Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Olgu sunumu

Vaccinia İlişkili Kinaz 1 Geninde Homozigot c.1124G>A Varyantı Kaynaklı Distal Kalıtsal Motor Nöropatili Bir Pedigriye İlişkin Olgu Sunumu

55 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/72503

⸱

14 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Yunnan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, 2The First Clinical Medical College, Yunnan University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, vaccinia-related kinase 1 (VRK1) genindeki homozigot c.1124G>A varyantının neden olduğu, yetişkinlikte başlayan distal kalıtsal motor nöropati (dHMN) tanılı Çinli bir konsanguin soy ağacını bildirmektedir. Bulgular, Çin popülasyonunda VRK1 ile ilişkili dHMN'nin klinik fenotipik ve genetik spektrumunu genişletmektedir.

Özet

Bu çalışma, VRK1 varyantlarının neden olduğu distal kalıtsal motor nöropatisi (dHMN) olan bir soy ağacındaki klinik fenotipleri, nörofizyolojik özellikleri ve gen varyantlarının patojenitesini analiz etmeyi ve bu hastalığın klinik tanısı ile genetik danışmanlığını destekleyecek kanıtlar sağlamayı amaçlamıştır. VRK1 geninde homozigot c.1124G>A varyantı nedeniyle dHMN gelişen konsanguine bir Çinli aileyi rapor ediyoruz. Probandın klinik ve elektrofizyolojik verileri toplanmıştır. Varyant bölgesinin belirlenmesi için tüm ekzom dizileme (WES) ve Sanger dizileme ile doğrulama yapılmış ve patojenite yorumlaması Amerikan Tıbbi Genetik ve Genomik Koleji/Moleküler Patoloji Derneği (ACMG/AMP) kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Proband, alt ekstremitelerin distal bölgelerinde 2 yıldır süregelen progresif güçsüzlük ve atrofi ile birlikte üst ekstremitelerde incelme görülen ve duyusal bozukluğu olmayan 24 yaşında bir erkektir. Elektrofizyolojik inceleme, her iki üst ve alt ekstremitenin motor sinirlerinde bileşik kas aksiyon potansiyeli (CMAP) amplitüdünde azalma olduğunu göstererek periferik nörojenik hasara işaret etmiş, duyusal sinir iletimi ise normal bulunmuştur. Genetik testler, VRK1 geninde homozigot c.1124G>A (p.Trp375Ter) varyantı saptamıştır. Ebeveynleri ve ablaları heterozigot taşıyıcıdır ve soy ağacıle otozomal resesif kalıtım ile uyumludur. ACMG kılavuzlarına göre, bu varyant patojenik olarak sınıflandırılmıştır (kanıt: PVS1, PM2, PP1). Homozigot VRK1 c.1124G>A varyantı, bazı genetik veri tabanlarında belirtilen pontoserebellar hipoplazi tip 1A (PCH1A) yerine, erişkin başlangıçlı dHMN'ye neden olmaktadır. Bu soy ağacı, üst ekstremite incelmesi ve hem üst hem de alt ekstremitelerde difüz olarak azalmış CMAP amplitüdleri dahil olmak üzere belirgin fenotipler sunarak, Çin popülasyonunda VRK1 ile ilişkili dHMN'nin klinik ve genetik spektrumunu genişletmektedir.

Giriş

Distal kalıtsal motor nöropati (dHMN), patolojik olarak alt motor nöronların ve aksonlarının uzunluğa bağlı dejenerasyonu ile tanımlanan, genetik olarak heterojen bir kalıtsal periferik sinir sistemi bozuklukları grubunu oluşturur. Klinik olarak hastalar, distal ekstremite kaslarında progresif güçsüzlük ve atrofi ile prezante olurken, çoğu vakada duyusal fonksiyonlar büyük ölçüde korunur1. Başlangıç belirtileri genellikle ayak parmak fleksiyon güçsüzlüğü ve gastroknemius ile ayağın intrinsik kaslarının atrofisi dahil olmak üzere distal alt ekstremiteleri etkiler; hastalık ilerledikçe elin interosseöz kaslarını ve tenar/hipotenar kasları da kapsayacak şekilde kademeli bir seyir izler2. Kalıtım modelleri alt tipler arasında farklılık gösterir; hem otozomal dominant hem de otozomal resesif formlar tanımlanmıştır. Bugüne kadar 50'den fazla patojenik gen dHMN ile ilişkilendirilmiş olsa da, etkilenen bireylerin yarısından fazlasında altta yatan genetik neden henüz belirlenememiştir3.

