Bu çalışma, akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS) olan yenidoğanlarda LUS ve serum miR-486-3p seviyelerinin arttığını göstermiştir. Bu parametrelerin birlikte değerlendirilmesi, hastalık şiddetinin ve prognozun öngörüsünü iyileştirmiş ve miR-486-3p'nin Delta-Like Canonical Notch Ligand 4'ü hedefleyerek ARDS model hücre fonksiyonunu düzenlediği bulunmuştur.
Araştırma makalesi
Neonatal Akut Solunum Sıkıntısı Sendromunda Akciğer Ultrason Skorunun ve Serum miR-486-3p'nin Prognostik Değeri
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Bu çalışma, neonatal akut solunum sıkıntısı sendromunda (ARDS) akciğer ultrason skorunun (LUS) ve serum miR-486-3p'nin prognostik değerini değerlendirmeyi ve altta yatan mekanizmayı araştırmayı amaçlamıştır. Çalışmaya, ARDS'li toplam 112 neonat ve aynı dönemde doğan 100 sağlıklı bebek sırasıyla çalışma ve sağlıklı kontrol gruplarına dahil edilmiştir. Her neonata, yoğun bakım ünitesine kabul edildikten sonraki 6 saat içinde akciğer ultrasonu yapılmış ve LUS açısından değerlendirilmiştir. Gen ekspresyonunu belirlemek için gerçek zamanlı kantitatif PCR kullanılırken, prognostik performansı ve korelasyonları değerlendirmek için alıcı işletim karakteristiği (ROC) eğrisi ve Pearson korelasyon analizleri gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, miR-486-3p'nin altta yatan mekanizmasını araştırmak için HPMEC'ler kullanılarak in vitro bir ARDS modeli oluşturulmuştur. miR-486-3p ile Delta-Like Canonical Notch Ligand 4 (DLL4) arasındaki hedef ilişkisini doğrulamak için çift lüsiferaz raporlayıcı testi uygulanmıştır. Sonuçlar, ARDS'li neonatlarda LUS ve serum miR-486-3p'nin anlamlı düzeyde arttığını ortaya koymuştur. ROC eğrisi analizi, hem miR-486-3p'nin hem de LUS'un neonatal ARDS prognozunu öngörebildiğini (sırasıyla AUC = 0,883 ve 0,873, duyarlılık: %96,4 ve %89,3, özgüllük: %77,4 ve %73,8) ve miR-486-3p ile LUS kombinasyonunun daha iyi bir öngörü etkisine sahip olduğunu (AUC = 0,929, duyarlılık: %92,9, özgüllük: %84,5) göstermiştir. Mekanistik olarak miR-486-3p'nin, ARDS model hücrelerinin biyolojik fonksiyonlarını düzenlemek için DLL4'ü hedeflediği belirlenmiştir. Toplu olarak değerlendirildiğinde, LUS ve serum miR-486-3p'nin kombine değerlendirmesi, ARDS'li neonatlarda hastalık şiddetini değerlendirmek ve prognozu öngörmek için gelecek vaat eden bir yaklaşım olabilir. Genel uygulanabilirliğini onaylamak için hala daha fazla çok merkezli doğrulamaya ihtiyaç vardır.
Giriş
Neonatal akut solunum yetmezliği sendromu (ARDS), temel olarak alveolar sürfaktan fonksiyonunun bozulmasıyla karakterize, yenidoğan sağkalımı için büyük riskler oluşturan, yaşamı tehdit eden kritik bir solunum bozukluğudur1,2. Çeşitli tedavi yöntemlerinin geliştirilmesine rağmen, etkilenen yenidoğanlar için genel prognoz hala yetersizdir3. Bu nedenle, klinik müdahaleleri optimize etmek ve hasta sonuçlarını iyileştirmek için hastalık şiddetinin erken belirlenmesi ve doğru prognostik değerlendirme yapılması esastır. ARDS geliştiğinde, yenidoğan pulmoner fonksiyonları ciddi şekilde bozulur, buna ventilasyon ve gaz değişiminin aksaması eşlik eder4. Akciğer ultrasonu, ARDS'de ventilasyonun izlenmesi için birincil görüntüleme yöntemi olarak değerlendirilebilir5. ARDS'deki pulmoner lezyonların izlenmesi için tercih edilen bir yatak başı görüntüleme aracı haline gelmiş olup, akciğer ultrason skoru (LUS), yenidoğan akut solunum hastalıklarını teşhis etmek ve kritik bakım ortamlarında hastalık şiddetini ve prognozu değerlendirmek için yaygın olarak uygulanmaktadır6. Ancak, tek başına görüntüleme veya laboratuvar testleri doğaları gereği kusurludur ve klinik değerlendirme ihtiyacını tam olarak karşılayamaz7. Bu nedenle, kombine bir değerlendirme sistemi kurmak için yeni biyobelirteçlerin araştırılması büyük klinik öneme sahiptir.
MikroRNA (miRNA), ARDS patogenezinde kilit rol oynayan yeni bir gen düzenleyici faktör sınıfını temsil eder8. Örneğin, downregüle olan miR-141-3p, pulmoner fibrozis ve akciğer hasarında hastalık şiddetiyle yakından ilişkilidir9. miR-124-3p, p65'i hedefleyerek ARDS için koruyucu bir faktördür10. Önceki yüksek kapasiteli sekanslama çalışmaları, miR-486-3p'nin ARD hastalarında anlamlı düzeyde upregüle olduğunu doğrulamıştır11. Yakın tarihli araştırmalar, hsa_circ_0006892/miR-486-3p aksını ARDS gelişiminde rol oynayan potansiyel bir moleküler mekanizma olarak vurgulamıştır12. Bu bulgular, miR-486-3p'nin ARDS ile yakından bağlantılı olduğunu göstermektedir. Buna rağmen, miR-486-3p'nin neonatal ARDS'nin şiddeti ve seyri üzerindeki prognostik ve prediktif değeri henüz tam olarak aydınlatılmamıştır.
Günümüzde, göğüs radyografisi, kan gazı analizi ve tekli biyobelirteç saptaması, neonatal ARDS'nin değerlendirilmesinde kullanılan temel yöntemlerdir. Göğüs görüntüleme radyasyon maruziyeti içerir ve gerçek zamanlı, tekrarlayan izlem sağlayamaz. Kan gazı analizi yalnızca akut solunum fonksiyonunu yansıtır ve uzun vadeli prognoz için öngörücü değerden yoksundur. Tekli microRNA saptaması objektif kantitatif sonuçlar verir ancak akciğer dokusunun gerçek zamanlı morfolojik değişikliklerini yansıtamaz. Bu geleneksel yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, LUS ve serum miR-486-3p kombinasyonu, yatak başı görüntüleme ve moleküler saptamanın avantajlarını bir araya getirir.
Bu çalışma, klasik sürfaktan eksikliğine bağlı RDS'den ziyade ARDS kriterlerini karşılayan yenidoğanlara odaklanmıştır. Bu nedenle, bu çalışma başlangıç LUS ve serum miR-486-3p seviyelerinin neonatal ARDS'de kısa vadeli mortaliteyi öngörüp öngörmediğini değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Bu araştırmanın, neonatal ARDS'de hastalık durumlarının klinik değerlendirmesini ve kısa vadeli prognostik değerlendirmeleri geliştirmek için değerli veriler sağlaması hedeflenmektedir.
