Bu protokol, hassas sütür yerleşimi için tekrarlanabilir bir yüzey referans noktası olarak anterior interventriküler sulkus kullanılarak, kalıcı sol anterior desenden koroner arter ligasyonu yoluyla farelerde miyokard enfarktüsü oluşturur. Enfarktüs; elektrokardiyografi, ekokardiyografi, histolojik boyama ve serum biyobelirteç analizi ile doğrulanır.
Yöntem makalesi
Bir Fare Miyokard Enfarktüsü Modelinde Anatomik İşaretçiler Kullanarak Sol Ön İnen Koroner Arterin Hassas Ligasyonu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Sol ön descending (LAD) koroner arterin kalıcı ligasyonu, preklinik kardiyovasküler araştırmalarda miyokard enfarktüsü (MI) fare modelleri oluşturmak için en yaygın kullanılan yaklaşımdır. Ancak konvansiyonel protokollerde, ligasyon bölgesi tipik olarak sol atriyal apendiksle belirlenen ve cerrahi sırasında güvenilir şekilde tanımlanması genellikle zor olan bir noktanın 1–2 mm altına yerleştirilir. Fare koroner anatomisindeki belirgin bireysel farklılıklarla birleştiğinde bu durum, sıklıkla hatalı LAD lokalizasyonuna, tutarsız ligasyon bölgelerine ve operatörler arasında düşük tekrarlanabilirliğe yol açar. Bu sınırlamaları gidermek amacıyla bu protokol, LAD ligasyonu için rehber bir referans noktası olarak anterior interventriküler sulcus'u (AIS) tanıtmaktadır. AIS, mikroskop altında doğrudan görülebilen ve LAD'nin hemen altından geçtiği sığ bir yüzey oluğudur. Konvansiyonel yaklaşımların aksine, ligasyon bölgesinin daha tutarlı seçilmesini destekleyen stabil bir anatomik referans sağlar ve deneyimsiz operatörler tarafından tanımlanması daha kolaydır. Protokol, standardize izofluran inhalasyon anesteziyi non-invaziv trakeal entübasyonla birleştirir ve MI'yı elektrokardiyografi, ekokardiyografi, enzim bağlı immünosorbent analiz (ELISA), histopatolojik boyama ve üç boyutlu koroner arter görüntüleme ile doğrular. Bu protokol, MI sonrası patofizyolojik ve immün değişiklikleri araştırmak üzere farelerde MI indüklemek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir deneysel yöntem sunmaktadır.
Giriş
Dünya çapında kardiyovasküler morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenlerinden biri olan miyokard enfarktüsü (MI), insan sağlığına yönelik ciddi bir tehdit oluşturmaktadır1. Ani başlangıcı, kritik klinik seyri ve yüksek ölüm oranı ile karakterize olan MI, temel olarak koroner arterlerin trombotik tıkanıklığından kaynaklanır ve derin miyokard iskemisine, ardından gelen kardiyomiyosit nekrozuna ve aritmi, kalp yetmezliği ve ani kalp ölümü dahil olmak üzere bir dizi komplikasyona yol açabilir2. Klinik kardiyolojideki dikkate değer ilerlemelere rağmen, insan miyokard dokusuna erişimin sınırlı olması, MI'nin altında yatan patofizyolojik mekanizmaların araştırılmasını ve etkili terapötik stratejilerin geliştirilmesini engellemeye devam etmektedir3. Sonuç olarak, MI'nin klinik özelliklerini ve ilerlemesini aslına uygun şekilde tekrarlayan, güvenilir, yeniden üretilebilir ve klinik olarak ilgili in vivo hayvan modelleri, mekanistik çalışmalar ve preklinik terapötik değerlendirmeler için temel öneme sahip olmaya devam etmektedir.
Johns ve Olson'ın 1954'te ilk kez bir fare MI modeli oluşturmasından bu yana, farelerde MI indükleme metodolojileri sürekli bir geliştirme sürecinden geçmiştir4. Sol anterior desendan (LAD) koroner arterin doğrudan mikroskobik görüntüleme altında kalıcı ligasyonu; lokalize miyokardiyal iskemi, miyokardiyal nekroz ve enfarkt sonrası ventriküler yeniden şekillenme dahil olmak üzere insan MI'nın temel patolojik özelliklerini yeniden oluşturduğu için en yaygın kabul gören teknik haline gelmiştir5. Ancak, geleneksel LAD ligasyonu, tipik olarak yalnızca kapsamlı eğitimlerle kazanılan ciddi bir mikrocerrahi uzmanlığı gerektirmekte, bu durum operatörler ve laboratuvarlar arasındaki prosedürel tutarlılığı ve tekrarlanabilirliği sınırlamaktadır6. Ayrıca; kanama, pulmoner yaralanma veya kollaps, ligatürün yanlış yerleştirilmesi ve yetersiz ventilasyon sonucu oluşan mekanik doku hasarı dahil olmak üzere intraoperatif ve postoperatif komplikasyonlar, nispeten yüksek perioperatif mortaliteye katkıda bulunarak bu modelin yaygın uygulamasını daha da kısıtlamaktadır7. Bu sınırlamalara yanıt olarak Gao ve ark., cerrahi prosedürü basitleştiren ve model oluşturulmasındaki teknik engelleri düşüren, kardiyak eversiyon yoluyla LAD ligasyonunu içeren modifiye bir teknik tanıtmışlardır8. Koroner kriyoyaralanma ve miyokardiyal yaralanmanın farmakolojik indüksiyonu dahil olmak üzere ek deneysel yaklaşımlar da spesifik araştırma uygulamaları için geliştirilmiştir9,10. Buna rağmen, doğrudan görüntüleme altında kalıcı LAD ligasyonu, enfarkt boyutunun ve konumunun kontrollü indüksiyonuna izin verirken insan MI'nın temel patofizyolojik özelliklerini en yakın şekilde yeniden oluşturduğu için tercih edilen yöntem olmaya devam etmektedir.
Yaygın kullanımına rağmen, geleneksel LAD ligasyonu; ligasyon bölgesinin değişken tanımlanması, prosedürel tutarsızlıklar, nispeten yüksek perioperatif mortalite ve tekrarlanabilirlikteki laboratuvarlar arası değişkenlik ile sınırlıdır ve tüm bunlar deneysel sonuçların güvenilirliğini ve karşılaştırılabilirliğini etkileyebilir11. Mevcut protokolün genel amacı, damar lokalizasyonu için dışsal bir anatomik işaret olarak anterior interventriküler sulkus (AIS) kullanarak, farelerde kalıcı LAD ligasyonu için daha standardize ve tekrarlanabilir bir yöntem oluşturmaktır. Ligasyon bölgesini sol atriyal apandisin altındaki sabit bir mesafeden tahmin etmek yerine, bu protokol; mikroskobik görüntüleme altında doğrudan görülebilen ve LAD'nin üzerinde yer alan sığ bir yüzey oluğu olan AIS'yi, ligasyona rehberlik edecek sabit bir anatomik referans olarak tanımlar. Geleneksel işaret tabanlı tahmine kıyasla bu yaklaşımın, standart fare MI prosedürleriyle uyumluluğu korurken, ligasyon bölgesinin daha tutarlı seçimini kolaylaştırması, operatöre bağlı değişkenliği azaltması ve deneyimi daha az olan cerrahlar için erişilebilirliği artırması amaçlanmıştır. Bu nedenle protokol; miyokardiyal hasar, ventriküler remodeling, inflamasyon ve ilgili kardiyovasküler hastalık mekanizmalarının çalışmaları için kalıcı MI modelleri oluşturmada tekrarlanabilir bir cerrahi yöntem arayan araştırmacılar için uygundur.
Protokol
Hayvanlarla yapılan tüm deneyler, Southwest Medical University Hayvan Deney Merkezi Etik Kurulu'nun onayıyla gerçekleştirilmiştir (Onay No. SWMU20240146). Bu çalışmada, 8-10 haftalık ve 20,0 ± 3,0 g ağırlığındaki erkek C57BL/6J fareler (spesifik patojen içermeyen [SPF]) kullanılmıştır. Deneylere başlamadan önce fareleri standart laboratuvar koşullarında (22°C ± 2°C; 12 sa ışık/12 sa karanlık döngüsü) 1 hafta boyunca aklimatize edin.
1. Cerrahi öncesi hazırlık
- Pensler, oftalmik makaslar, iğne tutucu, mikro-mosquito hemostat, V şeklinde göz kapağı retraktörü, iğneli 3/8 daire 7-0 naylon süturlar, 6-0 naylon süturlar ve 5-0 naylon süturlar da dahil olmak üzere tüm cerrahi aletleri ameliyat gününde hazırlayın ve sterilize edin. Tüm metal aletleri işlemden önce 121°C'de 20 dk boyunca otoklavlayın ve hayvanlar arasında cam boncuklu sterilizatör (250°C'de 15 sn) kullanarak yeniden sterilize edin, ardından steril bir ped üzerinde soğutun. Mühürlü steril paketlerdeki süturları kullanın.
- Aseptik tekniği korumak için iki ayrı çalışma alanı kurun. Bir alanı pensler, bir fare trakeal entübasyon kiti ve bir anestezi cihazı ile hazırlayın; ikinci steril cerrahi alanı ise sterilize edilmiş aletler, pamuklu çubuklar, povidon-iyot ve steril gazlı bez ile hazırlayın.
- Torasik bölgeye 1 dk boyunca tüy dökücü krem uygulayın. Kremi ve tüyleri, steril su veya salin ile nemlendirilmiş steril gazlı bez kullanarak nazikçe temizleyin.
- Sadece tüy alma işlemi cerrahi cilt hazırlığı sayılmaz. Kesin aseptik cilt dezenfeksiyonunu ve steril örtme işlemini, fareyi anestezi altına alıp entübe ettikten ve cerrahi platforma sabitledikten sonra, cilt insizyonundan hemen önce gerçekleştirin (Adım 2.6).
- Ameliyattan 1 saat önce intraperitoneal enjeksiyon yoluyla cefazolin (300 mg/kg) uygulayın. Enjeksiyon için cefazolin sodyumu, steril 0.9% salin ile 30 mg/mL çalışma konsantrasyonuna getirin ve hedef doza ulaşmak için 20 g vücut ağırlığı başına yaklaşık 0.2 mL uygulayın. Ameliyat sonrası 5 ardışık gün boyunca günde bir kez uygulamaya devam edin.
NOT: Bu protokolde sistemik veya topikal farmakolojik hemostatik ajanlar uygulamayın. İntraoperatif hemostazı, steril bir pamuklu çubukla 10–30 sn boyunca veya kanama durana kadar nazik ve sürekli baskı uygulayarak sağlayın.
2. Anestezi İndüksiyonu ve Trakeal Entübasyon
- Fareyi anestezi cihazına bağlı indüksiyon haznesine (16 × 10 × 11 cm) yerleştirin. Taşıyıcı gaz akış hızını 0.5 L/min olarak ayarlayın ve %3.5–4.0 isofluran ile anestezi indüksiyonu yapın.
