation of left anterior descending coronary artery. J Vis Exp. 2019;(150).
  15. Chen J, et al. Variability in coronary artery anatomy affects consistency of cardiac damage after myocardial infarction in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2017;313(2):H275-H282.
  16. Ahn D, et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004;286(3):H1201-H1207.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Koroner Arter LigasyonuAnterior İntraventriküler Olukİzofluran AnestezisiTrakeal EntübasyonElektrokardiyografi DoğrulamasıEkokardiyografiHistopatolojik Boyama

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.