Protokol
Bu çalışma, Helsinki Deklarasyonu'na sıkı sıkıya bağlı kalınarak Yongkang Birinci Halk Hastanesi Tıbbi Etik Kurulu'ndan etik onay almıştır.
Denekler
İn vitro deneysel bir bileşene sahip olan bu tek merkezli, gözlemsel kohort çalışması, Ocak 2022 ile Aralık 2023 tarihleri arasında yürütülmüştür. Yongkang Birinci Halk Hastanesi'nde ARDS tanısı konmuş toplam 112 ardışık neonat çalışmaya dahil edilmiştir. Karşılaştırma amacıyla, aynı zaman diliminde doğmuş, asfiksi veya intrauterin distress öyküsü olmayan sağlıklı bebekler kontrol grubu olarak seçilmiştir.
Dahil edilme kriterleri:
Tüm katılımcılar, Montreux kılavuzlarında (2017 baskısı) belirtilen neonatal akut solunum sıkıntısı sendromu tanı kriterlerini karşılamıştır. Tanı, görüntüleme ve klinik değerlendirmelerle doğrulanmıştır: Röntgen incelemeleri, her iki akciğerde pulmoner ödem ile uyumlu yaygın opasiteler göstermiş ve ekokardiyografi, sol atriyal hipertansiyon bulgusuna rastlamayarak kardiyojenik pulmoner ödemi dışlamıştır. Ek kriterler arasında semptomların akut başlangıcı, ağır ekstrapulmoner enfeksiyonların olmaması ve 3 günden fazla mekanik ventilasyon ihtiyacı yer almıştır. Yenidoğanların ailelerinden gerekli bilgilendirilmiş onamlar alınmıştır.
Dışlama kriterleri:
Primer alveolar sürfaktan eksikliği, konjenital kalp hastalığı, metabolik bozukluklar veya diğer önemli altta yatan durumları olan neonatlar hariç tutuldu. Ayrıca, akciğer veya göğüs duvarı malformasyonları veya diğer majör konjenital anomalileri olan bebekler hariç tutuldu. Neonatal RDS hariç tutuldu.
Klinik veriler
Tüm katılımcılar için gestasyonel yaş, cinsiyet, yatış anındaki doğum ağırlığı ve maternal özellikler kaydedildi. Her yenidoğana, yoğun bakım ünitesine kabulünden sonraki 6 s içinde akciğer ultrasonu uygulandı ve LUS açısından değerlendirildi. LUS, maksimum 36 puanlık bir ölçek üzerinden puanlandı ve burada yüksek puan, pulmoner semptomların daha şiddetli olduğunu gösterdi. Kan örnekleri, ilk klinik değerlendirmenin bir parçası olarak ve herhangi bir majör terapötik müdahale (örneğin sürfaktan doz tekrarı, ventilasyon modunun yükseltilmesi veya vazoaktif ajanların başlanması) öncesinde, yatış anında hemen toplandı. Sağlıklı yenidoğanlardan alınan kan örnekleri, kayıtları yapıldıkları sırada elde edildi. Serum izolasyonu için tam kan, serum separatör tüplerine yerleştirildi ve pıhtılaşmanın tamamen gerçekleşmesi için 30 dk boyunca oda sıcaklığında hareketsiz bırakıldı. Örnekler daha sonra 4 °C'de 15 min boyunca 1500 x g hızında santrifüjlendi. Üstteki berrak serum supernatanı dikkatlice aspire edildi, steril kriyojenik tüplere paylaştırıldı ve sonraki deneyler için hemen -80 °C'deki ultra düşük sıcaklıklı bir dondurucuda saklandı. Sonraki deneyler için yalnızca berrak, hemoliz olmamış serum örnekleri kullanıldı. Kullanılan kan toplama tüpleri ve artık kan, kurum düzenlemelerine uygun olarak tıbbi biyolojik atık olarak atıldı.
Gruplandırma
Tüm yenidoğanlar, başlangıç akciğer grafisi bulgularına ve yatıştan 24 saat sonra değerlendirilen durumun şiddetine göre iki ayrı gruba ayrıldı: hafif grup (derece I–II) ve ağır grup (derece III–IV). Akciğer grafisi yorumlamaları sonucunda; bilateral akciğer şeffaflığının azalması, akciğer parankimi içinde küçük partiküller ve retiküler gölgelerin görülmesiyle karakterize olan derece I saptandı. Derece II, lezyonların akciğerin orta ve dış bölgelerine kadar uzandığını ve hava bronkogram bulgusunun mevcut olduğunu gösterdi. Derece III'te, her iki akciğerde şeffaflıkta belirgin bir azalma meydana gelmiş, bu da kalp ve diyafram sınırlarının belirsizleşmesiyle sonuçlanmıştır. Derece IV ise, belirgin hava bronkogram bulguları ile karakterize olup, "beyaz akciğer" görünümünü andıran neredeyse tam bir opasifikasyon ile sonuçlanmıştır.
ARDS tanısı konulan yenidoğanlar, yenidoğan yoğun bakım ünitesine kabul edildikten sonra kapsamlı bir yönetim rejimi uygulamasına tabi tutulmuştur. Bu rejim; mekanik ventilasyon, sedasyon, pulmoner sürfaktan uygulaması, anti-inflamatuar tedaviler, beslenme desteği, ekspektorasyon yardımı ve sıvı replasman önlemlerini kapsamaktaydı. Yenidoğanlarda ARDS tanısı çalışmanın başlangıç noktası olarak belirlenmiştir. Sonlanım noktaları, hastanın başarılı bir şekilde iyileşmesi ve taburcu edilmesi veya etkisiz tedavi sonucu meydana gelen ölüm olarak tanımlanmıştır. Klinik sonuçlara dayanarak katılımcılar iki gruba ayrılmıştır: sağkalanlar grubu ve ölüm grubu.
Hücre kültürü ve işlem
İnsan pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri (HPMEC'ler), %10 fetal sığır serumu, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile desteklenmiş DMEM içerisinde kültüre edildi. Hücreler, %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de muhafaza edildi. Bir ARDS hücre modeli oluşturmak için hücreler 1 mg/L konsantrasyonunda lipopolisakkarit (LPS) ile işleme tabi tutuldu13,14. Modelin başarıyla oluşturulduğu, LPS uygulamasının ardından ters mikroskop altında hafif hücresel büzülmelerin gözlemlenmesiyle doğrulandı. Deneylerin tamamlanmasının ardından, kullanılmış kültür ortamı, ölü hücreler ve tek kullanımlık kültür materyalleri biyolojik tehlikeli atık olarak imha edildi.
Hücre transfeksiyonu ve gruplandırma
HPMEC'ler kültür plaklarına ekildi ve transfeksiyondan önce %70 konfluens değerine ulaşana kadar inkübe edildi. Transfeksiyon kompleksleri, üreticinin talimatlarına göre hazırlandı. Hücreler şu gruplara ayrıldı: boş kontrol, miR-486-3p mimic, mimic negatif kontrol, miR-486-3p inhibitörü, inhibitör negatif kontrol, miR-486-3p mimic + DLL4 aşırı ekspresyon plazmidi (OE-DLL4) ve miR-486-3p mimic + boş aşırı ekspresyon plazmidi (OE-NC). Transfeksiyon kompleksleri ilgili kuyucuklara eklendi ve 4–6 h boyunca inkübe edildi. Besiyeri taze tam besiyeri ile değiştirildi ve sonraki deneyler için 24–48 h boyunca kültürleme işlemine devam edildi. Başarılı transfeksiyon, aşırı hücre ölümü olmaksızın stabil hücre konfluensi ile belirlendi.