NOT: Yeterli anesteziyi, pedal çekilme refleksinin yokluğu ile doğrulayın. Bu ayarlarda fare, genellikle 2–4 dk içinde cerrahi anestezi düzeyine ulaşır. - Anestezize edilmiş fareyi, murin trakeal entübasyon platformuna sırt üstü (supine) pozisyonda yerleştirin. Baş ve boyun yaklaşık 45° açıyla ekstansiyonda olacak şekilde, üst kesici dişleri platformun lastiğine takarak fareyi asın. Glottis doğrudan görünür hale gelecek şekilde oral, faringeal ve laringeal eksenleri hizalayın.
- Orotrakeal entübasyon gerçekleştirin
- Kontrollü mekanik ventilasyonu sağlamak için trakeotomi yapmadan, direkt laringoskopi altında orotrakeal entübasyon gerçekleştirin. Endotrakeal tüp olarak 20 G intravenöz kateter (dış çap yaklaşık 0.9 mm; uzunluk yaklaşık 15 mm) kullanın.
- Ağzı açın ve pens yardımıyla dili nazikçe bir yana itin. Küçük hayvan laringoskopunun kanadını dilin dorsumu boyunca yerleştirin ve dil kökünü aşağı bastırın.
- Epiglot görünür olana kadar laringoskopu ilerletin. Epiglotu kaldırmak ve V şeklindeki glottik açıklığı ile soluk renkli vokal kordları açığa çıkarmak için laringoskopu tutamağın ekseni boyunca yukarı ve ileri doğru kaldırın.
- Vokal kordların doğrudan görsellemesini sürdürürken, inspirasyon sırasında kateteri açık glottisten ilerletin. Kateter glottisten geçtikten sonra laringoskopu çıkarın.
- Kateteri yaklaşık 5–7 mm derinliğe kadar ilerletin. Stileti geri çekin ve kateteri ventilatöre bağlayın.
NOT: Endotrakeal tüpün doğru yerleşimini, ventilatörle senkronize, simetrik bilateral göğüs duvarı hareketlerini gözlemleyerek doğrulayın. Eğer göğüs duvarı hareketi minimal ise ve bunun yerine ritmik abdominal hareketler oluşuyorsa ve buna anestezinin kademeli olarak hafiflemesi eşlik ediyorsa, kateteri özofagustan çıkarın ve entübasyonu tekrarlayın. - Glottis görselleştirilemezse laringoskopu geri çekin ve fareyi, baş ve boyun yaklaşık 45° ekstansiyonda olacak şekilde entübasyon platformunda yeniden konumlandırın. Oral, faringeal ve laringeal eksenleri yeniden hizalayın, orofaringeal sekresyonları steril bir pamuklu çubukla temizleyin ve laringoskopiyi tekrarlayın. Fare anesteziden uyanma belirtileri gösterirse, onu indüksiyon haznesine geri götürün, anesteziyi derinleştirin ve ardından entübasyon girişimini tekrarlayın.
- Farede siyanoz, laringeal kanama veya kalıcı apne gelişirse prosedürü durdurun. İsofluran uygulamasını kesin ve fareyi tamamen iyileşene kadar sıcaklık kontrollü bir ısıtma pedine (37°C) yerleştirin.
- Trakeal entübasyon başarısız olursa torakotomiye geçmeyin. Prosedürü daha sonraki bir oturuma yeniden planlayın veya hayvanı çalışmadan hariç tutup bunu prosedürel başarısızlık olarak kaydedin.
NOT: Tekrarlanan entübasyon girişimleri laringeal ödeme neden olarak postoperatif solunum sıkıntısı riskini artırabilir. Çoğu durumda, glottisin doğrudan görsellemesinden sonraki ilk iki girişimde başarılı entübasyon sağlanır. Orotrakeal entübasyonda yetkinlik, uygulama ve tekniğe aşinalık gerektirir.
- Taşıyıcı gaz olarak havayı 0.5 L/min akış hızında verin ve anesteziyi %1.5–2.0 isofluran ile sürdürün. Ventilatörü 130 soluk/dak solunum hızı, 2 mL tidal hacim ve 5:4 inspiratuar-ekspiratuar oranına ayarlayın.
NOT: Ventilatörde ayarlanan tidal hacim, ventilatör devresinin sıkıştırılabilir hacmini ve endotrakeal tüpün ölü boşluğunu kompanse ettiği için vücut ağırlığından tahmin edilen teorik değeri aşar. Prosedür boyunca hayvanı siyanoz ve pnömotoraks ile subkutan amfizem dahil olmak üzere barotravma belirtileri açısından izleyerek ventilasyonu değerlendirin.- Prosedür boyunca anestezi derinliğini sürekli olarak izleyin. Solunum paternini ve pedal çekilme refleksini her 2 dk'da bir değerlendirin. Kalp hızını elektrokardiyogram (EKG) kullanarak sürekli izleyin ve kalp hızını 400–500 atım/dak düzeyinde tutmak için isofluran konsantrasyonunu ayarlayın; genellikle %1.5–2.0 isofluran konsantrasyonu yeterlidir. Prosedür boyunca ventilatöre karşı spontan solunum çabasını, bıyık hareketlerini ve mukoza rengindeki değişiklikleri gözlemleyin.
- Pedal çekilme refleksi yeniden ortaya çıkarsa, bıyık hareketi gözlemlenirse veya ventilatöre karşı spontan solunum çabası oluşursa, isofluran konsantrasyonunu maksimum %3.0'a kadar %0.5'lik artışlarla yükseltin. Kalp hızı 350 atım/dak'nın altına düşerse, isofluran konsantrasyonunu minimum %1.0'a kadar %0.5'lik azalışlarla düşürün. Bu belirtiler gözlemlendiğinde cerrahi prosedürü durdurun; kalp hızını, solunum paternini, mukoza rengini ve bıyık hareketlerini izlemeye devam edin ve prosedüre ancak fizyolojik parametreler stabilize olduktan sonra yeniden başlayın.
- Sol toraks duvarını açığa çıkarmak için fareyi sol tarafı üstte kalacak şekilde sağ yanına doğru eğin. Dört uzvu ve kuyruğu yapışkan bant kullanarak platforma sabitleyin.
- Cerrahi alanı üç ardışık povidon–iyodin uygulamasıyla dezenfekte edin. Her uygulama için, planlanan insizyon bölgesinden başlayarak ve her yönde amaçlanan insizyonun yaklaşık 1 cm ötesine kadar konsentrik bir spiral şeklinde hareket ederek taze steril bir pamuklu çubuk kullanın. Her uygulamadan sonra çubuğu atın ve kullanılmış bir çubuğu cerrahi alanın merkezine geri getirmeyin. Son uygulamanın havada tamamen kurumasına izin verin, ardından cilt insizyonunu yapmadan önce sadece cerrahi alanı açıkta bırakacak şekilde steril bir örtü serin.
3. Torakotomi ve Kalbin Açığa Çıkarılması
NOT: Hayvan konumlandırma, torakotomi, kalbin açığa çıkarılması, LAD koroner arter ligasyonu, torasik kapatma ve ameliyat sonrası iyileşmeyi içeren genel cerrahi iş akışı Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilmiştir.
Şekil 1: Anterior interventriküler sulkus kullanılarak sol anterior descending koroner arter ligasyon bölgesinin anatomik lokalizasyonu. (A) Ligasyon öncesi açığa çıkarılmış fare kalbinin ventral görünümü, anterior interventriküler sulkusu (AIS) göstermektedir. (B) Sol anterior descending (LAD) koroner arter ligasyonundan sonra aynı bölgenin görünümü; daire içine alınmış bölge ligasyon yerini belirtmektedir. (C) AIS ile koroner arterler arasındaki uzamsal ilişkiyi gösteren şema. LAD, AIS boyunca ilerler ve ligasyon noktası sulkusun üst üçte birlik kısmında yer alır. RCA, sağ koroner arter; LCA, sol koroner arter; LCX, sol sirkumfleks koroner arter. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Farelerde sol ön inen koroner arterin anterior interventriküler sulkus kılavuzluğunda ligasyonuna yönelik cerrahi işlem. (A) Sol göğüs bölgesi tüylerinden arındırılmış, anestezi altındaki fareyi konumlandırın ve sabitleyin. (B) Sol göğüs duvarı üzerinden bir cilt insizyonu yapın. (C) Pektoral kasları ayırın ve torakotomi için uygun interkostal boşluğu belirleyin. (D,E) Interkostal boşluğu genişletmek ve operasyon alanını açığa çıkarmak için göğüs ekartörünü yerleştirin ve konumlandırın. (F) Açığa çıkan kalbi görüntüleyin ve anterior interventriküler sulkusu (AIS) belirleyin. (G) 7-0 naylon bir sütürü AIS üzerinden ve sol ön inen (LAD) koroner arterin altından geçirin. (H) Kalıcı LAD ligasyonu sağlamak için sütürü sabitleyin. (I) Göğüs ekartörünü çıkarın ve göğüs duvarını kapatın. (J,K) Kas ve cilt katmanlarını sırayla kapatın. (L) Fareyi ameliyat sonrası ısıtma altında iyileşmeye bırakın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Oftalmik makas kullanarak, sol göğüs duvarında, sternumun uzun eksenine paralel ve sol sternal kenarın yaklaşık 2 mm lateralinde 1 cm'lik boylamsal bir cilt insizyonu yapın. Alttaki pektoral kasları açığa çıkarın.
- İnce forsepsler kullanarak, pectoralis major ve pectoralis minor kaslarını liflerin yönü boyunca künt olarak ayırın. Kaburgaları ve interkostal aralıkları açığa çıkarmak için kasları lateral yöne çekin ve kanamayı minimize etmek için kasları kesmekten kaçının.
- Torasik boşluğu açmadan önce uygun interkostal aralığı belirleyin. Kaburgalara paralel olarak bir interkostal aralık içinde seyreden internal torasik arterin bir dalı olan anterior interkostal arteri yerleştirin ve dördüncü interkostal aralıkta en tutarlı şekilde görünen arterin hemen kranialindeki üçüncü interkostal aralığı belirleyin.
- Anterior interkostal arter net bir şekilde görünmüyorsa, birinci kaburgayı palpe edin ve üçüncü ile dördüncü kaburgalar arasındaki aralığı belirlemek için kaudal yönde sayın. Devam etmeden önce, seçilen interkostal aralığın sol atrial apendiks ve sol ventrikülün anterior serbest duvarına doğrudan, engelsiz bir görünüm sağladığını onaylayın.
NOT: Üçüncü interkostal aralığın doğru belirlenmesi esastır çünkü yanlış torakotomi bölgesi kalbin görüntülenmesini azaltabilir ve prosedürü tehlikeye atabilir. - Sol üçüncü interkostal aralıktan bir torakotomi gerçekleştirin. Sol atrial apendiks ve sol ventrikülün üst üçte biri cerrahi sahada net bir şekilde açığa çıkana kadar V şeklinde bir göz kapağı retraktörü kullanarak interkostal aralığı nazikçe genişletin.
