Yöntem makalesi

Yüksek Kapasiteli Antiviral Tarama için İşaretleyici Kullanmayan, Gerçek Zamanlı Empedans Tabanlı Bir Yöntem

0 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/72539

⸱

3 Eylül 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vanderbilt Center for Antibody Therapeutics, Vanderbilt University Medical Center, 2Agilent Technologies, Inc., 11011 N Torry Pines, 3Department of Pathology, Microbiology and Immunology, 4Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center

Bu makalede

Özet

Empedans tabanlı gerçek zamanlı hücre analizi (RTCA) yaklaşımı, virüs kaynaklı sitopatik etkilerin gerçek zamanlı ve etiketsiz olarak miktarının belirlenmesine olanak tanıyarak, entegre ve yazılım destekli bir analiz iş akışı aracılığıyla antiviral bileşiklerin ve monoklonal antikorların değerlendirilmesi için hızlı bir yöntem sunar.

Özet

Empedans tabanlı teknolojiler, hücre kültürü tek tabakalarında sitopatik etkileri (CPE) nicelleştirmek için geleneksel son nokta veya görsel olarak subjektif analizlerin sınırlamalarını aşan, güçlü ve objektif bir yol sağlar. Sitolitik virüsler genellikle enfekte kültürlerde belirgin morfolojik değişikliklere ve hücre ölümüne neden olur; bu durum, hücre adezyonu, morfolojisi ve canlılığındaki değişiklikleri yansıtan empedans ölçümlerini, viral enfeksiyon ve ilerlemesinin hassas ve dinamik bir göstergesi haline getirir. Sonuç olarak, empedans tabanlı okumalar, antiviral müdahalelerin koruyucu etkilerini değerlendirmek için güçlü ve verimli bir yaklaşım sunar. Bu çalışma, virüs kaynaklı CPE'yi sürekli olarak izlemek için gelişmiş empedans ölçüm sistemlerinden yararlanan, gerçek zamanlı ve etiketsiz bir tarama platformu sunmaktadır. Bu yaklaşım, ek etiketleme veya boyama basamaklarına gerek kalmadan, hem küçük moleküllü ilaçlar hem de monoklonal antikorlar için antiviral etkinliğin hızlı ve kantitatif değerlendirmesine olanak tanır. Protokol, hücre ekimi ve viral enfeksiyondan veri toplama ve analize kadar tüm analiz iş akışını detaylandırmaktadır. Ayrıca, özellikle viroloji uygulamaları için özelleştirilmiş sistem entegreli yazılım, veri işleme ve yorumlamayı optimize ederek monoklonal antikor nötralizasyon potansiyelinin ve antiviral bileşik aktivitesinin belirlenmesini kolaylaştırır.

Giriş

Viral bir salgın tehdidiyle karşılaşıldığında, aşılar ve antiviral terapötikler, viral yayılımı sınırlandırmak ve enfekte hastaları tedavi etmek için temel stratejileri temsil eder1. Aşılar, bağışıklık sistemini patojenleri tanıyacak şekilde hazırlayarak enfeksiyonu önler ve proaktif, uzun süreli koruma sağlar. Antiviral terapötikler, ilacın modalitesine ve tasarımına bağlı olarak çeşitli kullanım alanlarına sahiptir. Aşılara benzer şekilde, monoklonal antikorlar proaktif ve sürdürülebilir koruma (haftalarca veya birçok ay boyunca) sağlayabilir ve ayrıca maruziyet sonrası kontrol için bir araç olarak kullanılabilir. Hem monoklonal antikorlar hem de antiviral küçük molekül terapötikler, viral bileşenleri doğrudan hedefleyerek veya inhibe ederek yerleşmiş enfeksiyonları tedavi etmek için kullanılır; böylece hastalığın şiddetini azaltarak reaktif ve kısa süreli bir müdahale görevi görürler.

Biyolojik sistemlerde antiviral aktivitenin fonksiyonel olarak değerlendirilmesi için kullanılan geleneksel yaklaşım, plak azaltma nötralizasyon testlerinde (PRNT) plak oluşumundaki azalmaları ve odakların miktarını belirleyen virüs azaltma nötralizasyon testidir (VRNT). aracılığıyla odak azalma nötralizasyon testi (FRNT) ile immün boyama veya hücre canlılığı tabanlı analizler kullanılarak sitopatik etkiler (CPE). PRNT, geniş bir viral enfeksiyon yelpazesine karşı antiviral ajanların inhibitör aktivitesini belirlemek için altın standart fenotipik yöntem olarak kabul edilmektedir.2Ancak PRNT zaman alıcı ve yoğun emek gerektiren bir yöntemdir ve özellikle uzun süreli inkübasyon sırasında plak aşırı büyümesi veya füzyonu meydana geldiğinde sonuçların yorumlanması subjektif olabilir. Analiz okumalarının objektifliği, virüse özgü antijenlerin veya raporlayıcı gen ekspresyonunun tespitine dayanan FRNT kullanılarak artırılabilir. Ancak bu yaklaşım, yüksek kaliteli antikorların veya tespit enzimlerinin mevcudiyeti ve performansıyla sınırlı olabilir. Hücre canlılığının değerlendirilmesi ve CPE'nin belirli yönlerinin ölçümü için birçok reaktif ve analiz protokolü iyi tanımlanmış olup yaygın olarak kullanılmaktadır. Canlı hücrelerdeki mitokondriyal dehidrogenazlar tarafından mono-tetrazolyum tuzu MTT kolorimetrik reaktifinin (3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazolyum bromür) enzimatik indirgenmesi, renkli formazan ürünü tarafından oluşturulan ve miktarı belirlenebilir bir kolorimetrik sinyal üretir. Canlılık analiz reaktifi (hücreleri lizize eden ve substrat lüsiferini oksilüsiferine dönüştüren lüsiferaz katalizli bir reaksiyonu tetikleyen hücre içi ATP'yi serbest bırakan), homojen bir lüminesans analizidir. Bu tür hücre canlılık analizleri, antiviral ajan taraması sırasında CPE'deki azalmayı nicelendirmek için kullanılabilir.3Ancak bu yöntemler ayrıca birden fazla yıkama ve boyama adımı gerektirir ve PRNT ve FRNT analizleri gibi uç nokta analizleridir. Sonuç olarak, antiviral analiz suboptimal bir zaman noktasında sonlandırılırsa, viral enfeksiyon üzerinde gecikmiş etkiler gösteren kısmen etkili antiviral ajanlar gözden kaçırılabilir. Bu nedenle, viral enfeksiyonlara karşı hücresel yanıtların gerçek zamanlı izlenmesine olanak tanıyan otomatik, orta ila yüksek kapasiteli bir analize güçlü bir ihtiyaç vardır.