Gerçek zamanlı kantitatif PCR
Toplam RNA, bir RNA ekstraksiyon reaktifi kullanılarak serum örneklerinden ve kültüre edilmiş hücrelerden ekstrakte edildi. RNA konsantrasyonu ve saflığı bir spektrofotometre ile ölçüldü ve A260/A280 oranı 1,8–2,1 olan örnekler ileri analizler için uygun kabul edildi. Bir ters transkripsiyon kiti kullanılarak tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezlendi. Ardından, aşağıdaki döngü koşullarıyla bir real-time PCR sistemi kullanılarak kantitatif PCR gerçekleştirildi: 95 °C'de 3 dk boyunca başlangıç denatürasyonu, ardından 40 döngü boyunca 95 °C'de 10 s ve 60 °C'de 30 s. microRNA tespiti için, miR-486-3p'nin bağıl ekspresyonu, internal referans olarak U6 snRNA kullanılarak 2-ΔΔCt yöntemiyle hesaplandı. mRNA kantifikasyonu için, DLL4 ekspresyonu aynı 2-ΔΔCt algoritmasıyla GAPDH mRNA'ya göre normalize edildi. Primer dizileri şu şekilde listelenmiştir: miR-486-3p ileri: 5'-GTATGACGGGGCAGCTCAGTA-3' ve miR-486-3p geri: 5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3', U6 ileri: 5'-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3' ve U6 geri: 5'-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3'. DLL4 ileri: 5'-AGGTGCCACTTCGGTTACAC-3' ve DLL4 geri: 5'-GGGAGAGCAAATGGCTGATA-3', GAPDH ileri: 5'-GCAAATTCCATGGCACCGT-3' ve GAPDH geri: 5'-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3'.
CCK-8 hücre proliferasyon analizi
Transfekte edilen hücreler, kuyuk başına 1 × 103 hücre yoğunluğunda 96 kuyucuklu plakalara ekildi ve 24, 48 ve 72 sa boyunca inkübe edildi. Ardından kültür ortamı aspire edildi ve hücreler 1× PBS ile iki kez yıkandı. Sonrasında, her kuyucuğa 100 µL taze 1× PBS ve 10 µL CCK-8 çözeltisi eklendi ve plaklar 37 °C'de 2 sa boyunca inkübe edildi. Absorbans, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak 450 nm'de ölçüldü ve hücre proliferasyonu absorbans değerlerine göre değerlendirildi. Deneysel gruplar arasındaki absorbansın zamana bağlı değişimleri, analizin başarılı bir şekilde gerçekleştirildiğini gösterdi.
Akış sitometrisi apoptoz analizi
Hücreler %0,25 tripsin ile sindirildi ve elde edilen hücre süspansiyonu toplanarak 4 °C'de 5 dakika boyunca 1500 × g hızında santrifüj edildi. Süpernatan uzaklaştırıldı ve hücre peletleri önceden soğutulmuş 1× PBS ile üç kez yıkandı. Ardından hücreler 500 µL 1x Bağlama Tamponu içinde yeniden süspande edildi ve ardından 5 µL Annexin V-FITC ve 5 µL propidyum iyodür (PI) eklendi. Nazikçe karıştırıldıktan sonra numuneler oda sıcaklığında, karanlıkta 40 dakika boyunca inkübe edildi. Hücre apoptozu akış sitometrisi ile ölçüldü ve veriler uygun akış sitometrisi analiz yazılımı ile analiz edildi. Başarılı analiz performansı, normal kontrol grubunda düşük apoptoz oranı ve ARDS model grubunda apoptozun belirgin şekilde artmasıyla gösterildi.
Lusiferaz raporlayıcı testi
miR-486-3p'nin potansiyel hedef genleri, çevrimiçi TargetScan veri tabanı (http://www.targetscan.org/vert_72/) kullanılarak belirlenmiştir. Öngörülen bağlanma bölgelerinin tanımlanmasının ardından, ilgili bağlanma dizilerini içeren vahşi tip (DLL4-WT) ve mutant (DLL4-MUT) lüsiferaz raporlayıcı plazmitler oluşturulmuştur. DLL4-WT ve DLL4-MUT vektörleri, sırasıyla miR-486-3p mimikleri veya inhibitörleri ile birlikte HPMEC'lere ko-transfekte edilmiştir. Ardından, çift lüsiferaz raporlayıcı assay kiti kullanılarak bağıl lüsiferaz aktivitesi ölçülmüştür. Biyolüminesans sinyalleri, üretici talimatlarına uygun olarak bir lüminometre ile tespit edilmiştir. Başarılı hedef doğrulaması, miR-486-3p aşırı ekspresyonu sonrası DLL4-WT grubunda lüsiferaz aktivitesindeki belirgin azalma ile gösterilmiştir.
Bu çalışmada kullanılan tüm reaktifler, sarf malzemeleri ve laboratuvar ekipmanları hakkında detaylı bilgiler, ekteki Malzeme Tablosu'nda sunulmuştur.
İstatistiksel yöntemler
İstatistiksel analizler ve veri görselleştirmeleri SPSS versiyon 26.0 ve GraphPad Prism versiyon 9.0 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ölçüm verileri ortalama ± standart sapma olarak sunulmuş ve iki bağımsız örneğin ortalamaları arasındaki karşılaştırmalar bağımsız t-testi ile değerlendirilmiştir. Üç veya daha fazla grup arasındaki karşılaştırmalar için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve tekrarlı ölçümler ANOVA uygulanmış, ardından gruplar arası farkların belirlenmesi için Tukey post-hoc çoklu karşılaştırma testi yapılmıştır. Kategorik veriler sayı (yüzde) olarak ifade edilmiş ve gruplar arası karşılaştırmalar ki-kare testi kullanılarak analiz edilmiştir. Parametrik olmayan veriler için Wilcoxon Mann-Whitney testi uygulanmıştır. Ayrıca, ARDS'li pediatrik hastalarda mortaliteyi belirlemede serum miR-486-3p ekspresyon seviyelerinin ve LUS'un öngörücü değerini değerlendirmek için ROC eğrisi oluşturulmuştur. Korelasyonları incelemek için Pearson korelasyon analizi kullanılmıştır. Tüm deney grupları üç bağımsız biyolojik tekrar ve teknik tekrar içermiştir. İstatistiksel birim, bağımsız bir deney olarak tanımlanmış olup; her bir biyolojik tekrar farklı pasajlardan türetilen ayrı bir hücre kültürü serisini temsil etmiş, teknik tekrarlar ise deney içi varyasyonu azaltmak için kullanılmıştır. Teknik tekrarlardan elde edilen veriler önce ortalaması alınmış ve ardından biyolojik tekrarların ortalama değerleri üzerinden istatistiksel analiz gerçekleştirilmiştir. İstatistiksel anlamlılık p < 0.05 olarak belirlenmiştir.