NOT: Bu aşamada kalp perikard ile örtülü kalır; bu nedenle AIS güvenilir bir şekilde belirlenemez. AIS'yi, Adım 4.2–4.3'te açıklandığı gibi, yalnızca perikard açıldıktan sonra (Adım 3.6) belirleyin. - Perikardı bir çift ince forsepsle nazikçe kavrayın ve miyokarddan yukarı kaldırın. Perikardı yavaşça yırtarak açmak ve kalbi tamamen açığa çıkarmak için ikinci bir çift ince forseps kullanın.
4. Sol Ön İnen Koroner Arterin İşaret Noktası Rehberliğinde Ligasyonu
- Göğüs duvarından 6-0 naylon bir sütur geçirin ve operasyon alanını genişletmek için nazikçe traksiyon uygulayın. Ligasyon bölgesini belirlemeden önce AIS'yi tamamen açığa çıkarın (Şekil 1A).
- AIS'yi, kardiyak tabandan apeksle doğru eğik şekilde uzanan ve sol ile sağ ventriküller arasındaki yüzey sınırını belirleyen sığ oluk olarak tanımlayın (Şekil 1C). Mikroskop altında, sol atriyum apendiksinin inferior kenarının yaklaşık 1–2 mm altında yer alan yarı dairesel bir çöküntü olarak belirleyin.
- AIS'nin tanımlanması zorsa, epikardiyal yüzeyi ılık salin ile nemlendirilmiş bir pamuklu çubukla nazikçe silin. Oluğu daha net belirlemek için operasyon alanını mikroskop altında yeniden inceleyin.
NOT: Diseksiyon mikroskobu altında AIS, anatomik olarak interventriküler sınırı belirleyen ve hemen altında LAD koroner arterin seyrettiği, kolayca tanımlanabilen sığ bir oluktur. Silme işleminden sonra AIS hala belirsizse, öncelikle torakotominin yeterli marj sağladığından emin olun. Ardından LAD'yi daha önce raporlanmış yöntemlere göre doğrudan tanımlayın: beraberindeki kardiyak vene kıyasla arter, renkte daha pembe, kalibre olarak daha küçük ve belirgin şekilde pulsatildir12.- AIS veya LAD koroner arter tanımlanamazsa, öncelikle torakotominin sol üçüncü interkostal boşluktan yapıldığını doğrulayın. Gerekiyorsa, torakotomini Adım 3.3–3.5'te açıklandığı gibi yeniden konumlandırın, ardından Adım 4.1–4.3'te açıklandığı gibi AIS ve LAD tanımlama işlemini tekrarlayın.
- 10 dakikalık dikkatli incelemeden sonra AIS veya LAD tanımlanamazsa, kontrol edilemeyen kanama meydana gelirse, toplam açık göğüs prosedürü 20 dakikayı aşarsa veya anestezik derinlik ayarına rağmen kalp hızı 300 atım/dakika altında kalırsa prosedürü sonlandırın. Fareyi %5 isoflurane ile derinlemesine anesteziye alın, servikal dislokasyon ile ötanazi yapın ve hayvanı cerrahi sonuç analizine dahil etmek üzere prosedür hatası olarak kaydedin.
- AIS'nin üst üçte birlik kısmındaki oluğun üzerinden 7-0 naylon bir sütur geçirin (Şekil 1B). İğneyi epikardiyal yüzeye dik olarak yaklaşık 0.5–1 mm derinliğe kadar yerleştirin; giriş ve çıkış noktaları oluğun karşı taraflarında konumlanmalı ve yaklaşık olarak maksimum genişliğini kapsamalıdır.
- Ligatürü bir cerrah düğümü kullanarak sabitleyin. İlk düğümden sonra, belirgin bir lokal doku çökmesi olmadan ligasyon bölgesinin distalindeki miyokardda hemen beyazlaşma (blanching) meydana gelene kadar ligatürü ayarlayın.
NOT: Süturu sadece koroner kan akışını oklüde edecek kadar sıkın. Aşırı gerginlik komşu miyokarda zarar verebilir veya süturun damarı ve çevre dokuyu kesmesine neden olabilir. - Ligasyondan sonraki 1 dakika içinde, ligasyon bölgesinin distalindeki miyokardda yamalı iskemik beyazlaşmayı gözlemleyerek başarılı koroner oklüzyonu doğrulayın12. Oklüzyonu, EKG'de ST segment yükselmesi belirleyerek daha da teyit edin.
- İskemik alan aşırı derecede küçükse veya beyazlaşma yoksa, ligatürü gevşetin ve ligasyon prosedürünü tekrarlayın.
5. Kapatma ve Ameliyat Sonrası İyileşme
- V şeklindeki göz kapağı retraktörünü dikkatlice çıkarın. Üçüncü interkostal alanı yeniden yaklaştırmak için iğneyi bitişik üçüncü ve dördüncü kaburgaların etrafından geçirerek torakotomiyi tekli kesintili 5-0 naylon sütür ile kapatın. İnterkostal nörovasküler demete zarar vermemek için iğneyi kaburga yüzeyine yakın tutun. Sütürü bağlamadan önce, rezidüel intratorasik havayı tahliye etmek için ekspirasyon sonunda toraksı hafifçe sıkıştırın, ardından sütürü cerrah düğümü ile sabitlerken sıkıştırmayı sürdürün.
- Cilt insizyonunu 5-0 naylon sütürler kullanarak katmanlar halinde kapatın. Devam etmeden önce yara kenarlarının tamamen karşı karşıya geldiğinden emin olun.
- Fareyi sıcaklık kontrollü bir ısıtma pedine (37°C) yerleştirin, izofluran uygulamasını kesin ve spontan solunum başlayana kadar mekanik ventilasyona devam edin. Kuyruk veya bıyık hareketleri ve yaklaşık 150 nefes/dakika düzeyinde düzenli bir solunum paterninin geri gelmesi dahil olmak üzere hayvanın anesteziden uyanışını gözlemleyin.
- Düzenli spontan solunumu, ventilatör döngüsüyle senkronize görülebilir göğüs duvarı hareketini ve ekstremitelerin veya bıyıkların amaçlı hareketlerini doğrulayarak ekstubasyon için hazır olduğunu teyit edin. Endotrakeal tüpü ekspirasyon fazında yavaşça geri çekin, ardından solunum sıkıntısı olmadığını doğrulamak için fareyi ısıtma pedi üzerinde 3–5 dak daha izlemeye devam edin.
NOT: Ekstubasyon sonrası solunum sıkıntısı, en yaygın olarak interkostal alanın yetersiz kapatılmasından kaynaklanan pnömotoraks nedeniyle oluşur. Solunum sıkıntısı meydana gelirse, fareyi geçici olarak yeniden anesteziye alın ve ventile edin, cilt sütürlerini yeniden açın, interkostal kapatmayı inceleyin ve ekstubasyon prosedürünü tekrarlamadan önce hava kaçağı olan herhangi bir bölgeye ek sütürler yerleştirin. - Anesteziden uyanma sonrası fareyi kendi kafesine geri döndürün. Ameliyattan hemen sonra ve ilk 48 saat boyunca her 4–6 saatte bir buprenorfin (0.1 mg/kg, subkütan) uygulayın.
- Postoperatif ilk 3 gün boyunca her fareyi günde en az iki kez, sonrasında ise günde bir kez izleyin. Vücut ağırlığını, postürü, aktiviteyi, solunum paternini ve cerrahi yarayı değerlendirin; kalıcı zorlu solunum, yiyecek veya suya erişememe veya stimülasyona yanıt vermeyen kambur, hareketsiz postür dahil olmak üzere önceden tanımlanmış insani sonlanma noktalarını karşılayan her hayvanı ötanize edin.
6. Elektrokardiyografik (EKG) Değerlendirme
- EKG amplifikatörü ile donatılmış çok kanallı bir fizyolojik kayıt sistemi kullanarak elektrokardiyografik sinyalleri kaydedin. Fareye üç adet subkütan ekstremite-lead elektrodu yerleştirerek; pozitif girişi (VIN+) sol arka bacağa, negatif girişi (VIN−) sağ ön bacağa ve topraklamayı (GND) sağ arka bacağa bağlayın.
- EKG amplifikatör modülünü veri toplama ünitesine bağlayın. Notch filtresini 50 Hz'e (veya yerel şebeke frekansına göre 60 Hz'e) ayarlayın, ardından toplama yazılımını açın ve analog kanal ayarları altından yeni bir EKG amplifikatör modülü ekleyin.
- Amplifikatörü şu parametrelerle yapılandırın: kazanç = 2000, mod = normal, alçak geçiren filtre = 150 Hz ve yüksek geçiren filtre = 0.05 Hz. Toplama ayarlarını açın, örnekleme hızını 1 kHz olarak ayarlayın ve kurulum penceresini kapatın.
- Elektrotları yerleştirdikten sonra, kayda başlamak için Start düğmesine tıklayın. Görüntüleme zaman tabanını ana bölme başına 0.5 s ve dikey ölçeği ana bölme başına 0.25 mV olarak ayarlayın, ardından EKG'yi en az 30 s boyunca sürekli olarak kaydedin. Analiz ve temsili sunum için stabil, artefakt içermeyen bir segment seçin.
- Fare %1.5 izofluran anestezisi altında tutulurken ve bir ısıtma pedi üzerinde normotermi korunurken, ligasyondan hemen sonra EKG kaydı yapın. Hem MI hem de normal kontrol (NC) gruplarından, benzer anestezik koşullar altında aynı zaman noktasında EKG kayıtları alın.
7. Ekokardiyografi
- Görüntülemeden 1 gün önce ön torasik bölgedeki tüyleri depilatuar krem kullanarak temizleyin. Muayene boyunca fareyi %1,5 isofluran ile anestezi edin.
- Fareyi ısıtmalı bir platforma sırtüstü yerleştirin, dört uzvunu EKG elektrotlarına sabitleyin ve prekordiuma ultrason jeli uygulayın. Kalp hızını 400 vuru/dk'nın üzerinde tutmak için isofluran konsantrasyonunu gerektiği şekilde ayarlayın.
- Ultrason probunu sol sternal kenar boyunca üçüncü ila dördüncü interkostal boşluğa yerleştirin. Prob işaretçisini yaklaşık 30°'lik bir açıyla sağ ön uzva doğru yönlendirin ve probu kalbin uzun ekseniyle hizalayın.
- Tüm görüntülemeleri; 30 MHz merkez iletim frekansına, 20–46 MHz bant genişliğine ve 50 μm aksiyel çözünürlüğe sahip lineer-array bir transdüser kullanarak gerçekleştirin. İletim gücünü %100'e, görüntü derinliğini 13 mm'ye, görüntü genişliğini 11 mm'ye, dinamik aralığı 60 dB'ye ve iki boyutlu kazancı 40 dB'ye ayarlayın. 210 kare/s kare hızında B-mod sinema döngüleri edinin.