Gerçek zamanlı hücre analizi (RTCA) sistemleri, etiketsiz ve noninvaziv empedans tabanlı bir okuma yöntemi aracılığıyla, permisif hücre modellerinde CPE gelişiminin ve antiviral yanıtların sürekli olarak izlenmesini sağlar. Virüs kaynaklı CPE, sadece hücre ölümünü değil, aynı zamanda hücresel morfoloji ve adezyondaki değişiklikleri de içerir ve bunların tamamı elektriksel empedanstaki değişimlerle hassas bir şekilde tespit edilebilir4,5. Bu empedans ölçümleri, özel bir 96 kuyucuklu hücre kültürü plağına yerleştirilmiş altın mikroelektrot sensörleri kullanılarak elde edilir; bu da etiketlere veya raporlayıcı gen ekspresyonuna ihtiyaç duymadan dinamik hücresel yanıtların kantitatif değerlendirmesine olanak tanır. RTCA teknolojisi, birçok farklı aileden virüslerle enfekte edilmiş çeşitli hücre modellerinde CPE tespiti ve antikor nötralize edici aktivitesinin değerlendirilmesi için yaygın olarak rapor edilmiştir6–10.

Burada, gerçek zamanlı ve etiketsiz empedans tabanlı bu yöntemin kritik adımları in vitro antiviral analizler tanımlandı. Bu yaklaşım, adenovirüs 5le enfekte edilmiş HEK293A hücrelerinde antiviral bileşiklerin taramasını ve Vero CCL-81 hücrelerinde Lassa glikoproteinini eksprese eden replikasyon yeteneğine sahip rekombinant veziküler stomatit virüsü (rVSV-LASV(Lin IV)) kullanılarak nötralize edici antikorların değerlendirilmesini içeren önceki çalışmalardan yararlanılarak oluşturulmuştur.11Tüm bu deneyler, 6 adede kadar çalıştırılmasını destekleyen bir RTCA MP sistemi üzerinde gerçekleştirilmiştir.× 96 kuyucuklu plakaları eş zamanlı olarak. Bu çalışmanın amacı, empedans tabanlı antiviral tarama için bir temel oluşturmaktı. Burada açıklanan protokol kullanılarak optimal analiz koşulları belirlendikten sonra, yöntem geniş bir virüs-hücre modeli yelpazesine kolaylıkla uyarlanabilir.

Protokol

Kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Materyaller Tablosunda listelenmiştir.

1. Permisif hücre kültürü ve pasajlama

NOT: Bu protokolde, antikor nötralizasyonu için Vero CCL-81 hücreleri, antiviral bileşik taraması için ise HEK293A hücreleri kullanılır. Deneyler arasındaki varyasyonu azaltmak için, analizde kullanılmak üzere aynı pasajdaki permisif hücrelerden bir hücre bankası oluşturulması şiddetle tavsiye edilir.

  1. Hücre büyüme ortamını (%10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1% penisilin-streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)) kullanmadan önce 37°C'lik bir su banyosunda ön ısıtmaya tabi tutun.
  2. Kriyoprezerve permisif hücrelerin bulunduğu bir flakonu, sadece küçük bir buz kristali parçası kalana kadar 37°C'lik su banyosunda çözdürün; kapak kısmını su banyosuna daldırmayın. 
  3. Canlandırılmış hücreleri içeren flakonu, dış yüzeyini %70 etanol ile sildikten sonra biyogüvenlik kabinine (BSC) yerleştirin.
  4. Hücreleri nazikçe yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın ve hücrelerin üzerine damla damla 9 mL ılık büyüme ortamı ekleyin. Nazikçe karıştırın.
  5. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında (RT), 200 × g hızda 5 dk boyunca santrifüjleyin.
  6. Resüspande edilen hücreleri, 5 mL ön ısıtılmış büyüme ortamı içinde yeni bir T-25 flask'a aktarın.
  7. Bir sonraki hücre pasajına kadar hücreleri, %5 CO2 içeren 37°C'lik bir inkübatörde %80%–90% konfluense ulaşana kadar büyütün. 
  8. Hücreleri pasajlayın.
    1. Ortamı aspire edin ve kalıntı büyüme ortamını uzaklaştırmak için hücre monokatmanını 3 mL 1× kalsiyum ve magnezyum içermeyen Fosfat Tamponlu Tuz Çözeltisi (PBS) ile iki kez nazikçe yıkayın.
    2. Hücreleri kaplayacak şekilde flask'a 2 mL %0.25 trypsin-EDTA ekleyin.
    3. 37°C'de 2–5 dk inkübasyondan sonra, 5 kat hacimde ön ısıtılmış büyüme ortamı ekleyerek tripsini nötralize edin.
    4. Hücre süspansiyonunu flask duvarına karşı nazikçe pipetleyerek hücreleri resüspande edin.
    5. Hücreleri, taze ortam ile istenen hücre ekim yoğunluğunda veya ayırma oranında ekin. 
      NOT: İstenen hücre ekim yoğunluğu; hücre büyüme hızı, pasaj sıklığı ve pasajlama anındaki hedef konfluense göre ampirik olarak belirlenir. Örneğin, Vero CCL-81 hücrelerinin minimum 0.4 × 104 hücre/cm2 yoğunlukta ekilmesi, hücrelerin %90% konfluense ulaşmadan önce her 3 günde bir pasajlanmasına olanak tanır.

2. Antiviral ajan taraması

NOT: Şekil 1, empedans tabanlı antiviral tarama analizinin iş akışını göstermektedir. Kısaca, permisif hücreler mikroelektrot entegreli 96 kuyucuklu mikroplakalara ekilir ve analizden önce hücre performansı yaklaşık 24 saat boyunca izlenir. Antikor nötralizasyon testleri için, sabit bir enfeksiyon çokluğu (MOI) düzeyindeki virüsler antikorlarla karıştırılır ve hücrelere eklenmeden önce 1 saat boyunca ön inkübasyona tabi tutulur. Buna karşılık, antiviral bileşik taraması için, sabit MOI düzeyindeki virüsler ve bileşikler hücrelere eş zamanlı olarak eklenir. Virüs kaynaklı CPE, empedans tabanlı okumalar kullanılarak sürekli olarak izlenir ve veri analizi ya analiz sırasında ya da analiz tamamlandıktan sonra gerçekleştirilebilir.