Belirgin genetik heterojenlik ve diğer nöromüsküler durumlarla geniş fenotipik örtüşme nedeniyle, dHMN teşhisinin yalnızca klinik değerlendirmeye dayandırılması genellikle güvenilmezdir4. Klinik fenotiplemeden aday gen dizilemesine doğru ilerleyen geleneksel aşamalı tanı yaklaşımları verimsizdir ve özellikle sporadik veya fenotipik olarak atipik vakalarda düşük tanısal verimle karşı karşıyadır1,2. Hedefe yönelik gen panelleri daha maliyet etkin bir alternatif sunsa da önceden tanımlanmış gen listeleriyle sınırlıdır ve nadir veya yeni patojenik varyantları gözden kaçırabilir. Tüm genom dizileme en kapsamlı genomik kapsamı sunar ancak yüksek maliyet, uzamış analitik dönüş süresi ve rutin klinik ortamlarda yüksek hacimli belirsiz öneme sahip varyantlar nedeniyle sınırlıdır5. Mevcut çalışma için sistemik klinik değerlendirme, nörofizyolojik inceleme, tüm ekzom dizileme (WES) ve ailesel segregasyon analizini birleştiren entegre bir tanısal çerçeve kullandık. Nörofizyolojik testler, saf motor periferik sinir tutulumunun doğrulanmasına ve sinir hasarının dağılımının belirlenmesine yardımcı olarak ayırıcı tanıyı daraltır. WES, dHMN ile ilişkili bilinen tüm genlerin eş zamanlı olarak sorgulanmasına, potansiyel yeni patojenik varyantların tespitine ve ardından ailesel segregasyon analizine olanak tanır; böylece benign rastlantısal varyantların filtrelenmesini sağlar ve aday varyantların patojenikliğine dair kanıtları güçlendirerek tanısal verim, maliyet ve yorumlanabilirlik arasında pragmatik bir denge kurar.

Vaccinia ile ilişkili kinaz 1 (VRK1) geni, nükleer sinyal iletimine ve DNA hasarı onarım yollarına katılan bir serin/treonin kinaz kodlar ve fizyolojik işlevi nöronal homeostazın ve canlılığın sürdürülmesi için gereklidir6. VRK1'deki patojenik varyantlar geniş bir klinik spektrum oluşturur: mikrosefali, şiddetli hipotoni ve derin motor gelişim geriliği ile karakterize olan bebeklik döneminde başlayan pontoserebellar hipoplazi tip 1A (PCH1A); ağırlıklı olarak distal ekstremite tutulumu ile seyreden yetişkinlik döneminde başlayan dHMN ve herediter spastik parapleji (HSP) ile amyotrofik lateral skleroz (ALS) benzeri fenotipleri içeren daha nadir prezentasyonlar7,8,9. Özellikle, VRK1'deki homozigot c.1124G>A (p.Trp375Ter) nonsense varyantı, tutarlı otozomal resesif kalıtım sergileyen birden fazla bağımsız dHMN soy ağacında belgelenmiş olup, dHMN ile kurulan nedensel ilişkisini desteklemektedir10. Bu varyant, VRK1'in C-terminal kodlama bölgesinde erken bir sonlandırma kodonu oluşturur ve ya trunke bir protein üretimi ya da nonsense aracılı mRNA yıkımının aktivasyonu yoluyla protein fonksiyon kaybına yol açacağı öngörülmektedir. Bu spesifik varyant için kesin patolojik mekanizma fonksiyonel olarak doğrulanmamış olsa da, bozulmuş VRK1 kinaz aktivitesinin nöronal DNA onarımını ve hücre içi sinyal kaskadlarını bozabileceği, böylece motor nöron dejenerasyonuna ve dHMN gelişimine katkıda bulunabileceği hipotez edilmektedir.

Klinik uygulamada, VRK1 genetik testlerine şu senaryolarda öncelik verilmelidir: duyusu korunmuş, uzunluğa bağlı distal motor güçsüzlük ve atrofi ile seyreden klinik olarak şüpheli dHMN hastaları, özellikle otozomal resesif aile öyküsü olanlar veya hastalığı yetişkinlik döneminde başlayanlar; açıklanamayan distal motor nöropati ile başvuran akraba evliliği olan ailelerden bireyler; diğer bilinen genetik bozukluklarla açıklanamayan, merkezi ve periferik sinir sistemi bulgularının örtüştüğü hastalar ve yaygın patojenik gen varyantları için negatif sonuçlanan dHMN veya Charcot-Marie-Tooth hastalık tip 2 (CMT2) vakaları11,12. Bu tanısal yaklaşımın birkaç önemli kısıtlılığı göz önünde bulundurulmalıdır. Birincisi, VRK1 ile ilişkili dHMN; spinal müsküler atrofi (SMA), CMT2, HSP ve erken evre ALS dahil olmak üzere diğer nöromüsküler bozukluklarla önemli fenotipik örtüşmeler paylaşır ve bu durum potansiyel olarak tanısal yanlış sınıflandırmalara yol açabilir. İkincisi, nadir VRK1 varyantlarının yorumlanması zor olmaya devam etmektedir, çünkü çoğunun fonksiyonel doğrulaması yoktur ve büyük ölçüde in silico tahmin araçlarına dayanmaktadır; bu da varyantların bir alt kümesi için belirsiz patojenite sınıflandırmalarıyla sonuçlanmaktadır. Üçüncüsü, tek bir soy çalışması olduğu için bulgularımızın genellenebilirliği sınırlıdır ve genotip-fenotip korelasyonlarının daha geniş hasta kohortlarında yeniden doğrulanması gerekmektedir.