- Bu edinim parametrelerini bir sistem ön ayarı olarak kaydedin. Tüm hayvanlar ve tüm görüntüleme oturumları için aynı transdüseri, ön ayarı, iletim gücünü, dinamik aralığı, görüntü derinliğini ve görüntü genişliğini kullanın; NC ve MI grupları arasında görüntü derinliğini değiştirmeyin.
- Aynı uzun eksen görünümü içinde, M-mod örnekleme hattını mid-ventriküler seviyeye, interventriküler septuma ve sol ventrikül posterior duvarına dik olacak şekilde, örnekleme kapısı sol ventrikülün tüm anteroposterior çapını kapsayacak şekilde konumlandırın. Sonraki analizler için M-mod izlemesini kaydedin.
- Sol ventrikül, sol atrium ve aort kökünün net bir şekilde görselleştirildiği B-mod görüntüleri edinin ve sonraki analizler için sinema döngülerini kaydedin. Aynı görüntüleme düzleminde karşılık gelen M-mod görüntülerini edinin.
- Elde edilen görüntülerden sol ventrikül end-diyastolik iç çapını (Dd), sol ventrikül end-sistolik iç çapını (Ds) ve interventriküler septal kalınlığı ölçün. Beş ardışık kardiyak döngü edinin ve ortalama değerleri raporlayın.
NOT: Sol ventrikül end-diyastolik hacmini (LVEDV) ve sol ventrikül end-sistolik hacmini (LVESV) görüntüleme yazılımını kullanarak otomatik olarak hesaplayın. Fraksiyonel kısalmayı (FS) FS = (Dd − Ds) / Dd × 100% ve ejeksiyon fraksiyonunu (EF) EF = (LVEDV − LVESV) / LVEDV × 100% olarak hesaplayın.
8. Doku Toplama, Histolojik Boyama ve ELISA
- Doku toplama
- MI indüksiyonundan sonraki 7. günde, her fareye ekokardiyografi uygulayın. Fareyi %4 isofluran ile anestezi edin, retro-orbital kanama yoluyla yaklaşık 1,5 mL kan toplayın, fareyi servikal dislokasyon ile ötanize edin ve kalbi çıkarın.
- Kan örneklerinin 4°C'de gece boyunca pıhtılaşmasını sağlayın. Örnekleri 4°C'de 10 dakika boyunca 2000 × g'de santrifüj edin, serumu toplayın ve analiz edilene kadar −80°C'de saklayın.
- Enzim bağlı immünosorbent assay (ELISA)
- Serum B tipi natriüretik peptid (BNP), interlökin-1β (IL-1β), tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) ve nükleer faktör-κB p65 (NF-κB p65) miktarlarını enzim bağlı immünosorbent assay (ELISA) kitleri kullanarak belirleyin.
- Tüm reaktifleri ve serum örneklerini oda sıcaklığına getirin ve çalışma çözeltilerini kit talimatlarına göre hazırlayın. Serum örneklerini fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1:5 oranında seyreltin; yani bir birim serum artı dört birim PBS.
- Standart, sıfır ve örnek kuyucuklarına sırasıyla 50 μL standart, PBS ve seyreltilmiş serum örnekleri ekleyin, boş (blank) kuyucuğu boş bırakın. Boş kuyucuk hariç tüm kuyucuklara 100 μL horseradish peroksidaz (HRP)-konjuge deteksiyon antikoru ekleyin, plakayı kapatın ve karanlıkta 37°C'de 60 dakika inkübe edin.
- Her kuyucuğun içeriğini boşaltın ve plakayı yıkama tamponu ile beş kez yıkayın; her yıkama döngüsünde tamponun her kuyucukta 20 saniye kalmasını sağlayın. Plakayı tüy bırakmayan kağıt üzerinde kurutun.
- Her kuyucuğa 100 μL taze hazırlanmış substrat (1:1 hacim oranında karıştırılmış Çözelti A ve B) ekleyin. Kapatılmış plakayı karanlıkta 37°C'de 15 dakika inkübe edin, 50 μL durdurma çözeltisi ekleyin ve optik yoğunluğu 450 nm'de ölçün.
- Boş kuyucuk optik yoğunluğunu her ölçümden çıkarın ve dört parametreli lojistik (4PL) regresyon modeli kullanarak bir standart eğri oluşturun. Her örneğin konsantrasyonunu uydurulan eğriden hesaplayın, değeri 5'lik dilüsyon faktörü ile çarpın ve duble kuyucuklardan elde edilen ortalama değeri raporlayın.
- Serum B tipi natriüretik peptid (BNP), interlökin-1β (IL-1β), tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) ve nükleer faktör-κB p65 (NF-κB p65) miktarlarını enzim bağlı immünosorbent assay (ELISA) kitleri kullanarak belirleyin.
- Doku işleme, gömme ve kesit alma
- Kalıntı kanı uzaklaştırmak için çıkarılan her kalbi buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin ile kısa sürede durulayın. Dokuyu oda sıcaklığında en az 24 saat boyunca %4 paraformaldehit içinde fikse edin.
- Her kalbi, düz bir kısa eksen yüzeyi açığa çıkacak şekilde düzeltin ve etiketli bir doku kasetine yerleştirin. Dokuyu dereceli bir etanol serisi ileye (4 saat %75 etanol, 2 saat %85 etanol, 2 saat %90 etanol, 1 saat %95 etanol ve her biri 30 dakika olmak üzere iki kez mutlak etanol değişimi)dehidrate edin. Dokuyu 5–10 dakika boyunca bir etanol–ksilen karışımından geçirin, her biri 10 dakika olmak üzere iki kez ksilen değişimi ile şeffaflaştırın ve her biri 1 saat olmak üzere üç kez eritilmiş parafin değişimi ile infiltre edin.
- Her kalbi, kısa eksen blok yüzeyine bakacak şekilde gömün. Mid-papiller seviyede seri 3 μm kesitler alın, kesitleri 40°C'lik bir su banyosunda yüzdürün, lamlar üzerine monte edin ve 60°C'de kurutun.
- Kesitleri, her biri 15 dakika olmak üzere iki kez ksilen değişimi, ardından her biri 5 dakika olmak üzere üç kez mutlak etanol değişimi, %75 etanol (5 dakika) ve ters osmoz (RO) suyu (5 dakika) ile deparafinize edin.
UYARI: Paraformaldehit muhtemel bir karsinojendir, solunum ve cilt tahriş edicidir; ksilen ise yanıcıdır ve nörotoksiktir. Bu reaktifleri aseptik tıbbi eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruması takarak kimyasal çeker ocak altında kullanın ve atıkları kurumun tehlikeli atık prosedürlerine göre bertaraf edin. Etanol ve n-butanol yanıcıdır; tutuşma kaynaklarından uzak tutun.
- Histolojik boyama
- Hematoksilin ve eozin boyama
- Deparafinize edilmiş ve rehidrate edilmiş kesitleri 3–5 dakika boyunca hematoksilin içinde bekletin. Kesitleri su ile durulayın.
- Kesitleri %1 asit alkol ile diferansiye edin ve su ile durulayın. Kesitleri %0,5 sulu amonyak ile mavileştirin ve tekrar durulayın.
- Kesitleri sırasıyla %85 etanol, %95 etanol ve mutlak etanol içinde her biri 5 dakika bekletin. Kesitleri 3–5 dakika boyunca eozin ile karşıt boyayın.
- Kesitleri, her biri 5 dakika olmak üzere üç kez mutlak etanol değişimi ve ardından 5 dakika n-butanol ile dehidrate edin. Kesitleri, her biri 5 dakika olmak üzere üç kez ksilen değişimi ile şeffaflaştırın ve nötral rezin ile monte edin.
NOT: Çekirdekler mavi, sitoplazma ve hücre dışı matris ise kırmızı görünür.
- Masson trikrom boyama
- Deparafinize edilmiş ve rehidrate edilmiş kesitleri, oda sıcaklığında yaklaşık 15 saat boyunca gece boyunca %2,5 potasyum dikromat çözeltisinde mordanlayın. Kesitleri, sarı renk kaybolana kadar yaklaşık 30 saniye boyunca akan su altında durulayın.
- Doku parlak kırmızı görünene kadar kesitleri 6 dakika boyunca Ponceau–asit fuksin çözeltisinde boyayın. Renk soluk kalırsa boyama süresini uzatın ve kesitleri akan su altında süzüntü renksiz olana kadar durulayın.
- Kesitlerin kurumasına izin vermeden fazla suyu süzün. Kollajen soluk görünene ve kas lifleri kırmızı kalana kadar kesitleri 1–2 dakika boyunca sulu fosfomolibdik asit ile diferansiye edin.
- Kesitleri durulamadan doğrudan anilin mavisi çözeltisine aktarın. Kesitleri 6–30 saniye inkübe edin.
- Kesitleri, her değişim için yaklaşık 8 saniye olmak üzere üç ila beş kez %1 asetik asit değişimi ile diferansiye edin. Kesitleri sırasıyla yaklaşık 3, 5 ve 5 saniye olmak üzere üç kez mutlak etanol değişimi ile hızla dehidrate edin.
- Kesitleri 5 dakika n-butanol ve ardından 5 dakika ksilen ile şeffaflaştırın. Kesitleri nötral rezin ile monte edin.
NOT: Kollajen lifleri mavi, kas lifleri, fibrin ve eritrositler ise kırmızı görünür.
- Sirius Red boyama
- Deparafinize edilmiş ve rehidrate edilmiş kesitleri 65°C'lik fırında 30 dakika boyunca Sirius Red çözeltisi A içinde inkübe edin. Kesitleri sarı renk kaybolana kadar akan su altında yıkayın.
- Fazla sıvıyı kurulayın ve kesitleri 2 dakika boyunca Sirius Red çözeltisi B içinde bekletin. Kesitleri kısa süreli yıkayın ve fazla sıvıyı kurulayın.
- Kesitleri 30 dakika boyunca Sirius Red çözeltisi C içinde bekletin. 1–2 saniye boyunca kısa süreli durulayın.
- Kesitleri, her biri yaklaşık 3 saniye olmak üzere üç kez mutlak etanol değişimi ile dehidrate edin. Her biri 5 dakika olmak üzere üç kez ksilen değişimi ile şeffaflaştırın ve nötral rezin ile monte edin.
NOT: Aydınlık alan (brightfield) aydınlatması altında kollajen lifleri sarı bir arka plan üzerinde kırmızı görünür.
- Hematoksilin ve eozin boyama
- Görüntü edinimi ve kantifikasyon
- Tüm histolojik görüntüleri dijital bir lam tarayıcı kullanarak edinin. Tüm gruplardan alınan tüm kesitler için aynı aydınlatma, beyaz dengesi, pozlama ve büyütme ayarlarını kullanın ve her görüntüye bir kalibrasyon ölçek çubuğu ekleyin.