  1. Gün 0: Plaka arka planını ölçün ve permisif hücreleri ekleyin
    1. Bir deneye başlamak için cihaz yazılımını açın (RTCA Pro) ve analiz için istenen beşiği seçin. Ardından, şunları seçin: Viroloji deneye başlamadan önce modül.
    2. İlgili tüm notları şuraya girin: Deney Notları sekme (örneğin, Deney Adı, Cihaz SN, Cihaz Tipi, veya diğer ilgili detaylar). Bu alanlar isteğe bağlıdır ve uygulanabilir değilse boş bırakılabilir.
    3. şuraya gidin: Düzen deneyde kullanılan kuyucukları sekmeleyin ve tanımlayın. Belirli kuyucuklar kullanılmayacaksa, kullanılmayan kuyucukları seçin, plaka düzeni arayüzünde sağ tıklayın ve şunları seçin Kuyu(lar)ı Kapatın bunları analiz dışı bırakmak için açılır menüden seçin.
    4. Mikroelektrot entegreli 96 kuyucuklu mikroplaka arka planının ölçümü
      1. Dağıtın 50 µL baloncuk oluşumunu en aza indirmek için çok kanallı bir pipetle ters pipetleme modunda, plakanın her kuyucuğuna assay ortamı ekleyin.
        NOT: Analiz hassasiyeti üzerindeki etkileşimi en aza indirmek ve tedavi etkinliğinin doğru değerlendirilmesini sağlamak için, tarama öncesinde analiz ortamı seçimi optimize edilmelidir. Örneğin, antikor nötralizasyon analizleri %2 FBS ve %1 penisilin-streptomisin içeren DMEM'de gerçekleştirilirken, antiviral bileşik tarama analizlerinde hücre büyüme ortamı olan %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin içeren DMEM kullanılmıştır.
      2. Plakayı, cihazın içinde bulunan plaka yuvasına yerleştirin 37 °C %5 CO2'li inkübatör2Plakanın, A1 kuyucuğu belirtildiği şekilde konumlandırılarak doğru yönde yerleştirildiğinden emin olun. Ardından, herhangi bir hata bildirimi olup olmadığını kontrol etmek için Mesaj sekmesine bakın.
        NOT: Plaka her seferinde yuvaya yerleştirildiğinde, "Plate scanned. Connections okay" mesajının görüntülendiğini doğrulayın. Bir hata oluşursa, plakayı çıkarın ve yuvaya yeniden yerleştirin.
      3. Şuraya gidin: Program sekme; Plaka arka plan ölçümü için gerekli bir adım olduğundan, Adım 1 varsayılan olarak görünür. Şuna tıklayın: Başlat kuyucuklardan kayıt başlatma düğmesi. Adım, tek bir arka plan empedans ölçümü kaydedildikten sonra otomatik olarak sona erer.
        NOT: Bu arka plan adımı her deneyden önce gerçekleştirilmelidir. Deneyde kullanılan tüm kuyucuklar yalnızca assay ortamı içermelidir (yani hücre ekimi öncesinde).
    5. Mikroelektrot entegreli 96 kuyucuklu plakaya permisif hücre ekimi
      1. T25 flasktaki permisif hücreleri, permisif hücre pasajlama bölümünde açıklanan adımları izleyerek tripsinizleyin.
      2. Deney ortamında yeniden süspanse edilen hücreleri sayın ve aşağıdaki hesaplamaları yapın:
        1. Canlı hücre yoğunluğunu kullanarak süspansiyondaki toplam canlı hücre sayısını hesaplayın: Toplam canlı hücre sayısı = canlı hücre yoğunluğu × süspansiyon hacmi
        2. Hücre süspansiyonunu nihai bir yoğunluğa (örneğin, 0,30–0,35) ayarlayın × 106 Vero CCL-81 için mL başına hücre, yaklaşık olarak mL başına 15.000–18.000 hücreye eşdeğerdir 50 µLveya 0,12 × 106 HEK293A için mL başına hücre, her birine karşılık gelen 6.000 hücre şeklinde 50 µL).
          NOT: Bu ekim yoğunluklarının, her bir virüs-hücre modeli için önceden optimal olduğu belirlenmiştir. Çok fazla veya çok az hücre kullanımı analiz hassasiyetini etkileyebileceği için uygun hücre ekim yoğunluğu esastır.
      3. ...içeren mikroplakayı çıkarın 50 µL analiz ortamını cihazdan alın ve hücre ekimi için BSC'ye aktarın.
      4. Dağıtın 50 µL kabarcık oluşumunu en aza indirmek için çok kanallı pipetin ters pipetleme modu kullanılarak, plakadaki her kuyucuğa hücre süspansiyonunun, her kuyucuğun nihai hacmi şuna ulaşacak şekilde eklenmesi 100 µL.
    6. Hücre eklemesinden sonra, hücrelerin her kuyucuğun tabanına eşit şekilde dağılmasını sağlamak için plakayı biyogüvenlik kabininde oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
    7. Plakayı, cihazın içinde bulunan plaka yuvasına geri yerleştirin 37 °C %5 CO2'li inkübatör2.
      NOT: Birden fazla plaka kullanılıyorsa, her plakayı açıkça etiketleyin ve plakanın, arka plan ölçümü sırasında kullanılan aynı yuvaya yerleştirildiğinden emin olun.
    8. Şuraya gidin: Düzen sekmesini açın ve ...'ı/i açın Hücre alt sekme. Uygun kuyucukları seçin, permisif hücreyi girin İsim ve Sayıve tıklayın Uygulayın bilgileri kaydetmek için. Hücre bilgileri deneyin herhangi bir aşamasında girilebilir veya güncellenebilir.
    9. Adım 2'yi şuraya ekleyin Program varsayılan kayıt ayarlarını (100 süpürme ve 15 dakikalık aralık) kullanarak sekmeye tıklayın, ardından şuna tıklayın Başla hücre yapışması ve proliferasyonunun gece boyunca sürekli izlenmesine başlamak için.
      NOT: Bu adım, virüs inokülasyonu öncesinde bir hücre kalite kontrol (KK) önlemi işlevi görür. Hücre İndeksi (Hİ), hücre tutunmasını ve proliferasyonunu yansıttığından, ekim sonrası 18–24 saatlik süre boyunca elde edilen Hİ değerleri temel bir KK metriği olarak kullanılır. Deneyler arasında tekrarlanabilir hücre davranışı, optimal analiz tekrarlanabilirliği için esastır. Özellikle, hem Hİ genliği hem de kinetik profiller hücre tipine özgüdür. Örneğin, gece boyu kültürlemeden sonra, kuyucuk başına 18.000 hücre olarak ekilen sağlıklı Vero CCL-81 hücreleri tipik olarak 6–8 arasında bir Hücre İndeksi sergilerken, kuyucuk başına 6.000 hücre olarak ekilen sağlıklı HEK293A hücreleri genellikle 0,8–1,2 arasında bir Hücre İndeksi sergiler.
  2. 1. Gün: Empedans tabanlı antiviral ajan taraması
    NOT: Tarama deneyi gerçekleştirilmeden önce, optimal çalışma dilüsyonunu belirlemek için virüs uygun şekilde titre edilmelidir. Bu adım, istenen deney süresi gibi kullanıcı tarafından tanımlanan gereksinimleri karşılarken, güçlü ve tekrarlanabilir deney performansı sağlayan bir virüs konsantrasyonu belirler. Örneğin, antikor nötralizasyon protokolünde11nötralizasyon analizi için 0,01'lik bir enfeksiyon multiplicitiesi (MOI) seçilmiştir; çünkü bu değer, inokülasyon sonrası 40 saat içinde tam (%100) CPE oluşturmuştur. Empedans tabanlı analizde, tam CPE, Hücre İndeksi veya Normalize Edilmiş Hücre İndeksi'nin sıfıra düşmesiyle belirtilir. Antiviral bileşik taraması sırasında 1'lik bir MOI kullanılmış ve inokülasyon sonrası 70 saat içinde %100 CPE gözlemlenmiştir. Viral titrasyon protokolünde, daha önceki bir raporda açıklanan yerleşik prosedürler izlenmiştir.12Analizde enfeksiyöz virüsler kullanılıyorsa, tüm geçerli güvenlik önlemlerine uyulduğundan emin olun. Enfeksiyöz virüslerin taşınmasına yönelik güvenlik kılavuzu bölümüne bakın.