Günümüzde, Çin popülasyonlarında VRK1 ilişkili dHMN raporları hala kısıtlıdır ve bu durumun tam fenotipik heterojenliği ile klinik özellikleri henüz tamamen tanımlanmamıştır. Bu çalışmada, VRK1 geninde homozigot c.1124G>A varyantı nedeniyle dHMN gelişen akraba evliliği olan Çinli bir aileyi rapor ediyoruz. Klinik, elektrofizyolojik ve genetik bulguları entegre ederek, bu soy ağacının fenotipik ve genotipik özelliklerini karakterize ediyor ve VRK1 ilişkili dHMN için doğru klinik tanı ve genetik danışmanlığı destekleyecek referans veriler sunuyoruz.

OLGU SUNUMU:

Proband (III₁), Guizhou Eyaleti'nin Bijie şehrinden, birinci derece kuzen olan ebeveynlerden doğmuş 24 yaşında bir erkektir. Üç nesillik aile soyağacı Şekil 1'de gösterilmiştir ve otosomal resesif kalıtım modeliyle uyumludur. II₁ ve II₂ (probandın ebeveynleri), VRK1 c.1124G>A varyantının heterozigot taşıyıcıları olup asemptomatiktenler. Proband (III₁), varyant için homozigot olup klinik semptomlar göstermiştir. III₂ ve III₄ (probandın ablaları), herhangi bir klinik fenotip göstermeyen heterozigot taşıyıcılardır. III₃ (probandın üçüncü ablası) çocuklukta evlat edinilmiş olup benzer alt ekstremite güçsüzlüğü ve kas atrofisi bildirilmiş, ancak genetik konfirmasyon yapılamamıştır.

Klinik belirtiler

Temel şikayet: 2 yıldır her iki alt ekstremitede ilerleyici güçsüzlük ve atrofi.

Mevcut hastalık öyküsü: İki yıl önce, hastada belirgin bir tetikleyici faktör olmaksızın distal alt ekstremitelerde ağrısız güçsüzlük gelişti. Hasta, düz zeminde yürürken kolayca düştüğünü ancak yardımsız çömelebildiğini ve ayağa kalkabildiğini belirtti. Hasta ve ailesi tarafından diz altı bölgelerde kademeli incelme fark edildi. Çocukluğundan beri koşma ve zıplama konusunda zorluk yaşadığı ve egzersiz toleransının düşük olduğu bildirildi. Ekstremitelerde uyuşma, ağrı veya ısı duyusu bozukluğu, belirgin bir üst ekstremite güçsüzlüğü veya bulber semptomlar izlenmedi. Zekası normal düzeydeydi ve kuaför olarak bağımsız bir şekilde çalışıyordu.

Nörolojik muayene

Kas kuvveti (MRC ölçeği): Bilateral olarak kalça fleksiyonu 5/5, diz ekstansiyonu 4+/5, ayak bileği dorsifleksiyonu 4/5, ayak bileği plantar fleksiyonu 3+/5; bilateral olarak üst ekstremite proksimal kaslar 5/5, el bileği ekstansiyonu 4+/5, parmak fleksiyonu 4/5, elin intrinsik kasları 4/5.

Kas tonusu: Tüm dört uzuvda normal; tonusta artış veya azalma yok.

Kas kütlesi: Alt ekstremite distal kaslarında (gastrocnemius, tibialis anterior ve ayağın intrinsik kasları) belirgin atrofi gözlemlendi (Şekil 2A). Üst ekstremiteler ince görünüyordu ve elin intrinsik kaslarında hafif atrofi mevcuttu (Şekil 2B).

Fasikülasyonlar: Ekstremite veya gövde kaslarında gözle görülür fasikülasyonlar gözlemlenmedi.

Tendon refleksleri: Üst ekstremite refleksleri azalmıştı; alt ekstremite tendon refleksleri (diz ve ayak bileği refleksleri) bilateral olarak yoktu.

Patolojik bulgular: Bilateral Babinski belirtisi ve Chaddock belirtisi negatifti.

Duyusal muayene: Tüm ekstremitelerde yüzeysel duyular (ağrı, dokunma, sıcaklık) ve derin duyular (vibrasyon, pozisyon) sağlamdı.