- Görüntü analizinden önce mekansal ölçeği kalibre edin. Çalışma görüntüleriyle aynı çözünürlükte ve piksel boyutlarında edinilmiş ölçek çubuğunu içeren bir referans görüntüsü yükleyin. Measure > Calibration > Set System sekmesi altında yeni bir mekansal kalibrasyon oluşturun, birimi μm olarak ayarlayın, kalibrasyon noktalarını ölçek çubuğu ile hizalayarak pikselden mikrometreye dönüşümü tanımlayın, kalibrasyonu kaydedin ve tüm görüntülere uygulayın.
- Masson trikrom boyalı bir kesit yükleyin ve düzensiz ilgi alanı (AOI) aracını kullanarak sol ventrikülü ana hatlarıyla belirleyin. Ventrikül boşluğunu, sağ ventrikülü ve doku işleme artefaktlarını hariç tutun, ardından toplam sol ventrikül alanını kaydedin.
- Measure > Count/Size sekmesini açın ve segmentasyon diyaloğunu açmak için Select Colors'ı seçin. Color Cube Based segmentasyonu seçin ve parametreleri şu şekilde ayarlayın: sensitivity = 4, expand selection by 1 color index, minimum color size = 1 piksel ve kernel size = 3 × 3. Aynı segmentasyon ayarlarını tüm kesitlere uygulayın.
- Tohum noktaları olarak damlalık aracını kullanarak mavi kollajen-pozitif pikselleri seçin. Yalnızca belirgin kollajen-pozitif bölgelerden örnek alın, bir önizleme görüntüsü oluşturun ve maskenin, kırmızı boyalı miyokardiyumu, ventrikül boşluğunu ve arka planı hariç tutarken kollajen-pozitif alanları kapsadığını doğrulayın. Maskeyi uygulamadan önce gerekirse tohum noktalarını ayarlayın.
NOT: Kesitler arasındaki küçük boyama yoğunluğu farklarını hesaba katmak için her kesit için tohum pikselleri yeniden seçin. Tüm görüntüler için aynı segmentasyon parametrelerini (hassasiyet, genişleme derecesi, minimum renk boyutu ve çekirdek boyutu) koruyun ve segmentasyonu yalnızca önizleme, kollajen dışı yapıları hariç tutup kollajen-pozitif alanların tamamen kapsandığını gösterdiğinde kabul edin. - Segmentasyon maskesini uygulayın ve diyaloğu kapatın. Measure > Select Measurements sekmesi altında Area'yı seçin, Count'a tıklayın, View > Statistics sekmesini açın ve toplanmış kollajen-pozitif alanı kaydedin.
- Kollajen-pozitif alanın toplam sol ventrikül alanına bölünmesiyle kollajen hacim fraksiyonunu (CVF) hesaplayın ve sonucu yüzde olarak ifade edin.
9. Doku Saydamlaştırma ve Üç Boyutlu Koroner Arter Görüntüleme
- Koroner Vaskülatürün Floresan Etiketlenmesi
- Koroner vaskülatürü etiketlemek için lateral kuyruk venine 200 µL %2'lik Evans Blue çözeltisi enjekte edin. Boyanın sistemik dolaşımına izin vermek için fareyi 60 dk boyunca kafesine geri koyun.
- Fareyi anestezi cihazına bağlı indüksiyon kamarasına (16 × 10 × 11 cm) yerleştirin ve %4 isofluran ile anesteziyi indükleyin. Fareyi servikal dislokasyonla ötanize edin, torasik boşluğu açın, sağlam kalbi çıkarın, PBS ile durulayın ve 4°C'de 24 sa boyunca %4 paraformaldehit (PFA) içinde fikse edin.
UYARI: PFA muhtemel bir kanserojendir; solunum yollarını ve cildi tahriş eder. PFA'yı aseptik tıbbi eldivenler, laboratuvar önlüğü ve göz koruması takarak kimyasal çeker ocak altında kullanın ve atıkları kurumsal tehlikeli atık prosedürlerine göre imha edin. - Saf su içinde %3'lük bir agaroz çözeltisi hazırlayın ve fikse edilmiş kalbi, ligasyon bölgesi görüntüleme için uygun şekilde yönlendirilmiş olarak gömün. Mikrolitre şırınga kullanarak ligasyon alanını çevreleyen sekiz farklı noktaya 1 µL DAPI çözeltisi enjekte edin ve örneği oda sıcaklığında 2 gün boyunca inkübe edin.
- Doku berraklaştırma
- Üretici talimatlarına uygun olarak, bir FDISCO (üstün floresan koruma kapasitesine sahip, solventle berraklaştırılmış organların üç boyutlu görüntülemesi) doku berraklaştırma kiti kullanarak doku berraklaştırmayı gerçekleştirin. Kit altı reajenden (A–F) oluşur: Reajen A, B, C, D ve E sırasıyla su içinde %50, %70, %80, %100 ve %100 tetrahidrofuran (THF) içerir ve Reajen F dibenzil eterdir.
UYARI: THF yüksek derecede yanıcıdır, depolama sırasında patlayıcı peroksitler oluşturur; solunum yollarını ve cildi tahriş eder. Dibenzil eter cilt ve göz tahriş edicidir. Tüm reajenleri, aseptik tıbbi eldivenler, laboratuvar önlüğü ve göz koruması dahil uygun kişisel koruyucu ekipmanlar takarak kimyasal çeker ocak altında kullanın. Atıkları kurumsal tehlikeli atık prosedürlerine göre imha edin. - Her bir kalbi sırasıyla Reajen A, B, C, D ve E içinde reajen başına 6 sa boyunca inkübe edin. Kalp başına her reajenden 10 mL kullanın; bu, minimum 1:5 örnek-reajen hacim oranına karşılık gelir.
- Örneği Reajen F'ye aktarın ve doku optik olarak şeffaf hale gelene kadar, tipik olarak yaklaşık 1 sa boyunca inkübasyona devam edin.
- Tüm berraklaştırma adımlarını 6°C–8°C'de hafif ajitasyonla gerçekleştirin. Floresan özelliğini korumak için örneği alüminyum folyoya sarılı cam bir kaba yerleştirin ve işlem boyunca ışıktan koruyun.
- Üretici talimatlarına uygun olarak, bir FDISCO (üstün floresan koruma kapasitesine sahip, solventle berraklaştırılmış organların üç boyutlu görüntülemesi) doku berraklaştırma kiti kullanarak doku berraklaştırmayı gerçekleştirin. Kit altı reajenden (A–F) oluşur: Reajen A, B, C, D ve E sırasıyla su içinde %50, %70, %80, %100 ve %100 tetrahidrofuran (THF) içerir ve Reajen F dibenzil eterdir.
- Işık sayfası floresan görüntüleme
- Berraklaştırılmış örneği örnek tutucuya monte edin. 4× objektif lens (nümerik açıklık = 0.28; çalışma mesafesi = 20.0 mm) ile donatılmış bir ışık sayfası floresan mikroskobu kullanın.
- Monte edilmiş örneği görüntüleme kamarası içindeki dibenzil etere daldırın. Spesimeni her iki taraftan aydınlatın ve sırasıyla DAPI'yi 405 nm'de ve Evans Blue'yu 647 nm'de uyarın.
- Kazanım parametrelerini şu şekilde ayarlayın: 405 nm kanalı için 3.000 arbitrer birim lazer yoğunluğu ve 30 ms pozlama süresi; 647 nm kanalı için 4.000 arbitrer birim lazer yoğunluğu ve 30 ms pozlama süresi kullanın. Tüm görüntüleri 6 μm z-adım boyutu ve 1,024 × 1,024 piksel görüntü çözünürlüğü kullanarak edinin.
- Kamera kazanım modunu, görüntüleme yazılımı tarafından yapılandırıldığı üzere, önce lateral (XY) görüntülerin alındığı, ardından sırasıyla kanal kazanımının (C), aksiyel adımlamanın (Z) ve zaman noktası kazanımının (T) yapıldığı XYCZT olarak ayarlayın.
- Görüntü veri işleme ve üç boyutlu rekonstrüksiyon
- Mikroskopla birlikte verilen görüntü işleme yazılımını kullanarak ham TIFF görüntü dosyalarını birleştirin (stitch). Birleştirilmiş görüntü dosyalarını Dosya > Imaris'e Dönüştür seçeneğini belirleyerek IMS formatına dönüştürün.
- Dönüştürülmüş IMS dosyalarını üç boyutlu analiz yazılımına aktarın. Varsayılan render ayarlarını kullanarak hacimsel render edilmiş rekonstrüksiyonlar oluşturun ve Snapshot modülünü kullanarak temsili görüntüleri dışa aktarın.
NOT: Üç boyutlu rekonstrüksiyonlar, yazılımın varsayılan render hattı kullanılarak herhangi bir modifikasyon yapılmadan oluşturulmuştur. Görüntü segmentasyonu, eşikleme, gürültü giderme, arka plan çıkarma veya başka bir ön işleme uygulanmamıştır. Rekonstrüktif görüntüler, koroner vaskülatürün kalitatif görselleştirilmesi için kullanılır ve kantitatif analiz için amaçlanmamıştır.
10. İstatistiksel Analiz
- Tüm verileri ortalama ± ortalamanın standart hatası (SEM) olarak ifade edin. İstatistiksel analizleri GraphPad Prism yazılımı (versiyon 5.0) kullanarak gerçekleştirin.
- Deneysel birimi bireysel hayvan olarak tanımlayın. Tüm fonksiyonel, biyobelirteç ve histomorfometrik sonlanım noktaları için grup başına n = 8 fareyi analiz edin.
- Veri toplama ve analiz işlemlerini, araştırmacıların grup atamalarına karşı körlüğünü koruyarak kodlanmış örnek tanımlayıcılar üzerinden yürütün. Grup atamalarını ancak tüm nicel analizler tamamlandıktan sonra açıklayın.
- Uygun istatistiksel testi seçmeden önce, GraphPad Prism (versiyon 5.0) ile veri normalliğini Shapiro–Wilk testiyle ve varyans homojenliğini Levene testiyle değerlendirin.
- Normallik ve eşit varyans varsayımları karşılandığında, iki grubu iki kuyruklu eşleştirilmemiş Student's t-testi ile karşılaştırın. Aksi takdirde, Mann–Whitney U testi uygulayın.
- P < 0.05 değerini istatistiksel olarak anlamlı kabul edin. İstatistiksel anlamlılığı P < 0.05, P < 0.01 ve P < 0.001 şeklinde belirtin.