Sonuçlar
Gruplar arasında karşılaştırılabilir başlangıç verileri
Çalışmaya dahil edilen bebeklerin genel özellikleri Tablo 1'de sunulmuştur. İki grup arasında başlangıç demografik özellikleri açısından anlamlı bir fark saptanmamıştır: gestasyonel yaş (36.07 ± 2.71'e karşı 35.72 ± 2.64 hafta, p = 0.347), erkek cinsiyet oranı (%59.0'a karşı %66.1, p = 0.290), doğum ağırlığı (3.39 ± 0.57'ye karşı 3.3 ± 0.5 kg, p = 0.437), anne yaşı (29.18 ± 4.0'e karşı 29.6 ± 4.05 yıl, p = 0.387) ve doğum yöntemi (vajinal: %54.0'a karşı %58.0; sezaryen: %46.0'a karşı %42.0, p = 0.54); bu durum grupların karşılaştırılabilir olduğunu göstermektedir. Akciğer grafisi değerlendirmesine göre, ARDS grubunda 72 vaka (%64.3) hafif (evre I-II), 40 vaka (%35.7) ise ağır (evre III-IV) olarak sınıflandırılmıştır.
ARDS şiddeti, hasta prognozu ile ilişkilidir
ARDS tanılı çocuklarda hayatta kalanlar ile hayatını kaybedenler arasındaki sağkalım sonuçlarının karşılaştırmalı analizi Tablo 2'de sunulmuştur. ARDS tanısı konulan 12 yenidoğandan 84 vaka (%75) hayatta kalırken, 28 vaka (%25) ölümle sonuçlanmıştır. Özellikle bebek yaşı, cinsiyet, doğum ağırlığı, anne yaşı, doğum şekli, amniyotik sıvı özellikleri, etiyoloji veya diğer değişkenler açısından iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamıştır (p > 0.05). Bununla birlikte, ARDS şiddetinde anlamlı bir fark gözlemlenmiş (p < 0.01), bu durum kritik bir prognostik faktöre dikkat çekmiştir.
ARDS'de miR-486-3p ve LUS Yüksektir. RT-qPCR analizi, ARDS'li yenidoğanlarda serum miR-486-3p seviyelerinin sağlıklı kontrollere kıyasla anlamlı şekilde yükseldiğini ortaya koymuştur. Ayrıca, ARDS kohortu içinde, şiddetli grup hafif gruba göre çarpıcı biçimde daha yüksek seviyeler göstermiştir (P < 0.001) (Şekil 1A). Dahası, LUS seviyesi şiddetli ARDS grubunda hafif ARDS grubuna göre daha yüksekti (p < 0.001) (Şekil 1B). ARDS hastaları klinik sonuca göre ayrıldığında, ölüm grubu sağ kalan gruba göre belirgin şekilde daha yüksek LUS ve miR-486-3p seviyeleri göstermiştir (Şekil 1C,D). Hayatta kalamayan hastalarda LUS ile serum miR-486-3p arasında güçlü bir pozitif korelasyon bulunmuştur (r = 0.832, p <0.01) (Şekil 1E).
Kombine tespit prognostik öngörüyü iyileştirir
ROC analiz protokolüne dayanarak, tekil ve kombine göstergelerin prognostik performansını değerlendirdik. LUS ve miR-486-3p'nin kısa vadeli mortaliteyi öngörmedeki AUC değerleri sırasıyla 0.873 (%95 GA: 0.809-0.936) ve 0.83 (%95 GA: 0.822-0.94) olarak belirlendi. Sensitivite değerleri %89.3 ve %96.4, spesifisite değerleri ise sırasıyla %73.8 ve %77.4 idi. LUS ve miR-486-3p için optimal kesme değerleri sırasıyla 15.50 ve 1.465 idi. Ayrıca, kombine öngörü modelinin AUC değeri 0.929 (%95 GA: 0.83-0.975) olup, 1.659 optimal kesme değeri ile %92.9 sensitivite ve %84.5 spesifisite göstermiştir (Şekil 1F).
miR-486-3p artışı hücre fonksiyonunu bozar
Hücre kültürü ve LPS müdahale protokolünü takiben, HPMEC'ler kullanılarak in vitro bir ARDS hücre modeli oluşturduk. qPCR sonuçları, LPS stimülasyonu sonrası miR-486-3p ekspresyonunun zamanla kademeli olarak arttığını göstermiştir (Şekil 2A). ARDS model hücreleri üzerindeki etkilerini incelemek amacıyla miR-486-3p aşırı eksprese edilmiş veya nakavt edilmiştir (Şekil 2B). CCK-8 ve akış sitometrisi analiz protokollerine uygun olarak, hücre proliferasyonu ve apoptozu tespit edilmiştir. miR-486-3p aşırı ekspresyonu, hücre proliferasyonunu önemli ölçüde baskılamış ve hücre apoptozunu teşvik etmiştir. Aksine, miR-486-3p nakavtı LPS kaynaklı hücre hasarını hafifletmiştir (Şekil 2C,D).
miR-486-3p, DLL4 ekspresyonunu aşağı düzenler
Plazmit konstrüksiyonu ve dual-lüsiferaz raporlayıcı analiz protokolüne uygun olarak, miR-486-3p ile DLL4 arasındaki etkileşimi doğruladık. Biyoenformatik öngörüler, miR-486-3p ile DLL4'ün 3’UTR bölgesi arasında korunmuş bir bağlanma bölgesinin varlığını onayladı (Şekil 3A). DLL4 vahşi tip grubunun lüsiferaz aktivitesi, miR-486-3p aşırı ekspresyonundan sonra önemli ölçüde azalırken, mutant grupta belirgin bir değişiklik gözlenmedi (Şekil 3B), bu da DLL4'ün miR-486-3p'nin doğrudan bir hedef geni olduğunu kanıtlamaktadır. Hücre modellerinde, LPS uygulamasından sonra DLL4 ekspresyonu zamana bağlı olarak azalmıştır (Şekil 3C). miR-486-3p ekspresyonunun manipüle edilmesi de DLL4 seviyelerini negatif yönde regüle etmiştir (Şekil 3D).
Klinik örneklerde, DLL4 ekspresyonu ARDS'li neonatlarda sağlıklı kontrollere göre daha düşükken, ölüm grubunda daha da azalmıştır (Şekil 3E–F). Hayatta kalmayan hastalarda miR-486-3p ile DLL4 arasında negatif bir korelasyon gözlemlenmiştir (r = -0.795, P < 0.01) (Şekil 3G). DLL4 için tüm qPCR testleri üç teknik tekrarlı olarak gerçekleştirilmiştir ve sonuçlar stabil bulunmuştur.
DLL4, miR-486-3p aracılı hücre hasarını geri çevir
miR-486-3p mimikleri ve DLL4 aşırı ekspresyon plazmidi kullanılarak uygulanan ko-transfeksiyon protokolünün ardından, kurtarma deneyleri gerçekleştirdik. qPCR, OE-DLL4 transfeksiyonu sonrası DLL4 ekspresyonunun etkili bir şekilde geri kazandırıldığını doğruladı (Şekil 4A). Fonksiyonel testler, DLL4 aşırı ekspresyonunun miR-486-3p'nin hücre proliferasyonu üzerindeki inhibitör etkisini ve pro-apoptotik etkisini kısmen geri çevirdiğini gösterdi (Şekil 4B,C). Bu sonuçlar, miR-486-3p'nin DLL4'ü hedefleyerek hücre aktivitesini kısmen modüle ettiğini göstermiştir.
Veri Erişilebilirliği:
Bu çalışma sırasında üretilen veya analiz edilen tüm veriler Ek Dosya 1 olarak sunulmuştur.