    1. Virüsü önceden belirlenmiş konsantrasyonda hazırlayın ve antikorun veya antiviral bileşiğin analiz ortamındaki seri dilüsyonlarını hazırlayın.
    2. Monoklonal antikor nötralizasyon analizleri için şunları karıştırın: 60 µL virüsün 4'teki...× ile olan nihai analiz konsantrasyonu 60 µL 4'te antikorun× final analiz konsantrasyonu ve şu sıcaklıkta inkübe edin: 37 °C permissif hücrelere eklenmeden önce 1 saat boyunca. Karıştırma işleminin ardından, virüs ve antikor 2'de bulunmaktadır× son assay konsantrasyonlarına. Buna karşılık, antiviral bileşik tarama assayleri için virüs-bileşik ön inkübasyonu gerekmemektedir.
    3. Şuraya gidin: Yerleşim sekmesine tıklayın ve ... seçin Tedavi uygun kuyucuklara antiviral ajanlara ilişkin tedavi bilgilerini girmek için kullanılan alt sekme.
    4. Aynı işlem için kuyucukları seçin, ardından şunları girin: İsim ajanların ve başlangıç değerlerini girin Seyreltme veya KonsantrasyonÖrneğin, başlangıç konsantrasyonu 10 µg/mL, girin 10 ve seçin µg/mL olarak “Birim”. Girin 3 olarak Seyreltme Faktörü ve belirtiniz Yönlendirme seyreltme (örneğin, Yukarıdan Aşağıya).
      NOT: Tıkladıktan sonra Uygulayınantiviral ajan konsantrasyonları veya dilüsyonları, plaka düzeni girdisine göre otomatik olarak hesaplanıp kaydedilecek ve ilgili kuyucuklarda görüntülenecektir. Hesaplanan değerler, sonraki veri analizleri için de kaydedilir. Virüs bilgilerinin (örneğin, İsim ve Seyreltme) opsiyoneldir, çünkü analiz tüm virüsle işlem görmüş kuyucuklar için tek bir sabit MOI kullanır.
    5. Uygun kuyucukları seçip [ilgili seçeneği] belirleyerek, yalnızca virüsle işlem görmüş kuyucukları pozitif kontrol olarak atayın Pozitif kontrol altında Kuyu Tipi.
    6. Yukarıda açıklanan adımı takip ederek ve kontrol ederek, enfekte edilmemiş kuyucukları negatif kontrol olarak belirleyin Negatif kontrol altında Kuyu Tipi.
      NOT: Yalnızca virüs içeren ve enfekte edilmemiş kuyucukların doğru şekilde atanması Pozitif kontrol ve Negatif kontrolsırasıyla, şunları kullanarak Kuyu Tipi Bu kuyucuklardan elde edilen CI değerleri tüm nötralizasyonla ilgili hesaplamalarda (örneğin, %Nötralizasyon) kullanıldığından, kurulum kritik öneme sahiptir. CPE ile ilgili hesaplamalar için (örneğin, %CPE), açıkça belirlenmiş negatif kontrol kuyucukları gereklidir. Antikor nötralizasyon deneyleri için, verilerin doğru yorumlanmasını sağlamak amacıyla aynı plakta hem pozitif hem de negatif kontrol antikorlarının yer alması şiddetle tavsiye edilir. Ancak, bu kontrol antikorları şu şekilde tanımlanmalıdır: Numuneler altında Kuyu Tipi.
    7. Analiz antiviral ajan ekleme aşamasına geldiğinde, şu düğmeye basın: Mevcut Adımı İptal Et Adım 2'deki kalan taramaları atlamak ve bir sonraki adıma geçmek için kullanılan düğme.
    8. Şuna tıklayın: Plakayı Kilidini Açın düğmesine basın, ardından plakayı yuvadan çıkarıp Biyogüvenlik Kabinine (BSC) yerleştirin.
    9. Yavaşça dağıtın 100 µL çok kanallı bir pipet kullanarak her kuyucuğa virüs-antikor karışımından veya virüs-antiviral bileşik karışımından, nihai kuyucuk hacmi şu şekilde olacak şekilde ekleyin: 200 µLİnokülüm, 2'de virüs ile antikor veya antiviral bileşik içerir× hücrelere eklendiklerinde nihai çalışma konsantrasyonlarına seyreltecekleri son analiz konsantrasyonları.
    10. Plakayı yuvaya geri yerleştirdikten sonra, şu bölüme gidin: Program sekme ve Adım 3'ü ekleyin. Şunun sayısını belirtin Taramalar ve Intervataramalar arasında. Toplam tarama süresinin (tarama sayısı × aralık) beklenen tedavi süresini aşmaktadır. Şuraya tıklayın: Başlat veri toplamayı yeniden başlatmak ve deneye devam etmek için.
      NOT: Antiviral ajan eklemesinin ardından ayrı bir adım (örneğin, Adım 3) belirlemek, tedavi sonrası izleme döneminin kolayca tanımlanmasını sağlar. Adım 1 hariç her adımı, beklenen analiz süresinden daha uzun sürecek şekilde programlayın. Programlanan çalışma süresine ulaşıldığında, cihaz ölçüm almayı durduracak ve bu durum veri noktalarının eksik olmasına yol açacaktır.
  3. 1. Gün ve sonrası: Veri analizi
    1. Veri toplama sırasında hücresel yanıtların gerçek zamanlı kaydını ve/veya analizini incelemek için şu bölüme gidin: Veri Analizi sekmeden belirli bir zaman noktasını veya zaman aralığını seçin; ardından analizde yer alacak kuyucukları seçip grafik şemasında görüntülenmek üzere ekleyin.
    2. Şu parametreleri seçin: Y ekseni açılır menü. Ne zaman Normalize Edilmiş Hücre İndeksi (NCI) seçildiğinde, şunları belirtin: Normalizasyon Süresizaman açılır listesinden, tedaviten hemen önceki zaman noktasını seçin. %CPE veya %Nötralizasyon Y ekseni açılır menüsünden ilgili seçenek seçilerek de görüntülenebilir.
      NOT: Cihaz, empedansı temsil etmek için birimsiz bir parametre olan Hücre İndeksi'ni (CI) kullanır. Kuyucuklar arası doğal varyasyonun etkisini en aza indirirken tedavi farklılıklarını değerlendirmek için Normalize Edilmiş Hücre İndeksi'nin (NCI) kullanılması önerilir.
    3. Şuraya gidin: Parametre şununla ilgili bölüm Veri Analizi belirli bir zaman noktasındaki (örneğin, analizinin orta noktasındaki veya bitiş noktasındaki) sütun grafiği ve 4 parametreli lojistik (4PL, değişken eğim) regresyon doz-yanıt eğrileri gibi farklı grafik türlerini hesaplamak ve oluşturmak için sekme. Alternatif olarak, IC₅₀ tedavi sonrası Hücre İndeksi veya Normalize Hücre İndeksi'nin eğri altı alanından (AUC) türetilen değer, antiviral ajanların tedavi süresi boyunca toplam doz-yanıtının bir ölçüsünü sağlar.
    4. Testin sonunda, şuraya tıklayın: Duraklat, ardından şu düğmeye basın: Plakayı Serbest Bırakın düğmesi. Plakayı yuvadan çıkarın ve elektronik olarak Salım it aracılığıyla belirtili tanımlık (veya bağlama göre: o, söz konusu) Plaka menü