Sonuçlar
AIS, LAD koroner arterinin yerelleştirilmesi ve ligasyon bölgesinin belirlenmesi için anatomik referans noktası olarak kullanılmıştır (Şekil 1A–C). AIS belirlendikten sonra; torakotomi, kalbin açığa çıkarılması, LAD ligasyonu, torasik kapatma ve postoperatif iyileşmeyi içeren MI indüksiyonu için ardışık cerrahi iş akışı, Şekil 2A–L'de gösterildiği gibi uygulanmıştır. Basitleştirilmiş protokol, farelerde MI'nın hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde indüklenmesini sağlamıştır. Bu protokolün güvenilir bir şekilde uygulanabilmesi için uzun bir uygulama eğitimi gereklidir; trakeal entübasyon ve AIS rehberliğinde yapılan ligasyon, öğrenme eğrisi en dik olan iki aşamadır. Eğitimin erken dönemlerinde, postoperatif ilk 7 gün içindeki perioperatif mortalite %50 veya daha üzerine çıkabilir ve model indüksiyon başarı oranı %30 veya altına düşebilir. Bu tekniklerde uzmanlaşıldığında, cerrahi başarı oranı tutarlı bir şekilde %90'ın üzerine çıkar. Mevcut çalışmada, postoperatif ilk 7 gün boyunca perioperatif ölüm meydana gelmemiştir. Tüm eğitim prosedürleri, onaylanmış aynı kurumsal hayvan kullanım protokolü altında gerçekleştirilmiştir.
LAD ligasyonunu takiben, belirgin Q dalgası derinleşmesi, yukarı-konveks morfolojili ST segment yükselmesi, hiperakut T dalgası pikleri (ki bunlar tipik olarak subakut fazda T dalgası inversiyonuna dönüşür), genişlemiş amplitüda ile artmış QRS kompleksi voltajı ve belirgin taşikardi dahil olmak üzere karakteristik elektrokardiyografik anomaliler gözlemlenmiştir (Şekil 3A). Makroskobik inceleme, NC grubuna kıyasla MI grubunda ligasyon bölgesinin distalinde lokalize miyokardiyal soluklaşma ve ventriküler dilatasyon göstermiştir (Şekil 3B). Histopatolojik inceleme; hematoksilen ve eozin (H&E), Masson trikrom ve Sirius Red boyamalarıyla gösterildiği üzere, MI grubunda düzensiz miyokardiyal lifler, genişlemiş hücreler arası boşluklar, inflamatuar hücre infiltrasyonu, kollajen depozisyonu ve miyokardiyal yapısal bozulma göstermiştir (Şekil 3C). Masson trikrom boyalı kesitlerin kantitatif analizi, MI grubunda CVF'nin NC grubundan anlamlı derecede daha yüksek olduğunu göstermiştir (18.24% ± 1.67%'ye karşı 0.05% ± 0.01%; P < 0.001; Şekil 3D).
Şekil 3: Farelerde sol ön inen koroner arter ligasyonundan sonraki elektrokardiyografik, makroskobik anatomik ve histopatolojik değişiklikler. (A) Normal kontrol (NC) ve miyokard enfarktüsü (MI) gruplarında cerrahi işlemden hemen sonra kaydedilen temsili elektrokardiyogramlar (EKG). (B) NC ve MI gruplarına ait kalplerin temsili makroskobik görüntüleri. Ölçek çubukları = 1 mm. (C) NC ve MI gruplarından hematoksilin ve eozin (H&E; sol), Masson trikrom (orta) ve Sirius Red (sağ) ile boyanmış temsili transvers kalp kesitleri. Masson trikrom boyalı kesitlerde kollajen mavi, miyokard ise kırmızı görünür; Sirius Red boyalı kesitlerde kollajen, sarı arka plan üzerinde kırmızı görünür. Ölçek çubukları = 1,000 µm. (D) NC ve MI gruplarında, kollajen pozitif alanın toplam sol ventrikül alanına bölünmesiyle hesaplanan ve yüzde olarak ifade edilen kollajen hacim fraksiyonu (CVF). Veriler ortalama ± standart hata (SEM) olarak sunulmuştur; grup başına n = 8 fare. NC grubuna göre istatistiksel anlamlılık **P < 0.001 olarak belirtilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Kardiyak fonksiyonel bozulma ekokardiyografi ile doğrulanmıştır. Temsili M-mod görüntüleri, MI grubunda azalmış sol ventrikül kontraktilitesini göstermiştir (Şekil 4A). Kantitatif analiz, NC grubuyla karşılaştırıldığında MI grubunda sol ventrikül EF ve FS'nin anlamlı derecede azaldığını göstermiştir (Şekil 4B,C). ELISA, bozulmuş kalp fonksiyonu ve inflamatuar yanıt ile tutarlı olarak, MI grubunda BNP, TNF-α, NF-κB p65 ve IL-1β serum konsantrasyonlarının anlamlı derecede arttığını göstermiştir (Şekil 4D–G).
Şekil 4: Sol ön inen koroner arter ligasyonundan sonraki kardiyak fonksiyonel değişiklikler ve serum biyobelirteç seviyeleri. (A) Normal kontrol (NC) ve miyokard enfarktüsü (MI) gruplarından temsili M-mod ekokardiyografik görüntüler. (B) Sol ventrikül ejeksiyon fraksiyonu (EF). (C) Sol ventrikül fraksiyonel kısalma (FS). (D–G) Enzim bağlantılı immünosorbent assay (ELISA) ile ölçülen (D) B tipi natriüretik peptid (BNP), (E) tümör nekroz faktörü-α (TNF-α), (F) nükleer faktör-κB p65 (NF-κB p65) ve (G) interlökin-1β (IL-1β) serum konsantrasyonları. EF ve FS yüzde olarak; BNP, TNF-α ve IL-1β pg/mL olarak; NF-κB p65 ise ng/mL olarak ifade edilmiştir. Veriler ortalama ± standart hata (SEM) olarak sunulmuştur; grup başına n = 8 fare. NC grubuna göre istatistiksel anlamlılık *P < 0.01 ve **P < 0.001 olarak belirtilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Doku şeffaflaştırılmış kalplerin üç boyutlu floresan görüntülemesi, LAD'nin AIS altındaki seyrini ortaya koymuş ve anatomik olarak tanımlanan bölgedeki ligasyonun koroner oklüzyon oluşturduğunu göstermiştir (Şekil 5A–F). Topluca bu bulgular, grup başına sekiz hayvandan oluşan bu ilk seride; sol ventrikül disfonksiyonu, miyokardiyal fibroz ve sistemik inflamasyon ile karakterize bir MI fenotipinin başarıyla indüklendiğini kanıtlamaktadır. Mevcut çalışma, örneklem büyüklüğünün kapsamlı validasyonunu, uzun süreli model stabilitesini veya AIS ile LAD arasındaki anatomik uyumu sağlamaktan ziyade, AIS rehberliğindeki MI modelini kurmak ve fizibilitesini göstermek amacıyla tasarlanmıştır. Buna bağlı olarak, bu hususlar mevcut çalışmanın kısıtlılıkları olarak kabul edilmiş ve Tartışma bölümünde ele alınmıştır. Özellikle, fonksiyonel ve biyokimyasal değerlendirmeler MI sonrası akut faz ile sınırlandırılmış olup, AIS ile LAD arasındaki ilişki kalitatif olarak gösterilmiş ancak henüz yeterince büyük bir kohortta kantitatif olarak belirlenmemiştir.
Şekil 5: Şeffaflaştırılmış fare koroner damar sisteminin üç boyutlu floresan görüntülemesi. Şeffaflaştırılmış bütün kalpler, koroner damar sistemini görselleştirmek için Evans Blue ile ve çekirdekleri görselleştirmek için 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ile işaretlenmiş, ardından ışık sayfası floresan görüntüleme ve üç boyutlu rekonstrüksiyon uygulanmıştır. (A–C) (A) DAPI kanalını, (B) Evans Blue kanalını ve (C) birleştirilmiş kanalları gösteren tüm kalp rekonstrüksiyonları. Ölçek çubukları = 1,000 µm. (D–F) Koroner vasküler bölgenin (D) DAPI kanalını, (E) Evans Blue kanalını ve (F) birleştirilmiş kanalları gösteren büyütülmüş görünümleri. Ölçek çubukları = 400 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Her prosedür optimal bir model sağlamaz ve suboptimal sonuçların fark edilmesi sorun giderme açısından önemlidir. Ligasyonun çok proksimal olarak yerleştirilmesi veya iğnenin çok derine itilmesi, şiddetli kalp yetmezliği, aritmi veya ventrikül rüptürünün eşlik ettiği aşırı büyük bir enfarkte yol açarak erken ölümlere neden olabilir. Aksine, ligasyonun çok distal veya çok yüzeysel yerleştirilmesi, yalnızca küçük bir enfarkt oluşturabilir veya enfarkt oluşumunu tetikleyemeyebilir. Bu nedenle, başarılı model indüksiyonu birden fazla kriter kullanılarak değerlendirilmelidir. Cerrahi sırasında, ligasyon bölgesinin distalindeki miyokardın beyazlaması, koroner oklüzyonun anlık bir göstergesidir; ancak bu bulgu her zaman kolayca görünür olmayabilir. Ameliyat sonrası ekokardiyografi ve histopatolojik inceleme, modelin başarıyla kurulduğuna dair ek onay sağlar. Ek Şekil 1 , histopatolojik incelemenin belirgin bir inflamatuar hücre infiltrasyonu veya fibrozis göstermediği, başarısız bir model örneğini göstermektedir.
Ek Şekil 1. Başarısız bir miyokard enfarktüsü modelinden temsili histolojik bulgular. Miyokard enfarktüsü indüksiyonunun başarısız olduğu bir fareden alınan, (A) hematoksilin ve eozin (H&E), (B) Masson trikrom ve (C) Sirius Red ile boyanmış temsili transvers kalp kesitleri. Başarılı miyokard enfarktüsü indüksiyonu ile karşılaştırıldığında, bu kesitler, başarısız koroner arter oklüzyonu ile uyumlu olarak sol ventrikül miyokardiumunda belirgin bir inflamatuar hücre infiltrasyonu veya fibrotik yeniden yapılanma göstermemektedir. Ölçek çubukları = 1,000 µm.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.
Tartışma
Son yıllarda, MI'nın klinik ve deneysel modelleri kardiyovasküler araştırmalarda giderek daha önemli hale gelmiştir; ancak MI'nın patogenezine ve tedavi stratejilerine ilişkin birçok soru hala çözülmemiştir. Bu makale, birkaç kritik prosedürel adımın özel dikkat gerektirdiği, geliştirilmiş bir murine MI modeli kurma yöntemini açıklamaktadır. İlk kritik adım trakeal entübasyondur. Bazı önceki protokoller, entübasyondan önce servikal derinin kesilmesini ve trakeayı açığa çıkarmak için dokuların diseke edilmesini gerektiren trakeotomi yoluyla hava yolunu oluşturur13; diğerleri orotrakeal entübasyonu sürdürür ancak prosedür sırasında görselleştirmeyi artırmak için orta hat servikal insizyon önerir14. Her iki yaklaşıma karşılık, mevcut protokol orofarenksi aydınlatmak için bir laringoskop kullanır ve servikal insizyon yapmadan, glottis'in doğrudan görselleştirilmesi altında orotrakeal entübasyon gerçekleştirir. Bu yaklaşım operatörün teknik becerisi üzerinde daha fazla talep oluştursa da servikal doku travmasını önler, enfeksiyon riskini ve postoperatif ağrıyı azaltır ve operasyon süresini kısaltır. Entübasyon sırasında en yaygın hata, tüpün yanlışlıkla özofagusa yerleştirilmesidir. Ventilasyon sırasında toraks yükselmiyorsa ve ekspirasyon sırasında endotrakeal tüpte yoğunlaşma görülmüyorsa, tüpü derhal geri çekin ve entübasyonu tekrarlayın. Ventilatörü yalnızca simetrik bilateral göğüs duvarı hareketi onaylandıktan sonra bağlayın.