Şekil 1Gruplar arasında LUS ve serum miR-486-3p düzeylerinin karşılaştırılması. (A) Sağlıklı yenidoğanlarda ve ARDS'li yenidoğanlarda serum miR-486-3p seviyeleri. (B) Sağlıklı yenidoğanlarda ve ARDS'li yenidoğanlarda LUS değerleri. (C) Sağkalım grubu ve ölüm grubundaki serum miR-486-3p düzeyleri. (D) Sağkalım grubu ve ölüm grubundaki LUS değerleri. (E) Hayatta kalmayan ARDS neonatlarında serum miR-486-3p ile LUS arasındaki korelasyon analizi. (F) Yenidoğan ARDS prognozunu öngörmek için tek başına LUS, tek başına miR-486-3p ve kombine tespitin ROC eğrileri. Tüm kantitatif veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur; hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir. *** = p <0,01, sağlıklı grup ile karşılaştırıldığında; ### = p <0,01, hafif ARDS grubu ile karşılaştırıldığında. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2miR-486-3p'nin ARDS model hücreleri üzerindeki etkisi. (A) LPS uygulaması sonrası HPMEC'lerde miR-486-3p ekspresyonunun zamana bağlı değişimleri. (B) Aşırı ifade ve nakavt müdahalesi sonrası miR-486-3p'nin göreli ifadesi. (C) miR-486-3p ekspresyonu değiştirildikten sonra CCK-8 analizi ile tespit edilen hücre proliferasyon aktivitesi. (D) miR-486-3p ekspresyonu değiştirildikten sonra akış sitometrisi ile tespit edilen hücre apoptoz oranı. Tüm veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur; hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir. İstatistiksel işaretler: * = p <0.05, ** = p <0.01, *** = p <0.001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3miR-486-3p ile DLL4 arasındaki hedefleme ilişkisinin doğrulanması. (A) miR-486-3p ile DLL4'ün 3’UTR bölgesi arasında öngörülen bağlanma bölgesinin şematik diyagramı. (B) Çift lusiferaz raporlayıcı gen deneyi, miR-486-3p ile DLL4 arasındaki hedefleme ilişkisini doğrulamıştır. (C) LPS tedavisi sonrası HPMEC'lerde DLL4 ekspresyonunun dinamik değişimleri. (D) miR-486-3p aşırı ekspresyonu veya nakavt sonrası DLL4 ekspresyonu. (E) Sağlıklı yenidoğanlarda ve ARDS'li yenidoğanlarda serum DLL4 seviyeleri. (F) ARDS tanılı neonatların sağkalım grubu ve ölüm grubundaki DLL4 seviyeleri. (G) Sağ kalmayan ARDS neonatlarında serum miR-486-3p ve DLL4 arasındaki korelasyon analizi. Tüm kantitatif veriler ortalama ± standart sapma olarak gösterilmiştir; hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir. İstatistiksel belirteçler: * = p <0.05, ** = p <0.01, *** = p <0,01. sağlıklı gruba kıyasla, ### = p Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4miR-486-3p'nin DLL4'ü hedeflemesinin ARDS model hücreleri üzerindeki etkisi. (A) miR-486-3p mimetiği ve DLL4 aşırı ekspresyon plazmidi ile ko-transfeksiyondan sonra DLL4 ekspresyonunun saptanması. (B) DLL4 kurtarma sonrası hücre proliferasyon aktivitesindeki değişiklikler. (C) DLL4 kurtarması sonrası hücre apoptoz oranındaki değişimler. Tüm veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur; hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir. İstatistiksel belirteçler: * = p <0.05, ** = p <0.01, *** = p <0.001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Değişken | Sağlıklı (n=10) | Neonatal ARDS (n=112) | p-değeri |
| Gestasyonel yaş (hafta) | 36.07 ± 2.71 | 35.72 ± 2.64 | 0.347 |
| Cinsiyet (erkek, %) | 59 (59.0 %) | 74 (66.1 %) | 0.29 |
| Doğum ağırlığı (kg) | 3.39 ± 0.57 | 3.33 ± 0.55 | 0.437 |
| Anne yaşı (yıl) | 29.18 ± 4.00 | 29.66 ± 4.05 | 0.387 |
| Teslimat yöntemi | 0.439 | ||
| Vajinal | 54 (54.0 %) | 65 (58.0 %) | |
| Sezaryen | 46 (46.0 %) | 47 (42.0 %) | |
| ARDS evreleri | --- | ||
| I-II | --- | 72 (64.3 %) | |
| III-IV | --- | 40 (35.7 %) |
Tablo 1: Dahil edilen bebeklerin başlangıç özellikleri. Bu tablo, sağlıklı yenidoğanların ve ARDS'li yenidoğanların başlangıç demografik bilgilerini özetlemektedir. Veriler, sürekli değişkenler için ortalama ± standart sapma ve kategorik değişkenler için sayı (yüzde) olarak sunulmuştur. P değerleri gruplar arası istatistiksel farkları belirtmektedir. Kısaltmalar: ARDS = akut solunum sıkıntısı sendromu.
| Değişken | Hayatta Kalma (n=84) | Ölüm (n=28) | p-değeri |
| Gestasyonel yaş (hafta) | 35.95 ± 2.58 | 35.04 ± 2.76 | 0.12 |
| Cinsiyet (erkek, %) | 53 (63.1 %) | 21 (75.0%) | 0.253 |
| Doğum ağırlığı (kg) | 3.37 ± 0.58 | 3.23 ± 0.42 | 0.248 |
| Anne yaşı (yıl) | 29.49 ± 3.82 | 30.18 ± 4.74 | 0.438 |
| Doğum yöntemi | 0.4 | ||
| Vajinal | 47 (56.0 %) | 18 (64.3 %) | |
| Sezaryen | 37 (4.0 %) | 10 (35.7 %) | |
| Anormal amniyotik sıvı | 6 (9.5 %) | 4 (14.3 %) | 0.485 |
| ARDS evreleri | 0.01** | ||
| I-II | 61 (72.6 %) | 1 (39.3 %) | |
| III-IV | 23 (27.4 %) | 17 (60.7%) | |
| Etiyoloji | 0.827 | ||
| Boğulma | 3 (39.3 %) | 12 (42.9 %) | |
| Zatürre | 17 (20.2 %) | 6 (21.4 %) | |
| Sepsis | 12 (14.3 %) | 2 (7.1 %) | |
| Mekonyum aspirasyon sendromu | 2 (26.2 %) | 8 (28.6 %) |
Tablo 2: ARDS'li neonatlarda sağ kalan grup ile ölen grup arasındaki klinik verilerin karşılaştırılması. Bu tablo, sağ kalan ve sağ kalamayan ARDS'li neonatlar arasındaki klinik göstergeleri karşılaştırmaktadır. Sürekli veriler ortalama ± standart sapma olarak gösterilmiş, kategorik veriler ise sayı (yüzde) olarak ifade edilmiştir. p-değerleri, iki grup arasındaki istatistiksel anlamlılığı belirtmektedir. ** = p<0.01. Kısaltmalar: ARDS = akut solunum sıkıntısı sendromu.