Koordinasyon: Parmak-burun testi ve topuk-diz-kaval kemiği testi bilateral olarak normaldi.

Kraniyal sinirler: Pupillalar eşit ve ışığa reaktif; ekstraoküler hareketler tam; yüz simetrisi mevcut; normal palatal elevasyon; atrofi veya fasikülasyon olmaksızın normal dil hareketi; disfaji veya dizartri yok.

Yürüyüş: Bilateral steppage yürüyüşü.

Yardımcı laboratuvar incelemeleri: Serum kreatin kinaz (CK), vitamin B₁₂ düzeyi ve tiroid fonksiyon testleri (TSH, FT3, FT4) normal referans aralıklarındaydı.

Nörogörüntüleme: Bu hastada kranial ve spinal manyetik rezonans görüntüleme (MRI) yapılmamıştır.

Ayırıcı tanı

PCH1A: Dışlandı. Hastada yetişkinlikte başlayan hastalık mevcuttu; klasik infantil PCH1A fenotipi ile tutarsız şekilde mikrosefali, hipotoni, serebellar displazi veya gelişimsel gerilik görülmedi.

SMA: Hariç tutuldu. Hastada, SMA'nın tipik proksimal ağırlıklı zayıflık paterni olmaksızın, sadece distal tutulumun olduğu ve proksimal ekstremite gücünün normal olduğu yetişkinlikte başlayan bir tablo vardı.

CMT2: Nörofizyoloji ile dışlanmıştır. Hastada tamamen normal duyusal sinir aksiyon potansiyelleri ile seyreden, saf motor sinir tutulumu mevcuttu ve bu nedenle CMT2 tanı kriterlerini karşılamıyordu.

ALS: Hariç tutuldu. Üst motor nöron tutulumu, bulber semptomlar ve servikal veya bulber-innervasyona sahip kaslarda fasikülasyonlar yoktu; saf distal tutulumla seyreden kronik progresif seyir ALS için atipikti.

HSP: Dışlandı. Hastada spastisite, hiperrefleksi veya patolojik belirti saptanmadı ve yalnızca alt motor nöron tutulumu mevcuttu.

Kennedy hastalığı (spinal ve bulber musküler atrofi, SBMA): Dışlandı. Bulber tutulum, perioral fasikülasyonlar ve endokrinolojik belirtiler yoktu; kalıtım paterni X-bağlı geçişle uyumlu değildi.

Tanı, Değerlendirme ve Plan

Tanı

1. VRK1 genindeki homozigot patojenik varyant c.1124G>A (p.Trp375Ter) ile doğrulanmış dHMN (otozomal resesif kalıtım).

2. Ağırlıklı olarak distal alt ekstremeleri etkileyen, saf motor aksonal periferik nöropati.

Değerlendirme

Hasta, duyusunun korunduğu, VRK1 ile ilişkili dHMN'nin klasik yetişkin başlangıçlı fenotipiyle uyumlu, yavaş ilerleyici distal motor güçsüzlük ve kas atrofisi ile başvurmuştur.

Nörofizyolojik bulgular, normal duyusal iletiyle birlikte diffüz motor aksonal hasarı göstermiş ve saf motor nöropatiyi desteklemiştir.

Mevcut başvuruda hastalık şiddeti hafif ile orta arasındaydı: hasta ambulatuvar kalmış ve günlük işlerini bağımsız olarak yapabilme yeteneğini korumuştu; bulber veya solunumsal tutulum saptanmadı.

Pedigri, heterozigot taşıyıcıların asemptomatik kaldığı otozomal resesif kalıtımı göstermiştir.

Yönetim ve takip planı

1. Semptomatik yönetim: Yürüyüş stabilitesini artırmak ve düşmeye bağlı yaralanmaları önlemek için ayak-bilek ortezleri reçete edin; eklem hareket açıklığını korumak ve kontraktürleri önlemek amacıyla kişiselleştirilmiş kuvvetlendirme eğitimi ve germe programları için rehabilitasyon tıbbına yönlendirin.

2. Düzenli takip: Hastalık progresyonunu izlemek için, tekrarlayan sinir ileti çalışmaları da dahil olmak üzere yıllık nörolojik değerlendirmeler planlayın.

3. Genetik danışmanlık: Probanda ve aile üyelerine nüks riski, üreme planlama seçenekleri ve risk altındaki akrabalar için semptom öncesi genetik testler konusunda ayrıntılı genetik danışmanlık sağlayın.

4. Hasta eğitimi: Nörotoksik ilaçlardan kaçınılması ve aşırı yorgunluktan sakınılması konusunda tavsiyeler verin; hastalığa bağlı kaygı ile başa çıkmak için psikolojik destek sağlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, Yunnan Geleneksel Çin Tıbbı Eyalet Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (onay numarası: YYLW-2026-006). Kayıt öncesinde probanddan ve katılan tüm aile üyelerinden yazılı bilgilendirilmiş onam alınmıştır.