İkinci ve en kritik adım, LAD koroner arterin tanımlanması ve ligatürün doğru yerleştirilmesidir. Geleneksel yöntemler bu aşamada çeşitli zorluklarla karşılaşmaktadır. Farelerin istirahat kalp hızı yaklaşık 500–600 vuru/dak'dır ve LAD, beraberindeki birkaç koroner vene komşu konumdadır; bu durum, arterin ameliyat sırasında gerçek zamanlı olarak tanımlanmasını doğal olarak zorlaştırmaktadır. Dahası, optimal koşullar altında bile LAD'lerin önemli bir kısmı diseksiyon mikroskobu altında net bir şekilde görüntülenememektedir15. Bu arka plan ışığında, ligasyon bölgesini sol atriyal apendiksin 1–2 mm altındaki bir nokta olarak tahmin eden önceki protokoller, bu anatomik referansın ameliyat sırasındaki tutarsız tanımlanması nedeniyle sınırlıdır12,14; sol koroner arterin karmaşık dallanma örüntüsü ise tekrarlanabilirliği daha da bozabilir16. Bu zorlukları aşmak için mevcut protokol, ligatürün konumlandırılması için anatomik işaret noktası olarak AIS'yi kullanmaktadır. Diseksiyon mikroskobu altında AIS, kalbin ventral yüzeyinde sığ bir oluk şeklinde görünür ve LAD hemen altından geçer. Bu nedenle, operatör deneyimine daha az bağımlı olan, nispeten kararlı bir anatomik referans sağlar. Ligatürün AIS'nin üst üçüncü kısmına yerleştirilmesi, koroner oklüzyon için tutarlı bir anatomik hedef sağlar. Temsili sonuçlar, bu yaklaşımın incelenen hayvanlarda beklenen akut MI fenotipini başarıyla oluşturduğunu göstermektedir.
AIS referans noktası her durumda güvenilir değildir. Torasik ekspozisyon sınırlı olduğunda veya epikardiyal kanama kalp yüzeyini kapatarak AIS'in tanımlanmasını zorlaştırdığında, cerrahi alanı salinle nemlendirilmiş bir pamuklu çubukla nazikçe silin ve ligasyondan önce oluğu yeniden değerlendirin. AIS hâlâ güvenle tanımlanamıyorsa, protokolde açıklandığı gibi LAD'yi doğrudan tanımlayın ve AIS'e güvenmek yerine doğrudan görselleştirme altında ligasyon gerçekleştirin. Gerekiyorsa, sol atriyal apendiksin ve sol ventrikül ön duvarının yeterli ekspozisyonunu sağlamak için birinci kaburgadan kaudal olarak sayarak doğru interkostal boşluğu teyit edin.
Postoperatif komplikasyonlar arasında pnömotoraks en yaygınıdır ve genellikle ekstubasyon sonrası solunum sıkıntısı şeklinde ortaya çıkar. Pnömotoraksı önlemenin temel yolu, interkostal boşluk kapatılmadan önce torasik boşluktaki rezidüel havanın tamamen tahliye edilmesidir. Pnömotoraks şüphesi varsa, fareyi kısa süreliğine yeniden anesteziye alın ve ventile edin, cilt sütürlerini açın ve interkostal kapatmayı kontrol edin. Bir veya daha fazla eksik kapatma noktası tespit edilirse, ekstubasyon prosedürünü tekrarlamadan önce hava kaçağının olduğu bölgeye ek sütürler yerleştirin. Bir diğer potansiyel komplikasyon, en yaygın olarak ligasyon sırasında iğnenin küçük bir epikardiyal damarı veya beraberindeki bir koroner veni delmesiyle ortaya çıkan intraoperatif kanamadır. Kanama genellikle sınırlıdır ve genellikle birkaç saniye boyunca salinle nemlendirilmiş bir pamuklu çubukla hafifçe baskı uygulanarak kontrol altına alınabilir. Postoperatif komplikasyonları minimize etmek için torasik boşluğu kapatmadan önce cerrahi sahada aktif kanama kalmadığını doğrulayın. Ek olarak farelerde, prosedür sırasında veya hemen sonrasında prematür ventriküler kontraksiyonlar veya geçici ventriküler fibrilasyon dahil olmak üzere aritmiler gelişebilir. Bu aritmiler genellikle vücut sıcaklığının korunması, anestezi derinliğinin stabilize edilmesi ve kardiyak ritmin kendiliğinden düzelmesine izin vermek için prosedürün geçici olarak durdurulmasıyla hafifler. Son olarak, anestetik komplikasyonlar en yaygın olarak başarılı trakeal entübasyondan sonra isoflurane konsantrasyonunun derhal düşürülmemesinden kaynaklanır. Endotrakeal tüp ventilatöre bağlandıktan hemen sonra isoflurane konsantrasyonunu idame seviyesine düşürün ve prosedür boyunca solunumu ve kalp hızını sürekli olarak izleyin.
Genel olarak, bu yöntem ciddi mikrocerrahi becerisi gerektirmektedir ve diğer kalıcı LAD koroner arter ligasyon modellerinde olduğu gibi, koroner anatomik farklılıklardan ve operatör deneyiminden kaynaklanan değişkenliklere tabidir. Bununla birlikte, uygun eğitim ve tutarlı cerrahi teknikle araştırmacılar, prosedürel tekrarlanabilirliği ve ameliyat sonrası sağkalımı artırırken MI modelini makul bir tutarlılıkla oluşturabilirler.
Bu yöntemin bazı kısıtlamaları kabul edilmelidir. İlk olarak, fonksiyonel ve biyokimyasal değerlendirmeler MI indüksiyonundan sonraki bir hafta içinde tamamlanmıştır ve bu nedenle, cerrahiden 4–8 hafta sonraki ventriküler yeniden şekillenme gibi uzun vadeli sonuçların sistematik değerlendirmesi yapılmadan, yalnızca MI'nın akut fazını yansıtmaktadır. İkinci olarak, emilmeyen sütürlerin kullanıldığı diğer kalıcı ligasyonlu MI modelleri gibi, bu protokol de kronik perikardiyal adezyonlarla sonuçlanabilir. Bu durum, AIS rehberli yaklaşımına özgü bir kısıtlamadan ziyade ligasyon modelinin doğal bir özelliğini temsil etmektedir. Bununla birlikte, bu adezyonların şiddeti ve uzun süreli kalp fonksiyonu üzerindeki etkileri mevcut çalışmada nicelleştirilmemiştir. Gelecekteki çalışmalar, emilebilir sütürlerin kullanımını araştırabilir ve bunların adezyon oluşumu ve model performansı üzerindeki etkilerini değerlendirebilir. Üçüncü olarak, üç boyutlu koroner görüntüleme LAD'nin AIS altında seyrettiğini kalitatif olarak göstermiş olsa da, bu yapılar arasındaki anatomik uyum henüz yeterince büyük bir kohortta nicelleştirilmemiştir. Dördüncü olarak, bu çalışma yalnızca erkek C57BL/6J fareleri içermiştir. AIS'nin tutarlı bir anatomik işaretleyici olması beklense de, dişi farelerde, diğer fare suşlarında ve diğer türlerdeki uygulanabilirliği daha fazla doğrulama gerektirmektedir. Son olarak, bu protokolün ligasyon bölgesi tutarlılığı ve prosedürel tekrarlanabilirlik açısından potansiyel avantajları, tek bir laboratuvardaki deneyime dayanmaktadır ve geleneksel LAD ligasyon yöntemleriyle doğrudan karşılaştırmalı olarak veya birden fazla operatör ve kurum arasında değerlendirilmemiştir. Bu nedenle, yöntemin daha geniş genel geçerliliğini belirlemek için ek doğrulama çalışmaları gerekecektir.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma; Sichuan Bilim ve Teknoloji Programı (No. 2026NSFSC1823 ve 2022YFS0618), Sichuan Eyaleti Geleneksel Çin Tıbbı İdaresi Projesi (Sichuan Eyaleti Geleneksel Çin Tıbbı İdaresi Ofisi No. 7 [2024]), Sichuan Geleneksel Çin ve Batı Tıbbı Entegrasyon Derneği Projesi (No. ZXY2025019) ve Güneybatı Tıp Üniversitesi Projesi (Hibe No. 2023ZYYQ04 ve 2023ZYYQ17) tarafından verilen hibelerle desteklenmiştir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.9% steril salin | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | – | Sefazolin rekonstitüsyonu |
| 3% agaroz | Sigma-Aldrich | A0169 | Numune gömme |
| 4% paraformaldehit | Sigma-Aldrich | 158127 | Doku fiksasyonu |
| Absolüt etanol | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 05.001.0170A | Doku dehydrasyonu; yanıcı |
| Asit fuksin | Aladdin | A104916-100g | Masson trikrom boyama için Ponceau–asit fuksin çözeltisinin hazırlanması |
| AcqKnowledge yazılımı | BIOPAC Systems | AcqKnowledge 4.0 | Elektrokardiyogram edinimi ve analizi |
| Amonyak çözeltisi, 0.5% sulu | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 05.001.2528A | Hematoksilen ve eozin boyama sırasında maviye çevirme |
| Anilin mavisi, asitte çözünür | Aladdin | A111200-100g | Masson trikrom boyama için anilin mavisi çözeltisinin hazırlanması |
| Aseptik tıbbi eldivenler | Nanchang Feixiang Latex Products Co., Ltd. | – | Kimyasal ve biyolojik koruma |
| Buprenorfin | Qinghai Pharmaceutical Factory Co., Ltd. | H10940181 | Postoperatif analjezi |
| Enjeksiyonluk sefazolin sodyum | CSPC Zhongnuo Pharmaceutical (Shijiazhuang) Co., Ltd. | – | Perioperatif antibiyotik profilaksisi |
| Pamuklu çubuklar | Shijiazhuang Kangertai Medical Equipment Co., Ltd. | – | Epikardiyal silme ve aseptik hazırlık |
| DAPI boyama çözeltisi | Thermo Fisher | D1306 | Nükleer markalama |
| Tüy dökücü krem | Veet | – | Torasik tüy temizleme |
| Dijital lam tarayıcı | 3DHISTECH | Pannoramic MIDI II | Tüm lam görüntüleme |
| EKG amplifikatörü | BIOPAC Systems | ECG100C | Elektrokardiyogram amplifikasyonu |
| Elektrokardiyogram kayıt sistemi | BIOPAC Systems | MP160 | Elektrokardiyogram kaydı |
| ELISA kiti, fare B-tipi natriüretik peptid | Quanzhou Ruixin Biological Technology Co. | RXW202726M | Serum BNP kantifikasyonu |
| ELISA kiti, fare interlökin-1β | Quanzhou Ruixin Biological Technology Co. | RX203063M | Serum IL-1β kantifikasyonu |
| ELISA kiti, fare nükleer faktör-κB p65 | Quanzhou Ruixin Biological Technology Co. | RX201879M | Serum NF-κB p65 kantifikasyonu |