Ek Dosya 1: Akciğer ultrason skoru (LUS), serum miR-486-3p ekspresyonu, DLL4 ekspresyonu ve hücre tabanlı assay sonuçlarına yönelik bireysel düzeydeki ölçümler dahil olmak üzere, bu çalışmanın bulgularını destekleyen ham klinik ve deneysel veri setleri.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tartışma
Neonatal ARDS, kritik durumdaki yenidoğanlar arasında solunum yetmezliğinin ve erken mortalitenin önde gelen nedenlerinden biridir15. Hastalık şiddetinin ve prognozun erken ve doğru değerlendirilmesi, bireyselleştirilmiş müdahale ve mortalite azalması için ön koşuldur. Giderek artan kanıtlar, mikroRNA'ların ARDS'nin patolojik ilerleyişine katıldığını ve gelecek vadeden dolaşıma giren biyobelirteçler olarak hizmet ettiğini doğrulamaktadır16. Araştırmalar, akut akciğer hasarı/ARDS geçiren septik hastalarda miR-155'in belirgin şekilde arttığını göstermektedir17. Ek olarak, çalışmalar ARDS tanısı konmuş çocuklarda serum miR-629-5p seviyelerinde artış olduğunu ortaya koymuştur18. Serum miR-34a, neonatal RDS'nin şiddeti ve prognozu ile yakından ilişkilidir19. Yeni çalışmalar, miR-375'in neonatal ARDS için tanısal ve prognostik bir biyobelirteç olduğunu göstermektedir20. Rapor edilen bu moleküllere benzer şekilde, serum miR-486-3p periferik kanda kantitatif PCR yoluyla kararlı bir şekilde saptanabilir ve yenidoğan yoğun bakım ünitelerinde (NICU'lar) hızlı tarama için uygundur. Esas olarak erken hastalık başlangıcını yansıtan miR-375 ve miR-34a ile karşılaştırıldığında, miR-486-3p ekspresyonu pulmoner lezyonların şiddeti ile daha yakından ilişkilidir ve akciğer hasarının ilerlemesine paralel olarak dinamik bir şekilde değişir. LUS ile birleştirildiğinde, kısa süreli mortalite için daha yüksek prognostik doğruluk sağlar. Bununla birlikte, miR-486-3p nispeten düşük hastalık spesifisitesi sergilemektedir ve ilgili klinik araştırma kanıtları, iyi tanımlanmış miRNA biyobelirteçlerine kıyasla sınırlı kalmaktadır. Toplu olarak bakıldığında, miR-486-3p, neonatal ARDS'nin yardımcı tanısı veya prognostik tahmini için bir markör olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir.
LUS, akciğer dokusunun ultrasonik özelliklerine dayanarak pulmoner havalanmayı değerlendiren, gelişmiş bir hasta başı görüntüleme göstergesidir21. Özellikle LUS, alveoler ventilasyonun derecesini ölçmek için etkili bir kantitatif metrik görevi görür22. Araştırmalar, neonatal ARDS'nin hem şiddetinin hem de prognozunun değerlendirilmesindeki faydasını doğrulamıştır23. Önceki çalışmalarla uyumlu olarak, klinik çalışmamız ARDS'li neonatlardaki LUS ölçümlerinin sağlıklı neonatlara kıyasla anlamlı derecede yüksek olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca, etkilenen neonatlar arasında, şiddetli alt grup, hafif alt gruba göre belirgin şekilde daha yüksek LUS değerleri göstermiş; bu durum yüksek LUS değerleri ile atelektazi, pulmoner ödem ve akciğer konsolidasyonunun şiddeti arasındaki doğrudan ilişkiyi vurgulamıştır24. Bulgularımız ayrıca, nihayetinde hayatını kaybeden hastaların da hayatta kalanlara göre belirgin şekilde daha yüksek LUS değerleri sergilediğini göstermiştir. Hayatta kalamayan neonatlarda LUS ile serum miR-486-3p arasında güçlü bir pozitif korelasyon gözlemlenmiş, bu da iki göstergenin sinerjik değerini daha da desteklemiştir. Her yöntemin kendine özgü özellikleri vardır: LUS radyasyonsuzdur, taşınabilirdir ve gerçek zamanlı hasta başı izleme için uygundur; ancak yorumlanması büyük ölçüde operatör deneyimine dayanır ve subjektif yanlılığa açıktır. Serum miR-486-3p tespiti objektif, tekrarlanabilir kantitatif sonuçlar sağlar ancak akciğer dokusundaki gerçek zamanlı morfolojik değişiklikleri yansıtamaz. Klinik uygulamada, bu kombine yaklaşımın yenidoğan yoğun bakım ünitelerinde rutin kullanım için önerildiği görülmektedir. Bu yöntem, şüpheli veya doğrulanmış ARDS'li neonatların erken risk stratifikasyonu, hastalık ilerlemesinin düzenli dinamik değerlendirmesi ve kısa vadeli klinik prognozun yardımcı değerlendirmesi için uygundur. Bununla birlikte, bu yöntemin kesin görüntüleme veya etiyolojik incelemelerin yerini alması amaçlanmamıştır; diğer inflamatuar akciğer hastalıkları ile komplike olmuş neonatlarda uygulandığında sınırlı özgüllük göstermektedir. Ek olarak, araştırmamız tek bir merkezde yürütüldüğü için farklı bölgelerden gelen popülasyonlara uygulanabilirliği henüz doğrulanmamıştır.
Klinik olarak, yüksek LUS değerlerinin yüksek serum miR-486-3p seviyeleriyle birlikte neonatal ARDS'de kötü prognozla ilişkili olduğunu gözlemledik; bu durum, miR-486-3p'nin olgunlaşmamış akciğerdeki şiddetli akciğer vasküler yaralanması ve bozulmuş vasküler onarım kapasitesi ile yakından ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. İn vitro hücre deneylerimiz, miR-486-3p'nin neonatal akciğerde vasküler bütünlüğü ve onarımı yöneten temel süreçler olan endotel hücre proliferasyonu ve apoptozunu doğrudan modüle ettiğini göstererek bu klinik gözlemi tamamlamıştır. Ayrıca, araştırmalar miRNA'ların çeşitli hücresel süreçlerde kritik roller oynadığını göstermiştir25,26. miRNA'ların etkilerini öncelikle hedef genlerin transkripsiyon sonrası düzenlemesi yoluyla, ağırlıklı olarak miRNA eklenmesi (splicing) ve protein translasyonunun baskılanması şeklinde gerçekleştirdikleri iyi bilinmektedir27. DLL4 geni, vasküler gelişim ve anjiyogenezde önemli bir rol oynamaktadır28. Araştırmalar, mikroRNA-30 ailesinin anjiyogenez sırasında endotel hücre davranışını modüle etmek için DLL4'ü hedeflediğini göstermiştir29. Bu bulgular, endotelyal DLL4 modülasyonunun neonatal ARDS'deki akciğer vasküler yaralanması ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. Çalışmamızda, miR-486-3p ve DLL4 arasındaki hedefleme ilişkisini tanımladık ve doğruladık. Sonraki analizler, yükselmiş miR-486-3p ekspresyonunun LPS ile indüklenen HPMEC'lerin proliferasyonunu önemli ölçüde inhibe ederken apoptozu teşvik ettiğini ortaya koymuştur. Önemli bir nokta olarak, DLL4 ekspresyonu miR-486-3p tarafından aracılık edilen etkileri kısmen tersine çevirebilmiştir. Bu durum, miR-486-3p'nin HPMEC fonksiyonlarını etkilemek ve neonatal ARDS'nin ilerlemesini düzenlemek için DLL4'ü hedeflediğini göstermektedir. Ancak, bunun pulmoner vasküler disfonksiyonu doğrudan etkileyip etkilemediği ve ARDS'ye katkıda bulunup bulunmadığı henüz daha fazla doğrulanmalıdır. Dikkat çekici bir şekilde, DLL4 miR-486-3p tarafından indüklenen hücresel değişiklikleri yalnızca kısmen tersine çevirmiştir. Tipik bir miRNA olarak miR-486-3p, birden fazla downstream hedef geni modüle eder. Gelecekteki çalışmalar, neonatal ARDS'de miR-486-3p'nin tüm mekanizmasını aydınlatmak için daha fazla hedef gen tanımlamaya odaklanacaktır.