1. Katılımcı hazırlığı ve klinik değerlendirme

  1. Yazılı bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra proband ve mevcut aile üyeleri çalışmaya dahil edildi.
  2. Standart bir anket kullanılarak ayrıntılı demografik bilgiler, hastalık öyküsü, aile öyküsü ve akrabalık bilgileri toplandı.
  3. Kas gücü, kas tonusu, tendon refleksleri, duyusal fonksiyon, koordinasyon, yürüyüş ve kranial sinir fonksiyonu değerlendirmelerini içeren sistematik bir nörolojik muayene yapıldı.
  4. Tüm ana kas gruplarının gücü, Medical Research Council (MRC) skalası kullanılarak belgelendi.
  5. Katılımcıdan yazılı onam alındıktan sonra ekstremitelerin klinik fotoğrafları çekildi.
    NOT: Tanısal tutarlılığı sağlamak amacıyla tüm klinik değerlendirmeler, nöromüsküler hastalıklar konusunda uzmanlaşmış, kurul onaylı bir nörolog tarafından gerçekleştirildi.

2. Nörofizyolojik inceleme

  1. Hasta hazırlığı
    1. Katılımcıya, incelemeden en az 2 saat önce kafeinden ve ağır egzersizden kaçınması talimatı verilmiştir.
    2. Muayene odası sıcaklığı 24–26ºC düzeyinde tutulmuş ve gerektiğinde bir ısıtıcı lamba kullanılarak ekstremite cilt sıcaklığı 32ºC'nin üzerinde tutulmuştur.
    3. Katılımcı, sessiz ve loş bir muayene odasında sırt üstü (supine) pozisyona getirilmiştir.
  2. Sinir iletim hızı çalışması
    1. Empedansı azaltmak için elektrot bölgelerindeki cilt, alkollü pamuklar ile temizlenmiştir.
    2. Yüzey kayıt elektrotları hedef kasın motor noktası üzerine yerleştirilmiş ve referans elektrodu ilgili tendonun distal kısmına konumlandırılmıştır.
    3. Stimülasyon elektrotları, sinirin seyri boyunca standart anatomik işaretlere yerleştirilmiştir.
    4. Bilateral median, ulnar, tibial ve common peroneal sinirlerde motor sinir iletim çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Distal latans, bileşik kas aksiyon potansiyeli (CMAP) amplitüdü ve motor iletim hızı kaydedilmiştir.
    5. Bilateral median, ulnar, superficial peroneal ve sural sinirlerde uygun şekilde ortodromik veya antidromik teknikler kullanılarak duyusal sinir iletim çalışmaları yapılmıştır. Duyusal sinir aksiyon potansiyeli (SNAP) amplitüdü ve duyusal iletim hızı kaydedilmiştir.
    6. Filtre bant genişliği motor çalışmalar için 20 Hz–10 kHz, duyusal çalışmalar için ise 20 Hz–2 kHz olarak ayarlanmıştır. Motor ve duyusal çalışmalar için sırasıyla 2 ms/division ve 1 ms/division tarama hızları kullanılmıştır.
  3. İğne elektromiyografisi
    1. Her bir hedef kasa steril koşullar altında konsentrik bir iğne elektrot yerleştirilmiştir.
    2. Pozitif keskin dalgalar, fibrilasyon potansiyelleri ve fasikülasyon potansiyelleri dahil olmak üzere istirahat halindeki spontan aktivite değerlendirilmiştir.
    3. Hafif gönüllü kontraksiyon sırasında motor ünite potansiyelinin (MUP) morfolojisi değerlendirilmiştir. Süre, amplitüd ve polifazi ölçülmüştür.
    4. Maksimum gönüllü kontraksiyon sırasında recruitman paterni değerlendirilmiştir.
    5. Tibialis anterior, medial gastrocnemius, abductor hallucis, first dorsal interosseous, deltoid ve rectus femoris kasları bilateral olarak incelenmiştir. Sternocleidomastoid ve T10 paraspinall kaslar da incelenmiştir.
      NOT: Tüm nörofizyolojik incelemeler deneyimli bir elektromiyograf tarafından gerçekleştirilmiştir. Kayıt kalitesini sağlamak için cilt empedansı 5 kΩ'nun altında tutulmuştur. Tüm dalga formlarının tekrarlanabilirliği, en az iki ardışık stimülasyonda doğrulanmıştır.