3. Bulaşıcı virüslerle çalışma için güvenlik kılavuzu

  1. Çift eldiven, yüz siperliği ve laboratuvar önlüğü kullanarak uygun KKE giyin. Virüslerle çalışırken bu işlem şiddetle tavsiye edilir.
  2. Virüs içeren materyalleri yalnızca çalışan bir Biyogüvenlik Kabini (BSC) içerisinde işleyin ve plakalara ekleyin.
  3. Virüs tüplerini ve virüs içeren tüm plakaları BSC'ye ve BSC'den dışarıya sızdırmaz bir biyogüvenlik taşıyıcısı içerisinde nakledin.
  4. BSC'de virüs içeren materyallerle çalışmadan önce ve çalışma sonrasında, tüm iç yüzeyleri bir dezenfektanla iyice püskürtün ve tam viral inaktivasyonu sağlamak için 5 dk temas süresi tanıyın. Yüzeyleri silerek temizleyin ve ardından kalıntı dezenfektanı gidermek için %70 etanol ile dezenfekte edin.
  5. Empedans tabanlı antiviral tarama deneyi tamamlandığında, tüm plakaları cihazdan çıkarın ve sızdırmaz bir biyogüvenlik taşıyıcısı ile doğrudan temiz bir BSC'ye nakledin.
  6. Taze %20 çamaşır suyu çözeltisi hazırlayın ve deney plakalarındaki her kuyucuğa ekleyin. Tüm kuyucukları aspire edip plakaları atmadan önce çamaşır suyunu 10 dk bekletin.
  7. Virüsle temas etmiş olabilecek tüm deney plakalarını, serolojik pipetleri, pipet uçlarını, tüpleri ve diğer tek kullanımlık plastikleri çamaşır suyu ile dekontamine edin ve bunları belirlenmiş biyohazard atık torbalarına atın.
  8. Tüp rafları ve pipetler gibi tek kullanımlık olmayan plastikleri bir dezenfektanla püskürtün ve silin.

Sonuçlar

Etiketsiz, gerçek zamanlı empedans okuması virüs kaynaklı CPE'yi ve antiviral korumayı ortaya çıkarır
Şekil 2A'da gösterildiği gibi, HEK293A konak hücreleri, kuyuk başına 6.000 hücre yoğunluğunda mikroelektrot entegreli 96 kuyucuklu bir plakaya ekildi13. 24 saatlik inkübasyonun ardından, antiviral bileşiklerin varlığında veya yokluğunda, 1 MOI değerinde adenovirüs tip 5 eklendi. Viral enfeksiyona ve antiviral tedaviye karşı hücresel yanıtlar, gerçek zamanlı, etiketsiz empedans ölçümleri kullanılarak sürekli olarak izlendi. Virüsün yokluğunda, hücreler 80 saatlik izleme süresi boyunca sürekli olarak çoğaldı ve empedanstaki istikrarlı artışı takip eden bir plato ile belirtildiği üzere konfluense ulaştı. Adenovirüs enfeksiyonu başlangıçta yaklaşık 20 saat boyunca hücre büyümesine izin verdi, ardından belirgin bir CPE gözlemlendi ve bu durum, enfeksiyondan yaklaşık 65 saat sonra empedans sinyalinin hızla bazal seviyeye düşmesiyle sonuçlandı. Stavudine (50 µM) veya ribavirin (20 µM) tedavisi, empedans izlerinin yalnızca virüs ile enfekte edilmiş hücrelerinkine çok benzemesiyle, virüs kaynaklı CPE üzerinde minimum etki gösterdi. Ganciclovir (50 µM), Normalize Hücre İndeksinin kısmi toparlanmasıyla kanıtlandığı üzere mütevazı bir antiviral aktivite sergiledi. Buna karşılık, cidofovir (50 µM) ve brincidofovir (1 µM), CPE'yi belirgin şekilde hafifleterek enfekte edilmemiş negatif kontrol hücrelerinde gözlemlenenlerle karşılaştırılabilir empedans profilleri oluşturdu. Özellikle, ön çalışmalarda test edilen konsantrasyonlarda bileşiklerin hiçbiri, araçla tedavi edilen kontrollere kıyasla Hücre İndeksini önemli ölçüde etkilemedi (veriler gösterilmemiştir).