Son olarak, temel protokol adımlarının sıkı bir şekilde standardize edilmesinin güvenilir ve tekrarlanabilir veriler sağladığını belirtmek gerekir. Deneysel hataları minimize etmek için örnek toplama prosedürlerini birleştirdik, standardize edilmiş hücre kültürü ve transfeksiyasyon protokollerini benimsedik ve bağımsız tekrarlar ekledik. Yaygın operasyonel sorunlar ve çözümleri şu şekilde özetlenmiştir: LUS değerlendirmesi için 12 bölgeli tarama protokolünü ve birleştirilmiş puanlama kurallarını standardize edin ve net görüntüler elde etmek için neonatal postürü ayarlayın. Serum miRNA tespiti için tekrarlayan dondurma-çözme döngülerinden kaçının, RNA saflığını doğrulayın (A260/A280 = 1.8–2.1) ve teknik tekrarlar ekleyin. LPS ile indüklenmiş hücre modelleri için taze hazırlanmış 1 mg/L LPS ve stabil kültür koşulları kullanın. Transfeksiyasyon sırasında hücre konfluensini ve reaktif oranını optimize edin ve sitotoksisiteyi azaltmak için besiyerini değiştirin. Dual-lüsiferaz analizleri için hücre lizininin tam gerçekleştiğinden ve operasyonun standardize edildiğinden emin olun.
Genel olarak, göğüs görüntüleme, kan gazı analizi ve tekli biyobelirteç testi içeren geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, kombine LUS/miR-486-3p stratejisi radyasyon içermeyen, düşük maliyetli, uygulanması kolay ve geliştirilmiş öngörü performansına sahip bir yöntemdir. Yenidoğan ARDS için güvenilir bir tamamlayıcı prognostik araç olarak işlev görür. Klinik olarak bu yöntem, yenidoğan yoğun bakım ünitelerinde erken risk sınıflaması ve dinamik durum izlemi için uygulanabilir. Ayrıca, çok merkezli çalışmalar için birleşik bir değerlendirme indeksi olarak da hizmet edebilir. Mekanizistik olarak, doğrulanmış miR-486-3p/DLL4 aksı, patolojik mekanizmaların ve hedefe yönelik tedavilerin araştırılması için yeni yönler sunmaktadır. Bununla birlikte, bu kombine yaklaşımın kendine özgü teknik sınırlamaları da vardır. LUS sonuçları operatörler arasında farklılık göstermekte ve miR-486-3p, inflamatuar akciğer hastalıkları için hastalık spesifisitesinden yoksundur. Bu yöntem yalnızca tek zaman noktalı deteksiyonu destekler ve kesin görüntüleme veya etiyolojik incelemelerin yerini tutamaz.
Umut verici bulgulara rağmen, bazı kısıtlamalar dikkat çekmektedir. İlk olarak, tek merkezli tasarım, sonuçlarımızın genellenebilirliğini sınırlamaktadır. İkinci olarak, LUS/miR-486-3p panelinin öngörücü performansının sağlamlığını doğrulamak için harici bir validasyon kohortuna sahip değildik. Üçüncü olarak, serum miR-486-3p düzeyi yalnızca tek bir zaman noktasında ölçülmüş olup, hastalık progresyonu ile olan dinamik ilişkisi yakalanamamıştır. Dördüncü olarak, tamamlayıcı protein analizlerinin ve in vitro/in vivo validasyonun eksikliği, mekanistik çıkarımlarımızın sağlamlığını sınırlandırmaktadır. Son olarak, miR-486-3p'nin neonatal ARDS patofizyolojisindeki spesifik rolü henüz tam olarak aydınlatılamamıştır ve daha fazla araştırma gerektirmektedir. Sonuç olarak, ARDS tanısı konan yenidoğanlarda artmış LUS ve yükselmiş serum miR-486-3p seviyeleri, klinik uygulamada önemli referans noktaları teşkil etmektedir. Bu iki biyobelirtecin sinerjik değerlendirmesi, neonatal ARDS'nin hem şiddetinin hem de prognozunun doğru tahmin edilmesini kolaylaştırabilir ve böylece belirli bir klinik uygulama değeri sunabilir.
Açıklamalar
İngilizce ifade optimizasyonu, dil bilgisi kontrolü ve format standardizasyonu için Grammarly kullanılmıştır. Tüm araştırma fikirleri, deneyler, veriler ve sonuçlar yazarların özgün çalışmasıdır.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.2 mL PCR Tüpleri | Axygen | PCR-02-C | |
| 0.25% Trypsin-EDTA Çözeltisi | Gibco (Thermo Fisher) | 25200056 | |
| 1.5 mL Mikrocentrifüj Tüpleri | Axygen | MCT-150-C | |
| 5% CO2 Nemlendirilmiş Hücre Kültürü İnkübatörü | Thermo Fisher | 3111 | |
| 6 Kuyucuklu Hücre Kültürü Plakaları | Corning | 3516 | |
| 96 Kuyucuklu Hücre Kültürü Plakaları | Corning | 3599 | |
| Mutlak Etanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Annexin V-FITC Apoptoz Tespit Kiti | BD Biosciences | 556547 | |
| Masaüstü Centrifüj | Eppendorf | 5810R | |
| Biyolojik Güvenlik Kabini | Thermo Fisher | 1300 Series A2 | |
| CCK-8 Hücre Sayım Kiti | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| Tek Kullanımlık Steril Kan Toplama Tüpleri | BD Vacutainer | 367815 | |
| DLL4 Aşırı Ekspresyon Plazmidi (OE-DLL4) | GenePharma | EX-M02151 | |
| DLL4-MUT Lusiferaz Reporter Plazmidi | GenePharma | PGL3-DLL4-MUT | |
| DLL4-WT Lusiferaz Reporter Plazmidi | GenePharma | PGL3-DLL4-WT | |
| DMEM Yüksek Glukozlu Besiyeri | Gibco (Thermo Fisher) | 11965092 | |
| Dual-Luciferase Reporter Analiz Kiti | Biolab | BL101A | |
| Enzim Bağlı İmmünosorbent Analiz (ELISA) Okuyucu | Thermo Fisher | Multiskan FC | |
| Fetal Bovin Serum (FBS) | Gibco (Thermo Fisher) | 10099141C | |
| Filtreli Pipet Uçları (10 μL, 200 μL, 1000 μL) | Axygen | TF-10-R-S, TF-200-R-S, TF-1000-R-S | |
| Akış Sitometresi | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Akış Sitometrisi Tüpleri | BD Biosciences | 352054 | |
| Yüksek Hızlı Soğutmalı Centrifüj | Eppendorf | 5424R | |
| E. coli O111:B4 kaynaklı Lipopolisakkarit (LPS) | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Akciğer Ultrason Sistemi | Mindray | M9 | |
| Mikrohacim Spektrofotometre | Thermo Fisher | NanoDrop 2000 | |
| miR-486-3p İnhibitörü | RiboBio | HmiR0000486-AS | |
| miR-486-3p Mimetiği | RiboBio | HmiR0000486 | |
| miR-486-3p qPCR Primer Seti | RiboBio | HmiRQP0486 | |
| Negatif Kontrol İnhibitörü (NC) | RiboBio | HmiR0001-AS | |
| Negatif Kontrol Mimetiği (NC) | RiboBio | HmiR0001 | |
| Negatif Kontrol Aşırı Ekspresyon Plazmidi (OE-NC) | GenePharma | EX-NEG | |
| Penisilin-Streptomisin Çözeltisi (100×) | Gibco (Thermo Fisher) | 15140122 | |
| Fosfat Tamponlu Salin (PBS) 1× | Gibco (Thermo Fisher) | 10010023 | |
| Pipet Seti (10 μL, 20 μL, 200 μL, 1000 μL) | Eppendorf | Research Plus | |
| Propidyum İyodür (PI) Boyama Çözeltisi | BD Biosciences | 556463 | |
| Real-Time Kantitatif PCR Sistemi | Applied Biosystems (Thermo Fisher) | 7500 Fast | |
| RNase-Free Su | Invitrogen (Thermo Fisher) | 10977015 | |
| RT-PCR Hızlı Master Mix | Toyobo | FSQ-101 | |
| Steril Tek Kullanımlık Pipetler | Corning | 4487, 4488, 4489 | |
| SYBR Green Real-time PCR Master Mix | Toyobo | QPK-201 | |
| Trizol Reaktifi | Invitrogen (Thermo Fisher) | 15596026 | |
| U6 snRNA qPCR Primer Seti | RiboBio | HmiRQP0001 | |
| Vorteks Karıştırıcı | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
Kaynaklar
- Chi M, Mei YB, Feng ZC. A review on neonatal acute respiratory distress syndrome. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi. 2018;20(9):724-728.