3. Periferik kan örneği toplama ve genomik DNA ekstraksiyonu

  1. Her katılımcıdan etilendiamintetraasetik asit (EDTA) antikoagülan tüpüne periferik venöz kan (3–5 mL) toplandı.
  2. Kan örnekleri toplandıktan hemen sonra 4ºC'de saklandı ve 24 saat içinde işlendi.
  3. Genomik DNA, bir genomik DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak periferik kan lökositlerinden izole edildi.
  4. DNA konsantrasyonu ve saflığı bir spektrofotometre kullanılarak ölçüldü.
  5. DNA bütünlüğü %1 agaroza jel elektroforezi ile değerlendirildi.
    NOT: A260/A280 oranı 1,8–2,0 ve konsantrasyonu ≥50 ng/µL olan DNA örnekleri kabul edildi. Kalite kontrol kriterlerini karşılamayan örnekler yeniden ekstrakte edildi.

4. Tüm ekzom dizileme

  1. Kütüphane hazırlığı
    1. Genomik DNA (1 μg), sonikasyon yoluyla 150–200 bp uzunluğundaki fragmanlara ayrılmıştır.
    2. Uç onarımı, A-kuyruk ekleme ve adaptör ligasyonu, kütüphane hazırlama kiti protokolüne göre gerçekleştirilmiştir.
    3. Eksonik bölgeler, üretici protokolüne uygun olarak bir insan tüm ekzom yakalama kiti kullanılarak zenginleştirilmiştir.
    4. Yakalanan kütüphane, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılarak amplifiye edilmiş ve elde edilen ürünler saflaştırılmıştır.
  2. Sekanslama
    1. Paired-end sekanslama, 150 bp okuma uzunluğu kullanılarak yüksek kapasiteli bir sekanslama platformunda gerçekleştirilmiştir.
    2. Hedef ekzom boyunca ≥100 Χ ortalama sekanslama derinliği hedeflenmiş; hedef bazların ≥98%'sinin ≥10Χ derinlikte ve ≥95%'inin ≥20Χ derinlikte kapsanması sağlanmıştır.
    3. NOT: Sekanslama öncesinde ≥2 nM kütüphane konsantrasyonu ve 250–350 bp insert boyut dağılımı doğrulanmıştır. Veri kalitesini teyit etmek için sekanslama sonrası Q30 skorları, GC içeriği ve kapsama derinliği değerlendirilmiştir.

5. Biyoenformatik analiz ve varyant filtreleme

  1. Baz çağırma, kalite değerlendirmesi ve adaptör kırpama dahil olmak üzere primer veri analizi gerçekleştirildi.
  2. Temiz okumalar, sekans hizalama yazılımı kullanılarak insan referans genomu GRCh37 (hg19) ile hizalandı.
  3. Tek nükleotit varyantlarını (SNV'ler) ve küçük insersiyon ve delesyonları (indeller) belirlemek için varyant çağırma işlemi yapıldı.
  4. Varyantlar; Genome Aggregation Database (gnomAD), 1000 Genomes Project, ClinVar ve Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) dahil olmak üzere kamuya açık veri tabanları kullanılarak açıklandı.
  5. Varyantlar, aşağıdaki kriterler kullanılarak filtrelendi ve önceliklendirildi.
    1. Ekzonik veya kanonik ekleme-çıkarma bölgesi (splice-site) bölgelerinde yer alan varyantlar tutuldu.
    2. Popülasyon veri tabanlarında minör alel frekansı (MAF) >0.01 olan yaygın varyantlar hariç tutuldu.
    3. Zararlı olduğu öngörülen nonsense, frameshift, splice-site ve missense varyantlara öncelik verildi.
    4. Aday genler, bilinen nöromüsküler hastalık gen listeleriyle karşılaştırıldı. Otozomal resesif kalıtım modeliyle uyumlu olan genlere daha fazla öncelik verildi.
    5. Varyant isimlendirmesi için referans sekans olarak VRK1 transkripti NM_003384.3 kullanıldı.

6. Sanger dizileme doğrulaması ve ailesel segregasyon analizi

  1. Aday varyant bölgesini çevreleyen PCR primerleri, primer tasarım yazılımı kullanılarak tasarlanmıştır.
  2. Her bir aile üyesinin DNA'sındaki hedef genomik bölge, PCR kullanılarak amplifiye edilmiştir.
  3. PCR ürünleri saflaştırılmış ve çift yönlü Sanger dizilemesi gerçekleştirilmiştir.
  4. Dizileme kromatogramları, dizi hizalama yazılımı kullanılarak referans dizi ile hizalanmıştır.
  5. Her bir aile üyesinin genotipi doğrulanmış ve varyantın soy ağacındaki hastalık fenotipi ile birlikte kalıtımı (kozegregasyonu) değerlendirilmiştir.
    NOT: Arka plan gürültüsü içermeyen, temiz ve tek pikli kromatogramlar onaylanmıştır. Belirsiz sonuçlar veren örnekler için PCR amplifikasyonu ve dizileme işlemleri tekrarlanmıştır.