Empedans tabanlı bir antikor nötralizasyon analizinde, Vero CCL-81 hücreleri mikroelektrot entegreli 96 kuyucuklu plakaya kuyucuk başına 18.000 hücre yoğunluğunda ekilmiş ve enfeksiyondan önce 24 saat boyunca kültüre edilmişlerdir. Analiz gününde, monoklonal antikorlar hücrelere eklenmeden önce 0.01 MOI değerindeki rVSV–LASV ile 1 saat boyunca ön inkübasyona tabi tutulmuştur. Test edilen monoklonal antikorlar (mAbs) arasında farklı nötralizasyon profilleri gözlemlenmiştir. Netlik sağlamak amacıyla, Şekil 2B güçlü, kısmi veya hiç nötralize edici aktivite göstermeyen antikorlardan alınan temsili sonuçları sunmaktadır. Nötralize edici olmayan antikorlar tam CPE'ye neden olmuş ve empedans izleri yalnızca virüs içeren kontrollerinkilerle örtüşmüştür. Orta düzeyde nötralize edici aktiviteye sahip antikorlar, virüs kaynaklı sitotoksisiteyi kısmen azaltarak azalmış ancak tespit edilebilir bir CPE ile sonuçlanmıştır. Buna karşın, tam nötralize edici antikorlar CPE'yi tamamen inhibe etmiş ve enfekte edilmemiş hücre kontrolleriyle karşılaştırılabilir empedans sinyalleri korumuştur. Birlikte değerlendirildiğinde, bu empedans profilleri nötralize edici olmayan, kısmen nötralize eden ve tam nötralize eden monoklonal antikorlar arasında net bir ayrım yapılmasını sağlamıştır.

Antiviral aktivitenin nicelendirilmesi ve karakterizasyonu
Empedans tabanlı RTCA analizinin, ilaç ve mAb kütüphanesinden "hit"leri tanımlama yeteneği kanıtlandıktan sonra, çalışma bir sonraki aşamada öncü bileşiklerin ve antikorların etkinliğini karakterize etmeyi amaçlamıştır. Antiviral ilaç brincidofovir konsantrasyonunun 15.6 nM'den 1,000 nM'ye kademeli olarak artırılması, empedans sinyalinde basamaklı bir artışla sonuçlanmaktadır; ilaç konsantrasyonu ne kadar yüksekse, hücreler enfekte olmamış kontrole o kadar benzer davranış sergilemektedir (Şekil 3A). Ek olarak, sadece brincidofovir ile yapılan tedavi, NCI'da yalnızca test edilen en yüksek konsantrasyonda (1100 nM) marjinal bir artışa yol açmıştır. Ancak, 1100 nM'nin altındaki konsantrasyonlarda, etki doz bağımlı olmasa da NCI orta düzeyde azalmıştır. Bu sonuç, Hücre İndeksi'ndeki iyileşmenin, hücre proliferasyonunun veya tutunmasının doğrudan artırılmasından ziyade, yalnızca ilacın antiviral aktivitesine bağlanabileceğini göstermektedir (Şekil 3B). Normalize edilmiş Hücre İndeksi altındaki alanın (AUC), brincidofovir konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilmesi, mükemmel bir uyum (R2 = 0.99) sağlayan ve IC50 değerinin 265 nM olduğunu gösteren doz-yanıt eğrisini ortaya koymaktadır (Şekil 3C). Antikor nötralizasyon analizinde, analizin sonunda (tedaviden yaklaşık 50 saat sonra), sistem yazılımı her bir mAb konsantrasyonundaki nötralizasyon yüzdelerini otomatik olarak hesaplamış ve ardından IC50 değerleri türetilmiştir. Şekil 3D'de gösterildiği gibi, negatif kontrol antikoru rANDV-5'in aksine, diğer üç mAb olan r37.2D, r25.1C ve r12.1F; sırasıyla 4,315 ng/mL, 83 ng/mL veya 232 ng/mL IC₅₀ değerleri ile yüksek antiviral potansiyel sergilemiştir14,15.

figure-results-1
Şekil 1: Empedans tabanlı antiviral tarama testi iş akışının şematik gösterimi. 0. Gün, Adım 1: Permisif hücreler mikroplakalara ekildi ve hücre büyümesi, %5 CO2 içeren 37 °C'lik bir inkübatörde bulunan cihaz yuvasında yaklaşık 24 saat boyunca izlendi. 1. Gün, Adım 2: Virüs, sabit bir MOI ve antiviral ajanların seri dilüsyonları ile hazırlandı. Antikor nötralizasyon testleri için virüs, karışım hücrelere eklenmeden önce antikorlar ile 37 °C'de 1 saat boyunca ön inkübasyona tabi tutuldu. Adım 3: Virüs-antiviral ajan karışımları hücrelere eklendi. 1. Gün ve sonrasında, Adım 4: Virüsün indüklediği CPE, birkaç gün boyunca empedans tabanlı ölçümler kullanılarak sürekli olarak izlendi. Adım 5: Veriler gerçek zamanlı olarak veya test tamamlandıktan sonra analiz edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: İmpedans tabanlı Hücre İndeksi ölçümleri kullanılarak antiviral aktivitenin gerçek zamanlı izlenmesi. (A) İmpedans analizi ile değerlendirilen antiviral ilaç taraması. Ribavirin (20 µM) ve brincidofovir (1 µM) hariç tüm bileşikler, 1 MOI değerinde adenovirüs tip 5 varlığında 50 µM konsantrasyonda test edilmiştir. Veriler, üç tekerrurlu kuyucuğun ortalaması ± SD olarak sunulmuştur. Şekil Zhang ve ark. çalışmasından uyarlanmıştır13. (B) İmpedans tabanlı monoklonal antikor nötralizasyon testi. Nötralizasyon göstermeyen (tam CPE, kırmızı), kısmi nötralizasyon gösteren (kısmi CPE, turuncu) veya güçlü nötralizasyon gösteren (saptanabilir CPE yok, siyah) monoklonal antikorlar için temsili Hücre İndeksi profilleri gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: İmpedans kullanılarak antiviral aktivitenin kantifikasyonu. (A) 1 MOI'de adenovirüs tip 5 enfeksiyonu ile birlikte artan konsantrasyonlarda brincidofovir tedavisi sonrası gerçek zamanlı Normalize Hücre İndeksi'nin dinamik değişimleri. (B) Yalnızca artan konsantrasyonlarda brincidofovir tedavisi sonrası gerçek zamanlı Normalize Hücre İndeksi'nin dinamik değişimleri. (C) Doz-yanıt eğrisi elde etmek için impedans izlerinin altındaki alan, brincidofovir'in bir fonksiyonu olarak grafiğe dökülmüştür. (A) ve (C) Zhang ve ark. 13 çalışmasından uyarlanmıştır. (D) Monoklonal antikorlar r37.2D, r25.1C, r12.1F ve negatif kontrol olarak eklenen rANDV-5 için temsili rVSV–LASV Lineage IV (Josiah) nötralizasyon eğrileri. Monoklonal antikorlar 37.2D, 25.1C, 12.1F ve ANDV-5 mevcut literatüre dayanarak rekombinant olarak üretilmiştir (bkz. Sonuçlar bölümü). Gösterilen veriler iki bağımsız deneyden alınan temsili eğrilerdir ve üç replika kuyucuğun ortalaması ± SD olarak raporlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Tüm hücre tabanlı assayler gibi, RTCA antiviral tarama assayi de her virüs-hücre sistemi için optimizasyon gerektirir. Assay, virüs kaynaklı CPE'yi empedans değişiklikleri aracılığıyla tespit ettiği için, viral replikasyonu ve ölçülebilir CPE'yi destekleyen permissif bir hücre modeline bağımlıdır. Empedansla tespit edilebilen CPE oluşturmayan virüsler bu yaklaşım için uygun olmayabilir; böyle durumlarda, virüse özgü antikorlar mevcut olduğunda FRNT gibi alternatif yöntemler kullanılabilir. Bir diğer önemli husus, Hücre İndeksi'ndeki değişikliklerin yalnızca virüs kaynaklı sitolizden kaynaklanmamasıdır. Hücre morfolojisi, adezyon, proliferasyon ve tutunmadaki değişiklikler de empedans sinyallerini etkileyebilir ve potansiyel olarak antiviral aktivite değerlendirmesini karıştırabilir. Bu nedenle, antiviral ajanların Hücre İndeksi üzerindeki etkileri, ön çalışmalarda veya uygun ajan-yalnız kontroller aracılığıyla değerlendirilmelidir. Mevcut çalışmada, plaka başına değerlendirilen ajan sayısını maksimize etmek için, viral enfeksiyon yokken her bir adayın bazal etkilerini belirlemek amacıyla tarama assayinden önce yalnızca antiviral ajan kontrolleri test edilmiştir. Assay performansı ayrıca hücre ekim yoğunluğu, virüs inokülasyon zamanlaması ve besiyeri koşulları gibi hücre büyümesini, viral replikasyonu, CPE gelişimini ve assay tekrarlanabilirliğini etkileyebilen faktörlerden de etkilenir7,10,16. Sonuç olarak, sağlam ve güvenilir RTCA tabanlı antiviral tarama için sistematik optimizasyon esastır.