| ELISA kiti, fare tümör nekroz faktörü-α | Quanzhou Ruixin Biological Technology Co. | RX202412M | Serum TNF-α kantifikasyonu |
| Gömme kasetleri | Jiangsu Shitai | 22022 | Doku gömme |
| Endotrakeal kateter, 20 G | Shenzhen Bailide Biotechnology Co., Ltd. | B11103 | Oral entübasyon; dış çap yaklaşık 0.9–1.0 mm; kullanımdan önce yaklaşık 15 mm'ye kısaltılmış |
| Eozin Y, alkolde çözünür | Hefei BASF Biotechnology Co., Ltd. | Y0310-100G | Hematoksilen ve eozin boyama sırasında sitoplazmik karşıt boyama |
| Evans Blue | Jarvisbio | A312001 | Koroner vaskülatür markalaması |
| Hassas pens | RWD Life Science | F12011-10 | Doku tutma ve perikard açma |
| Hassas pens, mikrocerrahi | RWD Life Science | FC12002T-08 | Mikrocerrahi doku tutma |
| Hassas makas | RWD Life Science | S12000-09 | Cilt insizyonu ve diseksiyon için oftalmik makas |
| Glasiyal asetik asit | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | – | Masson trikrom diferansiyasyonu için 1% asetik asit hazırlanması |
| Cam lamlar | Jiangsu Shitai | 80312/80302 | Kesit montajı |
| Cam boncuk sterilizatörü | RWD Life Science | RS3002 | Hayvanlar arası alet sterilizasyonu |
| GraphPad Prism yazılımı | GraphPad Software | Versiyon 5.0 | İstatistiksel analiz |
| Isıtma pedi | RWD Life Science | 69020 | Postoperatif termoregülasyon |
| Hematoksilen boyama çözeltisi | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1004 | Hematoksilen ve eozin boyama sırasında nükleer boyama |
| Yaban turbu peroksidaz-konjuge deteksiyon antikoru | Quanzhou Ruixin Biological Technology Co. | ELISA kitleri ile birlikte sağlanır | ELISA deteksiyonu |
| Hidroklorik asit | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 05.001.1337A | Hematoksilen diferansiyasyonu için asit alkol hazırlanması |
| Image-Pro Plus yazılımı | Media Cybernetics | Versiyon 6.0 | Kolajen hacim fraksiyonu kantifikasyonu |
| Imaris yazılımı | Bitplane | Versiyon 7.2.3 | Üç boyutlu rekonstrüksiyon ve analiz |
| İzofluran | RWD Life Science | R510-22-10 | İnhalasyon anesteziği |
| İzofluran anestezi sistemi | RWD Life Science | TAIJI-IE | İzofluran iletimi |
| Laringoskop, küçük hayvan | Shanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd. | SR310-MR | Entübasyon sırasında doğrudan görselleştirme |
| Işık-sayfa floresan mikroskobu | Light Innovation Technology | LiToneXL | Üç boyutlu floresan görüntüleme |
| LitScan yazılımı | Light Innovation Technology | Versiyon 3.31 | Görüntü birleştirme ve dönüştürme |
| Mekanik ventilatör | Chengdu Taimeng Software Co., Ltd. | HX-101E | Mekanik ventilasyon; 130 nefes/dak; tidal volüm 2 mL |
| Mikro-sivrisinek hemostatı | RWD Life Science | FC21001R-12 | Ligasyon ve kapatma sırasında iğne tutma |
| Mikrolitre şırınga | Shanghai Gaoge Industry and Trade Co., Ltd. | – | Lokalize DAPI enjeksiyonu |
| Mikroplaka okuyucu | Molecular Devices (Shanghai) Co., Ltd. | SpectraMax iD5 | 450 nm'de optik yoğunluk ölçümü |
| Mikroskop, diseksiyon | Maishidi (Dongguan) Technology Co., Ltd. | MSD204 | İntraoperatif görselleştirme |
| Mikroskop, dik ışıklı | Leica | DM500 | Histolojik görüntüleme |
| Mikrotom bıçakları | Epredia | MX35 ULTRA | Parafin kesit alma |
| Modifiye Sirius Red boyama kiti | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1078 | Kolajen boyama; A, B ve C çözeltilerini içerir |
| n-Bütanol | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 05.001.0886A | Histolojik dehydrasyon ve şeffaflaştırma; yanıcı |
| Nötr montaj reçinesi | Shanghai Yiyang | YSQN41-91 | Lam montajı |
| Naylon sütür, 3/8-daire 7-0 iğneli | Ningbo Medical Needle Co., Ltd. | – | Sol anterior desendan koroner arter ligasyonu |
| Naylon sütür, 5-0 | Ningbo Medical Needle Co., Ltd. | – | Torasik ve cilt kapatma |
| Naylon sütür, 6-0 | Ningbo Medical Needle Co., Ltd. | – | Göğüs duvarı ekspozisyonu ve traksiyon |
| Parafin gömme istasyonu | Wuhan Junjie Electronics | JB-L5 | Doku gömme |
| Parafin mumu | NA | NA | Doku infiltrasyonu ve gömme |
| Fosfat tamponlu salin | Sigma-Aldrich | P3813 | Doku yıkama ve reaktif dilüsyonu |
| Fosfomolibdik asit | Tianjin Aopusheng Chemical Co., Ltd. | – | Masson trikrom diferansiyasyonu |
| Ponceau 2R | Aladdin | P104989-25g | Masson trikrom boyama için Ponceau–asit fuksin çözeltisinin hazırlanması |
| Potasyum dikromat | Zhengzhou Paini Chemical Reagent Factory | 7778-50-9 | Masson trikrom mordanı |
| Povidon–iyodür | SingleLady | GB26368-2010 | Cilt dezenfeksiyonu |
| Ters osmoz suyu | Laboratuvar saflaştırmalı | Uygulanamaz | Çözelti hazırlama |
| Rotary mikrotom | Leica Instruments (Shanghai) | RM2016 | Parafin kesit alma |
| Numune tutucu adaptörü | Light Innovation Technology | LiToneXL ile birlikte sağlanır | Şeffaflaştırılmış numunelerin ışık-sayfa görüntüleme için montajı |
| Cilt yapışkan bandı | Qingdao Schultz Biotechnology Co., Ltd. | – | Ekstremitelerin ve kuyruğun sabitlenmesi |
| Lam lamelleri | Jiangsu Shitai | 80340-1630 | Lamel kapatma |
| Lam kurutucu | Shaoxing Luyue | 101-3B | Lam kurutma |
| Durdurma çözeltisi | Quanzhou Ruixin Biological Technology Co. | ELISA kitleri ile birlikte sağlanır | ELISA reaksiyon sonlandırma |
| Substrat çözeltileri A ve B | Quanzhou Ruixin Biological Technology Co. | ELISA kitleri ile birlikte sağlanır | ELISA renk gelişimi |
| Doku flotasyon banyosu | Wuhan Junjie Electronics | JK-5/6 | Kesit flotasyonu |
| Doku işlemci | Wuhan Junjie Electronics | JT-12S | Otomatik doku işleme |
| Doku şeffaflaştırma kiti, Reaktifler A–F | Jarvisbio | JA11012 | Solvent bazlı doku şeffaflaştırma |
| Trakeal entübasyon platformu | RWD Life Science | Re20-M | Oral entübasyon konumlandırması |
| Ultrasun analiz yazılımı | Fujifilm VisualSonics | VevoLAB 3.2.6 | Ekokardiyografi veri analizi |
| Ultrasun jeli | Tianjin Jinya Electronics Co., Ltd. | TM-100 | Ekokardiyografik kuplaj |
| Ultrasun görüntüleme sistemi | Fujifilm VisualSonics | Vevo 3100 | Ekokardiyografi |
| V-şekilli göz kapağı retraktörü | Suqian Shengshi Medical Equipment Co., Ltd. | SS5009G | İnterkostal ve kaburga retraksiyonu |
| Yıkama tamponu | Quanzhou Ruixin Biological Technology Co. | ELISA kitleri ile birlikte sağlanır | ELISA plaka yıkama |
| Su saflaştırma sistemi | Sichuan ULUPURE Ultrapure Technology Co., Ltd. | UPT-II-20T | Ters osmoz suyu üretimi |
| Ksilen | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 05.001.0586A | Doku şeffaflaştırma ve deparafinizasyon; yanıcı ve nörotoksik |
Kaynaklar
- Thygesen K, et al. Fourth universal definition of myocardial infarction (2018). J Am Coll Cardiol. 2018;72(18):2231-2264.
- Lindahl B, Mills NL. A new clinical classification of acute myocardial infarction. Nat Med. 2023;29(9):2200-2205. doi:10.1038/s41591-023-02513-2.
- De Villiers C, Riley PR. Mouse models of myocardial infarction: comparing permanent ligation and ischaemia-reperfusion. Dis Model Mech. 2020;13(11):dmm046565.
- Johns TNP, Olson BJ. Experimental myocardial infarction. I. A method of coronary occlusion in small animals. Ann Surg. 1954;140(5):675-682.
- Christia P, et al. Systematic characterization of myocardial inflammation, repair, and remodeling in a mouse model of reperfused myocardial infarction. J Histochem Cytochem. 2013;61(8):555-570.
- Martin TP, et al. Preclinical models of myocardial infarction: from mechanism to translation. Br J Pharmacol. 2022;179(5):770-791.
- Kumar M, et al. Animal models of myocardial infarction: mainstay in clinical translation. Regul Toxicol Pharmacol. 2016;76:221-230.
- Gao E, et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 2010;107(12):1445-1453.
- van den Bos EJ, et al. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005;289(3):H1291-H1300.
- Pinelli A, et al. Isoproterenol-induced myocardial infarction in rabbits. Protection by propranolol or labetalol: a proposed non-invasive procedure. Eur J Pharm Sci. 2004;23(3):277-285.
- Maruyama K, et al. Surgical protocol for permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice to generate a model of myocardial infarction. STAR Protoc. 2021;2(3):100775.
- Johny E, Dutta P. Left coronary artery ligation: a surgical murine model of myocardial infarction. J Vis Exp. 2022;(186).
- Kolk MVV, et al. LAD-ligation: a murine model of myocardial infarction. J Vis Exp. 2009;(32):1438.
- Lugrin J, Parapanov R, Krueger T, Liaudet L. Murine myocardial infarction model using permanent ligation of left anterior descending coronary artery. J Vis Exp. 2019;(150).
- Chen J, et al. Variability in coronary artery anatomy affects consistency of cardiac damage after myocardial infarction in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2017;313(2):H275-H282.
- Ahn D, et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004;286(3):H1201-H1207.
Yeniden basım ve izinler