7. Varyant patojenite sınıflandırması ve tanısal doğrulama

  1. Doğrulanmış varyant, Amerikan Tıbbi Genetik ve Genomik Koleji'nin (ACMG) 2015 standartlarına ve kılavuzlarına göre sınıflandırıldı.
  2. Nihai moleküler tanıyı koymak için klinik fenotipler, nörofizyolojik bulgular, genetik test sonuçları ve ailesel segregasyon verileri entegre edildi.
  3. Aileye tekrarlama riski, üreme seçenekleri ve uzun süreli prognoz hakkında genetik danışmanlık verildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Genetik bulgular

Probanda WES gerçekleştirilmiş olup, ortalama hedef bölge derinliği 112 × olarak belirlenmiştir; hedef bazların %98,7'si ≥10 × derinlikte ve %96,2'si ≥20 × derinlikte kapsanmıştır. Varyant filtreleme ve önceliklendirme sonrası, VRK1 geninde (transkript NM_003384.3, genom derlemesi GRCh37/hg19) homozigot bir nonsense varyant olan c.1124G>A (p.Trp375Ter), aday patojenik varyant olarak tanımlanmıştır.

Sanger dizileme, proba...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, yetişkin başlangıçlı dHMN olan Çinli akraba evliliği yapmış bir ailede homozigot VRK1 c.1124G>A patojenik varyantını tanımlamak için klinik fenotipleme, nörofizyolojik inceleme, WES ve ailesel segregasyon analizini birleştiren entegre birleşimli bir tanısal iş akışı uyguladık. Bu soy ağacı, VRK1 ile ilişkili bozuklukların fenotipik spektrumunu genişletmekte ve Çin popülasyonunda dHMN tanısı için referans veriler sağlamaktadır.

Tanısal iş akışı için metodoloji...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması bulunmamaktadır.

Teşekkürler

Bu çalışma, 2026 Ulusal TCM Avantajlı Uzmanlık (Ensefalopati) Yapılandırma Projesi (Yuncaishe [2025] No. 219) ve Yunnan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Departmanı Temel Araştırma Programı (Hibe No. 202401AZ070001-057) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifler &Sarf Malzemeleri
EDTA antikoagülanlı vakumlu kan toplama tüpü (5 mL)BD Biosciences (Becton, Dickinson and Company)367861
Periferik kan için genomik DNA ekstraksiyon kiti (spin kolon formatında)QIAGEN; QIAamp DNA Blood Mini Kit51106
Multipleks Ligasyona Bağımlı Prob Amplifikasyonu (MLPA) KitiMRC HollandHedef gen için özel prob seti
PCR Amplifikasyon Kiti (Taq polimeraz, dNTP'ler ve reaksiyon tamponu dahil)Takara Bio; LA Taq PCR KitiRR002A
Agaroz tozu (elektroforez saflığında)Biowest111860
Sanger Dizileme Reaksiyon Kiti (BigDye Terminator v3.1)Thermo Fisher Scientific; Applied Biosystems4337455
Sekanslama Ürünü Saflaştırma KitiThermo Fisher Scientific; BigDye XTerminator Purification Kiti4376484
TAE elektroforez tamponuTicari kalite / laboratuvar hazırlamalı—
PCR 8'li şerit tüpler, santrifüj tüpleri ve diğer rutin sarf malzemeleriAxygen—
Enstrümanlar &Ekipman ve Gereçler
Kapiler elektroforez genetik analizörü (Sanger dizileme platformu)Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific3500 Dx
Gradyan termal döngüleyici (PCR cihazı)Bio-Rad LaboratoriesC1000 Touch
Ultramikro spektrofotometre (nükleik asit miktar tayini için)NanoDrop One, Thermo Fisher ScientificND-ONE-W
Yatay agaroz jel elektroforez sistemiBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.DYY-6C
Jel dokümantasyon ve analiz sistemiBio-Rad LaboratoriesGelDoc Go
Masaüstü yüksek hızlı soğutmalı santrifüjEppendorf5424 R
Sinir ileti hızı / elektromiyografi (SİH/EMG) sistemiNatus MedicalKilit Nokta 9033A07
Sabit sıcaklıklı metal banyo / su banyosuDLAB Scientific—
Analiz Yazılımı
MLPA veri analiz yazılımı (Coffalyser.Net)MRC Hollandv140
Sanger dizileme pik analizi ve sekans hizalama yazılımıApplied Biosystems, Thermo Fisher ScientificSekanslama Analizi v6.0
Primer tasarım yazılımıPremier BiosoftPrimer Premier 6
Dizileme hizalama ve varyant yorumlama araçlarıNCBI BLAST (çevrimiçi), ClinVar veri tabanı—