Optimal analiz koşulları belirlendikten sonra, empedans tabanlı gerçek zamanlı antiviral analizlerin başarılı bir şekilde uygulanması; tutarlı hücre ekimi, sağlıklı hücreler ve stabil analiz koşulları gerektirir. Kuyu-kuyular arası yüksek değişkenlik genellikle düzensiz hücre dağılımından veya hatalı pipetlemeden kaynaklanır; bu nedenle, hücre süspansiyonları ekimden önce iyice karıştırılmalı ve hücrelerin düzgün şekilde çökelmesini sağlamak ve kenar etkilerini azaltmak için plaklar ekimden sonra 30 dk boyunca RT'de bekletilmelidir. Her işlem için en az üç tekerrur önerilirken, negatif (enfekte edilmemiş) ve pozitif (yalnızca virüs) kontroller için ek tekerrurların yapılması şiddetle tavsiye edilir, çünkü bu değerler tüm işlem koşulları genelindeki %CPE ve %Nötralizasyon hesaplamaları için referans noktaları olarak hizmet eder. Virüs kaynaklı CPE zayıf veya tutarsızsa, virüs stokunun kalitesini ve permissif hücre hattının sağlığını doğrulayın. Viral enfektiviteyi korumak için, her deney için tek kullanımlık virüs alikotları hazırlayarak tekrarlanan dondurma-çözme döngülerinden kaçının. Son olarak, deneysel değişkenliği en aza indirmek ve analiz tekrarlanabilirliğini artırmak için, tutarlı bir pasaj sayısına sahip permissif hücreler içeren bir hücre bankasının kullanılması şiddetle önerilir. Enfeksiyondan hemen önce ölçülen Hücre İndeksi (genellikle ekimden yaklaşık 24 sa sonra), permissif hücre hattı için belirlenen referans değerin altına düşerse ve bu durum suboptimal hücre sağlığına veya büyümesine işaret ederse, deney durdurulmalıdır. Bu gibi durumlarda, kriyoprezerve edilmiş hücrelerin yeni bir flakonu çözülmeli ve antiviral tarama analizi tekrarlanmalıdır.

Burada sunulan tarama verilerinin gösterdiği üzere, antiviral tarama testi iyi kontrol edilmiş ve optimize edilmiş koşullar altında gerçekleştirildiğinde, empedans tabanlı test, antiviral ajanların CPE'deki gerçek zamanlı azalmasını doğru bir şekilde nicelleştirebilir. İş gücü yoğun uç nokta ölçümlerine dayanan geleneksel yaklaşımların aksine, sürekli ve noninvaziv empedans okuması, virüs kaynaklı hücresel hasarın tüm spektrumunun ve antiviral yanıtların kinetik profillerinin boylamsal olarak izlenmesine olanak tanır. Bu gerçek zamanlı ölçüm kapasitesi, yalnızca erken etkili olanların değil, aynı zamanda geleneksel uç nokta testlerinin gözden kaçırabileceği gecikmiş antiviral etkilerin tespit edilmesi için uygun zamansal pencerelerin belirlenmesini kolaylaştırır.

Ayrıca, burada açıklanan RTCA protokolü, geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında antiviral tarama için daha hızlı ve önemli ölçüde basitleştirilmiş bir iş akışı sunar. Analiz, yalnızca başlangıçtaki bir hücre ekim adımını ve ardından antiviral ajanların varlığında veya yokluğunda virüs eklemesini gerektirir. Ek bir işlem veya analiz sonrası işleme ihtiyaç duyulmaz. Deneysel kurulum ve veri analizi, %CPE, %nötralizasyon ve kullanıcı tanımlı bir nötralizasyon seviyesine ulaşan bir antiviral ajanın en yüksek dilüsyonu veya en düşük konsantrasyonu dahil olmak üzere, VRNT'de yaygın olarak kullanılan parametrelerin otomatik hesaplanmasını sağlayan sistemin özelleştirilmiş Viroloji yazılım modülü ile daha da kolaylaştırılmıştır. Toplu olarak bu avantajlar, geleneksel yöntemlerle tipik olarak mümkün olandan çok daha fazla analiz koşulunun (ilaç karşılaştırmaları, genişletilmiş dilüsyonlar vb.) hızlı ve paralel şekilde taranmasına olanak tanır.