- Garcia MJ, Amarelle L, Malacrida L, Briva A. Novel opportunities from bioimaging to understand the trafficking and maturation of intracellular pulmonary surfactant and its role in lung diseases. Front Immunol. 2023;14:1250350.
- Wu H, et al. The value of oxygen index and base excess in predicting the outcome of neonatal acute respiratory distress syndrome. J Pediatr (Rio J). 2021;97(4):409-413.
- Coppola S, et al. Respiratory mechanics, lung recruitability, and gas exchange in pulmonary and extrapulmonary acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 2019;47(6):792-799.
- Bello G, Blanco P. Lung ultrasonography for assessing lung aeration in acute respiratory distress syndrome: a narrative review. J Ultrasound Med. 2019;38(1):27-37.
- Wu HL, et al. Lung ultrasound score for monitoring the withdrawal of extracorporeal membrane oxygenation on neonatal acute respiratory distress syndrome. Heart Lung. 2024;63:9-12.
- King A, Blank D, Bhatia R, Marzbanrad F, Malhotra A. Tools to assess lung aeration in neonates with respiratory distress syndrome. Acta Paediatr. 2020;109(4):667-678.
- Zhu Z, et al. Whole blood microRNA markers are associated with acute respiratory distress syndrome. Intensive Care Med Exp. 2017;5(1):38.
- Long G, Zhang Q, Yang X, Sun H, Ji C. Diagnostic and predictive significance of serum miR-141-3p in acute respiratory distress syndrome patients with pulmonary fibrosis. Tohoku J Exp Med. 2024;262(3):157-162.
- Liang Y, et al. MiR-124-3p helps to protect against acute respiratory distress syndrome by targeting p65. Biosci Rep. 2020;40(5).
- Najafipour R, et al. Screening for differentially expressed microRNAs in BALF and blood samples of infected COVID-19 ARDS patients by small RNA deep sequencing. J Clin Lab Anal. 2022;36(11):e24672.
- Zhang S, et al. Clinical significance and potential mechanism of hsa_circ_0006892 in acute respiratory distress syndrome complicated with pulmonary fibrosis. Mol Biol Rep. 2024;51(1):1120.
- Yao MY, et al. Long non-coding RNA MALAT1 exacerbates acute respiratory distress syndrome by upregulating ICAM-1 expression via microRNA-150-5p downregulation. Aging (Albany NY). 2020;12(8):6570-6585.
- Zhang C, Ji Y, Wang Q, Ruan L. MiR-338-3p is a biomarker in neonatal acute respiratory distress syndrome and has roles in the inflammatory response of ARDS cell models. Acta Med Okayama. 2022;76(6):635-643.
- Shi S, et al. Evaluation of the neonatal sequential organ failure assessment and mortality risk in neonates with respiratory distress syndrome: a retrospective cohort study. Front Pediatr. 2022;10:911444.
- Martucci G, et al. Identification of a circulating miRNA signature to stratify acute respiratory distress syndrome patients. J Pers Med. 2020;11(1).
- Wang ZF, Yang YM, Fan H. Diagnostic value of miR-155 for acute lung injury/acute respiratory distress syndrome in patients with sepsis. J Int Med Res. 2020;48(7):300060520943070.
- Zhang C, Ji Y, Wang Q, Ruan L. MiR-629-5p may serve as a biomarker for pediatric acute respiratory distress syndrome and can regulate the inflammatory response. Pediatr Neonatol. 2024. doi:10.1016/j.pedneo.2024.05.003.
- Li Q, Chen Y, Lin L. Value of serum miR-34a and Ang-1 in severity evaluation and prognosis of neonatal respiratory distress syndrome. Emerg Med Int. 2022;2022:5480026.
- Deng Y, Zhang R, Jiang X. Association of umbilical cord blood miR-375 with neonatal respiratory distress syndrome and adverse neonatal outcomes in premature infants. Acta Biochim Pol. 2022;69(3):605-611.
- Ostras O, Shponka I, Pinton G. Ultrasound imaging of lung disease and its relationship to histopathology: an experimentally validated simulation approach. J Acoust Soc Am. 2023;154(4):2410-2425.
- Soliman RM, et al. Prediction of extubation readiness using lung ultrasound in preterm infants. Pediatr Pulmonol. 2021;56(7):2073-2080.
- Huang L, Ye D, Wang J. Analysis of diagnosing neonatal respiratory distress syndrome with lung ultrasound score. Pak J Med Sci. 2022;38(5):1101-1106.
- Chardoli M, et al. Lung ultrasound in predicting COVID-19 clinical outcomes: a prospective observational study. J Am Coll Emerg Physicians Open. 2021;2(6):e12575.
- Jafari N, Abediankenari S. Role of microRNAs in immunoregulatory functions of epithelial cells. BMC Immunol. 2024;25(1):84.
- Sun LL, Li WD, Lei FR, Li XQ. The regulatory role of microRNAs in angiogenesis-related diseases. J Cell Mol Med. 2018;22(10):4568-4587.
- Hynes C, Kakumani PK. Regulatory role of RNA-binding proteins in microRNA biogenesis. Front Mol Biosci. 2024;11:1374843.
- Chowdhury TA, Li K, Ramchandran R. Lessons learned from a lncRNA odyssey for two genes with vascular functions, DLL4 and TIE1. Vascul Pharmacol. 2019;114:103-109.
- Bridge G, et al. The microRNA-30 family targets DLL4 to modulate endothelial cell behavior during angiogenesis. Blood. 2012;120(25):5063-5072.