Kaynaklar

  1. Tazir M, Nouioua S. Distal hereditary motor neuropathies. Rev Neurol (Paris). 2024;180(10):1031–6.
  2. Frasquet M, Sevilla T. Hereditary motor neuropathies. Curr Opin Neurol. 2022;35(5):562–70.
  3. Rossor AM. Broadening the genetic spectrum of distal hereditary motor neuropathy. Eur J Neurol. 2021;28(4):1104–5.
  4. Devic P, Petiot P. Les amyotrophies spinales distales [distal hereditary motor neuropathy]. Rev Neurol (Paris). 2011;167(11):781–90.
  5. Dick KJ, et al. Refinement of the locus for distal hereditary motor neuronopathy VII (dHMN-VII) and exclusion of candidate genes. Genome. 2008;51(11):959–62.
  6. Lazo PA. Nuclear functions regulated by the VRK1 kinase. Nucleus. 2024;15(1):2353249. doi:10.1080/19491034.2024.2353249.
  7. El-Bazzal L, et al. Loss of Cajal bodies in motor neurons from patients with novel mutations in VRK1. Hum Mol Genet. 2019;28(14):2378–94.
  8. Feng SY, Li LY, Feng SM, Zou ZY. A novel VRK1 mutation associated with recessive distal hereditary motor neuropathy. Ann Clin Transl Neurol. 2019;6(2):401–5.
  9. Marcos AT, et al. VRK1 (Y213H) homozygous mutant impairs Cajal bodies in a hereditary case of distal motor neuropathy. Ann Clin Transl Neurol. 2020;7(5):808–18.
  10. Lazo PA, Morejón-García P. VRK1 variants at the cross road of Cajal body neuropathogenic mechanisms in distal neuropathies and motor neuron diseases. Neurobiol Dis. 2023;183:106172. doi:10.1016/j.nbd.2023.106172.
  11. Capponi S, et al. HSPB1 and HSPB8 in inherited neuropathies: study of an Italian cohort of dHMN and CMT2 patients. J Peripher Nerv Syst. 2011;16(4):287–94.
  12. Luigetti M, et al. A novel HSPB1 mutation in an Italian patient with CMT2/dHMN phenotype. J Neurol Sci. 2010;298(1–2):114–17.
  13. Curthoys IS. A critical review of the neurophysiological evidence underlying clinical vestibular testing using sound, vibration and galvanic stimuli. Clin Neurophysiol. 2010;121(2):132–44.
  14. Simon AJ, et al. Whole exome sequencing (WES) approach for diagnosing primary immunodeficiencies (PIDs) in a highly consanguineous community. Clin Immunol. 2020;214:108376. doi:10.1016/j.clim.2020.108376.
  15. Miller DT, et al. ACMG SF v3.2 list for reporting of secondary findings in clinical exome and genome sequencing: a policy statement of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Genet Med. 2023;25(8):100866. doi:10.1016/j.gim.2023.100866.
  16. Tan L, et al. A 9-month-old Chinese patient with Gabriele-de Vries syndrome due to novel germline mutation in the YY1 gene. Mol Genet Genomic Med. 2021;9(2):e1582. doi:10.1002/mgg3.1582.
  17. Xu K, et al. Novel VRK1 variants and a founder effect in axonal polyneuropathy. Neurol Genet. 2026;12(3):e200381. doi:10.1212/NXG.0000000000200381.
  18. Campos-Díaz A, et al. Pathogenic effects of Leu200Pro and Arg387His VRK1 protein variants on phosphorylation targets and H4K16 acetylation in distal hereditary motor neuropathy. J Mol Med (Berl). 2024;102(6):801–17.
  19. Greenbaum L, et al. Identification of a homozygous VRK1 mutation in two patients with adult-onset distal hereditary motor neuropathy. Muscle Nerve. 2020;61(3):395–400.
  20. Bos R, et al. Altered action potential waveform and shorter axonal initial segment in hiPSC-derived motor neurons with mutations in VRK1. Neurobiol Dis. 2022;164:105609. doi:10.1016/j.nbd.2021.105609.
  21. Martín-Doncel E, Rojas AM, Cantarero L, Lazo PA. VRK1 functional insufficiency due to alterations in protein stability or kinase activity of human VRK1 pathogenic variants implicated in neuromotor syndromes. Sci Rep. 2019;9(1):13381. doi:10.1038/s41598-019-49821-7.
  22. Vinograd-Byk H, Renbaum P, Levy-Lahad E. Vrk1 partial knockdown in mice results in reduced brain weight and mild motor dysfunction, and indicates neuronal VRK1 target pathways. Sci Rep. 2018;8(1):11265. doi:10.1038/s41598-018-29215-x.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

VRK1 GeniHomozigot VaryantPeriferik NöropatiTüm Ekzom DizilemeSanger DizilemeOtozomal Resesif KalıtımElektrofizyolojik MuayeneBileşik Kas Aksiyon PotansiyeliPatojenik Varyant
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.