Burada açıklanan analiz, yukarıda belirtilen uygun analiz koşullarıyla 96 kuyucuklu plaka formatında geliştirilmiş olsa da, 384 kuyucuklu plaka formatına uyarlanabilir. Bu daha yüksek kapasiteli, empedans tabanlı analizi desteklemek için, dört adede kadar 384 kuyucuklu plakanın aynı anda işlenmesine olanak tanıyan otomatik bir empedans tabanlı RTCA sistemi kullanılabilir.

Antiviral taramanın ötesinde, bu RTCA yöntemi kombinasyon tedavisi çalışmalarına, serolojiye ve viral immün kaçış araştırmalarına uygulanabilir. Terapötik antikorların veya immün serumların virüs kaynaklı CPE'yi önleme yeteneğini ölçen bu analiz, enfeksiyon veya aşılama sonrası nötralize edici aktivite ve koruyucu immün yanıtların etiketsiz, gerçek zamanlı bir değerlendirmesini sağlar. Ek olarak, farklı viral varyantlar arasında nötralizasyon profillerinin karşılaştırılması, immün kaçışla ilişkili duyarlılık değişikliklerini ortaya çıkarabilir. Genomik dizileme ile birleştirildiğinde bu yaklaşım, antikor dirençli varyantların tanımlanmasını kolaylaştırabilir ve yeni nesil aşıların, antikor terapötiklerinin ve antiviral stratejilerin geliştirilmesini destekleyebilir.

Açıklamalar

J.E.C., Moderna ve Merck şirketlerine danışmanlık yapmış, IDBiologics'in kurucusudur ve UpToDate'ten telif ücretleri almaktadır. J.E.C.'nin laboratuvarı, çalışma süresince IDBiologics'ten konuyla ilgisiz sponsorlu araştırma sözleşmeleri almıştır.

Teşekkürler

Bu çalışma, kısmen ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü'nden (NIAID) alınan U19 AI181979 ve U19AI181930 numaralı hibeler tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Adenovirus-GFPVector Biolabs 1060
Brincidofovir (CMX001)AdooQA13326
CaviCideMetrex13-5024dezenfektan 
CidofovirSelleck S1516
Dulbecco Modifiye Eagle Besiyeri (DMEM)ATCC30-2002
E-Plate 96Agilent5232368001mikroelektrot entegreli 96 kuyucuklu plaka
Fetal sığır serumuAvantor97068-085
Gansiklovir Sodyum Selleck S5065
HEK293A hücresiThermo Fisher Scientific  R70507
Multichannel ViafloINTEGRAVIAFLO 96
Penisilin-Streptomisin çözeltisiGibco10378016
Fosfat tamponlu tuzlu su (1x)HyCloneSH30256.01
Rekombinant mAb'lerCrowe LabN/A
RibavirinSelleck S2504
rVSV-LASV (Lin IV)Crowe LabN/A
Stavudin Selleck S1398
0.25% Trypsin 0.53 mM EDTA  (1x )ATCC30-2101
12 kanallı reaktif rezervuarlarıVistaLab Technologies3054-1011
Vero CCL-81ATCCCCL-81
Viroloji ModülüAgilentS2807-90089
xCELLigence RTCA MP sistemiAgilent380601040

Kaynaklar

  1. Pardi N, Weissman D. Development of vaccines and antivirals for combating viral pandemics. Nat Biomed Eng. 2020;4(12):1128-1133.
  2. Rocha VPC, Quadros HC, Fernandes AMS, Gonçalves LP, Badaró R, Soares MBP, et al. An overview of the conventional and novel methods employed for SARS-CoV-2 neutralizing antibody measurement. Viruses. 2023;15(7). doi:10.3390/v15071552.
  3. Chen CZ, Shinn P, Itkin Z, Eastman RT, Bostwick R, Rasmussen L, et al. Drug repurposing screen for compounds inhibiting the cytopathic effect of SARS-CoV-2. Front Pharmacol. 2021;11:592737.
  4. Giaever I, Keese CR. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 1993;366(6455):591-592.
  5. Giaever I, Keese CR. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(17):7896-7900.
  6. Suryadevara N, Shrihari S, Gilchuk P, VanBlargan LA, Binshtein E, Zost SJ, et al. Neutralizing and protective human monoclonal antibodies recognizing the N-terminal domain of the SARS-CoV-2 spike protein. Cell. 2021;184(9):2316-2331.e15.
  7. Charretier C, Saulnier A, Benair L, Armanet C, Bassard I, Daulon S, et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. J Virol Methods. 2018;252:57-64.
  8. Ebersohn K, Coetzee P, Venter EH. An improved method for determining virucidal efficacy of a chemical disinfectant using an electrical impedance assay. J Virol Methods. 2014;199:25-28.
  9. Marlina S, Shu MH, Abubakar S, Zandi K. Development of a real-time cell analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasit Vectors. 2015;8:240.
  10. Teng Z, Kuang X, Wang J, Zhang X. Real-time cell analysis—a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. J Virol Methods. 2013;193(2):364-370.
  11. Suryadevara N, Gilchuk P, Zost SJ, Mittal N, Zhao LL, Crowe JE Jr, et al. Real-time cell analysis: a high-throughput approach for testing SARS-CoV-2 antibody neutralization and escape. STAR Protoc. 2022;3(2):101387.
  12. Zhang J, Abassi YA, Li N, Wang X, Zhang X. A streamlined, label-free real-time 50% tissue culture infectious dose (TCID50) assay using impedance for automated viral titer quantification. J Vis Exp. 2026;(227). doi:10.3791/73686.
  13. Zhang J, Giang C, Li N, Abassi YA, Lamarche BJ. Screening and characterizing antiviral drugs in real time using xCELLigence RTCA eSight's combination of impedance and imaging. Agilent Technologies; 2022.
  14. Engdahl TB, Kuzmina NA, Ronk AJ, Mire CE, Hyde MA, Kose N, et al. Broad and potently neutralizing monoclonal antibodies isolated from human survivors of New World hantavirus infection. Cell Rep. 2021;35(5):109086.
  15. Robinson JE, Hastie KM, Cross RW, Yenni RE, Elliott DH, Rouelle JA, et al. Most neutralizing human monoclonal antibodies target novel epitopes requiring both Lassa virus glycoprotein subunits. Nat Commun. 2016;7:11544.
  16. Piret J, Goyette N, Boivin G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. J Clin Microbiol. 2016;54(8):2120-2127.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Empedans Tabanl TaramaSitopatik EtkilerGer ek Zamanl zlemeH cre K lt r MonotabakalarVir s Enfeksiyon AnaliziY ksek Kapasiteli TaramaAntiviral EtkinlikMonoklonal AntikorlarH cre Canl l
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.